专利名称：降低多肽免疫原性的方法
技术领域：
本发明涉及免疫学和蛋白质治疗学领域。治疗蛋白是特别施用于人的多肽。该多肽被修饰过，所述修饰使得多肽对于施用于人时的免疫应答减弱。因此本发明提供了开发治疗多肽的方法，该治疗多肽在体内使用时比任何未修饰的相应多肽的免疫原性都要小。
背景技术：
有许多例子表明治疗蛋白的效率受限于针对所述治疗蛋白的干扰性免疫反应。已有若干种小鼠单克隆抗体表现出治疗多种人类疾病的前景，但在某些情况下由于诱导出相当程度的人抗小鼠抗体(HAMA)应答而未能成功应用[Schroff，R.W.等(1985)Cancer Res.45879-885；Shawler，D.L.等(1985)J.Immunol.1351530-1535]。对于单克隆抗体，已发展了多种技术以试图减弱HAMA应答[WO 89/09622；EP0239400；EP 0438310；WO 91/06667]。这些重组DNA方法通常是减少最终的抗体构建体中小鼠的遗传信息，同时增加最终构建体中人的遗传信息。尽管如此，在许多个体中，所得的“人源化”抗体仍然引起患者的免疫应答[Isacs J.D.(1990)Sem.Immunol.2449，456；Rebello，P.R.等(1999)Transplantation 681417-1420]。
抗体并不是唯一一类作为治疗剂施用并可引起免疫应答的多肽分子。即使是来源于人且具有与人体内蛋白相同氨基酸序列的蛋白也可以在人体内诱导免疫应答。值得注意的例子包括粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子[Wadhwa，M.等(1999)Clin.Cancer Res.51353-1361]和干扰素α2[Russo，D.等(1996)Bri.J.Haem.94300-305；Stein，R.等(1988)New Engl.J.Med.3181409-1413]等的治疗性应用。
一种对治疗蛋白的免疫应答通过MHC II类肽呈递途径进行。这里外源蛋白被吞入并被加工以和DR、DQ或DP类型的MHC II类分子结合而被呈递。MHC II类分子由专门的抗原呈递细胞(APC)如巨噬细胞和树突细胞等表达。MHC II类肽和T细胞表面上相关T细胞受体复合物以及一些其他共同受体如CD4分子的交叉结合能够共同在T细胞内诱导活化态。活化导致细胞因子的释放，进一步活化其他淋巴细胞如B细胞产生抗体或者作为完全的细胞免疫应答而活化T杀伤细胞。
诱导免疫应答的主要因素是在蛋白中存在可经由MHC II类分子的呈递作用激活T-细胞活性的肽(即所谓的T-细胞表位)。这种潜在的T-细胞表位通常定义为任何具有与MHC II类分子结合能力的氨基酸序列。可测定此种T-细胞表位以建立MHC结合。隐含地，″T-细胞表位″是指当其与MHC分子结合时可被T-细胞受体(TCR)识别的表位，并且至少原则上，这种表位可以通过使TCR促进T-细胞应答而激活这些T-细胞。但可以理解，某些可与MHC II类分子结合的肽可能存留在蛋白序列中，因为这种肽在施用此最终蛋白的生物中被识别为“自身的”。
根据前述，很明显治疗蛋白的免疫原性严重依赖于免疫系统选择和增殖对来自治疗蛋白的肽特异的T细胞克隆的能力。特定细胞克隆的活化是一个复杂的事件，但是其发生在多个复杂事件途径的末尾。该途径可以由几个关键步骤来表征1)蛋白被抗原呈递细胞摄取；2)在抗原呈递细胞中蛋白酶对该蛋白的蛋白水解加工；3)从该蛋白切割出的肽结合到能呈递这些肽到细胞表面的MHC分子；4)运送肽MHC复合物到细胞表面。
本发明涉及解决治疗蛋白中不可避免的存在免疫原性MHC II类表位所带来的问题。在通常的方面，本发明涉及破坏肽序列从上面概述的途径中出现的能力，并且尤其提供了方法，通过这些方法，可操纵上面所概述步骤2-4以开发具有改进的免疫原性模式的治疗蛋白。
在本领域已有鉴定能结合MHC II类分子的合成肽的方法。这些肽不可能在所有情况下(尤其是体内由于加工途径或其他现象)都起T细胞表位的功能。可认为T细胞表位的鉴定是表位消除的第一步，已经公开了计算技术，如扫描在实验中或者用计算技术确定的T细胞表位中识别序列基元以预测MHC II类结合肽。WO98/52976和WO00/34317中教导了鉴定具有与人MHC II类DR同种异型亚群结合的潜在能力的多肽序列的计算机穿线方法(computational threading approaches)。这些教导中，通过在人源或非人源治疗性抗体或非抗体蛋白一级序列中进行准确的氨基酸替换以去除预测的T-细胞表位。这些方法提供了通过氨基酸替代修饰的多肽序列，没有预期使用其他修饰模式以消除表位。
此外，利用重组MHC分子与合成肽的可溶性复合物(该复合物能与来自于人或受试实验动物外周血液样品中的T-细胞克隆相结合)的技术也在本领域中有所应用[Kern，F.等(1998)Nature Medicine4975-978；Kwok，W.W.等(2000)TRENDS in Immunol.22583-588]，这些技术也可以用于表位鉴定策略中。但是这些技术没有提供去除表位的方法。
US5,833,991(Masucci)提供了利用含甘氨酸序列的片段以防止对重组蛋白的所不希望的免疫应答的方法，该方法和广泛使用的方法类似，通过这些方法，一种免疫惰性种类(例如聚合分子，如PEG)被加合到治疗蛋白，在该领域中，该方法被广泛描述[实例方案见US5,349,001和WO90/13590]。
为了阐明以理解本发明，现在描述申请人在此处称作“免疫加工途径”的主要成分。
MHC II类系统MHC II类分子是一组高度多态的蛋白，其对辅助T细胞的选择和激活起重要作用。人白细胞抗原群DR(HLA-DR)是这组蛋白的主要同种型，然而，同种型HLA-DQ和HLA-DP行使类似的功能并且是生物学相关的。MHC II类DR分子由α和β链组成，其C-末端插入并穿越细胞膜。每一异源二聚体都具有可与长度在9到20个氨基酸范围内变化的肽相结合的配体结合结构域，但是结合沟中最多容纳11个氨基酸。配体结合结构域由α链的1-85位氨基酸和β链的1-94位氨基酸组成。最近的研究表明DQ分子具有同源的结构，预期DP家族蛋白也非常类似。在人中已发现了DR同种型的约70种不同同种异型，对于DQ有30种不同的同种异型，对于DP有47种不同的同种异型。每一个体带有2到4个DR等位基因，两个DQ及两个DP等位基因。许多DR分子的结构已阐明，这种结构指向一种带有许多疏水口袋的端开口肽结合沟，所述的疏水口袋与肽的疏水残基(口袋残基)相互作用[Brown等，Nature(1993)36433；Stern等，(1994)Nature 368215]。确立不同II类分子同种异型的多态性有助于肽结合沟中的不同肽结合表面的广泛多样性，并且在群体水平保证有关识别外来蛋白和引发针对病原生物免疫应答的最大灵活性。
蛋白水解加工蛋白抗原可被各种哺乳动物细胞摄入以进行加工并且表达MHC II类分子的APC能够特别高效的加工。抗原能够通过各种机制(如受体介导的内吞作用、吞噬作用、巨胞饮作用和自体吞噬)进入内吞途径。在酸性并且具有蛋白水解活性的自吞小泡中抗原被降解。多种不同蛋白酶参与该途径，然而，这些蛋白酶中的多种还没有被鉴定。内吞小泡逐渐改变性质，变得更酸、更具蛋白水解活性。抗原在几步中降解，最敏感的或者暴露的区域将首先被攻击。
在抗原呈递细胞的内吞小泡中已经鉴定了许多不同的蛋白酶。由于大多数这些蛋白也在哺乳动物的其他蛋白水解过程中发现，一些蛋白已经被良好的表征。在B细胞和树突细胞中，组织蛋白酶S起着关键的作用，在胸腺内皮细胞中为组织蛋白酶L，在巨噬细胞中为组织蛋白酶F。
组织蛋白酶是木瓜蛋白酶家族半胱氨酸蛋白酶，除了抗原呈递外还参与多种生理过程。组织蛋白酶为糖蛋白，在它们的活性位点含有一个必需的半胱氨酸残基，但是它们的一些酶学性质不同，包括底物特异性和pH稳定性。已经鉴定的一些组织蛋白酶有广泛的表达，可能起“管家”的作用，而其他组织蛋白酶(像组织蛋白酶S)具有组织限制性表达并且可能有更专门的功能。
除了组织蛋白酶S、L和F，还鉴定了一些其他参与抗原降解的组织蛋白酶。它们是组织蛋白酶B、组织蛋白酶H、组织蛋白酶D和组织蛋白酶E和潜在地组织蛋白酶Z、V和K。由于各种组织蛋白酶的最适pH不同，有些在早期内体中更具活性，而其他的在较迟阶段的抗原加工中起作用。结果，蛋白片段的种群将随着加工途径而变化，而在不同个体的APC中肽的范围也可能不同。除了组织蛋白酶，其他蛋白酶(如天冬酰胺内肽酶，它在加工B细胞摄入的抗原中起关键的作用)也可能参与抗原的降解。
MHC肽复合物的形成在抗原降解途径后，在HLA-DR、HLA-DQ或HLA-DP分子的结合沟中将出现能结合这些分子的肽。为了使肽结合HLA-DR、HLA-DQ或HLA-DP分子，必须从结合沟中除去称为CLIP(II类相关的Ii肽)的肽。CLIP是衍生自Ii蛋白的肽，它是一种伴侣蛋白分子，将内质网中的HLA-DR、DQ和DP靶定到内吞小泡。由于Ii含有(C末端)三聚区而形成九碱基序列复合物。Ii的胞质区含有信号序列，该信号序列靶定复合物穿过高尔基体，进入内吞途径。这里Ii分子分几个阶段降解。首先，该三聚区被一种非半胱氨酸蛋白酶切下，因此九碱基序列分离得到DRα-DRβ-IiP22复合物。一种Cys-蛋白酶从C末端切开CLIP区而除去两个庞大的糖类，留下DRα-DRβ-IiP10。最后，Ii在CLIP肽的N末端切开，留下DRα-DRβ-CLIP。该CLIP肽可以和内体中的其他肽交换。
在肽结合HLA-DR的交换反应中，一种叫做HLA-DM的分子(一种MHC II类编码的酶)通过催化CLIP肽和其他低亲和力的结合DRα-DRβ的肽的交换以得到更稳定地衍生自加工过的抗原的结合肽而起着关键作用[Busch等综述，(2000)，Curr.Op.Immunol.12，99-106]。HLA-DM对于肽和体外纯化的HLA-DR的交换反应动力学有很大影响，有效刺激一些肽的释放。内体中HLA-DM和HAL-DR的化学计量为1∶5-1∶12，而体外DM的更新为约3-12/min。HLA-DM通过暴露的疏水区和带电残基与HLA-DR分子相互作用。已经就HLA-DM的晶体结构模型提出了相互作用的最可能位点[Mosyak等，(1998)Immunity 9377-383]。HLA-DM优先结合已经和肽低亲和性结合的HLA-DR复合物。除此之外，HLA-DM还结合空的HLA-DR二聚体，该二聚体不稳定并且在没有HLA-DM时可能聚集。HLA-DM的结合稳定了与肽松散结合或没有肽结合的HLA-DR二聚体的“空态”。通过用这种方式保持HLA-DR结合沟的打开，肽能够竞争结合于该沟。肽的交换也可以在体内没有HLA-DM时发生，尽管交换效率显著下降。CLIP肽的N末端区能在结合沟外和一些HLA-DR同种型结合，从而稳定CLIP肽更可能被释放的构象。也不是绝对需要HLA-DM的作用以将HLA-DR复合物运送到质膜。没有HLA-DM时，结合有自身肽的CLIP肽的II类分子仍然能到达细胞表面。
HLA-DM在酸性pH下有最大活力，因此主要在蛋白水解性内体(称作MHC)中有活性。在酸性MHC中，肽稳定地结合在HLA-DR的抗原结合沟中后HLA-DM将被释放。或者，HLA-DM可以和HLA-DR复合物共同运送到细胞表面，细胞表面的中性pH导致HLA-DM的快速释放。实际上，在细胞表面可以发现少量HLA-DM，它们可能在细胞表面具有作用[Arndt等(2000)，EMBO J.196，1241-1251]。然后，含有溶酶体靶信号的HLA-DM被很快内化并重新靶向MHC。
一种叫做HLA-DO的MHC II类编码的蛋白具有调节功能[van Ham等综述，(2000)，Immunogen.51，765-770]，以依赖于pH的方式抑制HLA-DM的活性[van Ham等(1997)，Curr.Biol.7，950-957]。HLA-DM在pH 5时有最大活力，但在pH 6时也有活性。PH 6时HLA-DO的结合使HLA-DM活性丧失。这样，HLA-DO起着HLA-DM活性的pH传感器的作用，在早期内体中抑制HLA-DM的活性而在溶酶体pH时允许其具有活性。实际上，在HLA-DO阴性细胞中，可以发现HLA-DR装载着还没有被完全加工的长肽，而在HLA-DO阳性细胞中不会发生这些肽对HLA-DR的结合。
尽管HLA-DM在所有APC中表达，但是HLA-DO却主要在B细胞中发现。有人建议这是特异性刺激衍生自通过B细胞受体介导的摄取而内化的抗原表位呈递的一条途径。当结合抗体的抗原被B细胞胞内吞后，它们很快被运送到MHC——晚期蛋白加工囊泡。由于酸性pH，HLA-DO在这些区域不起作用，从这些抗原中切除的肽将很快结合到HLA-DR。在早期内体(即其中由于pH的关系，HLA-DM的功能被HLA-DO抑制的内体)中，由被非受体介导的胞饮作用摄入的抗原产生的肽将被阻止与HLA-DR的结合[van Ham等(2000)，J.Exp.Med1917，1127-1136]。
HLA-DR、DQ和DP二聚体的结合沟含有一些口袋，抗原肽氨基酸可以结合在这些口袋中。可以结合在这些口袋中的所谓的肽的锚定残基是将肽结合到HLA-DR、DQ和DP的主要决定簇。结合MHC是一种竞争性过程，具有高亲和力的肽比低亲和力的肽的竞争力要强，有助于它们在APC表面上的呈递[Adorni L.等(1988)J.Exp.Med1682091；Ii.W.等(1992)Eur.J.Immunol.22943]。对于某些肽，亲和力是如此高以至有效组成了不可逆的结合反应[Lanzavecchia A.等(1992)Nature357249]。
发明概述因此，如上所述，希望鉴定并去除任何有治疗价值但最初具有免疫原性的肽、多肽或蛋白的任何给定的T细胞表位或者至少降低其有效性。本发明的一个目标是提供方法，通过这些方法在施用作为治疗分子的蛋白时，必然存在的T细胞表位不会导致对该蛋白的免疫原性应答。因此，在去除或改善治疗蛋白免疫原性可能性的这一主题中，此处提供了多个方法学的备选方案。
概括的讲，本发明涉及下面的论题●一种修饰的多肽，其中该修饰破坏了该肽作为MHC II类配体的能力；●通过MHC II类途径呈递到免疫系统的能力降低的修饰的多肽；●一种修饰的多肽，当体内使用时其基本上没有免疫原性或者比具有相同的生物学活性的未修饰多肽的免疫原性要小；●一种据此修饰的多肽，其中修饰是分别用D-异构形式的氨基酸取代多肽链中特定氨基酸残基；●一种据此修饰的多肽，其中修饰是共价连接一个化学基团；●一种据此修饰的多肽，其中修饰导入了信号序列，该信号序列能够指导在合适的宿主中多肽的翻译后修饰，并且该翻译后修饰使得该多肽不能连同MHC II类分子一起呈递；●一种特异性的多肽，其中通过氨基酸替代、加入或缺失得到所述免疫原性的丧失，其中氨基酸序列的改变在某处进行，未修饰的多肽的该处易于被MHC II类蛋白水解途径的蛋白酶切割；●一种特异性的多肽，其中通过氨基酸替代、加入或缺失得到所述免疫原性的丧失，其中氨基酸序列的改变在某处进行，未修饰的多肽的该处不被MHC II类蛋白水解途径的蛋白酶切割；●一种特异性的多肽，其中通过氨基酸替代、加入或缺失得到所述免疫原性的丧失，其中所做的氨基酸序列的改变是为了向MHC II类蛋白水解途径的蛋白酶导入一个新的切割位点；●一种特异性的多肽，其中通过氨基酸替代、加入或缺失得到所述免疫原性的丧失，其中氨基酸序列的改变在某处进行，未修饰的多肽的该处为T细胞表位，并且由于肽的切割的原因该改变使得T细胞表位不能幸免于MHC II类呈递的加工途径；●一种特异性的多肽，其中通过氨基酸替代、加入或缺失得到所述免疫原性的丧失，其中氨基酸序列的改变在某处进行，未修饰的多肽的该处为T细胞表位，并且该改变使得T细胞表位由于失去和Ii的相互作用而不能幸免于MHC II类呈递的加工途径；●一种特异性的多肽，其中通过氨基酸替代、加入或缺失得到所述免疫原性的丧失，其中氨基酸序列的改变导致该多肽参与HLA-DM催化的肽交换反应的能力降低；●HLA-DO类似物或衍生物的应用，用于抑制HLA-DM催化的肽交换；●HLA-DM类似物或衍生物的应用，用于抑制HLA-DM催化的肽交换；●一种据此改造的多肽，其中改造在被识别为T细胞表位的序列中进行，所述免疫原性的丧失通过氨基酸的替代、增加或缺失得到，该氨基酸序列改变的位置在未修饰多肽中为T细胞表位，该改变使得T细胞表位由于肽的切割而不能幸存于MHC II类呈递的加工途径；●一种方法，其中目的蛋白的蛋白酶识别位点的知识被用于确定从该蛋白中必须除去哪些潜在的T细胞表位；●一种含有T细胞表位的多肽，其中所述表位的N-末端和/或C-末端侧面区域的一个或多个氨基酸的改变使得一个或多个蛋白酶识别位点对这些蛋白酶具有抗性；●一种含有T细胞表位的多肽，其中一个或多个氨基酸的改变使得在该表位中导入一个新的蛋白酶位点；●一种多肽，其中一个或多个氨基酸的改变产生了B细胞天冬酰胺酰基内肽酶切割位点；●一种多肽，其中一个或多个氨基酸的改变产生了组织蛋白酶位点；●一种多肽，其中一个或多个表面暴露的天冬酰胺残基被另外的氨基酸代替；●一种多肽，其中一个或多个表面暴露的天冬酰胺残基被谷氨酰胺残基代替；●一种多肽，其中所有表面暴露的天冬酰胺残基被另外的氨基酸代替；●一种降低多肽免疫原性潜能的方法，包括通过任何方法分析该多肽的蛋白酶切割模式的步骤；●一种降低多肽免疫原性潜能的方法，包括使用基因数据库研究技术(in silico)分析该多肽的蛋白酶切割模式；●一种降低多肽免疫原性潜能的方法，包括改变该多肽的蛋白酶切割模式；●一种降低多肽免疫原性潜能的方法，包括通过向该多肽序列中导入一个或多个额外的切割位点而改变该多肽的蛋白酶切割模式；●一种降低多肽免疫原性潜能的方法，包括通过除去该多肽中一个或多个切割位点改变该多肽的蛋白酶切割模式；●一种修饰的多肽，由此上述或下述任何类型的修饰特异地作用而导致一旦该多肽被加工以呈递于APC就失去和MHC II类肽结合沟的结合能力；●一种通过向治疗蛋白导入一份或多份能有效呈递MHC II类的肽序列而降低该治疗蛋白免疫原性的方法；●一种通过向治疗蛋白导入一份或多份能有效呈递MHC II类的肽序列而降低该治疗蛋白免疫原性的方法，并且多份拷贝串连，每个肽单元侧面与一个蛋白酶切割位点相接；●一种特异性的方法，其中附加的肽序列是自身肽；●一种特异性的方法，其中附加的肽序列是序列为AILEFRAMAQFSRKTD的自身肽；●一种结构为[X]nY的修饰肽，其中X＝全反应结合多个MHC同种型的自身肽，n＝包括1的任何整数，Y＝治疗蛋白；●一种特异性的多肽结构，但X＝AILEFRAMAQFSRKTD；●一种特异性的多肽结构，但X含有C-末端蛋白酶特别是对表1的任何组织蛋白酶的切割位点；●一种结构为Y-[X]n的修饰多肽，其中X＝全反应结合多个MHC同种型的自身肽，n＝包括1的任何整数，Y＝治疗蛋白；●一种特异性的多肽结构，但X含有N-末端蛋白酶特别是对表1的任何组织蛋白酶的切割位点；●一种结构为[X’]n-Y-[X”]n的修饰多肽，其中X＝全反应结合多个MHC同种型的自身肽，n＝包括1的任何整数，Y＝治疗蛋白；●一种据此修饰多肽结构，但X’＝X”；●一种据此修饰多肽结构，但X’含有C-末端蛋白酶切割位点并且X”含有N-末端切割位点；●一种结构为[X]nY的修饰多肽，其中X＝全反应结合多个MHC同种型的自身肽，n＝包括1的任何整数，Y＝治疗蛋白；此处和所附权利要求书中所用术语“肽”为包括两个或多个氨基酸的化合物。这些氨基酸通过肽键(下面定义)相连。有20种不同的天然存在的氨基酸参与肽的生物生产，并且任意数目的它们可以以任意顺序连接形成肽链或环。在肽的生物生产中所用的天然存在的氨基酸都为L构型。可用传统合成方法，利用L-氨基酸、D-氨基酸或这两种不同构型的氨基酸的各种组合制备合成肽。有些肽只含有一些氨基酸单元。短肽(例如，具有少于10个氨基酸单元)称为“寡肽”。其他肽含有许多氨基酸残基(例如多达100个或更多)，称为“多肽”。通常，可认为“多肽”是含有三个或更多氨基酸的任何肽链，而通常认为“寡肽”是特定类型的“短”多肽。这样，如此处所用的，任何所提及的“多肽”也包括寡肽。此外，任何提及的“肽”包括多肽、寡肽和蛋白。每个不同的氨基酸排列组成不同的多肽或蛋白。可形成的多肽数目——因此不同蛋白的数目——实际上是无限的。
APC表面上的MHC II类/肽复合物提供了特异性的T细胞受体(TCR)的结合面，该T细胞受体能够识别由该肽暴露的残基和MHCII类分子提供的决定簇。结合MHC II类分子并且使得TCR促进免疫应答的任何肽通常定义为表位，特别是功能性T细胞表位。
发明详述本发明特别提供了通过MHC II类途径呈递给免疫系统的能力降低的修饰多肽。在第一个实施方案中，通过氨基酸替代修饰该多肽，该替换为将多肽链中的一个或多个特定氨基酸残基改变为它们各自的D-异构形式。
已知将单个D-氨基酸包含于多肽中将破坏对MHC II类结合沟的结合。US 5,679,640表明D-氨基酸的替代需要在肽MHC复合物的关键接触位点进行，非关键位点的替代在MHC/肽复合物中是可以忍受的。本发明的目的是利用D-氨基酸替代破坏MHC II类结合口袋中的结合以便使肽不能呈递给TCR。这和US5,679,640所教导的方法显著不同，US5,679,640中替代发生在非关键结合残基，其策略是用保持对MHC高亲和性但不能识别和结合TCR的自身抗原替代物置换自身抗原肽。
在本领域中有许多描述多肽疗法的例子，并且这些例子的特征在于一级结构中一个或多个D-氨基酸残基。这些例子包括US5,182,261、US5,668,109、US4,764,504、US5,948,764、US5,545,618、US5,877,156、US5,932,545、US6,087,441等，其中均产生了含有一个或多个D-氨基酸残基的全合成肽。通常，这些替代与对N和/或C末端残基的额外修饰结合以通过减小被肽酶降解的可能性而赋予其体内稳定性。D-氨基酸本身不易受到酶的攻击从而具有体内稳定性，但是在上面引用的例子的上下文中，D-氨基酸被包含在特定位置，通常通过使它们对生物靶标的结合增强和阻碍某些具有潜在的或实际的治疗优点的生物学活性而赋予它们的组成性合成肽的拮抗活性。
这样，US5,985,242公开了以D-氨基酸为特征的合成的β淀粉状蛋白肽类似物，提出这些类似物结合存在于淀粉状蛋白产生性疾病如阿尔茨海默氏病中的新生神经原纤维缠结的天然存在的β淀粉状蛋白肽。通过如此结合，该多肽类似物抑制了进一步的聚集。类似地，该申请还描述了含有D-氨基酸的人髓鞘碱性蛋白(MBP)的肽类似物。在US5,948,764中的一个实施方案中描述了至少有7个氨基酸并且优选包含人MBP的86-99位残基的肽。修饰包含87位残基(否则将是L-缬氨酸)的肽以在该位置包含一个D-氨基酸，这样相对于天然MBP87-99，肽类似物对MHC的结合增强。典型的修饰包括将L-缬氨酸替换为D-缬氨酸或另一种D-氨基酸。
在本领域，特别是在合成肽治疗学领域，通常在肽的N和/或C末端包括“帽化”结构以增加该肽的体内半衰期。这样，从上面的例子中，在US5,985,242中，末端修饰除了在序列段中包含D-氨基酸外还包括C-末端酰胺化、烷基化或加入芳基酰胺或羟基基团。也公开了N-末端的修饰方法，包括加入环、杂环、多杂环和/或分支的烷基基团，在本领域中，已经考虑过各种化学基团和化学键旨在使体内环境中多肽的末端稳定。
利用非天然对映异构体形式的氨基酸如D-氨基酸对于通过化学合成制备的治疗剂是可行的策略。不能用重组表达系统将D-氨基酸掺入大分子量的多肽治疗剂中。尽管许多微生物来源的发酵系统和从细菌、真菌和其他生物来源纯化的酶能够互变外消旋的游离氨基酸，但是，根据发明人的知识，在多肽链中使得氨基酸残基外消旋的酶学方法在本领域中还是未知的。在本发明的方案下，这种酶的能力的发现将具有明显的实用性。
本发明的另一个实施方案包括将化学基团共价连接到多肽治疗蛋白上。所附加的基团将阻止一个或多个上面所概述的抗原加工步骤并使该基团所连接的多肽序列的片段呈递于APC表面MHC/肽所有组成成分的倾向减至最小。最优选地，所用的化学基团连接到多肽链的单个目的位点。也考虑备选的构型，由此共价连接修饰发生在许多目的位点和/或由该多肽特定一级结构中指定的位点。
在本领域中存在通过共价连接大化学基团或附件(appendage)如聚糖衍生物、聚乙二醇衍生物脂部分等的修饰多肽的方法[例如见US5,885,570、WO0026230、WO90/13590等]。还公开了其他的修饰方法，如连接单碳乙酰基[WO0035427]，所进行的修饰旨在通过空间阻碍分子上特定受体位点和/或免疫监视逃避的一般化机制增强治疗剂的生物利用度。
这种设想的化学修饰的一个特定的实例是对多肽链增加Asn-连接的糖基化，该化学修饰对于本发明的目的是特别合适的。提供Asn-连接的糖基化的共有信号序列确切定义为Asn-X-Ser/Thr，其中X为除Pro之外的任何氨基酸(三字母密码)。在任何定义的表位中通过单个氨基酸替换产生Asn-X-Ser/Thr基元对于大多数表位实际上是不可能的，因为它们的核心序列将和该基元相去甚远，这是公认的。为此，建议用多个氨基酸的替代产生该信号序列，并且这些氨基酸替代在本发明范围内。
本领域中已知其他糖基化连接，如O-连接的糖基化，包括简单的寡糖链或粘多糖链[Alberts.B.等(1990)Molecular Biology of the Cells第二版，Garland Publishing Inc.New York 433-475页]并且位于本发明范围内。
糖基化肽(例如Asn-连接的聚糖)是稳定的并且不会被TAP(MHC I类加工途径的一个关键组分)从细胞溶胶中输出到内质网腔[Momburg F.M.等(1994)J.Exp.Med.179533]。而且，大多数天然加工的肽不含有N-连接的聚糖共有序列，可以合理预期MHC II类途径中的聚糖肽的加工和运输将受到单糖决定簇的影响并且进一步使该肽和MHC II类结合沟结合的不可能性增大。
因此，可以理解多肽的糖基化可以导致糖基化的多肽比未糖基化的多肽(否则具有相同结构)的免疫原性要弱。本发明另一个实施方案提供了多肽，其中糖基化信号或者糖基化位点被除去以至所得多肽比未糖基化肽相对物更具免疫原性。这种情况是例如疫苗分子所需要的，由此旨在关注对特定分子产生免疫应答。
优选使用本发明的多肽的共价修饰发生在最小数目的位点上。特别优选共价修饰定位于多肽一级结构内所限定的残基。将化学连接定位于多肽分子的特定残基或几类氨基酸残基的方法是熟知的，并且根据优选的实施方案，在本发明范围内这些方法可用于修饰。这样，使得靶向连接到Lys残基的酰胺基团或者Asp或Glu残基上的羧基基团或者活化Cys残基上的巯基的化学修饰方法是成熟的[见例如Bioconjugate Techniques，(1996)Hermanson G.T.Academic Press Inc；Aslam M.& Dent A.Bioconjugation(1998)Macmillan，London]并且可用于本发明方案中。类似地，活化和偶联聚合物分子如PEG的方法已在本领域中详细描述[实例见US5,349,001和WO90/13590]并且可鉴定适合在本发明方案中使用的本领域中偶联其他脂质或酰胺或单糖或其他化学物质的类似方案。
本发明涉及降低治疗蛋白免疫潜能的方法，通过第四种通用方法也可以达到该目的，该方法包括这样一个实施方案，即在治疗多肽氨基酸残基序列的一个或多个特定区域对其进行修饰。该修饰可以是替代、缺失或加入氨基酸残基，这种修饰的结果是改变了一个或多个关键蛋白酶对该多肽的识别，这些蛋白酶通过对肽的降解而使加工的肽表位最终可能和MHC II类结合沟结合。
本发明的一个特定实施方案是对被证明或者预测可能结合MHC II类分子HLA-DR、DQ和DP的侧翼肽进行突变或修饰，使得这些肽不能被参与MHC II类途径蛋白加工的蛋白酶从抗原蛋白中切除。
另一个实施方案是对被证明或者预测可能结合HLA-DR、DQ和DP分子的蛋白序列进行修饰，使得这些序列对参与MHC II类加工途径的蛋白酶敏感。这也可以通过改变氨基酸使得产生的基元能被参与MHC II类途径的蛋白酶识别和切割而完成。
在另一个实施方案中，关于目的蛋白中蛋白水解加工位点的信息本身就是有用的数据，可以用于预测以鉴定可能结合HLA-DR、DQ或DP并因此可能在APC的表面发现的肽。
蛋白酶天冬酰胺内肽酶在被B细胞摄入的抗原的加工中起关键作用。已表明该酶在降解人B细胞破坏的溶酶体中的破伤风毒素区中扮演着关键角色[Manouri等，(2000)Nature396695-699]。B细胞天冬酰胺酰基内肽酶的切割位点依赖于靶蛋白的序列和结构。已知道所述多肽抗原首先用该蛋白酶消化从而暴露对其他蛋白酶如组织蛋白酶敏感的位点，这些位点对于进一步加工是必须的。天冬酰胺酰基内肽酶对破伤风毒素C片段的加工可以被所述抗原Asn残基的N-糖基化所抑制。该酶在胸腺APC中的蛋白加工中起作用[Mannoury等，(2002)Nat.Immunol3169-174；Anderton等，(2002)Nat.Immunol.3175-181]，在胸腺APC中该酶除去髓鞘碱性蛋白(含有一个中央天冬酰胺)的一个隐含的表位。
因此，通过除去暴露于表面的天冬酰胺残基可以降低本发明方案中多肽的免疫原性。通过氨基酸替代，最方便的是用重组DNA技术(尽管也可考虑其他方案如化学脱酰胺作用或化学合成)完成去除。在第一个实例中，特别好的替代是用谷氨酰胺替换天冬酰胺，尽管可以同样考虑其他替换，如用天冬氨酸或谷氨酸进行替换。
另一个蛋白酶(只在胸腺中发现)是胸腺特异性丝氨酸蛋白酶。编码该蛋白的基因位于MHCI类区。在其他APC中没有观察到该蛋白的表达。该酶的专有表达和胸腺细胞中组织蛋白酶L的特异角色(见上面)表明胸腺细胞中蛋白水解环境是相当独特的。
因为一些上面所提到的蛋白酶也参与其他生理过程，所以也对这些蛋白酶中的某些的机制和特异性进行了分析。表1概述了许多重要的组织蛋白酶的特异性。
表1
本发明的目的是修饰抗原蛋白，使得被参与MHC II类呈递蛋白水解加工途径的蛋白酶加工的位点对这些酶不敏感，导致在抗原呈递细胞表面抗原肽的呈递减少；另一个目的是在抗原蛋白的T细胞表位导入额外的蛋白酶位点，使得这些表位在内吞小泡中被进一步加工而不再被呈递给免疫系统。这些突变和那些除去或破坏表位自身的突变不同，而是导致潜在的MHC II类配基从加工途径中出现并被呈递到APC表面的可能性减小。这样，在本发明方案下，不必突变抗原肽的MHC锚定残基，尽管本发明的突变可以和这种策略组合进行。
以及采用了许多方法鉴定通过此处所概述的MHC II类系统呈递到APC表面的肽的性质。例如，可以从载有抗原的APC表面纯化抗原肽并对提取的肽应用蛋白测序技术。备选地，将构成某种目的蛋白的合成(重叠的)肽文库结合到抗原呈递细胞或纯化的HLA-DR、DQ或DP分子，洗脱后对与这些蛋白相互作用的那些肽进行序列分析。另一个方法是基于HLA-DR分子的共有结合基元或者通过X射线衍射/结构建模或者其他基于基因数据库研究技术如肽对接来预测某种目的蛋白的哪些肽可能结合HLA-DR分子。
原则上，所有这些方法都能够得到可能结合到MHC分子的肽的序列的信息，这些数据可用来在肽或衍生肽的蛋白中产生突变，这样和MHC分子的相互作用就受到严重的阻碍。可以在蛋白中得到的突变通常局限于那些紧密结合于HLA-DR、DQ或DP的肽结合沟中的抗原肽的残基，即所谓的锚定残基。尽管大多数表位的这些突变足够降低抗原性，但是，有些表位较难去除，因为这些位置的突变严重地影响该蛋白的功能活性。本发明将克服该局限。
当使用肽文库选择DR结合肽时，可能发现肽具有结合DR分子的潜力，但是在抗原呈递细胞中从不发生，因为这些细胞中的蛋白水解途径不允许该肽从抗原蛋白中出现。对于用计算机算法预测结合DR或DQ分子的肽也会出现同样的问题。结果，两种方法都导致对可能在对某个蛋白的免疫应答中起作用的肽的数目的过多预测。确定哪些预测的可能T细胞表位很可能被呈递到抗原呈递细胞还需要关于该蛋白中蛋白酶位点的额外信息。
根据本发明，优选的除去蛋白酶加工位点的方法如下1.确定给定目的蛋白的(部分)序列。
2.鉴定可能结合HLA-DR、HAL-DQ或HLA-DP分子的肽。
3.分析这些表位两侧伸展的氨基酸已确定存在可以被参与MHC II类加工途径的蛋白酶，特别是表1详述的蛋白酶识别的基元。
4.设计突变，使得蛋白酶不再在这些位置识别并切割。
5.用任何现今的标准分子生物学技术向目的蛋白中导入突变。
6.任选地，重新分析修饰的分子以证实在所希望的区域失去蛋白酶敏感性并且该肽于MHC II类结合而被呈递于细胞表面的能力降低。
在实施上面的方法时，可利用从抗原呈递细胞中提取蛋白水解蛋白时，任选地进行步骤3。将目的蛋白和提取物孵育，这可以在宽范围的条件下(例如多个pH点)进行。可以例如用HPLC纯化各种片段，然后用Edman降解和/或质谱鉴定它们的序列来分析目的蛋白的消化产物。根据该方案，所发现的片段的序列与目的蛋白序列的对比表明蛋白酶切割的位点使得可以设计合理的突变而使蛋白酶不再识别这些位置并在这些位置切割。
根据本发明，优选的通过导入额外的加工位点而降低免疫原性的方法如下1.确定给定目的蛋白(部分)的序列。
2.鉴定可能结合HLA-DR、HAL-DQ或HLA-DP分子的肽。
3.在鉴定为T细胞表位的肽中设计导入蛋白酶识别基元突变，这样可以在T细胞表位的第一个和最后一个锚定残基之间用该蛋白酶消化。
4.用任何现今的标准分子生物学技术向目的蛋白中导入突变。
5.任选地，重新分析修饰的分子以证实在所希望的区域失去蛋白酶敏感性并且该肽与MHC II类结合而被呈递于细胞表面的能力降低。
在可检测到多个重叠T细胞表位的情况下特别优选上面的方法。根据上面方法的步骤3，由此在某个定义的表位的第一个和最后一个锚定残基之间导入从头加工位点，定义的要求可能是行不通的，除非已经非常详细的绘出了足以可以鉴定关键的九碱基序列的表位图。实践中，应该考虑许多MHC II类同种异型(特别是HLA DR)，一种同种异型的nonomer序列可能“逃避”与结合同样的表位具有类似同种异型特异性的nonomer序列的登记，在长度超过9个残基的序列中可以定义一系列重叠nonomer。在这种情况下，在步骤3中定义的从头切割位点可能落在表位第一个和最后一个锚定残基之间的区域的外面，然而切割仍然导致通过MHC II类的肽呈递的丧失。认为这种突变改变在本发明范围内。
在另外一个实施方案中，关于目的蛋白中蛋白水解加工位点的信息本身是有用的数据，可用于预测可能结合HLA-DR、DQ或DP的肽。如上所描述的，T细胞表位预测算法和重叠肽文库中能结合HLA-DR、DQ或DP分子的肽的选择将几乎不可避免的导致T细胞表位数目的过多预测。当预测潜在T细胞表位含有被参与MHC II类加工途径的蛋白酶切割的识别基元时，在自然界中发现该表位的机会减少了，所以不必从目的蛋白中除去该表位。同样，当预测潜在T细胞表位两侧没有蛋白酶识别位点时，这个表位从蛋白中切除并被呈递到抗原呈递细胞表面的机会减少了，所以不必从目的蛋白中除去该表位。
根据本发明的这个进一步的实施方案，优选的靶定以除去的关键T细胞表位的方法如下1.测定给定目的蛋白的序列。
2.预测序列中潜在的T细胞表位。
3.仔细检查所有潜在的T细胞表位以确定在结合区中存在的基元能够被参与MHC II类蛋白水解途径的蛋白酶识别。
4.认为所有发现在潜在T细胞表位的N末端或C末端10个氨基酸中含有蛋白酶切割位点的潜在T细胞表位对于表位去除都是关键的。认为所有缺乏这些基元的潜在表位都是较不关键的，并且可以从需要从目的蛋白中除去的表位组中排除。
本发明涉及降低治疗蛋白免疫潜能的方法，通过第四种通用方法也可以达到该目的，该方法包括这样一个实施方案，即在治疗多肽氨基酸残基序列的一个或多个特定区域对其进行修饰。该修饰可以是替代、缺失或加入一个氨基酸残基，这种修饰的结果是改变了关键HLA-DM催化反应的效率，在该反应中加工的肽表位和MHCII类结合沟结合。
尽管HLA-DM催化的表位的肽交换的主要决定簇是该肽对HLA-DR的亲和力，但是越来越多的证件表面不决定对HLA-DR结合亲和性的氨基酸残基也对交换反应有影响。已经表明用合成肽进行的与HLA-DR-CLIP的体外肽交换反应中HLA-DM的存在对置换CLIP肽的选择有很大影响。Lightstone等[Lightstone等(1997)；Proc.Natl.Acad.Sci.USA 949255-9260]比较了正常Ii-、HLA-DM-和HLA-DM/Ii-抗原呈递细胞表面上自身肽的表达，注意到有或没有HLA-DM表达的呈递于细胞上的肽阵列中的显著的差异。Kropshofer等[Kropshofer等(1996)；EMBO J.156144-6154]用亲和纯化方法从EBV-转化的类淋巴母细胞中得到了HLA-DR分子(DR2和DR3同种异型)并在有或没有HLA-DM的情况下，在pH 5孵育这些分子16小时。将保持复合的肽洗脱下来并用质谱分析。当比较光谱时，明显发现一些肽被HLA-DM有效地除去，而另一些肽不受影响。在另一个实验中，当原先从HLA-DR1洗脱的6种不同的自身肽的混合物进行结合分析测试时，在没有DM时它们中的5种有效结合DR1，存在DM时，只有两种保持结合。从这些及其他实验得出这样一个观点HLA-DM可能起肽编辑器的在于，它选择某些肽的亚群呈递于细胞表面。很明显除了这些肽对HLA-DR的亲和力，一些其他因素也起作用复合物的动力学稳定性。虽然稳定性和亲和力是相关的(KD＝Koff/Kon)，但是Koff对HLA-DM催化的交换反应的效率有深远的影响。这可通过CLIP肽来例证，该肽具有异常高的Kon和高koff。因此，亲和力相对较高，但稳定性(在DM存在时)却较低。这样HLA-DM的角色可描述为动力学校正型。
已经进行了多种尝试来分析潜在表位一些位置的哪些氨基酸将影响HLA-DM催化的交换反应的效率。Kropshofer等[Kropshofer等(1996)；EMBO J.156144-6154]分析了HA肽锚定位置(307-319)的突变对体外结合HLA-DR1的影响。1位锚定残基的丝氨酸非常适于结合沟的第一个口袋。用天冬氨酸替换使得不能结合。在该位用甲硫氨酸或缬氨酸替换后仍然结合良好，但是在HLA存在时结合减弱。所以可以选择抗HLA-DM的锚定位置的(亚)最优残基。对口袋9位残基也进行了类似的观察。在口袋6中观察到适度相反的效果HLA-DM能使不利于其不存在的残基结合。HLA-DM还选择抗少于11个氨基酸的表位，反映了自然界中发现的DR-结合肽的大小。
Raddrizzani等[Raddrizzani等(1999)；Eur.J.Immunol.29，660-668]表明(合成)肽最可能被富含甘氨酸和脯氨酸残基的HLA-DM体外从HLA-DR释放出来。可能的解释是甘氨酸和脯氨酸对肽的二级结构有相对较大的影响。实际上，当将对HLA-DR1有高亲和力的肽与甘氨酸或脯氨酸或者导入或者除去的变异肽相比较时，观察到体外HLA-DM催化的交换反应的显著影响。
将前述作为本发明另一个重要的实施方案进行了介绍，在该实施方案中有一种修饰多肽的方法，该修饰使得一种或多种从多肽抗原加工而来的肽被阻止参与HLA-DM催化的肽交换反应或者至少参与反应的能力下降。这可通过突变目的蛋白使得能结合HLA-DR、DQ和DP的一些肽在该交换反应中失利。
在本发明该实施方案下的一般性方法如下1.确定给定目的蛋白(部分)序列。
2.鉴定可能结合HLA-DR、HLA-DQ或HLA-DP分子的肽。
3.在这些(潜在的)T细胞表位中设计突变，该突变将降低HLA-DM催化的和HAL-DR-CLIP复合物的交换反应的效率。
4.用现今标准的分子生物学技术向目的蛋白中导入突变。
可以在(潜在的)T细胞表位的任何位置进行降低HLA-DR催化的和结合HLA-DR复合物的CLIP肽的交换反应效率的突变。这包括可能结合在HLA-DR抗原结合沟的口袋中的位置。这些位置的某些突变可能不影响肽对HLA-DR的亲和力，但是可能降低HLA-DR催化的交换反应的效率。此外，某些突变可以在非锚定位置进行。
在本发明的再一个实施方案中，并且作为操纵肽序列以影响HLA-DM催化的交换反应的备选方案，可以通过操纵或模拟HLA-DM或HLA-DO分子自身改变这种交换。例如，通过外源HLA-DO(或其模拟物)的胞吞作用或通过导入编码HLA-DO的基因或通过活化停留HLA-DO基因将HLA-DO分子或模拟HLA-DO作用的其他分子导入APC而不是B细胞(如果它们存在的话)。实践中可以修饰(如通过氨基酸的改变)这些HLA-DO分子，该修饰改变HLA-DO pH依赖的行为使得例如，该分子可能在pH 5或更低的pH下抑制HLA-DM活性从而阻碍HLA-DM催化的肽的交换。类似地，可以向APC中导入HLA-DM分子或其他模拟HLA-DM作用的分子以提高肽交换的效率，或者通过对HLA-DM进行合适的修饰来抵抗HLA-DO的抑制作用或者改变被HLA-DM结合的肽的特异性或者改变HLA-DM的pH敏感性。这样，操纵或者模拟HLA-DO或HLA-DM能够增强特定肽在HLA-DP、DQ或DR上的呈递或者减弱/除去这种呈递。
在本发明的再一个实施方案中，可以在临近或者在特定HLA结合肽中包括特异性蛋白酶识别位点，使得该蛋白酶位点对于不同APC中的切割具有不同的敏感性。通过该方法，肽可以被特定APC从蛋白序列中优先释放出来以影响从接下来的在APC上的肽的呈递从而影响T细胞应答。例如，和巨噬细胞中通过相同蛋白的加工诱导的细胞应答相比，从树突细胞优先释放的肽(例如通过优先包含侧翼组织蛋白酶S位点)可能诱导不同类型的细胞应答(例如TH1偏向的)。这样，由相同蛋白诱导的TH0、TH1和TH2应答的平衡可能被明智地包含侧翼或内部蛋白酶位点所影响。类似地，不同APC中蛋白酶的不同模式可被用来影响APC中肽的运输。扰乱APC表面肽呈递动力学的一个特别有利的方案是在治疗性多肽抗原中提供肽序列，这些序列通过它们的序列和丰度能够通过MHC系统优先呈递于外表面。为此，这些优先呈递的肽将胜过那些存在于抗原蛋白中的其他肽，这样那些肽将不能被用来启动免疫应答。这种方法有用性的关键是优先呈递的肽本身不能诱发免疫应答。因此，在该方案的设计中暗含使用自身肽抗原，即来自宿主生物的肽，该生物对该肽具有高水平的免疫耐受性。
除了需要自身耐受序列，可被定义为“免疫抑制”的、在该方案中有效的肽还应该具有对宽范围的MHC、优选HLA-DR同种异型由高亲和性，在HLA-DM存在时还具有高的动力学稳定性的特征。具有上面提到的特征的肽定义为自身肽SP3，其单字母密码序列为AILEFRAMAQFSRKTD。
在本发明方案中，SP3或功能等价的肽序列被连接到治疗性目的蛋白的C末端和/或N末端。优选在肽的每侧连接有一个识别基元，该基元被参与MHC II类加工途径的蛋白酶如表1所描述的任何或更多的蛋白酶所识别。该肽可以串连重复连接到治疗蛋白的N和/或C末端。设计该构建体的方法在本领域中可容易地得到，可以设想具有任何数目重复单元特征的结构并且这些结构都位于本发明范围之内。
权利要求
1.一种修饰目标蛋白或目标多肽的方法，该目标蛋白或目标多肽具有特异的生物学活性，并且当体内使用时基本无免疫原性或者比具有相同生物学活性的未修饰的目标蛋白或多肽的免疫原性要低，该方法包括下面的步骤(i)确定所述目标蛋白的氨基酸序列或其部分序列；(ii)用标准的方法鉴定可能结合MHC II类的HLA-DR、HLA-DQ或HLA-DP分子的所述序列上的潜在T细胞表位；(iii)用分子生物学技术通过替代、插入或缺失一个或多个氨基酸或者通过连接分子在所述T细胞表位之内或之外修饰目标蛋白以得到具有不能结合MHC II类分子或者结合能力降低的表位的修饰的蛋白或多肽，和(iv)任选地重复步骤(i)至(iii)以得到T细胞表位数减少的蛋白，其中步骤(iii)的修饰选自至少一种下面的备选方案(a)在T细胞表位区内导入一个或多个非天然氨基酸残基；(b)共价连接一个高分子量分子到潜在T细胞表位内一个或多个位点；(c)修饰T细胞表位内的氨基酸残基而防止或减少HLA-DM/HLA-DO催化的交换反应，这些交换反应负责将T细胞表位肽结合到MHC II类分子置换CLIP肽；(d)分析所述T细胞表位外侧翼区域的蛋白以确定存在可以被蛋白酶识别的基元并修饰一个或多个所述基元以除去所述蛋白酶加工位点；(e)在T细胞表位内的所述T细胞表位的第一个和最后一个锚定残基之间导入一个或多个蛋白酶加工位点；(f)在T细胞表位内或外导入一份或多份能被有效呈递在MHC II类分子上的肽序列。
2.根据权利要求1的方法，其中(iii a)所述非天然氨基酸残基是相应于天然L-异构形式的D-异构形式。
3.根据权利要求1的方法，其中(iii b)所述高分子量分子选自糖、脂质、糖脂、PEG和其衍生物。
4.权利要求3的方法，其中所述T细胞表位被糖基化。
5.权利要求4的方法，其中糖基化通过由单个氨基酸替代导入的Asn-X-Ser/Thr基元完成，其中X是除Pro之外的任何天然氨基酸。
6.权利要求1的方法，其中选择备选方案(iii d)或(iii e)。
7.根据权利要求6的方法，其中所述蛋白酶参与MHC II类加工途径。
8.根据权利要求7的方法，其中所述蛋白酶选自表1所指定的蛋白酶。
9.根据权利要求1的方法，其中选择备选方案(iii f)。
10.权利要求9的方法，其中所述肽序列的多份拷贝串连，每个肽单元侧面与一个蛋白酶切割位点相接。
11.权利要求9或10的方法，其中所述肽为自身肽。
12.权利要求11的方法，其中所述自身肽连接在所述目标蛋白或多肽的C-和/或N-末端。
13.权利要求11或12的方法，其中所述自身肽单元含有序列AILEFRAMAQFSRKTD。
14.权利要求10到13中任一项的方法，其中使用表1任一组织蛋白酶的蛋白酶切割位点。
15.根据前面权利要求中任一项的方法，其中所述目标蛋白或多肽为治疗性蛋白或多肽。
16.一种含有T细胞表位的具有特异性生物学活性的修饰过的目标蛋白或多肽，当体内使用时其不能结合MHC II类分子或者结合能力降低并且基本无免疫原性或者比具有相同生物学活性的未修饰的目标蛋白或多肽的免疫原性要低，其中所述修饰通过替代、插入或缺失一个或多个氨基酸或者通过连接分子得到，且产生的修饰分子具有(a)在所述T细胞表位内的一个或多个非天然氨基酸残基，和/或(b)连接到所述潜在T细胞表位内的一个或多个位点的一个或多个高分子量分子，和/或(c)导致防止或减少HLA-DM/HLA-DO催化的交换反应的T细胞表位内的特定氨基酸残基，这些交换反应负责将T细胞表位肽结合到MHC II类分子置换CLIP肽上；和/或(d)所述T细胞表位外的侧翼区域中的一个或多个蛋白酶加工位点；和/或(e)所述T细胞表位的第一个和最后一个锚定残基之间的T细胞表位区内的一个或多个蛋白酶加工位点；和/或(f)T细胞表位内或外的一份或多份肽序列，该序列能够有效呈递于MHC II类分子上。
17.根据权利要求16的修饰目标蛋白，其中(a)中所述非天然氨基酸残基为相应于天然L-异构形式的D-异构形式。
18.根据权利要求16的修饰目标蛋白，其中(b)所述高分子量分子选自糖、脂质、糖脂、PEG和其衍生物。
19.根据权利要求16的修饰目标蛋白，其中所述T细胞表位具有与一个糖残基连接的位点。
20.根据权利要求19的修饰目标蛋白，其中糖分子通过Asn-X-Ser/Thr基元连接到T细胞表位位点，其中X为除Pro之外的任何天然氨基酸。
21.根据权利要求16的修饰目标蛋白，其在所述T细胞表位内或外有一个或多个蛋白酶位点。
22.权利要求21的修饰目标蛋白，其中所述蛋白酶参与MHCII类加工途径。
23.权利要求22的修饰目标蛋白，其中所述蛋白酶选自表1指定的蛋白酶。
24.权利要求16的修饰目标蛋白，其中所述肽序列的多份拷贝串连，每个肽单元侧面与一个蛋白酶切割位点相接。
25.权利要求24的修饰目标蛋白，其中所述肽为自身肽。
26.权利要求25的修饰目标蛋白，其中所述自身肽连接在所述目标蛋白或多肽的C-和/或N-末端。
27.权利要求25或26的修饰目标蛋白，其中所述自身肽单元含有序列AILEFRAMAQFSRKTD。
28.权利要求24到27中任一项的修饰目标蛋白，其中使用表1任一组织蛋白酶的蛋白酶切割位点。
29.权利要求16到28中任一项的修饰目标蛋白，其中所述目标蛋白或多肽为治疗性蛋白或多肽。
30.药物组合物，该组合物含有权利要求29的蛋白并任选包括药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂。
31.权利要求29的蛋白在制备药物中的用途。
32.DNA分子，该DNA分子含有编码权利要求16到29中任一项的目标蛋白或多肽的序列。
全文摘要
本发明涉及免疫学和蛋白质治疗学领域。治疗蛋白是特别施用于人的多肽。该多肽被修饰过，该修饰使得多肽对于施用于人宿主时的免疫应答减弱。因此本发明提供了开发治疗多肽的方法，该治疗多肽在体内使用时比任何未修饰的相应多肽的免疫原性都要小。根据本发明所使用的修饰涉及例如，导入蛋白酶切割位点、连接不同的分子或者插入非天然氨基酸。
文档编号C07K14/47GK1523996SQ02813544
公开日2004年8月25日 申请日期2002年7月12日 优先权日2001年7月13日
发明者F·J·卡尔, G·卡特, K·海伦多尔恩, F J 卡尔, 锥喽 申请人:默克专利有限公司