专利名称：低氧诱导因子1相关肽及其筛选的利记博彩app
技术领域：
本发明属于多肽生物技术领域。
低氧诱导因子1(hypoxia inducible factorl，HIF1)是由HIF1α和HIF1β(aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator，ARNT)亚基组成的异源二聚体转录调节因子，HIF1通过与靶基因的启动子或增强子上的缺氧反应元件(hypoxia response elemet，HRE)结合而诱导靶基因的表达，调节机体对低氧水平的生理反应。由于它的作用之广泛而日益引起国内外学者的注意，对它的研究也在不断向纵深方向发展。迄今为止，已有数十个HIF1调节基因得到确定，其中包括参与脉管形成、能量代谢、红细胞生成、细胞增殖与发育能力、血管重构与血管收缩反应的蛋白基因。大量的研究表明，HIF1通过调节下游基因的表达(如EPO、VEGF、葡萄糖运载体等)，可以增强细胞或组织对于缺血缺氧的耐受性，促进梗死区内血管新生，在心肌缺血、脑缺血再灌注等病理生理过程中起着预防和保护作用，尤其是在实验动物经过缺氧预处理后，可以诱导HIF1的表达并在随后的脑缺血中对神经元起到了保护作用。
噬菌体表面展示肽库是将随机序列肽表达在噬菌体表面，肽库是大量某一长度短肽的集合，它包括了该长度短肽的各种可能序列或其中绝大部分序列，容量可达数十亿。用相应的配体分子对文库噬菌体进行亲和筛选，可得到与配体特异亲和的噬菌体克隆，通过测定克隆噬菌体所编码的氨基酸序列，可以确定与配体特异亲和的配基氨基酸组成及其关键性氨基酸残基。噬菌体展示描述的是一种体外的选择技术。它是将编码外源肽或蛋白质的DNA插入噬菌体外壳蛋白基因pIII或pVIII区，使外源肽或蛋白质以融合蛋白的形式表达于丝状噬菌体的表面，并使它们保持良好的空间构象。噬菌体展示技术将一个巨大的随机肽序列库与编码每一个序列的DNA有机地联结在一起，通过一个被称为“淘筛”的体外选择过程，各种靶分子的肽配基可以迅速得以确认。经3轮的淘筛之后，可以得到与配体特异亲和的，表达有特异肽或蛋白质的噬菌体克隆，通过测定插入噬菌体的DNA序列，就可以明确所表达的外源物质的氨基酸序列，同其它技术相比，噬菌体展示肽库更易筛选到大量的克隆，应用此项技术可以得到109个以上的不同展示序列。由于筛选到的噬菌体可以在E.coli内繁殖，因此可以采用亲和免疫的方法，通过多轮反复的筛选使肽库中的与靶分子结合的噬菌体由劣势转为优势，最终得到与靶分子特异结合最紧密的序列，这一过程又被形象地称为“富集”。
本发明的目的在于提供一种HIF1相关肽，是一种利用噬菌体展示肽库和HIF1α单克隆抗体结合筛选的12肽，鉴于该肽为本发明人所发现的能与HIF1α单克隆抗体特异结合的新的噬菌体展示肽，因此目前对该肽的认识仅限于我们的研究。
本发明的另一目的在于提供一种HIF1相关肽筛选方法。通过改变每轮筛选时的HIF1α单克隆抗体的稀释度和TBST洗脱液中Tween-20的比例，使肽库中的与靶分子结合的噬菌体由劣势转为优势，最终得到与靶分子特异结合紧密的序列。
本发明所述的HIF1相关肽具有如下的多肽序列Gly Pro His His Tyr Trp TyrHis Leu Arg Leu Pro。利用噬菌体展示肽库技术筛选HIF1相关肽的过程如下
将1∶50稀释的HIF1α单克隆抗体包被ELISA板，第二天加入封闭液，用TBST冲洗后，加入噬菌体展示12肽库，与HIF1α单克隆抗体结合，1小时后，倾去未结合的噬菌体。然后用含0.1％[v/v]Tween-20的TBST洗脱液轻轻震荡洗脱结合的噬菌体，将此噬菌体洗脱液加入到E.coli ER2738培养液中进行扩增。第二轮筛选时，按1∶100稀释抗HIF1α抗体包板，并将TBST洗脱液中Tween-20提高至0.5％[v/v]。第三轮筛选时，按1∶200稀释抗HIF1α抗体包板，TBST洗脱液中Tween-20仍为0.5％[v/v]。
用M13空载体做阴性参照，取原肽库、3轮筛选后的噬菌体各3μl点于硝酸纤维素膜(NC)上，用不同稀释度的HIF1α抗体杂交，进行膜斑点印记(dot-ELISA)鉴定特异性结合的噬菌体，发现经过三轮筛选，噬菌体得到了有效的富集，第三轮噬菌体的回收率是第1轮的回收率的200倍。第三轮筛选的噬菌体扩增后随机挑选的10个克隆进行膜斑点印记鉴定也出现深浅不同的阳性反应。按M13 ssDNA抽提试剂盒的说明提取10个克隆的单链DNA，采用双脱氧终止法测序。发现有4个克隆的序列完全相同，这4个克隆共有氨基酸序列为Gly Pro His His Tyr Trp Tyr His Leu Arg Leu Pro。
HIF1通过调节下游基因的表达(如EPO、VEGF、葡萄糖运载体等)，在缺氧适应和病理反应中起着关键作用，是与新生血管形成、血流供应、氧化和能量代谢相关基因转录和表达有关的重要调节因子。但是，HIF1为一含八百多个氨基酸的蛋白质，用人工合成和重组的方法获得都十分困难。而HIF1相关肽可模拟HIF1的作用，仅含十几个氨基酸，因此，利用噬菌体表面展示肽库技术筛选HIF1相关肽，对缺血缺氧性疾病的防治及其机理研究具有重要的意义，HIF1相关肽尚可以用于制备治疗缺血缺氧性疾病的药物。
四、具体实施方案(一)HIF1相关肽筛选1.材料噬菌体展示12肽库(Ph.D.-12TMPhage Display Peptide Library Kit)，其受体菌为E.coli ER2738，肽库的滴度为2.0×1013pfu/ml，随机多样性为2.7×109，测序引物为(-96 gIIIsequencing primer)5’-CC CTC ATA GTT AGC GTAACG-3’，均购自美国NEW ENGLAND Biolabs公司。抗HIF1α单克隆抗体及辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗鼠IgG多克隆抗体购自Novus Biologicals，Inc.M13噬菌体单链DNA抽提试剂盒购自上海华舜生物工程公司。ELISA板为Nunc公司产品，硝酸纤维素膜为Hybond公司产品。D-37520型低温离心机为Biofuge公司产品。2方法2.1亲和筛选过程2.1.1包板将抗HIF1α单克隆抗体按1∶50溶于0.1M NaHCO3(pH8.6)，取100μl包被ELISA板的一孔，4℃孵育过夜。2.1.2封闭第二天弃去包板液，加入150μl封闭液(0.1MNaHCO3，5mg/mlBSA)，37℃封闭1h。2.1.3噬菌体结合弃去封闭液，用TBST(TBS+0.1％[v/v]Tween-20)迅速洗6次，将10μl原肽库用TBS稀释至100μl加入孔内，室温下震荡作用60min。2.1.4倾去未结合的噬菌体，用TBST洗10次。用100μl洗脱液(0.2MGlycine-HCL[pH2.2]，1mg/ml BSA)室温轻轻震荡8min洗脱结合的噬菌体，吸出洗脱液于一个微量离心管中，用15μl中和缓冲液(1MTris-HCl，pH9.1)中和至中性。2.1.5扩增取1μl洗脱液测滴度。其余的洗脱液加入到20mlE.coli ER2738培养液中，37℃震荡培养4.5h。将培养液转至离心管，4℃离心10,000rpm×10min，吸取80％的上清液于干净的离心管，加入1/6体积的PEG/NaCl(20％[W/V]PEG-8000，2.5M NaCl)，4℃沉淀过夜。沉淀过夜后，4℃离心12,000rpm×15min，弃去上清液。用1ml TBS悬浮沉淀，转移至一个微量离心管内，4℃离心10,000rpm×5min沉淀残余的细菌。将上清移至新的离心管，用1/6体积的PEG/NaCL冰上二次沉淀60min。40℃离心12,000rpm×15min弃上清。用100μl TBS悬起沉淀，测定扩增的噬菌体滴度。2.1.6第二轮筛选按1∶100稀释抗HIF1α抗体包板，封闭后加入第一轮扩增后的噬菌体肽库，将TBST中Tween-20提高至0.5％[v/v]进行第二轮筛选，其余步骤同第一轮筛选。2.1.7第三轮筛选按1∶200稀释HIF1α抗体包板，封闭后加入第二轮扩增后的噬菌体肽库，TBST中Tween-20仍为0.5％[v/v]，进行第三轮筛选和扩增。最后计算每一轮筛选后噬菌体的回收率。计算公式为回收率(％)＝(洗脱的噬菌体数/筛选时加入的噬菌体数)×100％。2.1.8噬菌体克隆第三轮筛选的噬菌体扩增后，随机挑选多个克隆，进行膜斑点印记(dot-ELISA)鉴定和DNA序列的测定。2.2噬菌体滴度的测定取每一轮洗脱下来的噬菌体依次稀释，预热3ml的顶琼脂，加入IPTG和X-gal，取10μl的稀释后的噬菌体加入到顶琼脂中，快速铺于LB平板上，反转平板，37℃培养过夜。第二天取出平板，记数兰色噬菌斑的数量。用相同的方法测定每一轮扩增后的噬菌体滴度。2.3膜斑点印记(dot-ELISA)鉴定特异性结合的噬菌体克隆用M13空载体做阴性参照，取扩增纯化后滴度为2.0×1014pfu/ml原肽库、3轮筛选后的噬菌体各3μl点于硝酸纤维素膜(NC)上。37℃放置10min使之干燥，用5％脱脂奶粉室温封闭1小时。PBS洗膜10min×3次，用不同稀释度的HIF1α抗体4℃杂交过夜。洗膜后，加入HRP标记的抗鼠的IgG，室温封闭1小时，PBS洗膜10min×3次，DAB显色，观察结果。另用随即挑出10个克隆的噬菌体点膜，按上述的方法做dot-ELISA。2.4 DNA序列的测定取第三轮筛选洗脱下来的噬菌体铺板，37℃培养过夜，随机挑取10个兰色噬菌斑，扩增纯化，按M13 ssDNA抽提试剂盒的说明提取单链DNA，采用双脱氧终止法测序。测序引物为(-96 gIIIsequencing primer)5’-CC CTC ATA GTTAGC GTA ACG-3’。3结果3.1亲和筛选的结果在进行每一轮筛选时加入的噬菌体为1-2×1011pfu，3轮筛选依次提高HIF1α抗体的稀释度，测定洗脱下来的噬菌体的滴度。从噬菌体的回收率来看，经过3轮筛选，噬菌体得到了有效的富集，第3轮噬菌体的回收率是第1轮的回收率的200倍。3.2 dot-ELISA结果dot-ELISA结果显示M13空载体和原肽库未显色呈阴性反应，第1到第3轮筛选后的噬菌体阳性反应逐轮增强，并且这种阳性反应随着HIF1α抗体的稀释度的升高而减弱。结果还显示出随机挑选的10个克隆出现深浅不同的阳性反应。3.3测序结果经过3轮筛选后，挑选10个阳性克隆，进行测序，有4个克隆的序列完全相同，其它的6个克隆的序列为不相同的单独序列，因此共获得7个氨基酸序列，4个克隆共有氨基酸序列为Gly Pro His His Tyr Trp Tyr His Leu Arg LeuPro。(二)HIF1相关肽对HIF1下游基因mRNA和编码蛋白表达的影响。1.HIF1相关肽对HIF1下游基因mRNA表达的影响。
采用RT-PCR技术，以β-actin作为内参照来半定量检测缺氧和氯化钴处理不同时间后培养的神经细胞、肿瘤细胞、视网膜色素上皮细胞VEGF、烯醇化酶1、糖酵解酶A、红细胞生成素mRNA的表达水平，以及HIF1相关肽对缺氧和氯化钴诱导的基因表达的影响。结果缺氧和氯化钴处理后，VEGF、烯醇化酶1、糖酵解酶A、红细胞生成素mRNA的表达逐渐增加，并随着时间的延长而改变。HIF1相关肽可不同程度地改变缺氧和氯化钴诱导的VEGF、烯醇化酶1、糖酵解酶A、红细胞生成素mRNA的表达。2.HIF1相关肽对HIF1下游基因编码蛋白表达的影响。
采用免疫荧光组织化学技术和激光共聚焦显微镜，以荧光比值来表示VEGF、烯醇化酶1、糖酵解酶A、红细胞生成素蛋白的表达，半定量分析缺氧和氯化钴处理不同时间对体外培养神经细胞、肿瘤细胞、视网膜色素上皮细胞VEGF、烯醇化酶1、糖酵解酶A、红细胞生成素蛋白表达的诱导作用，以及HIF1相关肽对缺氧和氯化钴诱导的VEGF蛋白表达的影响。结果缺氧和氯化钴处理后，VEGF、烯醇化酶1、糖酵解酶A、红细胞生成素蛋白的表达逐渐增加，并随着时间的延长而改变。HIF1相关肽可不同程度地改变缺氧和氯化钴诱导的VEGF、烯醇化酶1、糖酵解酶A、红细胞生成素蛋白的表达。低氧诱导因子1相关肽氨基酸序列<110>南京医科大学<120>低氧诱导因子1相关肽及其筛选<160>1<210>1<211>12<212>PRT<213>噬菌体(M13 Phage)<400>1Gly Pro His His Tyr Trp Tyr His Leu Arg Leu Pro1 5 10
权利要求
1.一种低氧诱导因子1相关肽，其特征在于多肽序列为Gly Pro His His Tyr Trp Tyr HisLeu Arg Leu Pro。
2.一种低氧诱导因子1相关肽筛选方法，其特征在于将稀释的低氧诱导因子1α单克隆抗体包被ELISA板，第二天加入封闭液，用TBST冲洗后，加入噬菌体展示12肽库，与低氧诱导因子1α单克隆抗体结合，1小时后，倾去未结合的噬菌体。然后用含Tween-20的TBST洗脱液轻轻震荡洗脱结合的噬菌体，将此噬菌体洗脱液加入到E.coli ER2738培养液中进行扩增。第二轮筛选和第三轮筛选时，改变低氧诱导因子1α单克隆抗体稀释度和TBST洗脱液中Tween-20含量，以富集与配体特异亲和的噬菌体。第三轮筛选的噬菌体扩增后随机挑选的多个克隆进行膜斑点印记鉴定和DNA测序，得到与低氧诱导因子1α单克隆抗体结合特异性强、亲和力高的噬菌体多肽。
3.根据权利要求2所述的低氧诱导因子1相关肽筛选方法，其特征在于第一轮筛选时，低氧诱导因子1α单克隆抗体的稀释度为1∶50，TBST洗脱液中Tween-20的比例为0.1％(v/v)；第二轮筛选时，低氧诱导因子1α单克隆抗体的稀释度为1∶100，TBST洗脱液中Tween-20的比例为0.5％(v/v)；第三轮筛选时，低氧诱导因子1α单克隆抗体的稀释度为1∶200，TBST洗脱液中Tween-20的比例为0.5％(v/v)。
4.一种低氧诱导因子1相关肽的应用，其特征在于低氧诱导因子1相关肽可以用于制备治疗缺血缺氧性疾病的药物。
全文摘要
本发明属于多肽生物技术领域。本发明涉及一种低氧诱导因子1相关肽，是一种利用噬菌体展示肽库和低氧诱导因子1α单克隆抗体结合筛选的12肽。本发明还涉及到该12肽的筛选方法，通过改变每轮筛选时的低氧诱导因子1α单克隆抗体的稀释度和TBST洗脱液中Tween－20的比例，使肽库中的与靶分子结合的噬菌体由劣势转为优势，最终得到与靶分子特异结合紧密的序列。低氧诱导因子1相关肽可调节低氧诱导因子1下游基因的表达，对缺血缺氧性疾病的防治及其机理研究具有重要的意义，低氧诱导因子1相关肽尚可以用于制备治疗缺血缺氧性疾病的药物。
文档编号C07K7/08GK1398895SQ02138179
公开日2003年2月26日 申请日期2002年8月28日 优先权日2002年8月28日
发明者王斌, 张爱霞, 肖继皋 申请人:南京医科大学