用于测量βig－h3蛋白质的量的方法以及使用其的诊断试剂盒的利记博彩app

专利名称：用于测量βig－h3蛋白质的量的方法以及使用其的诊断试剂盒的利记博彩app
技术领域：
本发明涉及用于测量βig-h3蛋白质的量的方法以及使用其的诊断试剂盒。具体而言，本发明涉及通过βig-h3蛋白质或βig-h3蛋白质中fas-1结构域的重组蛋白(包括其片段或其衍生物)与其配体之间的特异结合反应来测量体液中βig-h3蛋白质的量的方法，还涉及用于肾病、肝病、类风湿性关节炎或心血管疾病的诊断试剂盒，其包含βig-h3蛋白质或βig-h3蛋白质中fas-1结构域的重组蛋白(包括其片段或其衍生物)及其配体。
背景技术：
βig-h3是包括人黑素瘤细胞、乳房上皮细胞、角质细胞和肺成纤维细胞在内的多种细胞中由TGF-β诱导的胞外基质蛋白。TGF-β(转化生长因子-β)涉及多种细胞的生长和分化，而且哺乳动物具有三种TGF-β(TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3)。已知TGF-β具有许多复杂的功能，诸如生长控制、免疫应答调节、刺激骨形成、诱导软骨特异大分子、刺激伤口愈合等(Bennett，N.T.等人，Am.J.Surg.，1993，165，728)。TGF-β在伤口愈合过程中表达于上皮细胞中，可能是为了在上皮细胞再生过程中刺激角质细胞中整合素的表达。最近关于TGF-β表达的研究揭示了，TGF-β3mRNA表达于正常皮肤的上皮细胞和急性或慢性伤口恢复中的上皮细胞，TGF-β1mRNA只表达于由急性伤口再生的上皮细胞中，而TGF-β2mRNA根本不表达(Schmid，P.等人，J.Pathol.，1993，171，191)。尽管关于上述机制的具体理论尚未建立，但是认为TGF-β在上皮细胞再生中发挥重要作用。
βig-h3，即由TGF-β诱导的基因h3，是由Stonier等人首先发现的。确切的说，βig-h3是在搜索来自A549细胞系的cDNA文库差异筛选数据的过程中发现的，A549细胞系是经过TGF-β1处理的人肺腺癌细胞系，据报道在TGF-β1处理后两天βig-h3升高了20倍(Stonier，J.等人，DNACell Biol.，1992，11，511)。还通过DNA测序确认了βig-h3是由SEQ.ID.No 1所示的683个氨基酸组成的，具有氨基末端分泌序列和能够进行针对某些整合素的配体识别的羧基末端Arg-Gly-Asp(RGD)序列。
βig-h3包含四个同型内部重复结构域以及RGD基元，在哺乳动物、昆虫、海胆、植物、酵母和细菌等物种的膜蛋白或分泌蛋白中都能观察到这种高度保守的序列。诸如骨膜蛋白(periostin)、成束蛋白I、海胆HLC-2、海藻CAM和分支杆菌MPB70等蛋白质也包含上述保守序列(Kawamoto，T.等人，Biochem.Biophys.Acta.，1998，1395，288)。在那些蛋白质中非常保守的同型结构域(在下文中称为“fas-1结构域”)由110-140个氨基酸组成，包含两个各由10个氨基酸组成的非常保守的分支(H1和H2)。βig-h3、骨膜蛋白和成束蛋白I含有4个fas-1结构域，HCL-2含有2个fas-1结构域，而MPB70则只含有1个fas-1结构域。已知那些蛋白质中的一些可以作为细胞粘附分子而介导细胞的粘附和脱离，尽管尚未能够完全解释那些蛋白质的生物学功能。例如，βig-h3、骨膜蛋白和成束蛋白I分别干预成纤维细胞、成骨细胞和神经细胞的粘附，而则证实海藻-CAM是在团藻胚中驻留的细胞粘附分子(LeBaron，R.G.等人，J.Invest.Dermatol.，104，844，1995；Horiuchi，K.等人，J.Bone Miner.Res.，1999，14，1239；Huber，O.等人，EMBO J.，1994，13，4212)。
纯化的βig-h3蛋白质在无血清培养基中刺激皮肤成纤维细胞的粘附和铺展，但是阻碍A549、HeLa和WI-38细胞的粘附。βig-h3尤其阻碍肿瘤细胞的生长、集落的形成和出现。事实上，通过用βig-h3表达载体转染中国仓鼠卵巢细胞，肿瘤细胞在裸鼠中的生长显著降低，这在美国专利#5,714,588和#5,599,788中有明确叙述。此外，在那些专利中还叙述了通过用需要量的βig-h3接触伤口来刺激受伤部位周围的成纤维细胞扩展和粘附的方法。因此，作为在许多细胞中由TGF-β高度诱导的细胞粘附分子，βig-h3在细胞生长、细胞分化、伤口愈合、形态发生和细胞粘附中发挥重要作用。
尽管βig-h3是有效的有用物质，然而因为人体内只生成极少量的βig-h3，所以它的供应是不足的。为了解决这个问题，通过遗传工程在真核细胞系统中表达βig-h3，从而开发了制备它的方法。可是，在那种情况中，生成βig-h3的细胞的生长比其它细胞慢得多，从而导致难以获得足够量的βig-h3生成细胞。因此，本发明人建立了一种纯化方法，其中使用大肠杆菌作为宿主大量表达包含整个βig-h3蛋白质或其一些结构域的重组蛋白，证实了那些重组蛋白支持细胞粘附和铺展，并申请了专利(韩国专利申请#2000-25664)。
细胞粘附分子βig-h3的细胞粘附活性首先报导于人的真皮成纤维细胞，然后在软骨细胞、腹膜成纤维细胞和人MRC5成纤维细胞中也有这样的报导。早期认为βig-h3的细胞粘附活性是由βig-h3羧基末端的RGD基元介导的。但是后来报导RGD基元并非是刺激软骨细胞铺展所必需的，而且通过羧基末端加工使其中RGD基元缺失的成熟βig-h3能够阻碍细胞粘附。因此，确认了RGD基元并非βig-h3细胞粘附活性的必需介导物。最近的研究进一步确认了βig-h3通过与整合素α1β1独立作用来刺激细胞粘附和铺展，尤其是成纤维细胞的铺展，而βig-h3的RGD基元并非由βig-h3介导的细胞铺展所必需的(Ohno，S.等人，Biochim.Biophys.Acta，1999，1451，196)。此外，确认了βig-h3中所包含的H1和H2肽不影响由βig-h3介导的细胞粘附，说明细胞粘附所需要的某些氨基酸并非位于H1和H2中而是在βig-h3的其它部位。为了支持上文，通过计算机分析了βig-h3的重复fas-1结构域与其它蛋白质的fas-1结构域之间的同源性，从而确认了βig-h3中除了H1和H2以外的许多其它保守氨基酸参与细胞粘附的事实。
因此，本发明人试图寻找参与细胞粘附和脱离活性的保守基元，并制备包含它们的肽。结果是，本发明人使用称为细胞粘附分子的βig-h3的第二个和第四个结构域制备了通过与α3β1整合素一起作用来介导细胞粘附和脱离的肽NKDIL、EPDIM和它们的衍生物，并揭示了位于βig-h3第二个和第四个结构域中H2区域附近的两个非常保守的氨基酸，天冬氨酸(Asp)和异亮氨酸(Ile)是细胞粘附和脱离所必需的氨基酸，并申请了专利(韩国专利申请#2000-25665)。
今天，尚无βig-h3直接涉及疾病的报导，但是βig-h3似乎涉及一些人类癌症。尚未能够解释βig-h3表达与肾病、肝病、类风湿性关节炎和心血管疾病发展的关联，同样尚未报导通过测量体液中βig-h3蛋白质的量即利用βig-h3蛋白质诊断疾病的可能性。
由此，本发明人开发了使用通过将许多βig-h3或βig-h3的第四个fas-1结构域连接起来而制备的重组蛋白作为标准蛋白而测量βig-h3的量的方法，以及使用其的试剂盒。本发明人证实本发明的方法和试剂盒能够有效的作为灵敏诊断方法，用于诊断肾病、肝病、类风湿性关节炎或心血管疾病的损伤或发展程度，从而完成了本发明。
发明概述本发明的一个目标是提供使用βig-h3蛋白质或包含βig-h3的fas-1结构域的重组蛋白来测量βig-h3蛋白质的量的方法，以及使用其的诊断试剂盒。
附图简述

图1是显示βig-h3重组蛋白的结构的图，I、II、III和IV各个结构域； 和 碱基序列保守区域；Aβig-h3；B人βig-h3；C小鼠βig-h3。
图2是显示通过重复βig-h3 IV结构域制备的βig-h3 D-IV重组蛋白的几何结构的图，Aβig-h3；Bβig-h3 D-IV(1x)；Cβig-h3 D-IV(2x)；Dβig-h3 D-IV(3x)Eβig-h3 D-IV(4x)。
图3是分离的βig-h3重组蛋白的电泳照片，1人βig-h3；2小鼠βig-h3。
图4是βig-h3 D-IV(1x、2x、3x、4x)蛋白质的电泳照片，1βig-h3 D-IV(1x)；2βig-h3 D-IV(2x)；3βig-h3 D-IV(3x)；4βig-h3 D-IV(4x)。
图5是显示使用一抗的Western印迹的结果的照片，由此确认了人βig-h3和小鼠βig-h3，
1人βig-h3； 2小鼠βig-h3。
图6是显示酶联免疫吸收测定法(ELISA)的原理的图。
图7是显示一抗的数量比率的图表，◆1∶200； ■1∶400； ▲1∶800；×1∶1600；※1∶2000；●1∶3200。
图8是显示二抗的数量比率的图表，A将一抗固定在1∶1600，B将一抗固定在1∶2000，◆将二抗稀释至1∶1000，■将二抗稀释至1∶2000，●将二抗稀释至1∶3000。
图9是显示人βig-h3蛋白质的包被浓度的图表，◆0.5μg/ml； ■1.0μg/ml。
图10是显示人βig-h3蛋白质和小鼠βig-h3蛋白质都可用作标准蛋白的图表，这通过交叉测试得到了证实，◆人βig-h3蛋白质包被浓度0.5μg/ml，抗人βig-h3一抗1∶2000，二抗1∶2000，■人βig-h3蛋白质包被浓度0.5μg/ml，抗小鼠βig-h3一抗1∶2000，二抗1∶2000，▲小鼠βig-h3蛋白质包被浓度0.5μg/ml，抗人βig-h3一抗1∶2000，二抗1∶2000，×小鼠βig-h3蛋白质包被浓度0.5μg/ml，抗小鼠βig-h3一抗1∶2000，二抗1∶2000。
图11是显示重组βig-h3 D-IV(1x)蛋白质和重组βig-h3 D-IV(4x)蛋白质可以用作标准蛋白的图表，这通过交叉测试得到了证实，A的◆βig-h3 D-IV(1x)包被浓度0.5μg/ml，抗人βig-h3一抗1∶2000，二抗1∶2000，A的■βig-h3 D-IV(4x)包被浓度0.5μg/ml，抗人βig-h3一抗1∶2000，二抗1∶2000，B的◆βig-h3 D-IV(1x)包被浓度0.5μg/ml，抗小鼠βig-h3一抗1∶2000，二抗1∶2000，B的■βig-h3 D-IV(4x)包被浓度0.5μg/ml，抗小鼠βig-h3一抗1∶2000，二抗1∶2000。
图12是显示肾组织中的βig-h3表达模式的免疫组织化学染色照片，A的S3近侧肾小管细胞基底膜的表达模式，B的肾小球Bowman氏囊基底膜的表达模式，B的→皮质厚升支细胞(cortical thick ascending limb cell)基底膜的表达模式。
图13是显示诱发糖尿病大鼠尿液中的βig-h3水平的图表，■对照组，□通过链佐星(streptozotocin)处理诱发糖尿病的大鼠。
图14是显示图13中诱发糖尿病大鼠的尿液中的βig-h3个体水平。
图15是显示由每个正常大鼠、肾单位剂量不足大鼠、慢性排斥大鼠、复发性GN大鼠和显示CyA毒性的大鼠获得的尿液中的βig-h3水平的图表。
图16的图表显示了由于在肾移植后再次形成病灶性部分肾小球硬化症(focal segmental glomerulosclerosis)(FSGS)而接受了血浆取出法处理的患者的每日尿样测量得到的不同βig-h3蛋白质浓度。
图17的图表显示了活着的供体、死去的供体、剂量不足和排斥患者在肾移植之前和之后的尿液中测量得到的βig-h3蛋白质浓度。
图18是显示诱发糖尿病小鼠损伤血管中的βig-h3蛋白质表达模式的免疫组织化学染色照片，A正常血管，B损伤血管，L内腔。
图19的图表显示了血管平滑肌细胞培养物中的βig-h3蛋白质表达模式，*p＜0.05；**p＜0.01。
发明详述为了实现上述目标，本发明提供了用于测量βig-h3蛋白质的量的方法。
本发明还提供了使用其且用于肾病、肝病、类风湿性关节炎或心血管疾病的诊断试剂盒。
本发明的其它特征将在下文中出现。
本发明用于测量βig-h3的量的方法包括一下步骤1)制备βig-h3蛋白质或包含βig-h3 fas-1结构域的重组蛋白、其片段或衍生物；2)制备针对上文步骤1的上述重组蛋白、其片段或衍生物的特异配体；和3)通过使用上文步骤2的配体与上文步骤1的重组蛋白、其片段或衍生物的结合反应的方法来测量样品中βig-h3蛋白质的量。
在步骤1中，βig-h3蛋白质或是具有SEQ.ID.No 3所示氨基酸序列的人βig-h3蛋白质或是具有SEQ.ID.No 5所示氨基酸序列的小鼠βig-h3蛋白质。图1显示了人和小鼠βig-h3蛋白质的结构元件。图1中的斜线阴影区和交叉线阴影区显示重复的fas-1结构域I、II、III和IV的非常保守的序列，而空白区表示RGD基元。
βig-h3蛋白质含有4个fas-1结构域。对于上文步骤1的βig-h3fas-1结构域，优选选择βig-h3蛋白质第一个至第四个fas-1结构域中的一个或超过两个，更优选使用第四个fas-1结构域。第四个fas-1结构域可以独立使用，或者作为许多fas-1结构域重复连接的重组蛋白。对于重组蛋白，需要联合1-10个fas-1结构域，更优选使用1-4个fas-1结构域。在本发明的优选实施方案中，本发明人提供了只使用第四个fas-1结构域和分别通过连接2个、3个和4个βig-h3第四个结构域制备的重组蛋白的实例。
本发明人制备了由SEQ.ID.No 7、No 8、No 9和No 10每个所示的蛋白质，它们分别具有1个、2个、3个和4个包含βig-h3第502-632位氨基酸的第四个fas-1结构域，并将它们命名为“βig-h3 D-IV(1x)”、“βig-h3 D-IV(2x)”、“βig-h3 D-IV(3x)”和“βig-h3 D-IV(4x)”(见图4)。
βig-h3蛋白质中与配体发生特异结合反应的部位即表位和蛋白质中包含蛋白酶水解的肽的任何其它部分都可作为重组蛋白的片段。可以通过包括磷酸化或糖基化在内的共价键以及包括离子键、配位键、氢键、疏水键或范德华键在内的非共价键来制备本发明重组蛋白的衍生物。如果上述重组蛋白衍生物的片段能够与配体特异结合，那么它们也将包括在本发明蛋白质的范围之内。
为了制备本发明的标准蛋白，可以通过常规方法来进行表达载体的构建和转化。
在步骤2中，可以通过观察配体与步骤1的蛋白质或重组蛋白的结合反应来确认特异结合βig-h3、βig-h3 fas-1结构域、其片段或衍生物的配体。配体有许多种类，诸如抗体、RNA、DNA、包括脂类、蛋白质或有机盐的有机化合物、或包括金属离子或无机盐的无机化合物，优选的配体是使用步骤1的蛋白质或重组蛋白(包括片段或衍生物)作为抗原制备的步骤2中针对βig-h3或βig-h3 fas-1结构域的一抗。可以通过常规方法来制备一抗，而且可以使用单克隆抗体或多克隆抗体。
在步骤3中，通过配体与βig-h3蛋白质、它的片段或衍生物的特异结合反应来测量样品中所包含的βig-h3蛋白质的量。在发生配体结合反应的部位，甚至可以使用那些片段或衍生物的片段。优选使用采用抗原-抗体结合反应的定量测定法，所述结合反应中以βig-h3蛋白质作为抗原。更优选的是由下组选择一种方法免疫印迹(Current Protocols inMolecular Biology，第2卷，第10.8章；David等，Cells，(a LaboratoryManual)，第1卷，第73章)、免疫沉淀(Current Protocols in MolecularBiology，第2卷，第10.16章；Cells(a Laboratory Manual)，第1卷，第72章)、ELISA(Current Protocols in Molecular Biology，第2卷，第11.2章；ELISA Theory and Practice，John R.Crowther；The ELISAGuidebook，John R.Crowther)、RIA(放射免疫测定法)(Nuklearmedizin，1986年8月，25(4)125-127，Tumor markers as target substancesin the radioimmunologic detection of malignancies。von Kleist S；Mariani G.Ann Oncol，1999，10增刊437-40)、蛋白质芯片(DanielFigeys等人，Electrophoresis，2001，22，208-216；Albala JS.，ExpertRev Mol Diagn，2001年7月，1(2)145-152)、快速测定法(KasaharaY和Ashihara Y，Clinical Chimica Acta，267，1997，87-102；韩国专利申请#2000-46639)或微阵列(Vivian G.Cheung等人，NatureGenetics，1999，21，15-19；Robert J.Lipshutz等人，Nature Genetics，1999，21，20-24；Christine Debouck和Peter N.Goodfellow，NatureGenetics，1999，21，48-50；DNA Microarrays，M.Schena)，而且ELISA是最优选的方法。还有可能使用生物学微芯片和自动化微阵系统以及ELISA进行大规模样品分析，而且可以由此开发出使用尿液的简单的自我诊断方法。
依照本发明的优选实施方案，使用ELISA通过竞争测定法测量βig-h3蛋白质的量的方法包括以下步骤1)用βig-h3蛋白质或包含βig-h3 fas-1结构域的重组蛋白、它的片段或衍生物包被基质；2)使针对上文步骤1的蛋白质、它的片段或衍生物的抗体与样品反应；3)将上文步骤2的反应物加到步骤1的包被蛋白质上，并等待反应进行，然后对其进行清洗；和4)将二抗加到上文步骤3的反应物上，进行进一步的反应，然后测量OD。
所有种类的常用基质都可用作上文步骤1的基质，尤其是硝酸纤维素膜、聚乙烯板(例如96孔板)、聚苯乙烯板和载玻片可以用作基质。
用显色酶、荧光物质、发光物质、放射性同位素或金属螯合物标记上文步骤4的二抗。每一种常用标记物都可用于本发明，而且过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-D-半乳糖苷酶、苹果酸脱氢酶、葡萄球菌核酸酶、辣根过氧化物酶、触酶(catalse)和乙酰胆碱酯酶是优选的显色酶。对于荧光物质，优选使用异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiochanate)、藻胆蛋白、若丹明、藻红蛋白、藻蓝蛋白、正邻苯二醛等。
作为显色酶或荧光物质以外的另一种二抗标记物，优选使用发光物质诸如异鲁米诺、光泽精、鲁米诺、吖啶鎓酯(acridiniumester)、imidasol、吖啶盐、荧光素、荧光素酶和水母发光蛋白，或者放射性同位素诸如125I、127I、131I、14C、3H、32P和35S。另外，还可以将小分子半抗原像生物素、二硝基苯基、pyridoxil或荧光胺与抗体缀合。
在步骤4中使用显色酶的情况中，应当使用呈色底物来测量酶的活性，而且能够由二抗所结合的酶显色的每一种物质都可以用作呈色底物。优选使用4-氯-1-萘酚(4CN)、二氨基联苯胺(DAB)、氨基乙基咔唑(AEC)、2，2’-连氮基-二(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)(ABTS)、邻苯二胺(OPD)和四甲基联苯胺(TMB)作为呈色底物。
作为上文步骤2的范例，可以使用患有βig-h3相关疾病患者所有种类的体液。尤其优选患有肾病、肝病、类风湿性关节炎或心血管疾病患者的尿液、血液或滑液。
为了确认本发明用于测量βig-h3蛋白质的量的方法是否是正确的，本发明人使用包含小鼠βig-h3或βig-h3第四个fas-1结构域的重组蛋白作为标准蛋白，并将结果与使用人βig-h3作为标准蛋白获得的结果进行比较。
为了本发明用于测量βig-h3的方法确定人βig-h3蛋白质的最佳包被浓度和抗体的数量比率。抗人βig-h3一抗的最佳数量比率是1∶1600和1∶2000(见图7)，而二抗的最佳数量比率是1∶2000(见图8)。人βig-h3蛋白质的合适浓度是1.0μg/ml和0.5μg/ml，但是更优选0.5μg/ml作为包被浓度(见图9)。
因此，本发明人决定了人βig-h3标准蛋白的最佳包被浓度是0.5μg/ml，而抗人βig-h3一抗和二抗的最佳稀释比率皆为1∶2000。
本发明人还确定了使用小鼠βig-h3、重组βig-h3 D-IV(1x)、βig-h3D-IV(2x)、βig-h3 D-IV(3x)和βig-h3 D-IV(4x)时蛋白质的浓度以及一抗和二抗的数量比率。确切的说，将每种蛋白质的包被浓度都调整至0.5μg/ml，将抗人βig-h3一抗和二抗均稀释至1∶2000，并进行定量测定法。同样，将抗小鼠βig-h3一抗和二抗均稀释至1∶2000，并进行定量测定法。
结果是，所有情况都得到了直线图，说明上述比率是最佳的，而且它们的测量范围在11ng/ml和900ng/ml之间，意味着在此测量范围内没有太大差异(见图11和图12)。
根据上述结果，证实了标准蛋白质可以是人βig-h3、小鼠βig-h3、重组βig-h3 D-IV(1x)、βig-h3 D-TV(2x)、βig-h3 D-IV(3x)和βig-h3 D-IV(4x)中的任一种，而且抗人βig-h3抗体或抗小鼠βig-h3抗体可以用作一抗。
在本发明中，标准蛋白的优选包被浓度是0.1-2.0μg/ml，更优选0.5-1.0μg/ml。一抗和二抗的优选稀释比率是1∶400-1∶3200，更优选1∶2000。
本发明提供了用于肾病、肝病、类风湿性关节炎或心血管疾病的诊断试剂盒，由此可以通过测量患者体液中βig-h3蛋白质的量来诊断疾病。
本发明的诊断试剂盒包含βig-h3蛋白质或βig-h3蛋白质fas-1结构域的重组蛋白(包括其片段或其衍生物)及其配体。此时，作为优选的特异配体，使用针对βig-h3蛋白质或βig-h3 fas-1结构域的抗体。试剂盒可以额外包含缓冲液、二抗、清洗液或呈色底物。
通过测量体液中βig-h3蛋白质的量，本发明的诊断试剂盒可用于诊断多种疾病，诸如肾病、肝病、类风湿性关节炎或心血管疾病。
根据βig-h3表达是由在肾病发展中发挥重要作用的TGF-β所诱导的这一事实，有可能通过测量βig-h3蛋白质的量来诊断肾病。为了证明这一点，测量糖尿病患者尿液中βig-h3的量。结果是，包括微蛋白尿症在内的糖尿病样肾病患者尿液中βig-h3的量比正常人高大约5倍。一些未患肾病的糖尿病患者也显示βig-h3的量比正常的高。根据上述结果，尿液中的βig-h3水平似乎反映了肾脏损伤的程度，而一些未患肾病的糖尿病患者所具有的高水平βig-h3则说明他们的肾早已受到一定程度的损伤，尽管尚未显示任何临床症状。因此，测量患者尿液中βig-h3的量是一种高度灵敏且重要的诊断方法，它能够反映早期的肾脏损伤。
为了确认糖尿病患者尿液中的βig-h3浓度是否能够反映早期的肾脏损伤，测量了糖尿病动物中的βig-h3浓度。结果是，在诱发糖尿病5天后βig-h3浓度升高了4倍(见图13)。观察诱发糖尿病后各个个体中βig-h3浓度的变化，发现诱发糖尿病后导致尿液中的βig-h3浓度大大升高(见图14)。在诱发糖尿病后第5天，血尿和肌酸是正常的，而且肾组织看上去是正常的。由此，在诱发糖尿病第5天尿液中βig-h3量的大大增加说明肾脏早已受到微小损伤，而这是常规测试方法所检测不到的。
本发明人还通过测量肾移植患者在手术之前和之后尿液中βig-h3的量而证实了肾脏损伤与βig-h3浓度之间的关联。结果是，手术前患者的高浓度βig-h3在手术成功后逐渐下降。但是在5号患者的情况中，他的肾功能甚至在手术后也未恢复，βig-h3浓度仍然很高(见图2)。根据所有上述结果，可以肯定βig-h3浓度灵敏的反映了肾脏损伤的程度。
本发明人还测量了肾衰竭患者尿液中的βig-h3浓度。结果是，所有那些肾衰竭患者都显示他们的尿样中有高浓度的βig-h3。由此，再次证实了尿液中βig-h3的量灵敏的反映了甚至早期的肾脏损伤，因而测量βig-h3的量对于多种肾病而言是非常重要的诊断方法(见表3)。
确定慢性肝炎患者是否会发展成肝硬化患者是非常重要的，但是至今尚无办法。形成肝硬化最最重要的因素是TGF-β。因此，由TGF-β诱导表达的βig-h3在血液中的浓度可能随着肝硬化的发展而升高。如果是这样，那么βig-h3的量也能够反映肝硬化的程度。事实上，通过对肝炎患者肝组织的免疫组织学测试证实了βig-h3表达随着肝硬化的恶化而增强。本发明人根据慢性肝炎患者的活组织检查结果将患者的状况细分成几个等级和阶段，并调查了各个阶段和等级的血液βig-h3浓度。慢性肝炎患者显示血液βig-h3浓度比正常人高。较低阶段和等级的βig-h3浓度证实比较高阶段和等级高(见表5)。第3等级和第3阶段患者的状况是已经形成了严重的肝硬化，而且它的活性早已经过峰值。同时，第1和2等级以及第1和2阶段的患者显示炎症反应发展非常活跃的状况。由此，βig-h3浓度意味着肝硬化活性，因而可以通过定期测量血液βig-h3浓度来观察肝硬化的发展。
还测量了类风湿性关节炎患者和骨关节炎患者滑液中的βig-h3浓度。结果是，在类风湿性关节炎患者的滑液中观察到高2倍的βig-h3浓度，说明测量滑液中的βig-h3浓度可能是诊断骨关节炎和类风湿性关节炎的有效方法(见表6)。
另外，通过免疫组织化学方法调查了糖尿病小鼠正常和损伤血管中的βig-h3表达模式，从而证实了βig-h3表达与心血管疾病之间的关联。结果是，βig-h3蛋白质在糖尿病小鼠损伤血管中的表达大大高于正常血管(见图18)。根据βig-h3表达是由在血管病发展中发挥重要作用的TGF-β所诱导的这一事实，调查了形成血管的血管平滑肌细胞中由TGF-β诱导的βig-h3表达。结果是，证实了βig-h3表达随着TGF-β1的量的增加而增加(见图19)。
血液和组织中的βig-h3表达反映了它们的损伤。由此，证实了本发明用于测量βig-h3蛋白质的量的方法能够有效用于多种血管病的诊断。
因此，本发明测量βig-h3蛋白质的量的诊断试剂盒在使用中非常有效，因为它反映了肾病、肝病、类风湿性关节炎或心血管疾病的损伤和发展程度。
实施例下面的实施例举例说明了本发明的实践和当前优选实施方案。
然而，应当理解的是，本领域熟练技术人员在考虑了本公开内容后，可以在本发明的精神和范围内进行修改和改进。
实施例1标准蛋白和一抗的制备<1-1>人βig-h3和小鼠βig-h3的分离本发明人已制备了人和小鼠βig-h3蛋白质。图1显示了人和小鼠βig-h3蛋白质的结构元件。图1中的斜线阴影区和交叉线阴影区显示重复的fas-1结构域I、II、III和IV中非常保守的序列，而空白区表示RGD基元。
用Nde I和BglII消化具有克隆到pBluescript SK(-)载体中由SEQ.ID.No 2所示碱基序列的βig-h3 cDNA(pBS βig-h3；通过克隆人皮肤乳头瘤细胞的cDNA得到的)，从而制备了具有平末端的DNA片段。将上述DNA片段亚克隆到pET-29β载体(购自Novagen)的EcoRV和EcoRI位点中。分离具有SEQ.ID.No 3所示βig-h3第69-653位氨基酸的氨基酸序列的蛋白质，并命名为人βig-h3。
接着，用NamHI和Xho I消化βig-h3 cDNA，从而制备了具有SEQ.ID.No 4所示碱基序列的DNA片段。将上述DNA片段亚克隆到pET-29β载体的BamHI和Xho I位点中。分离具有SEQ.ID.No 5所示βig-h3第23-641位氨基酸的氨基酸序列的蛋白质，并命名为小鼠βig-h3。
为了表达上述人和小鼠βig-h3蛋白质，转化大肠杆菌BL21(DE3)细胞。将转化子在含卡那霉素(50g/ml)的LB培养基中于37℃培养至它们的OD595达到0.5-0.6。在培养过程中，通过使用1mM异丙基-β-D-(-)-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG)于37℃处理3小时来诱导βig-h3蛋白质的表达。
将大肠杆菌细胞沉淀重悬于细胞裂解缓冲液(50mM Tris-HCl pH8.0、100mM NaCl、1mM EDTA、1％Triton X-100、1mM甲苯磺酰氟化物(下文称为“PMSF”)和0.5mM DTT)，然后通过超声处理进行破碎。将该流程重复5次。
将上述溶液离心，并将含有βig-h3的不溶性内含体溶于含0.5MNaCl、5mM咪唑和8M尿素的20mM Tris-HCl缓冲液中。使用Ni-NTA树脂(Qiagen)纯化蛋白质。为了纯化，将蛋白质接连在尿素浓度由高至低的含50mM NaCl的20mM Tris-HCl缓冲液中透析，并通过SDS-PAGE确认结果。
结果是，证实了本发明的人βig-h3和小鼠βig-h3蛋白质得到了纯化(图2)。
<1-2>βig-h3 D-IV(1x)和βig-h3 D-IV(4x)的构建和分离通过PCR扩增SEQ.ID.No 6所示DNA片段，该片段编码第四个结构域，该结构域对应于SEQ.ID.No 1所示人βig-h3的第498-637位氨基酸。将PCR产物克隆到pET-29β载体中以构建第四个结构域的表达载体。本发明人将第四个结构域的表达载体命名为“βig-h3 D-IV”。
通过PCR合成对应于第四个结构域的碱基序列，并使用Klenow片段将PCR产物的3’末端补平。将该PCR产物插入上述表达载体pβig-h3 D-IV的EcoRV位点，并命名为pβig-h3 D-IV(2x)。用EcoR V和Xho I消化pβig-h3 D-IV(2x)的插入片段，并使用Klenow片段将片段的3’末端补平。将该片段插入pβig-h3 D-IV的EcoRV位点，并命名为pβig-h3 D-IV(3x)。同样，将具有补平的3’末端的片段插入pβig-h3 D-IV(2x)的EcoR V位点，并命名为pβig-h3 D-IV(4x)(图3)。通过将6个组氨酸残基连接到DNA片段的羧基末端而制备了His标签，从而能够用Ni-NTA树脂(Qiagen)纯化蛋白质。
用表达载体转化大肠杆菌BL21(DE3)细胞。将转化子在含卡那霉素(50μg/ml)的LB培养基中进行培养。将大肠杆菌细胞沉淀重悬于细胞裂解缓冲液(50mM Tris-HCl pH8.0、100mM NaCl、1mM EDTA、1％TritonX-100、1mM甲苯磺酰氟化物(下文称为“PMSF”)和0.5mM DTT)，然后通过超声处理进行破碎。将该流程重复5次。将上述溶液离心以获得上清液。使用Ni-NTA树脂(Qiagen)由上清液纯化蛋白质，并通过SDS-PAGE确认。
结果是，证实了具有SEQ.ID.No 7所示氨基酸序列的βig-h3 D-IV(1x)、具有SEQ.ID.No 8所示氨基酸序列的βig-h3 D-IV(2x)、具有SEQ.ID.No 9所示氨基酸序列的βig-h3 D-IV(3x)、和具有SEQ.ID.No10所示氨基酸序列的βig-h3 D-IV(4x)，这些蛋白质都得到了表达。所有上述蛋白质都包含人βig-h3的第四个结构域(图4)。
<1-3>一抗的制备和分离使用实施例<1-1>中分离的人βig-h3和小鼠βig-h3蛋白质作为抗原来制备一抗。将蛋白质皮下注射到兔的背部。对于第一次注射，将200μg蛋白质与弗氏完全佐剂混合，然后注射。对于第2次至第5次注射，将100μg蛋白质与弗氏不完全佐剂混合，然后间隔3周注射。收集静脉血，并于室温放置2小时。离心(10,000xg，10分钟)后，获得含有一抗的上清液。将上清液保存于-20℃以待进一步使用(图5)。
实施例2人βig-h3蛋白质的包被浓度和抗体的数量比率的确定<2-1>一抗的数量比率的确定为了确定抗人βig-h3蛋白质一抗的数量比率，用20mM碳酸盐-碳酸氢盐溶液(pH9.6，含0.02％叠氮化钠)稀释人βig-h3(0.5μg/ml)。将βig-h3溶液加到96孔板的各个孔中(200μl/孔)，并于4℃包被过夜。用稀释液(盐水-磷酸盐缓冲液/吐温80)将抗人βig-h3一抗梯度稀释至1∶200、1∶400、1∶800、1∶1600、1∶2000和1∶3200，并加到经过包被的96孔板中。将二抗(1∶5000)也加到其中，并于室温反应1.5小时。将底物溶液(如下制备将邻苯二胺溶于甲醇(10mg/ml)，用蒸馏水稀释至1∶100，并与10μl 30％过氧化氢溶液混合)也加到其中，并于室温反应1小时。加入50μl 8N硫酸溶液终止反应，并进行ELISA(O.D 492nm)。
结果是，证实了抗人βig-h3一抗的最佳数量比率是1∶1600和1∶2000(图7)。
<2-2>二抗的数量比率的确定为了确定二抗的数量比率，用人βig-h3蛋白质(0.5μg/ml)包被平板。将抗人βig-h3一抗加到其中(1∶1600和1∶2000)。加入二抗(分别为1∶1000、1∶2000和1∶3000)并进行反应。使用与上文实施例<2-1>相同的方法进行ELISA。
结果是，证实了二抗的最佳数量比率是1∶2000(图8)。
<2-3>人βig-h3蛋白质的包被浓度的确定为了确定人βig-h3蛋白质的包被浓度，将抗人βig-h3一抗稀释至1∶2000，将二抗稀释至1∶2000，用人βig-h3蛋白质(分别为0.5μg/ml和1.0μg/ml)包被平板，然后进行ELISA。
结果是，证实了1.0μg/ml和0.5μg/ml都是人βig-h3蛋白质的合适浓度，但是0.5μg/ml作为包被浓度来说是更优选的，因为该浓度下R2值最接近1(图9)。
根据上述结果，本发明人决定了人βig-h3标准蛋白的最佳包被浓度是0.5μg/ml，而抗人βig-h3一抗和二抗的最佳稀释比率皆为1∶2000。
通过由下文<数学公式1>表述的Robard公式(Robard，1971)，将由上述结果获得的数值进行log转化。结果是，由11ng/ml至900ng/ml形成一条线，这是测量的可能范围。还证实了甚至10ng/ml的范围在上述反应条件下仍有可能进行测量(图10)。
<数学公式1>
log b＝log eb/(100-b)在上文公式中，b表示相对于各个浓度的不含任何抗原的孔的OD的百分比。
实施例3通过交叉测试测量小鼠βig-h3、重组βig-h3 D-IV(1x)和βig-h3 D-IV(4x)的数量范围本发明人还使用小鼠βig-h3、重组βig-h3 D-IV(1x)和βig-h3 D-IV(4x)确定了蛋白质的浓度以及一抗和二抗的数量比率。具体而言，就是确定了实验中各种蛋白质的包被浓度均为0.5μg/ml，而且抗人βig-h3一抗和二抗的数量比率均为1∶2000。将抗小鼠βig-h3一抗和二抗的数量比率也均调整为1∶2000。
结果是，所有情况都得到了直线图，说明上述比率是最佳的，而且它们的范围在11ng/ml和900ng/ml之间，意味着在此测量范围内没有太大差异(图11和图12)。
根据上述结果，证实了标准蛋白质可以是人βig-h3、小鼠βig-h3、重组βig-h3 D-IV(1x)和βig-h3 D-IV(4x)中的任一种，而抗人βig-h3抗体或抗小鼠βig-h3抗体可以用作一抗。
实施例4肾病与βig-h3表达之间的关联<4-1>测量糖尿病患者中的βig-h3根据βig-h3表达是由在肾病发展中发挥重要作用的TGF-β所诱导的这一事实，本发明人已证实了肾病与βig-h3表达之间的关联。为了证明这一点，测量糖尿病患者尿液中βig-h3的量。具体而言，就是将110μl糖尿病患者的尿液与110μl一抗(1∶1000)在圆底平板中混合，并于37℃保温1小时。将200μl上述混合物添加到经βig-h3包被的平板上，并于室温反应30分钟。加入二抗-底物终止液终止反应，并进行ELISA(O.D492nm)。
<表1>
糖尿病患者尿液中的βig-h3浓度
结果是，包括微蛋白尿的糖尿病样肾病患者尿液中βig-h3的量比正常人高大约5倍。一些未患肾病的糖尿病患者也显示βig-h3的量比正常的高。根据上述结果，尿液中的βig-h3水平似乎反映了肾脏损伤的程度，而一些未患肾病的糖尿病患者所具有的高水平βig-h3则说明他们的肾早已受到一定程度的损伤，尽管尚未显示任何临床症状。因此，测量患者尿液中βig-h3的量是一种高度灵敏且重要的诊断方法，它能够反映早期的肾脏损伤。
<4-2>测量糖尿病动物模型中的βig-h3为了确认糖尿病患者尿液中的βig-h3浓度是否能够反映早期的肾脏损伤，本发明人测量了糖尿病动物中βig-h3的量。
通过将一种诱发糖尿病的药物链佐星(60mg/kg)注射到大鼠的腹膜腔内，在Sprague-Dawley(SD)大鼠中诱发了糖尿病。通过测量大鼠的血糖而确认诱发了糖尿病。在诱发糖尿病后第5天由大鼠采集尿样，并使用与实施例<4-1>相同的方法测量βig-h3的量。
结果是，在诱发糖尿病5天后βig-h3的量增加了4倍(56.9±6.4ng/mg肌酸230.4±131.8ng/mg肌酸，图13)。观察诱发糖尿病后各个个体中βig-h3量的变化，发现诱发糖尿病后导致尿液中βig-h3的量大大增加(图14)。在诱发糖尿病后第5天，血尿和肌酸是正常的，而且肾组织看上去是正常的。因此，在诱发糖尿病第5天尿液中βig-h3量的大大增加说明肾脏早已受到微小损伤，而这是常规方法所检测不到的。
<4-3>测量肾移植患者中的βig-h3本发明人通过测量患者在肾移植之前和之后尿液中βig-h3的量而证实了肾脏损伤与βig-h3的量之间的关联。结果见表2。
<表2>
患者在肾移植之前和之后βig-h3浓度的变化
结果是，手术前患者的高βig-h3量在手术成功后逐渐下降。但是在5号患者的情况中，他的肾功能甚至在肾移植之后也未恢复，βig-h3的量仍然很高。根据所有上述结果，可以肯定βig-h3的量灵敏的反映了肾脏损伤的程度。
<4-4>测量肾衰竭患者中的βig-h3本发明人测量了肾衰竭患者尿液中βig-h3的量。结果是，所有那些患者都显示他们的尿样中有大量的βig-h3(表3)。
<表3>
肾衰竭患者尿液中的βig-h3浓度
<4-5>测量肾相关疾病患者中的βig-h3为了调查肾病患者中βig-h3的表达是否不同，本发明人使用与实施例<4-1>相同的方法测量了由肾移植后显示正常症状的患者、所移植的肾脏较小的患者、显示慢性排斥的患者、肾盂炎复发的患者和具有cyclosphorine毒性的患者采集的尿液中的βig-h3浓度。
结果是，肾移植后症状正常的患者显示βig-h3浓度平均为34.9ng/mg肌酸，而有慢性排斥、复发性肾盂炎和cyclosphorine毒性的患者都显示βig-h3浓度大大增加(分别为140.8、175.4和90.9ng/mg肌酸)(图15，表4)。
<表4>
本发明人还调查了复发肾病患者中升高的βig-h3浓度在治疗生效时是否再次下降。结果，通过血浆交换来治疗肾移植后复发性肾盂炎的患者的尿液βig-h3浓度逐渐降低，说明尿液βig-h3浓度在治疗生效时下降。因此，βig-h3浓度可以用作治疗反应的标志(图16)。
<4-6>分析肾移植对βig-h3浓度的影响为了调查肾移植后尿液βig-h3浓度的变化，本发明人测量了接受肾移植患者每天的尿液βig-h3浓度。
结果是，不管肾是来自活着的人还是脑死亡的人，成功接受肾移植的患者的尿液βig-h3浓度都逐渐下降。确切的说，对于接受来自活着的人的肾，尿液βig-h3浓度在移植后4-5天内恢复到正常水平，而对于接受来自脑死亡的人的肾，βig-h3浓度在6-7天内恢复到正常水平(图17)。
此外，对于接受小肾的患者，尿液βig-h3浓度在移植后恢复到正常水平，尽管他们的血液肌酸值仍然偏高，说明移植的肾工作正常，尽管它因尺寸较小而不能将废弃产物彻底过滤掉。无论如何，反映肾脏损伤程度的βig-h3浓度恢复到了正常水平(图17)。同时，肾移植不成功的患者的尿液βig-h3浓度则波动很大。
根据这些结果，尿液βig-h3浓度可以作为早期肾病诊断的有效标志，用于检测肾病的发展和用于确定治疗效果，因为βig-h3浓度很好的反映了肾脏损伤。
因此，本发明人证实了尿液βig-h3浓度灵敏的反映了早期的肾脏损伤，而且对于诊断多种肾病而言是重要且有用的。
实施例5肝病与βig-h3表达之间的关联确定慢性肝炎患者是否会发展成肝硬化患者是非常重要的，但是至今尚无办法。形成肝硬化最最重要的因素是TGF-β。因此，由TGF-β诱导表达的βig-h3在血液中的浓度可能随着肝硬化的发展而升高。如果是这样，那么βig-h3的量也能够反映肝硬化的程度。事实上，通过对肝炎患者肝组织的免疫组织学测试证实了βig-h3表达随着肝硬化的恶化而增强。本发明人根据慢性肝炎患者的活组织检查结果将患者的状况细分成几个等级和阶段，并调查了各个阶段和等级的血液βig-h3浓度。具体而言，本发明人由慢性肝炎患者采集了血液，并使用与实施例<4-1>相同的方法测量了βig-h3的量。结果见表5。
<表5>慢性肝炎患者血液中βig-h3的浓度
结果是，慢性肝炎患者显示血液βig-h3浓度比正常人高，而且较低阶段和等级(1和2)的βig-h3浓度证实比较高阶段和等级(3)高。第3等级和第3阶段患者的状况是已经形成了严重的肝硬化，而且它的活性早已经过峰值。同时，第1和2等级以及第1和2阶段的患者显示炎症反应发展非常活跃的状况。因此，βig-h3浓度意味着肝硬化活性，因而可以通过定期测量血液βig-h3浓度来观察肝硬化的发展。
实施例6类风湿性关节炎与βig-h3表达之间的关联使用与实施例<4-1>相同的方法，本发明人通过测量骨关节炎和类风湿性关节炎患者滑液中βig-h3的量证实了类风湿性关节炎与βig-h3表达之间的关联(表6)。
<表6>
滑液中的βig-h3浓度
结果是，在类风湿性关节炎患者的滑液中观察到高2倍的βig-h3浓度，说明测量滑液中的βig-h3浓度可能是诊断骨关节炎和类风湿性关节炎的有效方法。
实施例7心血管疾病与βig-h3表达之间的关联<7-1>测量诱发糖尿病小鼠的损伤血管中的βig-h3本发明人通过免疫组织化学方法调查了糖尿病小鼠正常和损伤血管中的βig-h3表达模式，从而证实了βig-h3表达与心血管疾病之间的关联。
结果是，βig-h3蛋白质在糖尿病小鼠损伤血管中的表达大大高于正常血管(图18)。
<7-2>测量血管平滑肌细胞中由TGF-β诱导的βig-h3表达根据βig-h3表达是由在血管病发展中发挥重要作用的TGF-β所诱导的这一事实，本发明人试图确认βig-h3表达与心血管疾病之间的关联。具体而言，本发明人使用与实施例<4-1>相同的方法测量了形成血管的血管平滑肌细胞中由TGF-β1诱导的βig-h3表达模式。
结果是，证实了βig-h3表达随着TGF-β1的量的增加而增加(图19)。
根据上述结果，证实了血液和组织中的βig-h3表达反映了它们的损伤。因此，本发明用于测量βig-h3蛋白质的量的方法能够有效用于多种心血管疾病的诊断。
工业应用如上所述，本发明用于测量βig-h3蛋白质的量的方法在用于测量各种体液中的βig-h3浓度时花费不多且非常精确，在本发明方法中使用人βig-h3、小鼠βig-h3、βig-h3 D-IV(1x)或βig-h3 D-IV(4x)作为标准蛋白。βig-h3的量灵敏的反映了早期的TGF-β相关疾病，诸如肾病、肝病、类风湿性关节炎和心血管疾病，使得本发明的方法能够有效的用于检查那些疾病的损伤和发展及其诊断。
序列表<110>再生生命工学会社<120>用于测量βig-h3蛋白质的量的方法及使用其的诊断试剂盒<130>2fpo-10-14<160>10<170>KopatentIn 1.71<210>1<211>683<212>PRT<213>人<400>1Met Ala Leu Phe Val Arg Leu Leu Ala Leu Ala Leu Ala Leu Ala Leu15 10 15Gly Pro Ala Ala Thr Leu Ala Gly Pro Ala Lys Ser Pro Tyr Gln Leu20 25 30Val Leu Gln His Ser Arg Leu Arg Gly Arg Gln His Gly Pro Asn Val354045Cys Ala Val Gln Lys Val Ile Gly Thr Asn Arg Lys Tyr Phe Thr Asn50 5560Cys Lys Gln Trp Tyr Gln Arg Lys Ile Cys Gly Lys Ser Thr Val Ile657075 80Ser Tyr Glu Cys Cys Pro Gly Tyr Glu Lys Val Pro Gly Glu Lys Gly85 90 95Cys Pro Ala Ala Leu Pro Leu Ser Asn Leu Tyr Glu Thr Leu Gly Val100 105 110Val Gly Ser Thr Thr Thr Gln Leu Tyr Thr Asp Arg Thr Glu Lys Leu115 120 125Arg Pro Glu Met Glu Gly Pro Gly Ser Phe Thr Ile Phe Ala Pro Ser130 135 140Asn Glu Ala Trp Ala Ser Leu Pro Ala Glu Val Leu Asp Ser Leu Val
145 150 155 160Ser Asn Val Asn Ile Glu Leu Leu Asn Ala Leu Arg Tyr His Met Val165 170 175Gly Arg Arg Val Leu Thr Asp Glu Leu Lys His Gly Met Thr Leu Thr180 185 190Ser Met Tyr Gln Asn Ser Asn Ile Gln Ile His His Tyr Pro Asn Gly195 200 205Ile Val Thr Val Asn Cys Ala Arg Leu Leu Lys Ala Asp His His Ala210 215 220Thr Asn Gly Val Val His Leu Ile Asp Lys Val Ile Ser Thr Ile Thr225 230 235 240Asn Asn Ile Gln Gln Ile Ile Glu Ile Glu Asp Thr Phe Glu Thr Leu245 250 255Arg Ala Ala Val Ala Ala Ser Gly Leu Asn Thr Met Leu Glu Gly Asn260 265270Gly Gln Tyr Thr Leu Leu Ala Pro Thr Asn Glu Ala Phe Glu Lys Ile275 280285Pro Ser Glu Thr Leu Asn Arg Ile Leu Gly Asp Pro Glu Ala Leu Arg290 295300Asp Leu Leu Asn Asn His Ile Leu Lys Ser Ala Met Cys Ala Glu Ala305 310 315 320Ile Val Ala Gly Leu Ser Val Glu Thr Leu Glu Gly Thr Thr Leu Glu325 330 335Val Gly Cys Ser Gly Asp Met Leu Thr Ile Asn Gly Lys Ala Ile Ile340 345 350Ser Asn Lys Asp Ile Leu Ala Thr Asn Gly Val Ile His Tyr Ile Asp355 360 365Glu Leu Leu Ile Pro Asp Ser Ala Lys Thr Leu Phe Glu Leu Ala Ala370 375 380Glu Ser Asp Val Ser Thr Ala Ile Asp Leu Phe Arg Gln Ala Gly Leu385 390 395 400
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<221>肽<222>(1)..(585)<223>人ID No.1的69-653氨基酸序列<400>3Tyr Gln Arg Lys Ile Cys Gly Lys Ser Thr Val Ile Ser Tyr Glu Cys1 5 10 15Cys Pro Gly Tyr Glu Lys Val Pro Gly Glu Lys Gly Cys Pro Ala Ala20 25 30Leu Pro Leu Ser Asn Leu Tyr Glu Thr Leu Gly Val Val Gly Ser Thr3540 45Thr Thr Gln Leu Tyr Thr Asp Arg Thr Glu Lys Leu Arg Pro Glu Met50 5560Glu Gly Pro Gly Ser Phe Thr Ile Phe Ala Pro Ser Asn Glu Ala Trp65 70 7580Ala Ser Leu Pro Ala Glu Val Leu Asp Ser Leu Val Ser Asn Val Asn85 9095Ile Glu Leu Leu Asn Ala Leu Arg Tyr His Met Val Gly Arg Arg Val100 105 110Leu Thr Asp Glu Leu Lys His Gly Met Thr Leu Thr Ser Met Tyr Gln115 120 125
Asn Ser Asn Ile Gln Ile His His Tyr Pro Asn Gly Ile Val Thr Val130 135 140Asn Cys Ala Arg Leu Leu Lys Ala Asp His His Ala Thr Asn Gly Val145 150 155 160Val His Leu Ile Asp Lys Val Ile Ser Thr Ile Thr Asn Asn Ile Gln165 170 175Gln Ile Ile Glu Ile Glu Asp Thr Phe Glu Thr Leu Arg Ala Ala Val180 185 190Ala Ala Ser Gly Leu Asn Thr Met Leu Glu Gly Asn Gly Gln Tyr Thr195 200 205Leu Leu Ala Pro Thr Asn Glu Ala Phe Glu Lys Ile Pro Ser Glu Thr210 215 220Leu Asn Arg Ile Leu Gly Asp Pro Glu Ala Leu Arg Asp Leu Leu Asn225 230 235 240Asn His Ile Leu Lys Ser Ala Met Cys Ala Glu Ala Ile Val Ala Gly245 250 255Leu Ser Val Glu Thr Leu Glu Gly Thr Thr Leu Glu Val GIy Cys Ser260 265 270Gly Asp Met Leu Thr Ile Asn Gly Lys Ala Ile Ile Ser Asn Lys Asp275 280 285Ile Leu Ala Thr Asn Gly Val Ile His Tyr Ile Asp Glu Leu Leu Ile290 295 300Pro Asp Ser Ala Lys Thr Leu Phe Glu Leu Ala Ala Glu Ser Asp Val305 310 315 320Ser Thr Ala Ile Asp Leu Phe Arg Gln Ala Gly Leu Gly Asn His Leu325 330 335Ser Gly Ser Glu Arg Leu Thr Leu Leu Ala Pro Leu Asn Ser Val Phe340 345 350Lys Asp Gly Thr Pro Pro Ile Asp Ala His Thr Arg Asn Leu Leu Arg355 360 365Asn His Ile Ile Lys Asp Gln Leu Ala Ser Lys Tyr Leu Tyr His Gly370 375 380
Gln Thr Leu Glu Thr Leu Gly Gly Lys Lys Leu Arg Val Phe Val Tyr385 390 395 400Arg Asn Ser Leu Cys Ile Glu Asn Ser Cys Ile Ala Ala His Asp Lys405 410 415Arg Gly Arg Tyr Gly Thr Leu Phe Thr Met Asp Arg Val Leu Thr Pro420 425 430Pro Met Gly Thr Val Met Asp Val Leu Lys Gly Asp Asn Arg Phe Ser435 440 445Met Leu Val Ala Ala Ile Gln Ser Ala Gly Leu Thr Glu Thr Leu Asn450 455 460Arg Glu Gly Val Tyr Thr Val Phe Ala Pro Thr Asn Glu Ala Phe Arg465 470 475 480Ala Leu Pro Pro Arg Glu Arg Ser Arg Leu Leu Gly Asp Ala Lys Glu485 490 495Leu Ala Asn Ile Leu Lys Tyr His Ile Gly Asp Glu Ile Leu Val Ser500 505 510Gly Gly Ile Gly Ala Leu Val Arg Leu Lys Ser Leu Gln Gly Asp Lys515 520 525Leu Glu Val Ser Leu Lys Asn Asn Val Val Ser Val Asn Lys Glu Pro530 535 540Val Ala Glu Pro Asp Ile Met Ala Thr Asn Gly Val Val His Val Ile545 550 555 560Thr Asn Val Leu Gln Pro Pro Ala Asn Arg Pro Gln Glu Arg Gly Asp565 570 575Glu Leu Ala Asp Ser Ala Leu Glu Ile580 585<210>4<211>1857<212>DNA<213>小鼠脑池内A-颗粒<400>4
gcaggtcccg ccaagtcacc ctaccagctg gtgctgcagc atagccggct ccggggtcgc 60cagcacggcc ccaatgtatg tgctgtgcag aaggtcattg gcaccaacaa gaaatacttc120accaactgca agcagtggta ccagaggaag atctgcggca agtcgacagt catcagttat180gagtgctgtc ctggatatga aaaggtccca ggagagaaag gttgcccagc agctcttccg240ctctcaaatc tgtatgagac catgggagtt gtgggatcga ccaccacaca gctgtataca300gaccgcacag aaaagctgag gcctgagatg gagggacccg gaagcttcac catctttgct360cctagcaatg aggcctggtc ttccttgcct gcggaagtgc tggactccct ggtgagcaac420gtcaacatcg aactgctcaa tgctctccgc taccacatgg tggacaggcg ggtcctgacc480gatgagctca agcacggcat gaccctcacc tccatgtacc agaattccaa catccagatc540catcactatc ccaatgggat tgtaactgtt aactgtgccc ggctgctgaa ggctgaccac600catgcgacca acggcgtggt gcatctcatt gacaaggtca tttccaccat caccaacaac660atccagcaga tcattgaaat cgaggacacc tttgagacac ttcgggccgc cgtggctgca720tcaggactca ataccgtgct ggagggcgac ggccagttca cactcttggc cccaaccaac780gaggcctttg agaagatccc tgccgagacc ttgaaccgca tcctgggtga cccagaggca840ctgagagacc tgctaaacaa ccacatcctg aagtcagcca tgtgtgctga ggccattgta900gctggaatgt ccatggagac cctggggggc accacactgg aggtgggctg cagtggggac960aagctcacca tcaacgggaa ggctgtcatc tccaacaaag acatcctggc caccaacggt 1020gtcattcatt tcattgatga gctgcttatc ccagattcag ccaagacact gcttgagctg 1080gctggggaat ctgacgtctc cactgccatt gacatcctca aacaagctgg cctcgatact 1140catctctctg ggaaagaaca gttgaccttc ctggcccccc tgaattctgt gttcaaagat 1200ggtgtccctc gcatcgacgc ccagatgaag actttgcttc tgaaccacat ggtcaaagaa 1260cagttggcct ccaagtatct gtactctgga cagacactgg acacgctggg tggcaaaaag 1320ctgcgagtct ttgtttatcg aaatagcctc tgcattgaaa acagctgcat tgctgcccat 1380gataagaggg gacggtttgg gaccctgttc accatggacc ggatgttgac acccccaatg 1440
gggacagtta tggatgtcct gaagggagac aatcgtttta gcatgctggt ggccgccatc 1500cagtctgcag gactcatgga gatcctcaac cgggaagggg tctacactgt ttttgctccc 1560accaatgaag cgttccaagc catgcctcca gaagaactga acaaactctt ggcaaatgcc 1620aaggaactta ccaacatcct gaagtaccac attggtgatg aaatcctggt tagcggaggc 1680atcggggccc tggtgcggct gaagtctctc caaggggaca aactggaagt cagctcgaaa 1740aacaatgtag tgagtgtcaa taaggagcct gttgccgaaa ccgacatcat ggccacaaac 1800ggtgtggtct atgccatcaa cactgttctg cagccgccag ccaaccgacc acaagaa 1857<210>5<211>609<212>PRT<213>小鼠脑池内A-颗粒<220>
<221>肽<222>(1)..(609)<223>小鼠的23-641氨基酸序列<400>5Ala Gly Pro Ala Lys Ser Pro Tyr Gln Leu Val Leu Gln His Ser Arg15 10 15Leu Arg Gly Arg Gln His Gly Pro Asn Val Cys Ala Val Gln Lys Val20 25 30Ile Gly Thr Asn Arg Lys Tyr Phe Thr Asn Cys Lys Gln Trp Tyr Gln3540 45Arg Lys Ile Cys Gly Lys Ser Thr Val Ile Ser Tyr Glu Cys Cys Pro50 5560Gly Tyr Glu Lys Val Pro Gly Glu Lys Gly Cys Pro Ala Ala Leu Pro65 70 7580Leu Ser Asn Leu Tyr Glu Thr Leu Gly Val Val Gly Ser Thr Thr Thr85 9095Gln Leu Tyr Thr Asp Arg Thr Glu Lys Leu Arg Pro Glu Met Glu Gly
100 105 110Pro Gly Ser Phe Thr Ile Phe Ala Pro Ser Asn Glu Ala Trp Ala Ser115 120 125Leu Pro Ala Glu Val Leu Asp Ser Leu Val Ser Asn Val Asn Ile Glu130 135 140Leu Leu Asn Ala Leu Arg Tyr His Met Val Gly Arg Arg Val Leu Thr145 150 155 160Asp Glu Leu Lys His Gly Met Thr Leu Thr Ser Met Tyr Gln Asn Ser165 170 175Asn Ile Gln Ile His His Tyr Pro Asn Gly Ile Val Thr Val Asn Cys180 185 190Ala Arg Leu Leu Lys Ala Asp His His Ala Thr Asn Gly Val Val His195 200 205Leu Ile Asp Lys Val Ile Ser Thr Ile Thr Asn Asn Ile Gln Gln Ile210 215 220Ile Glu Ile Glu Asp Thr Phe Glu Thr Leu Arg Ala Ala Val Ala Ala225 230 235 240Ser Gly Leu Asn Thr Met Leu Glu Gly Asn Gly Gln Tyr Thr Leu Leu245 250 255Ala Pro Thr Asn Glu Ala Phe Glu Lys Ile Pro Ser Glu Thr Leu Asn260 265 270Arg Ile Leu Gly Asp Pro Glu Ala Leu Arg Asp Leu Leu Asn Asn His275 280 285Ile Leu Lys Ser Ala Met Cys Ala Glu Ala Ile Val Ala Gly Leu Ser290 295 300Val Glu Thr Leu Glu Gly Thr Thr Leu Glu Val Gly Cys Ser Gly Asp305 310 315 320Met Leu Thr Ile Asn Gly Lys Ala Ile Ile Ser Asn Lys Asp Ile Leu325 330 335Ala Thr Asn Gly Val Ile His Tyr Ile Asp Glu Leu Leu Ile Pro Asp340 345 350
Ser Ala Lys Thr Leu Phe Glu Leu Ala Ala Glu Ser Asp Val Ser Thr355 360 365Ala Ile Asp Leu Phe Arg Gln Ala Gly Leu Gly Asn His Leu Ser Gly370 375 380Ser Glu Arg Leu Thr Leu Leu Ala Pro Leu Asn Ser Val Phe Lys Asp385 390 395 400Gly Thr Pro Pro Ile Asp Ala His Thr Arg Asn Leu Leu Arg Asn His405 410 415Ile Ile Lys Asp Gln Leu Ala Ser Lys Tyr Leu Tyr His Gly Gln Thr420 425 430Leu Glu Thr Leu Gly Gly Lys Lys Leu Arg Val Phe Val Tyr Arg Asn435 440 445Ser Leu Cys Ile Glu Asn Ser Cys Ile Ala Ala His Asp Lys Arg Gly450 455 460Arg Tyr Gly Thr Leu Phe Thr Met Asp Arg Val Leu Thr Pro Pro Met465 470 475 480Gly Thr Val Met Asp Val Leu Lys Gly Asp Asn Arg Phe Ser Met Leu485 490 495Val Ala Ala Ile Gln Ser Ala Gly Leu Thr Glu Thr Leu Asn Arg Glu500 505 510Gly Val Tyr Thr Val Phe Ala Pro Thr Asn Glu Ala Phe Arg Ala Leu515 520 525Pro Pro Arg Glu Arg Ser Arg Leu Leu Gly Asp Ala Lys Glu Leu Ala530 535 540Asn Ile Leu Lys Tyr His Ile Gly Asp Glu Ile Leu Val Ser Gly Gly545 550 555 560Ile Gly Ala Leu Val Arg Leu Lys Ser Leu Gln Gly Asp Lys Leu Glu565 570 575Val Ser Leu Lys Asn Asn Val Val Ser Val Asn Lys Glu Pro Val Ala580 585 590Glu Pro Asp Ile Met Ala Thr Asn Gly Val Val His Val Ile Thr Asn595 600 605
Val<210>6<211>391<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>βig-h3 D-IV<400>6gtttgggacc ctgttcacca tggaccggat gttgacaccc ccaatgggga cagttatgga 60tgtcctgaag ggagacaatc gttttagcat gctggtggcc gccatccagt ctgcaggact120catggagatc ctcaaccggg aaggggtcta cactgttttt gctcccacca atgaagcgtt180ccaagccatg cctccagaag aactgaacaa actcttggca aatgccaagg aacttaccaa240catcctgaag taccacattg gtgatgaaat cctggttagc ggaggcatcg gggccctggt300gcggctgaag tctctccaag gggacaaact ggaagtcagc tcgaaaaaca atgtagtgag360tgtcaataag gagcctgttg ccgaaaccga c 391<210>7<211>140<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>βig-h3 D-IV(1x)氨基酸序列<400>7Leu Thr Pro Pro Met Gly Thr Val Met Asp Val Leu Lys Gly Asp Asn15 1015Arg Phe Ser Met Leu Val Ala Ala Ile Gln Ser Ala Gly Leu Thr Glu20 25 30Thr Leu Asn Arg Glu Gly Val Tyr Thr Val Phe Ala Pro Thr Asn Glu
35 40 45Ala Phe Arg Ala Leu Pro Pro Arg Glu Arg Ser Arg Leu Leu Gly Asp50 55 60Ala Lys Glu Leu Ala Asn Ile Leu Lys Tyr His Ile Gly Asp Glu Ile65 70 75 80Leu Val Ser Gly Gly Ile Gly Ala Leu Val Arg Leu Lys Ser Leu Gln85 90 95Gly Asp Lys Leu Glu Val Ser Leu Lys Asn Asn Val Val Ser Val Asn100 105 110Lys Glu Pro Val Ala Glu Pro Asp Ile Met Ala Thr Asn Gly Val Val115 120 125His Val Ile Thr Asn Val Leu Gln Pro Pro Ala Asn130 135 140<210>8<211>280<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>βig-h3 D-IV(2x)氨基酸序列<400>8Leu Thr Pro Pro Met Gly Thr Val Met Asp Val Leu Lys Gly Asp Asn15 10 15Arg Phe Ser Met Leu Val Ala Ala Ile Gln Ser Ala Gly Leu Thr Glu2025 30Thr Leu Asn Arg Glu Gly Val Tyr Thr Val Phe Ala Pro Thr Asn Glu3540 45Ala Phe Arg Ala Leu Pro Pro Arg Glu Arg Ser Arg Leu Leu Gly Asp50 55 60Ala Lys Glu Leu Ala Asn Ile Leu Lys Tyr His Ile Gly Asp Glu Ile65 70 75 80Leu Val Ser Gly Gly Ile Gly Ala Leu Val Arg Leu Lys Ser Leu Gln
85 9095Gly Asp Lys Leu Glu Val Ser Leu Lys Asn Asn Val Val Ser Val Asn100 105 110Lys Glu Pro Val Ala Glu Pro Asp Ile Met Ala Thr Asn Gly Val Val115 120 125His Val Ile Thr Asn Val Leu Gln Pro Pro Ala Asn Leu Thr Pro Pro130 135 140Met Gly Thr Val Met Asp Val Leu Lys Gly Asp Asn Arg Phe Ser Met145 150 155 160Leu Val Ala Ala Ile Gln Ser Ala Gly Leu Thr Glu Thr Leu Asn Arg165 170 175Glu Gly Val Tyr Thr Val Phe Ala Pro Thr Asn Glu Ala Phe Arg Ala180 185 190Leu Pro Pro Arg Glu Arg Ser Arg Leu Leu Gly Asp Ala Lys Glu Leu195 200 205Ala Asn Ile Leu Lys Tyr His Ile Gly Asp Glu Ile Leu Val Ser Gly210 215 220Gly Ile Gly Ala Leu Val Arg Leu Lys Ser Leu Gln Gly Asp Lys Leu225 230 235 240Glu Val Ser Leu Lys Asn Asn Val Val Ser Val Asn Lys Glu Pro Val245 250 255Ala Glu Pro Asp Ile Met Ala Thr Asn Gly Val Val His Val Ile Thr260 265 270Asn Val Leu Gln Pro Pro Ala Asn275 280<210>9<211>420<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>βig-h3 D-IV(3x)氨基酸序列
<400>9Leu Thr Pro Pro Met Gly Thr Val Met Asp Val Leu Lys Gly Asp Asn15 1015Arg Phe Ser Met Leu Val Ala Ala Ile Gln Ser Ala Gly Leu Thr Glu20 25 30Thr Leu Asn Arg Glu Gly Val Tyr Thr Val Phe Ala Pro Thr Asn Glu35 4045Ala Phe Arg Ala Leu Pro Pro Arg Glu Arg Ser Arg Leu Leu Gly Asp50 55 60Ala Lys Glu Leu Ala Asn Ile Leu Lys Tyr His Ile Gly Asp Glu Ile65 70 75 80Leu Val Ser Gly Gly Ile Gly Ala Leu Val Arg Leu Lys Ser Leu Gln8590 95Gly Asp Lys Leu Glu Val Ser Leu Lys Asn Asn Val Val Ser Val Asn100 105 110Lys Glu Pro Val Ala Glu Pro Asp Ile Met Ala Thr Asn Gly Val Val115120 125His Val Ile Thr Asn Val Leu Gln Pro Pro Ala Asn Leu Thr Pro Pro130 135 140Met Gly Thr Val Met Asp Val Leu Lys Gly Asp Asn Arg Phe Ser Met145 150 155 160Leu Val Ala Ala Ile Gln Ser Ala Gly Leu Thr Glu Thr Leu Asn Arg165 170 175Glu Gly Val Tyr Thr Val Phe Ala Pro Thr Asn Glu Ala Phe Arg Ala180 185 190Leu Pro Pro Arg Glu Arg Ser Arg Leu Leu Gly Asp Ala Lys Glu Leu195 200 205Ala Asn Ile Leu Lys Tyr His Ile Gly Asp Glu Ile Leu Val Ser Gly210 215 220Gly Ile Gly Ala Leu Val Arg Leu Lys Ser Leu Gln Gly Asp Lys Leu225 230 235 240
Glu Val Ser Leu Lys Asn Asn Val Val Ser Val Asn Lys Glu Pro Val245 250 255Ala Glu Pro Asp Ile Met Ala Thr Asn Gly Val Val His Val Ile Thr260 265 270Asn Val Leu Gln Pro Pro Ala Asn Leu Thr Pro Pro Met Gly Thr Val275 280 285Met Asp Val Leu Lys Gly Asp Asn Arg Phe Ser Met Leu Val Ala Ala290 295 300Ile Gln Ser Ala Gly Leu Thr Glu Thr Leu Asn Arg Glu Gly Val Tyr305 310 315 320Thr Val Phe Ala Pro Thr Asn Glu Ala Phe Arg Ala Leu Pro Pro Arg325 330 335Glu Arg Ser Arg Leu Leu Gly Asp Ala Lys Glu Leu Ala Asn Ile Leu340 345 350Lys Tyr His Ile Gly Asp Glu Ile Leu Val Ser Gly Gly Ile Gly Ala355 360 365Leu Val Arg Leu Lys Ser Leu Gln Gly Asp Lys Leu Glu Val Ser Leu370 375 380Lys Asn Asn Val Val Ser Val Asn Lys Glu Pro Val Ala Glu Pro Asp385 390 395 400Ile Met Ala Thr Asn Gly Val Val His Val Ile Thr Asn Val Leu Gln405 410 415Pro Pro Ala Asn420<210>10<211>560<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>βig-h3 D-IV(4x)氨基酸序列<400>10
Leu Thr Pro Pro Met Gly Thr Val Met Asp Val Leu Lys Gly Asp Asn15 1015Arg Phe Ser Met Leu Val Ala Ala Ile Gln Ser Ala Gly Leu Thr Glu20 25 30Thr Leu Asn Arg Glu Gly Val Tyr Thr Val Phe Ala Pro Thr Asn Glu35 40 45Ala Phe Arg Ala Leu Pro Pro Arg Glu Arg Ser Arg Leu Leu Gly Asp50 55 60Ala Lys Glu Leu Ala Asn Ile Leu Lys Tyr His Ile Gly Asp Glu Ile65 70 7580Leu Val Ser Gly Gly Ile Gly Ala Leu Val Arg Leu Lys Ser Leu Gln85 9095Gly Asp Lys Leu Glu Val Ser Leu Lys Asn Asn Val Val Ser Val Asn100 105 110Lys Glu Pro Val Ala Glu Pro Asp Ile Met Ala Thr Asn Gly Val Val115 120 125His Val Ile Thr Asn Val Leu Gln Pro Pro Ala Asn Leu Thr Pro Pro130 135 140Met Gly Thr Val Met Asp Val Leu Lys Gly Asp Asn Arg Phe Ser Met145 150 155 160Leu Val Ala Ala Ile Gln Ser Ala Gly Leu Thr Glu Thr Leu Asn Arg165 170 175Glu Gly Val Tyr Thr Val Phe Ala Pro Thr Asn Glu Ala Phe Arg Ala180 185 190Leu Pro Pro Arg Glu Arg Ser Arg Leu Leu Gly Asp Ala Lys Glu Leu195 200 205Ala Asn Ile Leu Lys Tyr His Ile Gly Asp Glu Ile Leu Val Ser Gly210 215 220Gly Ile Gly Ala Leu Val Arg Leu Lys Ser Leu Gln Gly Asp Lys Leu225 230 235 240Glu Val Ser Leu Lys Asn Asn Val Val Ser Val Asn Lys Glu Pro Val245 250 255
Ala Glu Pro Asp Ile Met Ala Thr Asn Gly Val Val His Val Ile Thr260 265 270Asn Val Leu Gln Pro Pro Ala Asn Leu Thr Pro Pro Met Gly Thr Val275 280 285Met Asp Val Leu Lys Gly Asp Asn Arg Phe Ser Met Leu Val Ala Ala290 295 300Ile Gln Ser Ala Gly Leu Thr Glu Thr Leu Asn Arg Glu Gly Val Tyr305 310 315 320Thr Val Phe Ala Pro Thr Asn Glu Ala Phe Arg Ala Leu Pro Pro Arg325 330 335Glu Arg Ser Arg Leu Leu Gly Asp Ala Lys Glu Leu Ala Asn Ile Leu340 345 350Lys Tyr His Ile Gly Asp Glu Ile Leu Val Ser Gly Gly Ile Gly Ala355 360 365Leu Val Arg Leu Lys Ser Leu Gln Gly Asp Lys Leu Glu Val Ser Leu370 375 380Lys Asn Asn Val Val Ser Val Asn Lys Glu Pro Val Ala Glu Pro Asp385 390 395 400Ile Met Ala Thr Asn Gly Val Val His Val Ile Thr Asn Val Leu Gln405 410 415Pro Pro Ala Asn Leu Thr Pro Pro Met Gly Thr Val Met Asp Val Leu420 425 430Lys Gly Asp Asn Arg Phe Ser Met Leu Val Ala Ala Ile Gln Ser Ala435 440 445Gly Leu Thr Glu Thr Leu Asn Arg Glu Gly Val Tyr Thr Val Phe Ala450 455 460Pro Thr Asn Glu Ala Phe Arg Ala Leu Pro Pro Arg Glu Arg Ser Arg465 470 475 480Leu Leu Gly Asp Ala Lys Glu Leu Ala Asn Ile Leu Lys Tyr His Ile485 490 495Gly Asp Glu Ile Leu Val Ser Gly Gly Ile Gly Ala Leu Val Arg Leu
500 505 510Lys Ser Leu Gln Gly Asp Lys Leu Glu Val Ser Leu Lys Asn Asn Val515520 525Val Ser Val Asn Lys Glu Pro Val Ala Glu Pro Asp Ile Met Ala Thr530 535 540Asn Gly Val Val His Val Ile Thr Asn Val Leu Gln Pro Pro Ala Asn545 550 555 560
权利要求
1.一种用于测量βig-h3蛋白质的量的方法，其包括以下步骤1)制备βig-h3或βig-h3 fas-1结构域的重组蛋白、其片段或衍生物；2)制备针对上述步骤1的上述重组蛋白、其片段或衍生物的特异配体；和3)通过使用上述步骤2的配体与上述步骤1的重组蛋白、其片段或衍生物的结合反应的方法来测量样品的βig-h3蛋白质的量。
2.权利要求1中所述的用于测量βig-h3蛋白质的量的方法，其中步骤1)的配体选自由抗体，RNA，DNA，脂类，蛋白质，有机化合物和无机化合物组成的组。
3.权利要求1中所述的用于测量βig-h3蛋白质的量的方法，其中步骤3)的特异结合反应是抗原—抗体反应。
4.权利要求3中所述的用于测量βig-h3蛋白质的量的方法，其中抗原—抗体反应是通过一种方法进行的，所述方法选自免疫印迹，免疫沉淀，ELISA，RIA，蛋白质芯片，快速测定法和微阵列组成的组。
5.权利要求3中所述的用于测量βig-h3蛋白质的量的方法，其中步骤3)的抗原—抗体反应包括以下步骤1)用由βig-h3蛋白质或βig-h3 fas-1结构域制备的重组蛋白、其片段或衍生物包被基质；2)使针对上述步骤1的蛋白质、其片段或衍生物的抗体与样品反应；3)将上述步骤2的反应物加到步骤1的包被蛋白质上，并等待反应，然后对其进行清洗；和4)将二抗加到上述步骤3的反应物上，以进一步的反应，然后测量OD。
6.权利要求1-5之任一项中所述的用于测量βig-h3蛋白质的量的方法，其中βig-h3蛋白质是具有SEQ.ID.NO 3所示氨基酸序列的人βig-h3蛋白质或具有SEQ.ID.NO 5所示氨基酸序列的小鼠βig-h3蛋白质。
7.权利要求1-5之任一项中所述的用于测量βig-h3蛋白质的量的方法，其中重复连接了1或2-10个βig-h3蛋白质的第四个fas-1结构域。
8.权利要求7中所述的用于测量βig-h3蛋白质的量的方法，其中βig-h3的fas-1结构域选自由SEQ.ID.No 7，No 8，No 9和No 10所示序列组成的组。
9.权利要求1中所述的用于测量βig-h3蛋白质的量的方法，其中所述样品可以是任何体液，其包括尿液，血液或滑液。
10.一种用于肾病，肝病，类风湿性关节炎或心血管疾病的诊断试剂盒，其包含βig-h3蛋白质或βig-h3蛋白质中fas-1结构域的重组蛋白(包括其片段或其衍生物)及其配体。
11.权利要求10中所述的诊断试剂盒，其中所述配体选自由特异结合βig-h3蛋白质，βig-h3的fas-1结构域，其片段或衍生物的抗体，RNA，DNA，脂类，蛋白质，有机化合物和无机化合物组成的组。
12.权利要求11中所述的诊断试剂盒，其中所述配体是抗体。
13.权利要求12中所述的诊断试剂盒，其中所述试剂盒还额外包含缓冲液，二抗，清洗液，终止液或呈色底物。
14.权利要求10中所述的诊断试剂盒，其中βig-h3蛋白质是具有SEQ.ID.NO 3所示氨基酸序列的人βig-h3蛋白质或具有SEQ.ID.NO 5所示氨基酸序列的小鼠βig-h3蛋白质。
15.权利要求10中所述的诊断试剂盒，其中重复连接了1或2-10个βig-h3蛋白质的第四个fas-1结构域。
16.权利要求15中所述的诊断试剂盒，其中βig-h3的fas-1结构域选自由SEQ.ID.No 7，No 8，No 9和No 10所示序列组成的组。
全文摘要
本发明涉及用于测量 βig－h3蛋白质的量的方法以及使用该方法的诊断试剂盒。具体而言，本发明涉及通过βig－h3蛋白质或βig－h3蛋白质中fas－1结构域的重组蛋白(包括其片段或其衍生物)与其配体之间的特异结合反应来测量体液中βig－h3蛋白质的量的方法，还涉及用于肾病、肝病、类风湿性关节炎或心血管疾病的诊断试剂盒，其包含βig－h3蛋白质或βig－h3蛋白质中fas－1结构域的重组蛋白(包括其片段或其衍生物)及其配体。本发明的方法和试剂盒能够有效的作为用于诊断肾病、肝病、类风湿性关节炎或心血管疾病的损伤和发展程度的灵敏诊断方法。
文档编号C07K14/435GK1625687SQ02828782
公开日2005年6月8日 申请日期2002年10月22日 优先权日2002年4月19日
发明者金仁山, 裴宗燮 申请人:再生生命工学会社