专利名称：从紫杉醇粗产品分离纯化紫杉醇的方法
技术领域：
本发明涉及植物提取物的分离纯化领域，具体是一种从紫杉醇粗产品分离纯化紫杉醇的方法。
(二)技术背景紫杉醇是近二十年来世界上发现的最有希望的抗癌药物，对治疗乳腺癌、卵巢癌、食道癌、肺癌、肝癌等癌症均有良好疗效，对癌细胞有极强的杀伤力，而毒副作用极小。因此成为目前药品行业研究的重点。
紫杉醇属于二萜类生物碱。最开始是从天然植物红豆杉中提取分离紫杉醇。红豆杉是珍稀物种，天然红豆杉资源极为有限，而且红豆杉生长缓慢，天然红豆杉无法满足紫杉醇生产的需要量。为了开辟紫杉醇的新的来源，人们研究了从人工种植的曼地亚红豆杉中提取分离紫杉醇、红豆杉细胞培养生产紫杉醇及多种生物合成、半合成、全合成紫杉醇工艺。无论采用何种工艺，由于紫杉醇合成率低、成本高，所以紫杉醇价格昂贵。另外从多种结构相近的衍生物、同系物的混合物中分离纯化出紫杉醇药物，特别是紫杉醇与三尖杉宁碱的分离，是很困难的工作。分离纯化过程中收率稍有升降，即意味着珍贵的紫杉醇的得失多少，效益上将有巨大差异。所以如何改进紫杉醇的分离纯化工艺，是目前普遍重视的课题。
目前的分离方法主要有硅胶柱层析法、氧化铝柱层析法，纯化方法主要有C18柱层析、氟苯基柱层析等反相层析法和硅胶柱层析正相层析法。
有关紫杉醇的分离纯化工艺的专利申请有多件，如加拿大植原药物公司1999年申请的中国专利99815315.X“从含紫杉醇物质生产紫杉醇的高产率提取方法”用丙酮/水沉淀法制备高纯度紫杉醇，复旦大学1998年申请的中国专利“一种清洁纯化紫杉醇的方法”使用填充色谱柱正构烷烃淋洗纯化紫杉醇粗产物，梅县梅雁生物工程研究所2001申请的中国专利“从红豆杉细胞培养液滤液中富集提取紫杉醇的方法”将大孔吸附树脂与试液充分混合进行吸附富集，有机溶剂洗脱被树脂吸附的紫杉醇，浓缩得到高含紫杉醇的浓缩物。
现有的分离纯化方法的不足之处在于，紫杉醇一次收率(即从投料开始，经过按顺序的工艺流程，而得到的产出物收得率，以有效成份紫杉醇计算。不包括副产出物的反复投入)仅为70％；而且要使用易燃、易爆或有毒溶剂，如氯仿、二氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇、乙腈等，对人体有害，污染环境，生产操作过程危险性高；此外上样量小，一般硅胶柱层析时硅胶与样品的比例为150比0.9～1.0。
发明内容本发明的目的是提供一种收率高、且生产操作安全的从紫杉醇粗产品分离纯化紫杉醇的方法。
本发明的从紫杉醇粗产品分离纯化紫杉醇的方法，包含下述步骤①紫杉醇含量为9～20％的紫杉醇粗产品为原料样品；②用大孔吸附树脂作固定相，大孔吸附树脂与样品的重量比为10比0.9～1.4；③用能与水混溶的、浓度为40～70％极性溶剂水溶液为流动相；④用柱层析法分离纯化紫杉醇，样品溶液从大孔吸附树脂的层析柱顶端上样；⑤流动相洗脱时，层析柱内流出液流速为0.6～1.5升/小时；⑥按时间分段收集经层析后的流出液，每小时收集1份，至HPLC检测紫杉醇浓度低于0.2毫克/毫升时终止，按时间段收集的流出液分为三部分；⑦第I部分流出液中基本无紫杉醇，集中处理，回收溶剂；⑧第II部分流出液中紫杉醇含量小于三尖杉宁碱含量，浓缩干燥得紫杉醇中间产品A；⑨第III部分流出液中紫杉醇含量大于三尖杉宁碱含量，浓缩干燥得紫杉醇中间产品B。
本发明从紫杉醇粗产品分离纯化紫杉醇的方法的优点为1、分离纯化效果好，很方便地将紫杉醇含量为9～20％的紫杉醇粗产品纯化为含紫杉醇40～60％的紫杉醇中间产品；2、收率高，紫杉醇一次性收率高达80％左右；3、操作安全，不使用易燃、易爆或有毒溶剂；4、上样量大，大孔吸附树脂与样品的重量比高达10比0.9～1.5，是一般硅胶柱层析时硅胶上样量的15倍；5、可除去紫杉醇粗产品中的水溶性杂质。
具体实施方式
实施例1①原料样品中紫杉醇含量为15.6％的紫杉醇粗产品100克，其中紫杉醇净含量15.6克；
②紫杉醇样品原料溶于300毫升95％(V/V)极性溶剂乙醇中，然后加水至乙醇浓度为60％(V/V)，样品与乙醇水溶液重量比约为1比5；③大孔吸附树脂AB-8 1000克，与样品的重量比为10比1，装入外径6厘米可充填高度100厘米的玻璃层析柱内；④从大孔吸附树脂的层析柱顶端上样，即将样品溶液倒入层析柱中，调节层析柱出口阀门，控制层析柱内溶液流速为1升/小时；⑤ 按时间分段收集经层析后的流出液，每小时收集1份，至HPLC检测紫杉醇浓度为0.2毫克/毫升时终止；⑥1～4份流出液为第I部分，其中基本无紫杉醇，集中处理，回收溶剂；⑦5～20份流出液为第II部分，其中紫杉醇含量小于三尖杉宁碱含量，浓缩干燥得紫杉醇中间产品A8.35克，其中含紫杉醇37.4％，即紫杉醇净含量为3.12克，占原料中紫杉醇的20％；⑧21～终止的流出液为第III部分，其中紫杉醇含量大于三尖杉宁碱含量，浓缩干燥得紫杉醇中间产品B 18.2克，其中含紫杉醇54.2％，即紫杉醇净含量为9.86克，占原料中紫杉醇的63.2％。
紫杉醇中间产品A和B中的紫杉醇净含量共为12.98克，占原料中紫杉醇的83.2％，即紫杉醇的一次性收率为83.2％。
紫杉醇中间产品A和B中的紫杉醇净含量平均为48.9％。
实施例2使用大孔吸附树脂D101，①～⑥步其它条件与实施例1相同；⑦5～20份流出液为第II部分，其中紫杉醇含量小于三尖杉宁碱含量，浓缩干燥得紫杉醇中间产品A8.55克，其中含紫杉醇38.5％，即紫杉醇净含量为3.29克，占原料中紫杉醇的21.09％；⑧21～终止的流出液为第III部分，其中紫杉醇含量大于三尖杉宁碱含量，浓缩干燥得紫杉醇中间产品B 17.5克，其中含紫杉醇53.5％，即紫杉醇净含量为9.36克，占原料中紫杉醇的60.01％。
紫杉醇中间产品A和B中的紫杉醇净含量共为12.65克，占原料中紫杉醇的81.1％，即紫杉醇的一次性收率为81.1％。
紫杉醇中间产品A和B中的紫杉醇净含量平均为48.6％。
实施例3使用大孔吸附树脂D201，①～⑥步其它条件与实施例1相同；⑦5～20份流出液为第II部分，其中紫杉醇含量小于三尖杉宁碱含量，浓缩干燥得紫杉醇中间产品A8.765克，其中含紫杉醇40.2％，即紫杉醇净含量为3.52克，占原料中紫杉醇的22.57％；⑧21～终止的流出液为第III部分，其中紫杉醇含量大于三尖杉宁碱含量，浓缩干燥得紫杉醇中间产品B 18.5克，其中含紫杉醇50.2％，即紫杉醇净含量为9.19克，占原料中紫杉醇的59.53％。
紫杉醇中间产品A和B中的紫杉醇净含量共为12.81克，占原料中紫杉醇的82.1％，即紫杉醇的一次性收率为82.1％。
紫杉醇中间产品A和B中的紫杉醇净含量平均为47.0％。
实施例4使用大孔吸附树脂AK-9，①～⑥步其它条件与实施例1相同；⑦5～20份流出液为第II部分，其中紫杉醇含量小于三尖杉宁碱含量，浓缩干燥得紫杉醇中间产品A8.60克，其中含紫杉醇37.8％，即紫杉醇净含量为3.25克，占原料中紫杉醇的20.84％；⑧21～终止的流出液为第III部分，其中紫杉醇含量大于三尖杉宁碱含量，浓缩干燥得紫杉醇中间产品B17.4克，其中含紫杉醇51.2％，即紫杉醇净含量为8.91克，占原料中紫杉醇的57.11％。
紫杉醇中间产品A和B中的紫杉醇净含量共为12.16克，占原料中紫杉醇的77.9％，即紫杉醇的一次性收率为77.9％。
紫杉醇中间产品A和B中的紫杉醇净含量平均为46.8％。
实施例5①与实施例1相同；②紫杉醇样品原料溶于200毫升极性溶剂丙酮中，然后加水至丙酮浓度为40％(V/V)，样品与丙酮水溶液重量比约为1比6；③～⑤与实施例1相同；⑥1～2份流出液为第I部分，其中基本无紫杉醇，集中处理，回收溶剂；⑦3～6份流出液为第II部分，其中紫杉醇含量小于三尖杉宁碱含量，浓缩干燥得紫杉醇中间产品A11.5克，其中含紫杉醇30.2％，即紫杉醇净含量为3.59克，占原料中紫杉醇的23.0％；⑧17～终止的流出液为第III部分，其中紫杉醇含量大于三尖杉宁碱含量，浓缩干燥得紫杉醇中间产品B 19.7克，其中含紫杉醇48.3％，即紫杉醇净含量为9.52克，占原料中紫杉醇的61.0％。
紫杉醇中间产品A和B中的紫杉醇净含量共为12.11克，占原料中紫杉醇的42.0％，即紫杉醇的一次性收率为42.0％。
紫杉醇中间产品A和B中的紫杉醇净含量平均为84.0％。
实施例6①原料样品中紫杉醇含量为9.5％的紫杉醇粗产品140克，其中紫杉醇净含量13.3克；②紫杉醇样品原料溶于300毫升95％(V/V)极性溶剂乙醇中，然后加水至乙醇浓度为70％(V/V)，样品与乙醇水溶液重量比约为1比4；③与实施例1相同；④从大孔吸附树脂的层析柱顶端上样，即将样品溶液倒入层析柱中，调节层析柱出口阀门，控制层析柱内溶液流速为0.6升/小时；⑤与实施例1相同；⑥第1份流出液为第I部分，其中基本无紫杉醇，集中处理，回收溶剂；⑦2～16份流出液为第II部分，其中紫杉醇含量小于三尖杉宁碱含量，浓缩干燥得紫杉醇中间产品A8.72克，其中含紫杉醇30.2％，即紫杉醇净含量为2.63克，占原料中紫杉醇的19.8％；⑧16～终止的流出液为第III部分，其中紫杉醇含量大于三尖杉宁碱含量，浓缩干燥得紫杉醇中间产品B 20.55克，其中含紫杉醇41.8％，即紫杉醇净含量为8.59克，占原料中紫杉醇的64.59％。
紫杉醇中间产品A和B中的紫杉醇净含量共为11.22克，占原料中紫杉醇的84.4％，即紫杉醇的一次性收率为84.4％。
紫杉醇中间产品A和B中的紫杉醇净含量平均为38.3％。
实施例7①原料样品中紫杉醇含量为11.8％的紫杉醇粗产品95克，其中紫杉醇净含量11.2克；②紫杉醇样品原料溶于300毫升95％(V/V)极性溶剂乙醇中，然后加水至乙醇浓度为50％(V/V)，样品与乙醇水溶液重量比约为1比6；③与实施例1相同；④从大孔吸附树脂的层析柱顶端上样，即将样品溶液倒入层析柱中，调节层析柱出口阀门，控制层析柱内溶液流速为1.5升/小时；⑤与实施例1相同；⑥1～6份流出液为第I部分，其中基本无紫杉醇，集中处理，回收溶剂；⑦7～23份流出液为第II部分，其中紫杉醇含量小于三尖杉宁碱含量，浓缩干燥得紫杉醇中间产品A4.59克，其中含紫杉醇36.1％，即紫杉醇净含量为1.66克，占原料中紫杉醇的14.79％；
⑧24～终止的流出液为第III部分，其中紫杉醇含量大于三尖杉宁碱含量，浓缩干燥得紫杉醇中间产品B 11.98克，其中含紫杉醇56.2％，即紫杉醇净含量为6.73克，占原料中紫杉醇的60.1％。
紫杉醇中间产品A和B中的紫杉醇净含量共为8.39克，占原料中紫杉醇的74.9％，即紫杉醇的一次性收率为74.9％。
紫杉醇中间产品A和B中的紫杉醇净含量平均为50.6％。
实施例8①原料样品中紫杉醇含量为18.6％的紫杉醇粗产品120克，其中紫杉醇净含量22.32克；②紫杉醇样品原料溶于300毫升95％(V/V)极性溶剂乙醇中，然后加水至乙醇浓度为65％(V/V)，样品与乙醇水溶液重量比约为1比4.5；③与实施例1相同；④从大孔吸附树脂的层析柱顶端上样，即将样品溶液倒入层析柱中，调节层析柱出口阀门，控制层析柱内溶液流速为1.2升/小时；⑤与实施例1相同；⑥1～3份流出液为第I部分，其中基本无紫杉醇，集中处理，回收溶剂；⑦4～18份流出液为第II部分，其中紫杉醇含量小于三尖杉宁碱含量，浓缩干燥得紫杉醇中间产品A 11.31克，其中含紫杉醇38.3％，即紫杉醇净含量为4.33克，占原料中紫杉醇的19.41％；⑧19～终止的流出液为第III部分，其中紫杉醇含量大于三尖杉宁碱含量，浓缩干燥得紫杉醇中间产品B 27.34克，其中含紫杉醇52.9％，即紫杉醇净含量为14.46克，占原料中紫杉醇的64.8％。
紫杉醇中间产品A和B中的紫杉醇净含量共为18.79克，占原料中紫杉醇的84.2％，即紫杉醇的一次性收率为84.2％。
紫杉醇中间产品A和B中的紫杉醇净含量平均为48.6％。
权利要求
1 一种从紫杉醇粗产品分离纯化紫杉醇的方法，包含下述步骤①紫杉醇含量为9～20％的紫杉醇粗产品为原料样品；②用大孔吸附树脂作固定相，大孔吸附树脂与样品的重量比为10比0.9～1.4；③用能与水混溶的、浓度为40～70％极性溶剂水溶液为流动相；④用柱层析法分离纯化紫杉醇，样品溶液从大孔吸附树脂的层析柱顶端上样；⑤流动相洗脱时，层析柱内流出液流速为0.6～1.5升/小时；⑥按时间分段收集经层析后的流出液，每小时收集1份，至HPLC检测紫杉醇浓度低于0.2毫克/毫升时终止；⑦流出液中紫杉醇含量小于三尖杉宁碱含量，浓缩干燥得紫杉醇中间产品A；⑧流出液中紫杉醇含量大于三尖杉宁碱含量，浓缩干燥得紫杉醇中间产品B。
2 如权利要求1所述的从紫杉醇粗产品分离纯化紫杉醇的方法，其特征为其中的所述的大孔吸附树脂为AB-8、或D101、或D201、或AK-9。
3 如权利要求1或2所述的从紫杉醇粗产品分离纯化紫杉醇的方法，其特征为其中所述的极性溶剂为乙醇、或丙酮。
4 如权利要求1至3中任一项所述的从紫杉醇粗产品分离纯化紫杉醇的方法，其特征为其中所述的极性溶剂水溶液的浓度为55～65％。
5 如权利要求4所述的从紫杉醇粗产品分离纯化紫杉醇的方法，其特征为其中所述的极性溶剂水溶液的浓度为58～62％。
6 如权利要求1至5中任一项所述的从紫杉醇粗产品分离纯化紫杉醇的方法，其特征为其中所述的大孔吸附树脂与样品的重量比为10比0.9～1.2。
7 如权利要求6所述的从紫杉醇粗产品分离纯化紫杉醇的方法，其特征为其中所述的大孔吸附树脂与样品的重量比为10比0.95～1.05。
8 如权利要求1至7中任一项所述的从紫杉醇粗产品分离纯化紫杉醇的方法，其特征为其中所述的层析柱内流出液流速为0.8～1.2升/小时。
9 如权利要求8所述的从紫杉醇粗产品分离纯化紫杉醇的方法，其特征为其中所述的层析柱内流出液流速为0.9～1.1升/小时。
全文摘要
本法用大孔吸附树脂如AB－8、D101、D201、AK－9作固定相，40～70％极性溶剂如乙醇、丙酮的水溶液为流动相，柱层析法分离纯化紫杉醇，流出液流速为0.6～1.5升/小时，每小时收集1份，至紫杉醇浓度低于0.2毫克/毫升时终止，按时间分段收集流出液；流出液中紫杉醇含量小于三尖杉宁碱含量，浓缩干燥得紫杉醇中间产品A；流出液中紫杉醇含量大于三尖杉宁碱含量，浓缩干燥得紫杉醇中间产品B。本法便于将9～20％的紫杉醇粗产品分离纯化为40～60％的紫杉醇中间产品；一次性收率高达80％；操作安全，不使用易燃、易爆或有毒溶剂；上样量大，大孔吸附树脂与样品的重量比高达10比0.9～1.5，是一般层析上样量的15倍；可除去粗产品中的水溶性杂质。
文档编号C07D305/00GK1526708SQ0313591
公开日2004年9月8日 申请日期2003年9月22日 优先权日2003年9月22日
发明者丁志坚, 徐位坤 申请人:丁志坚