分离寡核苷酸的方法

专利名称：分离寡核苷酸的方法
技术领域：
本发明涉及纯化有机化学制品，并且更具体地涉及化学合成的寡核苷酸。
背景在寡核苷酸的化学合成过程中，可能发生偶联失败和/或副发应，以致产生非全长或不完整的寡核苷酸。另外，酸催化的脱嘌呤作用可能发生，导致在寡核苷酸脱保护的过程中寡核苷酸主链的裂解。因而，在寡核苷酸化学合成过程中产生多种寡核苷酸，这些寡核苷酸必须纯化以获得目的寡核苷酸。
概述本发明基于使用连接于寡核苷酸3’和5’末端的分离标签纯化寡核苷酸的方法。一方面，本发明主要涉及分离寡核苷酸的方法。该方法包括a)提供多种寡核苷酸，多种寡核苷酸包括至少一种双功能寡核苷酸和至少一种非双功能的寡核苷酸(例如，脱嘌呤或截短的寡核苷酸)，其中每个至少一种双功能寡核苷酸包括第一分离标签和第二分离标签，第一分离标签连接于至少一种双功能寡核苷酸的第一末端，第二分离标签连接于至少一种双功能寡核苷酸的第二末端，并且其中第一或第二分离标签的裂解产生具有3’羟基部分的寡核苷酸；b)在对连接至少一种双功能寡核苷酸到分离介质有效的条件下，使多种寡核苷酸和分离介质接触；和c)选择性地洗脱至少一种非双功能寡核苷酸。该方法可以进一步包括洗脱至少一种双功能寡核苷酸。该方法也可以包括裂解第一分离标签或第二分离标签；并且洗脱缺乏未裂解分离标签的寡核苷酸。
第一或第二分离标签通过非共价相互作用(例如，疏水、亲水、氢键、金属螯合、离子或抗原抗体相互作用)或通过共价键(例如，二硫键、亚肼基(hydrazo)、烷氧氨基、或反应性羰基键)和分离介质相互作用。第一或第二分离标签可以是不同的。第一或第二分离标签可包括选自烷氧基三苯甲基、alkoxypixyl、alkyldithioformacetal、甲硫基烷基、巯基二甲氧基三苯甲基或巯基三苯甲基的衍生物、和以直链或支链的二醇形式引入的烃链，以及其组合的分离单元。烷氧基三苯甲基可以选自4-癸氧甲氧基三苯甲基(C10Tr)、4-己氧甲氧基三苯甲基(C6Tr)、二甲氧基三苯甲基(DMTr)和单甲氧基三苯甲基(MMTr)。alkoxypixyl可以是4-octadecyloxyphynylxanthyl(C18-Px)。分离单元可以是巯基二甲氧基三苯甲基或巯基三苯甲基的衍生物。分离单元可以是甲硫基烷基部分。分离单元可以是以直链或支链的二醇的形式引入的烃链。
第一或第二分离标签的可裂解单元可选自酸不稳定、氟离子不稳定、光不稳定、氧化还原不稳定和亲电子试剂不稳定的部分。氧化还原不稳定部分可以包括dithioformacetal部分。第一或第二分离标签的可裂解单元可以包括硅氧基(siloxyl)或二硅氧基(disyloxyl)部分。第一或第二分离标签的可裂解单元可以包括烷硫基甲基部分或烃基二硫代甲基部分。
分离介质可以选自亲和、疏水相互作用、亲水相互作用、金属螯合、离子交换、共价偶联和抗原抗体亲和分离介质。尤其是，分离介质可以是离子交换分离介质、反相分离介质或混合式类型分离介质。混合式类型分离介质可以包括反相和离子交换分离介质或共价偶联分离介质(例如，基于二硫键形成的分离介质)。分离介质可以包括第一分离介质和第二分离介质，第一分离介质对连接到第一分离标签有效和第二分离介质对连接到第二分离标签有效。
在另一方面，本发明涉及分离寡核苷酸的方法。该方法包括a)提供多种寡核苷酸，其中多种寡核苷酸包括至少一种双功能寡核苷酸和至少一种非双功能寡核苷酸，并且其中每个至少一种双功能寡核苷酸包括第一分离标签和第二分离标签，第一分离标签连接于至少一种双功能寡核苷酸的第一末端，第二分离标签连接于至少一种双功能寡核苷酸的第二末端，并且其中第一或第二分离标签的裂解产生具有3’羟基部分的寡核苷酸；b)在对连接至少一种双功能寡核苷酸到分离介质有效的条件下，使多种寡核苷酸接触分离介质；c)洗脱缺乏第一分离标签的非双功能寡核苷酸，而不洗脱双功能寡核苷酸；d)从保留在分离介质上的寡核苷酸裂解第一分离标签；和e)洗脱缺乏第二分离功能的非双功能寡核苷酸。裂解步骤可以使用TBAF或酸促进。
在另一方面，本发明涉及包括多种寡核苷酸的组合物，每种寡核苷酸包括连接于寡核苷酸第一末端的第一分离标签和连接于寡核苷酸第二末端的第二分离标签，其中第一或分离标签的裂解产生具有3’羟基部分的寡核苷酸；和b)分离介质，多种寡核苷酸连接到分离介质。分离介质包括第一分离介质和第二分离介质，第一分离介质和第二分离介质是不同的分离介质。
除非另外定义，此处使用的所有技术以及科学术语和缩略语与本发明相关领域普通技术人员所通常理解的含义相同。尽管同此处描述的那些相似或相同的方法和材料可以用来实施本发明，合适的方法和材料在下面描述。此处提及的所有的出版物、专利申请、专利和其它参考文献被完全引用作为参考。在有矛盾的情况下，将以本说明书(包括定义)为准。而且，材料、方法和实例只起说明作用并不用于作为限制。
本发明的一个或更多的实施方案的详细内容在下面附图和说明中阐释。本发明的其它的特点和优势将在下面的详细的描述和权利要求书中阐明。


图1是描述多种寡核苷酸的分离特征图，在寡核苷酸的3’和5’末端包括多种分离功能。
图2A和图2B是举例说明分离寡核苷酸的洗脱特征层析图。
详细说明通常，本发明的方法允许多种化学合成寡核苷酸(例如在固相支持物上合成的寡核苷酸)基于连接于寡核苷酸的第一和第二末端的分离标签被分离。术语“寡核苷酸”包括具有3’-5’磷酸二酯主链的核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸的寡聚体，以及具有不同于标准3’-5’磷酸二酯键(例如，肽-核酸(PNAs)、甲基膦酸酯或硫代磷酸酯键)主链结构的核糖核苷酸和脱氧核糖寡核苷酸的寡聚体。术语“寡核苷酸”也包括包含非标准碱基部分(如次黄苷或nubularine)、修饰碱基部分、修饰糖部分和这样部分的组合的寡聚体。例如，含氮碱基或糖部分可以被修饰为包括反应性官能团(例如，C5丙炔、卤化物或生物素)和标记(例如放射性的、发光的、电致发光的、可见的、近红外线的和荧光的)。合成包括含有非标准碱基的寡核苷酸在内的寡核苷酸的方法为本领域所知。例如，寡核苷酸可以通过β氰乙基亚磷酰胺(phosphoramidite)方法组装。例如参见“Oligonucleotide SynthesisAPractical Approach，”ed.M.J.Gait，IRL Press，1984，WO92/09615；和WO98/08857中的对寡核苷酸合成方法的说明。使用二硫化物锚定连接物固相合成PNAs的实例可以在Aldrian Herrada G等。J.PeptideSci.4，266-281(1998)找到。自动寡核苷酸合成仪可以用来制备寡核苷酸。这种合成仪众所周知并且可以从包括Applied Biosystems和Amersham Pharmacia Biotech在内的多个公司购买。
在本申请中在第一和第二末端具有分离标签的寡核苷酸设计为“双功能”。应该指出双功能寡核苷酸包括全长寡核苷酸，即，具有目的长度并且包括两个分离标签的寡核苷酸，以及包含两个分离标签但是小于目的长度的寡核苷酸，例如由于内部缺失。“非双功能“指的是不包含两个分离标签的任何寡核苷酸。
分离标签术语“分离标签“指的是结合到寡核苷酸3’或5’末端的化学基团或部分，使得具有分离标签的寡核苷酸可以和没有这种功能的其它寡核苷酸分离开。有用的分离标签是选择性地化学地或光化学地可裂解，以致可以从寡核苷酸的每一个末端除去分离标签。因此，分离标签包括“分离单元”和“可裂解单元”，二者可以是相同的或不同的化学部分。分离标签可以在化学合成的过程中连接到寡核苷酸上，例如，作为将寡核苷酸连接到固相支持物上的连接物的一部分。或者，使用本发明相关领域中普通技术人员所知的方法，分离标签可以在合成之前或之后添加。
分离标签位于寡核苷酸末端，即，位于寡核苷酸第一个核苷酸之前和寡核苷酸的最后一个核苷酸之后。例如，具有30个核苷酸的寡核苷酸，即，30聚体，连接在其末端的分离标签，位于核苷酸1之前和核苷酸30之后。应该指出第一和第二末端不是指核苷酸的具体的或特异的末端。更确切地说，第一和第二末端只是说明每个寡核苷酸具有两个末端。
在寡核苷酸的第一和第二末端的分离标签可以是相同的或不同的。例如，在每一末端上的分离标签可以是疏水的，或在一个末端上的具有疏水功能而另外一个末端上具有共价功能。
双功能寡核苷酸的合成寡核苷酸的化学合成一般使用一个固相支持物，一个或多个被保护的核苷酸可以通过连接在核苷酸的3’-氧上的连接物连接在固相支持物上。随着另外的核苷酸单体相继添加，产生的寡核苷酸在3’-5’末端方向延伸。在获得具有目的长度的寡核苷酸链后，寡核苷酸从固相支持物上被裂解下来并且去除保护基团。连接物是指包含原子(例如碳、氮、氧等)链的任何分子，用于将支持物上待合成分子和支持物连接。连接物通常在支持物上的合成开始前通过共价键连接于支持物，并且提供一个或多个用来连接待合成分子前体的位点。应该理解，有时连接物包括一个或多个不是完成的全长寡核苷酸的一部分的核苷酸，例如polyT。是连接物一部分但是不是完成的全长寡核苷酸的一部分的核苷酸不被认为是寡核苷酸的3’末端。一般地，连接物对碱不稳定因此可以使用例如氨将寡核苷酸从固相支持物上裂解下来。对碱不稳定的连接物的非限制性实例是琥珀酰烷基胺。
在寡核苷酸3’末端的分离标签可以是在固相支持物和寡核苷酸的第一个核苷酸(即3’末端)间的连接物的组分。在寡核苷酸的3’末端的分离标签一般在氨水处理下稳定，因此当寡核苷酸从固相支持物上释放时，分离标签不会从寡核苷酸上裂解下来。基于一个或多个化学相互作用，例如包括， 疏水的、亲水的、离子的、氢键和/或共价相互作用，分离标签的分离单元可以和分离介质相互作用。例如，在分离单元和分离介质间的相互作用包括离子交换(例如阴离子或阳离子交换)、疏水(例如反相)、金属螯合(例如Ni(+2)络合/组氨酸标签)、蛋白质相互作用(例如酶/底物)、半抗原/抗原/抗体、和/或共价(例如硫羟/二硫、亚肼基、烷氧氨基、或反应性羰基)。尤其是，直链或支链二醇如1，10-癸二醇或其它疏水二醇可以用来作为制备分离标签的疏水分离单元的起始材料。
在寡核苷酸的3’末端的分离标签的可裂解单元可以连接在寡聚体中的第一个核苷酸的3’氧上。在寡核苷酸的3’末端的合适的可裂解单元在被裂解后产生一个游离的3’羟基。二硅氧基基团(“Dsi)、烷基硫甲基和烃基二硫代甲基基团、光不稳定基团(例如o-硝苄基基团)、氧化还原活性基团(例如含有二硫键或烃基二硫代甲基的基团)和亲电子试剂(例如烷基硫甲氧基基团)是可以作为连接物组分的合适的可裂解单元的实例。包含二硅氧基的连接物可以使用Kwiatkowski等，Nucleic Acids Res.，244632-4638(1996)；Kwiatkowski等，NucleicAcids Res.，27(24)4710-14(1999)；或WO 98/08857中提供的方法产生。光不稳定官能团可以使用Greenberg，Tetrahedron Lett.34251-254(1993)中的方法引入到连接物。含有烃基二硫代甲基基团的连接物可以使用在美国专利第6,309,836号中提供的方法引入。尤其是，根据Veeneman等，Tetrahedron，471547-1562(1991)的方法可以从5’二甲氧基三苯甲基、3’-甲基硫甲基胸腺嘧啶脱氧核苷制备3’-甲基硫烷基亚磷酰胺。Ducharme和Harrison，Tetrahedron Lett.366643-6646(1995)的方法可以用来将5’二甲氧基三苯甲基、3’-甲硫基甲基胸腺嘧啶脱氧核苷转变成5’-二甲氧基三苯甲基、3’-甲基硫丁醇胸腺嘧啶脱氧核苷，然后可以根据众所周知的方法亚磷酸化(phosphitylated)制备成3’-甲基硫烷基亚磷酰胺。
上面讨论的基团也可以用来作为寡核苷酸5’末端的分离标签。5’末端分离标签可以被引入和5’末端核苷酸一起作为末端，在合成的过程中添加适当衍生的亚磷酰胺(phosphoramidite)到寡聚物。用于寡核苷酸5’末端的合适的分离标签包括那些除了保护末端羟基残基还提供分离功能的，并且可以从合成的寡聚体中选择性地裂解下来。末端的核苷酸可以包括也作为分离功能的糖和/或碱基-OH或-NH2保护基团。而且，几个有用的官能基团可以在寡核苷酸的5’末端掺入进来。这些官能团包括可以通过已知方法制备的适当地衍生的磷酸、硫醇、胺、酰肼、烷氧基胺或生物素。例如，硫醇或磷酸可以通过Connolly，Tetrahedron Letters，28(4)463-66(1987)的三苯甲基-S方法被添加。使用在美国专利第6,309,836中描述的方法烃基二硫代甲基基团可以被添加到羟基上。
有用的5’分离官能团包括众所周知的疏水基团例如二甲氧基三苯甲基(“DMTr”)、pixyl、烷氧基三苯甲基、和alkoxypixyl保护基团。例如，octadecyloxypixyl phyhylxanthyl(“C18Px”)、4-癸氧甲氧基三苯甲基(“C10Tr”)、4-己氧甲氧基三苯甲基(“C6Tr”)、和单甲氧基三苯甲基(MMTr)、以直链或支链的二醇形式引入的烃链、alkyldithioformacetal、甲硫基烷基和巯基二甲氧基三苯甲基或巯基三苯甲基的衍生物可以用来作为分离官能团。5’分离标签也可以在单独的反应中添加。如美国专利第5,319,079号中描述的三苯甲基交换的方法中，不同类型的取代的三苯甲基基团可以引入到合成的寡核苷酸的5’位置上。
作为实例，双功能寡核苷酸可以使用一个或多个下面的步骤产生。3’末端分离标签通过在氨水中可裂解的连接物连接在固相支持物上(例如通过掺入简单的酯部分)。简要地，连接物可以连接在固相支持物上，如1000可控微孔玻璃(CPG)，其事前已经通过单一或重复引入足够疏水的直链或支链的二醇的亚磷酰胺衍生物用一个或多个标准的核苷酸衍生。被适当保护的核苷可以使用溶于无水嘧啶和咪唑中的1，3-二氯-1，1，3，3-四异丙基二硅氧烷进行硅烷基化，随后和所选的二醇反应(例如，四甘醇)。硅烷化的核苷酸的末端羟基基团然后可以转变成亚磷酰胺并且添加入连接物末端的游离的羟基上。将亚磷酰胺衍生物偶联到连接物的游离末端引进了寡核苷酸的起始3’核苷。使用已知的寡核苷酸合成方法将另外的核苷亚磷酰胺依次偶联形成具有目的长度的寡核苷酸。最后，通过在增长的寡核苷酸链的5’末端偶联合适的衍生的核苷亚磷酰胺，5’末端分离标签可以引入到全长的寡核苷酸上。使用浓氨水脱保护并且从固相支持物上裂解下寡核苷酸后，可以获得结构1的双功能寡核苷酸。
结构1 关于上面的结构1，“T”表示一个或多个在完成的寡核苷酸从固相支持物上分离下来后保留在双功能寡核苷酸3’末端的核苷酸或非核苷酸等同物。例如，在结构1中，“T”表示一个或多个胸苷核苷酸。
变量“n”可以是0，1或2，并且表示添加在CPG寡核苷酸固相支持物上的分离标签的分离单元的数目。多种分离单元可以用于本发明的分离标签内。例如在结构1描述的实施方案中，变量“n”表示磷酸-1，10-癸二醇单元的数目。提高癸二醇单元数目增加3’末端分离官能团的疏水性。在这个实施方案中，总的3’末端连接物包括一个或多个胸苷核苷酸、磷酸-1，10癸二醇单元、磷酸-三甘醇单元和二硅氧基组分(即，分离标签的可裂解单元)。“o-|-|-o”代表寡核苷酸。“R”代表连接在寡核苷酸5’-OH的5’末端分离标签。
在一些实施方案中，3’-甲基硫烷基亚磷酰胺取代上面讨论的二硅氧基amidite。3’-甲基硫烷基亚磷酰胺然后可以偶联到1，10-癸二醇单元的游离羟基上。在寡核苷酸合成循环和标准氨水脱保护完成后，合成的双功能寡核苷酸具有下面的结构2。
结构2 在一些实施方案中，通过偶联1-O-二甲氧基三苯甲基-己基-二硫化物、1’-[(2-氰乙基)-(N，N-二异丙基)]-亚磷酰胺到适当衍生的固相支持物，可以添加二硅氧键到固相支持物上。二硫苏糖醇可以用来还原二硫键，藉此产生可以共价连接在包含硫醇反应性官能团的分离介质上的寡核苷酸。还原后，在含有二硅氧基的支持物上合成的寡核苷酸具有结构3。
结构3 分离介质上面描述的分离标签决定了可以用来分离双功能寡核苷酸的分离介质的类型。因此，任何已知的适合特定分离单元的分离介质可以用来分离双功能和非双功能寡核苷酸并且获得纯化的双功能寡核苷酸。有用的分离介质包括包括基于一个或多个化学相互作用(例如疏水的、亲水的、离子的和/或共价的相互作用)和分离单元相互作用的化学基团和部分。例如，包含这样基团的分离介质是有用的，该基团可以通过离子交换(例如阴离子或阳离子交换)、疏水(例如反相)、金属络合(例如，Ni(+2)络合组氨酸标签)、亲和相互作用、半抗原/抗原/抗体、和/或共价(例如，硫醇/二硫)类型相互作用和分离单元相互作用。
可以使用的分离介质的类型并不局限于并且包括，例如，衍生硅、树脂、适当修饰的膜或加载在膜上的微粒和其它支持物。合适的分离介质可以从，例如，Amersham Pharmacia Biotech(Piscatawy，NJ)；Amicon，Inc.(Beverly，MA，现归Millipore所有)；EM SeparationsTechnology(Gibblstown NJ)Vydac(Hesperia，CA)；和/或Bio-RadLaboratories(Hercules，CA)购买。分离介质的非限制性实例包括疏水介质，如基于硅的C4、C8和C18支持物或非基于硅的材料如丁基琼脂糖、辛基琼脂糖和苯基琼脂糖。离子交换材料(尤其是阴离子交换材料)包括Mini Q、Mono Q、Q琼脂糖、SAX三甲基氨丙基、DEAE琼脂糖和EMD DEAE-650。亲和分离材料是以成对的表示，例如，固定化的链霉亲和素和亚氨生物素标记的寡核苷酸、固定化的硝化链霉亲和素和生物素标记的寡核苷酸(Morag等。Anal.Biochem.，243257-263)或固定化的水杨基羟肟酸和苯基硼酸标记的寡核苷酸(Bergseid等， BioTechniques，29(5)1126-1133)。依赖共价键形成的分离介质可以用以下例子来说明吡啶二硫代丙基琼脂糖和硫醇标记寡核苷酸、固定化的羟氨或酰肼诸如琼脂糖己二酸酰肼和乙醛标记的寡核苷酸。使用举例的树脂和膜的方法和推荐条件为技术人员众所周知并且易于获得。
分离寡核苷酸的系统可以包括一个或多个HPLC柱和/或分离柱。包含多种元件(例如阀门、泵、上样单元和组分收集器)和柱或柱体的系统可以设置为使双功能寡核苷酸的分离自动化。柱或柱体以顺序或平行的模式运行，根据对于特定寡核苷酸优选的分离顺序。
根据第一和第二分离标签的性质，使用单一分离介质或多种类型分离介质(即混合式)可以使双功能寡核苷酸从非全长的寡核苷酸中分离。在一些实施方案中，使用一个单一层析柱，并且在一些情况下单次运行，可以使双功能寡核苷酸和非双功能寡核苷酸分离。例如，使用如下的一种或多种类型的反相分离介质，可以使包含疏水的第一和第二分离标签的双功能寡核苷酸从非双功能寡核苷酸中分离。使双功能和非双功能寡核苷酸的混合物和适当的分离介质接触，保留包含和分离介质相互作用更强的分离标签的双功能寡核苷酸以及非双功能寡核苷酸。然后从层析柱上洗脱保留的寡核苷酸并且裂解更强结合的分离标签。使产生的寡核苷酸混合物和分离介质接触并且获得目的寡核苷酸。应该理解分离标签可以从双功能寡核苷酸裂解，同时连接到分离介质上，即不需要首先洗脱双功能寡核苷酸。相似地，当分离标签连接到分离介质上时可以从只拥有一个分离标签的寡核苷酸上裂解。
寡核苷酸混合物的分离可以使用在层析柱内的分离介质(即，混合式)完成。例如，包含分离介质的层析柱的一个区域可以和第一分离标签相互作用，同时在同一层析柱的不同区域的不同分离介质可以和第二分离标签相互作用。或者，不同分离介质散布在层析柱内。
纯化后，寡核苷酸的浓度可以通过紫外吸收(λmax 260nm)测定。在最终纯化的产品中的组分的定量和定性比较可以从装备有紫外检测器的液相层析装置上直接获得。例如，峰面积直接从所有含发色团组分的HPLC层析图计算。积分(integrated)峰面积的比例用于计算目的产物的纯度。
在下面的实施例中将进一步描述本发明，这不限制权利要求书中描述的本发明的范围。
实施例实施例中使用的试剂以及分析和制备的方法。
除非另外指出，下面的试剂和方法用于在这个方法部分后面的实施例中。
5’-O-(4，4’-二甲氧基)三苯甲基thymidylyl 3’-O-(1，1，3，3-四异丙基-二硅氧基-3)-(1-O-3，6，9-三噁)十一烷-11-醇{5’-O-(4，4’-dimethoxy)trityl thymidylyl 3’-O-(1，1，3，3-tetraisopropyl-disiloxyl-3)-(1-O-3，6，9-trioxa)undecan-11-ol}和它的亚磷酰胺衍生物根据PCT Publication No.WO 98/08857制备。商品有售的CPG(1000 A；CPG Inc.，Fairfield；或Applied Biosystems，Foster City，CA)使用和Pon，RT，“Chapter 19 Solid-phase Supports for OligonucleotideSynthesis，”Methods in Molecular Biology Vol.20 Protocols forOligonucleotides and Analogs，465-497，Ed.S.Agrawal，Humana PressInc.，Towata，NJ(1993)中描述的那些相似的方法丙硫硅烷化。二甲氧基三苯甲基-己基-二硫化物、1’-[(2-氰乙基)-(N，N-二异丙基)]-亚磷酰胺从Glen Research，Sterling，VA获得。所有的商品化学试剂是合成品质并且使用时无需进一步纯化。
寡核苷酸合成在ABI 394 DNA合成仪上完成。在生产商推荐用于0.2μmol规模合成的条件下，使用苯甲酰基(dA，dC)和/或异丁酰(dG)基团在环外胺官能团保护的amidites完成所有的偶联。如果需要，最后一个核苷亚磷酰胺被用另外5’保护基团衍生的核苷亚磷酰胺取代，或根据三苯甲基交换方法最终的二甲氧基三苯甲基(DMTr)基团被其它三苯甲基衍生物交换(参看美国专利第5,319,079号)。
氨脱保护寡核苷酸的分析性的液相层析在配备有LiChrosorb RP18(5μm)层析柱、二极管阵列检测器的Hitachi-Merck La ChromHPLC系统上完成，使用溶剂A5％v/v乙腈(“MeCN”)的0.1M乙酸三乙胺(“TEAA”)溶液，pH 7.0，和溶剂B80％v/v乙腈的0.1MTEAA溶液，pH 7.0，40分钟线性梯度。
为了除掉二硅氧基基团，添加0.5 M氟化四丁基铵(“TBAF”)的无水四氢呋喃(“THF”)(200μl)溶液到部分蒸发的寡核苷酸溶液中，在那里水在10ml圆底烧瓶的壁上只形成一个薄膜。混合物在20℃孵育2小时。或者，二硅氧基连接物可以使用200μl 0.5M TBAF的干的DMF溶液65℃裂解30分钟。通过使全长寡核苷酸和80％乙酸水溶液在20℃接触20分钟，随后蒸发酸，三苯甲基和pixyl类型基团被去除。
分离的和彻底脱保护的寡核苷酸在分析性离子交换Mini QHPLC层析柱上分析，使用变性(pH 12)盐梯度洗脱模式，由溶剂A(0.01M NaOH)，和溶剂B(0.01M NaOH+1.0M NaCl)组成，0％-100％B，运行40分钟。长于25个碱基的寡核苷酸在Beckman MDQ系统上使用ssDNA 100-R毛细管试剂盒(毛细管长度30cm)通过毛细管电泳分析。
实施例1当第一和第二分离标签是在不同条件下可除去的，包含第一和第二分离标签的双功能寡核苷酸的化学合成和单次HPLC运行使其和非双功能寡核苷酸分离只是由鸟嘌呤和腺嘌呤组成的包含25个核苷酸的寡核苷酸(25-mer)，即，G(AG)12，根据上面描述的方法合成。寡核苷酸在购自Applied Biosystems，Foster City，CA的CPG寡核苷酸固相支持物上合成。CPG固相支持物获得时预先添加了任何标准的脱氧核糖核苷。25-mers根据下面表示的通用结构合成，该结构表示了部分脱保护和从CPG固相支持物上去除的寡核苷酸。
关于上面的通用结构，“T”表示结合在商品的CPG寡核苷酸固相支持物上的单一胸苷单元。变量“n”是0，1，或2并且表示添加到CPG寡核苷酸固相支持物上的磷酸-1，10-癸二醇单元的数目。连接于寡核苷酸3’末端的分离标签(3’分离标签)包括磷酸-1，10-癸二醇单元、磷酸三甘醇单元和二硅氧基连接物(Dsi)。制备了三个不同变量的3’分离标签，其中n＝0，1或2，分别称为Dsi，DsiC10和DsiC20。“o-|-|-o”表示寡核苷酸。“R”表示5’羟基分离标签(5’分离标签)，如octadecyloxypixyl(C18Px)、4-癸氧甲氧基三苯甲基(C10Tr)、4-己氧甲氧基三苯甲基(C6Tr)或二甲氧基三苯甲基(DMTr)。5’分离标签将疏水性质引入到寡核苷酸的5’末端。
根据表1的九个系统，合成的寡核苷酸得到多种3’和5’分离标签。改变个别的3’分离标签或5’分离标签将改变全长寡核苷酸和包含3’或5’分离标签的任何片段的疏水性质。

通过使固相支持物接触浓氨水并且放置固相支持物在65℃烤箱里12小时，化学合成的寡核苷酸脱保护并且从CPG固相支持物上除去。氨处理去除了碱基保护基团、磷酸酯保护基团并且裂解了连接寡核苷酸到固相支持物上的酯基团。通过对所有脱嘌呤位点碱催化裂解方法，包含在寡核苷酸合成中产生的脱嘌呤位点的寡核苷酸同时被裂解。3’-二硅氧基分离标签和5’-酸不稳定分离标签保持完整。脱保护的寡核苷酸在NAP 10 Sephadex层析柱上部分浓缩和脱盐。根据上面描述的方法，使用5μm Lichrosorb RP18层析柱通过HPLC对浓缩的和脱盐的脱保护寡核苷酸分析。
图1显示RP18对于根据表1的系统1-9合成的包括全长的和非双功能寡核苷酸的各种25-mers的保留性质，即，用于洗脱的乙腈的大约百分数。
包含C18Px5’分离标签的寡核苷酸也被制备，但是没有在图1中表示，因为包含C18Px5’分离标签的种类要求图1所示范围外的更强的洗脱条件。为方便查阅，每个表现在图1的寡核苷酸种类被置于下面四个类别之一A组)具有表1所示的3’和5’两种分离标签的双功能寡核苷酸，实心圆圈； B组)只具有表1所示的5’分离标签的非双功能寡核苷酸(例如5’末端脱嘌呤和裂解的寡核苷酸)，实心正方形；C组)只具有表1所示的3’分离(例如成熟前截短的寡核苷酸和3’末端脱嘌呤和裂解的寡核苷酸)标签的非双功能寡核苷酸，空心圆圈；和D组)表1所示的没有5’和3’分离标签(例如在位于相同寡核苷酸链内的至少两个脱嘌呤位点裂解产生的寡核苷酸片段)的非双功能寡核苷酸，空心正方形。
使用乙腈洗脱模式促进分离全长寡核苷酸，即A组，根据系统1、5和9制备的寡核苷酸混合物在一次单一层析运行中足以分离。然后使用下面的方法从全长寡核苷酸上释放3’和5’分离标签。分离的A组组分干燥并且重悬于80％乙酸溶液20分钟，来除去对酸不稳定的分离标签。接下来，全长的寡核苷酸再次干燥然后重悬于0.5M TBAF中2小时，来除去硅氧基功能基团。最终的产品在一次性凝胶过滤层析柱(例如，NAP 5(Pharmacia))上脱盐。
实施例2使用多次HPLC运行使双功能寡核苷酸和非双功能寡核苷酸分离。
使用系统7(表1)的3’和5’分离标签策略，根据实施例1的方法制备长度为20-105个核碱基的寡核苷酸。反应混合物包括全长(A组)和在B、C和D组中表示的更短一些的副产物寡核苷酸。反应混合物上样至5μm RP18层析柱并且使用在等度(isocratic)模式(60％MeCN，0.1M TEAA)下运行的5μm RP18层析柱(正如上面描述)分离。
图2a举例说明洗脱液图。在图2a中的散列符号(hash marks)表示收集的洗脱液组分的起始和终止点。收集的洗脱液组分只包含属于A和C组的寡核苷酸。收集的洗脱液组分被浓缩并且用0.5M TBAF的无水THF(200μl)溶液处理来除去3’-二硅氧基分离标签。添加三乙基胺(20μl)到浓缩的洗脱液中以防止在TBAF处理期间5’-DMTr分离单元的裂解。包含没有3’-分离标签的寡核苷酸的洗脱液在TBAF处理后脱盐并且上样到用32％MeCN平衡的RP18层析柱上。图2b显示的是32％MeCN洗脱图。在图2b中的散列符号表示收集的洗脱液组分的起始和终止点。收集的洗脱液组分只包含具有完整5’分离标签的全长的寡核苷酸。收集的洗脱液组分随后被干燥并且使用众所周知的方法去三苯甲基化。
用来分离寡核苷酸的等度方法是非常快速的，在3-4分钟内分离目的寡核苷酸。改变寡核苷酸长度和/或序列不能显著影响分离时间。等度方法的另外的优势是层析柱在不同运行间无需重新平衡。
实施例3使用混合式分离使双功能寡核苷酸和非双功能寡核苷酸分离。
包括实施例1中A、B、C和D组的双功能和非双功能寡核苷酸的多种寡核苷酸，并且以中度疏水性的3’分离标签(n＝1)和强疏水性的C18Px5’分离标签为特征的这些寡核苷酸，使用阴离子交换分离介质分离。
溶于水∶乙醇(9∶1)的寡核苷酸混合物上样到用水平衡的Mono Q层析柱(MonoQ，Pharmacia Biotech，Uppsala Sweden)上。水和乙醇的混合物用于防止由寡核苷酸形成的具有相当去垢剂性质的胶束(micelles)。上样的Mono Q层析柱使用3倍柱体积的水洗涤。在15分钟内应用0-1M的NaCl梯度到柱上，藉此除去D组的寡核苷酸。接下来是第二次1M NaCl溶液中的0-30％MeCN梯度洗脱来洗脱C组的寡核苷酸。Mono Q层析柱然后先后用水和100％MeCN平衡。接下来，用泵使三氯乙酸(“TCA”)(3％)的二氯甲烷(“DCM”)溶液流过层析柱来除去5’末端分离标签。C18Px分离标签的释放伴随着有色的碳正离子的形成，这对肉眼是可见的。因此，碳阳离子的除去是容易监控的。用来除去对酸不稳定的5’分离标签所需的时间少于2分钟。
Mono Q层析柱先后用100％MeCN和水洗涤。在15分钟内应用另外一个0-1M的NaCl梯度于层析柱，藉此除去在TCA处理期间由B组形成的D组的寡核苷酸。第二次用1M NaCl中的0-30％MeCN梯度于Mono Q层析柱来洗脱C组的寡核苷酸，这是在TCA处理期间通过全长物质的depixylation形成的。通过如上面实施例1描述的用TBAF处理浓缩的组分，然后从收集的物质中除去3’末端二硅氧基分离标签。
实施例4使用混合式分离使双功能寡核苷酸和非双功能寡核苷酸分离。
根据Veeneman等Tetrahedron，471547-1562(1991)制备5’-二甲氧基三苯甲基、3’-甲硫基甲基胸苷。在和Ducharme&Harrison，Tetrahedron Lett.366643-6646(1995)中描述的相似的反应中，该物质转变为5’-二甲氧基三苯甲基、3’-甲基硫丁醇(1)胸苷。产生的胸苷衍生物根据众所周知的方法被亚磷酸化(phophitylated)，形成3’-甲硫基烷基亚磷酰胺。
如实施例3中所述完成寡核苷酸的合成，除了二硅氧基amidite被3’-甲基硫烷基亚磷酰胺取代。在用标准氨水脱保护后，合成的全长寡核苷酸具有下面的通用结构 使用实施例3中的方法分离双功能寡核苷酸，除了如下取代第二个乙腈梯度洗脱步骤。Mono Q层析柱用0.1M磷酸盐0.5M NaCl缓冲液(pH 6.5)平衡。通过使磷酸盐缓冲液0.1M溴水(20∶1 v/v)混合液以1ml/min流速流过层析柱裂解3’分离标签。直接收集2ml洗脱液到一个非常稀释的硫酸氢钠溶液中以淬灭过量的溴。没有3’和5’分离标签的寡核苷酸在最终的脱盐后获得。
实施例5使用混合式分离使双功能寡核苷酸和非双功能寡核苷酸分离。
1-O-二甲氧基三苯甲基-己基-二硫化物、1’-[(2-氰乙基)-(N，N-二异丙基)]亚磷酰胺，(购自Glen Research，Sterlin，VA)偶联到支持物。通过amidite的掺入添加实施例1中所示的二硅氧基键。使用标准条件在含有二硅氧基CPG固相支持物上化学合成四十二个核碱基的寡核苷酸。末端的5′位置用C18Px保护的胸苷封闭(capped)。
通过使层析柱接触浓氨水以及25mg的还原试剂二硫苏糖醇，从支持物上释放寡核苷酸。混合物放置在55℃烤箱中12小时，以完成寡核苷酸的脱保护和二硫化物的裂解。
还原的和脱保护的双功能寡核苷酸具有下面的通用结构。
部分浓缩后，脱保护的寡核苷酸混合物在NAP 10 Sephadex层析柱上脱盐，这去除任何过量的DTT。脱保护的寡核苷酸混合物以大约0.1ml/min的流速上样于包含位于萃取柱柱体下部分的反相硅支持物(C-8)和位于上层的二硫吡啶基衍生的CPG支持物(28μmol SS-Py/g)的二元萃取柱柱体。具有适当的3’分离标签的寡核苷酸(在这个例子中是游离的硫醇)通过二硫键共价结合到硫醇反应性的支持物上。缺乏3’末端的游离硫醇的寡核苷酸结合到具有较低疏水性的支持物上。
使用水∶乙腈(4∶6)混合物洗去缺乏3’游离硫醇的寡核苷酸。层析柱然后用水平衡并且用溶于0.1M TEAA(pH 7.0)的10μM DTT洗涤，裂解二硫键并且释放结合在二元萃取柱柱体上半部分的寡核苷酸。在这些条件下，释放的寡核苷酸连接到二元萃取柱柱体中的具有较低疏水性的支持物上。二元萃取柱柱体用30％MeCN∶0.1M TEAA缓冲液洗涤，将非双功能寡核苷酸片段从萃取柱柱体上洗脱。目的寡核苷酸用70％MeCN∶0.1 TEAA洗脱和收集。收集的组分蒸发，用80％乙酸溶液处理20分钟以除去5’pixyl分离标签，再次蒸发，并且如上面所述用TBAF处理以除去二硅氧键标签。TBAF使用一次性脱盐柱除去。
应该理解尽管本发明已经用其详细说明书描述，但上述的说明意在举例说明而不是限制本发明的范围，本发明的范围由所附的权利要求书限定。其它方面、优势和修改在下面的权利要求书范围内。
权利要求
1.分离寡核苷酸的方法，所述方法包括a)提供多种寡核苷酸，所述的多种寡核苷酸包括至少一种双功能寡核苷酸和至少一种非双功能寡核苷酸，其中每种所述的至少一种双功能寡核苷酸包含第一分离标签和第二分离标签，第一分离标签连接在所述的至少一种双功能寡核苷酸的第一末端，第二分离标签连接在所述的至少一种双功能寡核苷酸的第二末端，并且其中所述的第一或所述的第二分离标签的裂解产生具有3’羟基部分的寡核苷酸；b)在有效使所述的至少一种双功能寡核苷酸附着到分离介质的条件下，使所述的多种寡核苷酸和分离介质接触；并且c)选择性地洗脱至少一种非双功能寡核苷酸。
2.权利要求1的方法，其中所述的非双功能寡核苷酸包含脱嘌呤或截短的寡核苷酸。
3.权利要求1的方法，其中所述的第一或所述的第二分离标签中的任一者通过非共价相互作用与所述的分离介质相互作用。
4.权利要求1的方法，其中所述的第一或所述的第二分离标签中的任一者通过共价键与所述的分离介质相互作用。
5.权利要求4的方法，其中所述的共价键选自二硫键、亚肼基、烷氧氨基、和反应性羰基键。
6.权利要求3的方法，其中所述的非共价相互作用选自疏水、亲水、氢键、金属络合、离子、和抗原-抗体相互作用。
7.权利要求1的方法，其中所述的第一和所述的第二分离标签是不同的。
8.权利要求1的方法，其中所述的第一或所述的第二分离标签中的任一种包含选自烷氧基三苯甲基、alkoxypixyl、alkyldithioformacetal、甲硫基烷基、巯基二甲氧基三苯甲基或巯基三苯甲基的衍生物和直链或支链的二醇形式引入的烃链及其组合的分离单元。
9.权利要求8的方法，其中所述的烷氧基三苯甲基选自4-癸氧甲氧基三苯甲基(C10Tr)、4-己氧甲氧基三苯甲基(C6Tr)、二甲氧基三苯甲基(DMTr)和单甲氧基三苯甲基(MMTr)。
10.权利要求8的方法，其中所述的alkoxypixyl包括4-octadecyloxyphynylxanthyl(C18-Px)。
11.权利要求8的方法，其中所述的分离单元包括巯基二甲氧基三苯甲基或巯基三苯甲基的衍生物。
12.权利要求8的方法，其中所述的分离单元是甲硫基烷基部分。
13.权利要求8的方法，其中所述的分离单元是以直链或支链的二醇形式引入的烃链。
14.权利要求1的方法，其中所述的第一或所述的第二分离标签中任一者的可裂解单元选自对酸不稳定、对氟离子不稳定、对光不稳定、对氧化还原不稳定、和对亲电子试剂不稳定的部分。
15.权利要求14的方法，其中所述的对氧化还原不稳定的部分包括dithioformacetal部分。
16.权利要求1的方法，其中所述的第一或所述的第二分离标签中任一者的可裂解单元包括硅氧基或二硅氧基部分。
17.权利要求1的方法，其中所述的分离介质选自亲和、疏水相互作用、亲水相互作用、金属螯合、离子交换、共价偶联、和抗原-抗体亲和分离介质。
18.权利要求1的方法，其中所述的分离介质是离子交换分离介质。
19.权利要求1的方法，其中所述的分离介质是反相分离介质。
20.权利要求1的方法，其中所述的分离介质是混合式类型分离介质。
21.权利要求20的方法，其中所述的混合式类型分离介质包括反相和离子交换分离介质。
22.权利要求20的方法，其中所述的混合式类型分离介质包括共价偶联分离介质。
23.权利要求22的方法，其中所述的共价偶联分离介质基于二硫键的形成。
24.权利要求1的方法，其中所述的方法进一步包括洗脱所述的至少一种双功能寡核苷酸。
25.权利要求1的方法，其中所述的分离介质包括第一分离介质和第二分离介质，所述的第一分离介质对于与所述的第一分离标签附着有效而所述的第二分离介质对于与所述的第二分离标签附着有效。
26.权利要求1的方法，所述的方法进一步包括d)裂解所述的第一分离标签或所述的第二分离标签；并且e)洗脱缺乏所述的未裂解分离标签的寡核苷酸。
27.分离寡核苷酸的方法，所述的方法包括a)提供多种寡核苷酸，其中所述的多种寡核苷酸包括至少一种双功能寡核苷酸和至少一种非双功能寡核苷酸，并且其中每个所述的至少一种双功能寡核苷酸包括第一分离标签和第二分离标签，第一分离标签连接在所述的至少一种双功能寡核苷酸的第一末端，第二分离标签连接在所述的至少一种双功能寡核苷酸的第二末端，并且其中所述的第一或所述的第二分离标签的裂解产生具有3’羟基部分的寡核苷酸；b)在有效使所述的至少一种双功能寡核苷酸附着到分离介质有效的条件下，使所述的多种寡核苷酸和分离介质接触；c)洗脱缺乏所述的第一分离标签的非双功能寡核苷酸，而不洗脱所述的双功能寡核苷酸；d)从保留在分离介质上的寡核苷酸裂解所述的第一分离标签；并且e)洗脱缺乏所述的第二分离功能的非双功能寡核苷酸。
28.权利要求27的方法，其中使用TBAF促进所述的裂解步骤。
29.权利要求27的方法，其中使用酸促进所述的裂解步骤。
30.一种组合物，包括a)多种寡核苷酸，每种所述的寡核苷酸包括连接在所述寡核苷酸第一末端的第一分离标签和连接在所述寡核苷酸第二末端的第二分离标签，其中所述的第一或所述的第二分离标签的裂解产生具有3’羟基部分的寡核苷酸；和b)分离介质，所述的多种寡核苷酸附着于所述的分离介质上。
31.权利要求30的组合物，其中所述的分离介质包括第一分离介质和第二分离介质，所述的第一分离介质和所述的第二分离介质是不同的分离介质。
32.权利要求1的方法，其中所述的第一或所述的第二分离标签中的任一者的可裂解单元包括烷硫基甲基部分。
33.权利要求1的方法，其中所述的第一或所述的第二分离标签中的任一者的可裂解单元包括烃基二硫代甲基部分。
全文摘要
本发明基于使用连接在寡核苷酸3’和5’末端的分离标签纯化寡核苷酸的方法。在一方面，本发明主要涉及分离寡核苷酸的方法。
文档编号C07H21/04GK1628123SQ03803410
公开日2005年6月15日 申请日期2003年2月7日 优先权日2002年2月8日
发明者麦克·克威特考斯基 申请人:麦克·克威特考斯基