专利名称：固相支持物表面双链核酸的制备方法
技术领域：
本发明是基础分子生物学及生物医学领域中在固相支持物制备双链核酸的一种独特方法，运用这种方法制备连接双链核酸的固相支持物。
背景技术：
在固相支持物上组装双链核酸的技术在制造双链核酸微阵列芯片、筛选核酸结合蛋白(如转录因子)及核酸结合药物等领域具有重要应用价值。特别是本发明对于制备双链核酸微阵列芯片，提供了一种经济、高效的技术体系。
生物芯片主要是指在固相支持物上组装的核酸、蛋白质、细胞、微小组织等生物活性物质构成的微阵列。应用生物芯片可实现对待检样品中目标核酸分子、蛋白质分子、细胞、微小组织等物质的有无及多少进行准确、快速、大信息量检测。具有微型化、高通量和自动化的检测特征。生物芯片在生物检测、医学检测及疾病诊断、药物筛选和基因序列分析上有着极其重要的应用价值意义，因此受到广泛关注和投资，使其已经成为一个全球性的新型产业，即生物芯片产业。
目前生物芯片的研究和开发种类逐渐趋于多样化，包括最初开发并广泛应用的基因芯片、暂露头角却气势逼人的蛋白质芯片、具有生命特色的细胞芯片和组织芯片。基因芯片和蛋白质芯片能够在转录和翻译两个层面上实现对基因表达的检测，在基因组和蛋白质组的研究中已经成为极其重要的技术平台，同时对医学临床诊断、新药筛选、疗效分析等生物医学领域产生了革命性的影响。
从构成上来说，基因芯片和蛋白质芯片分别由单链DNA寡核苷酸分子和蛋白质分子构成，因此基因芯片只能依靠核酸分子之间的杂交检测经核酸扩增后的样品中目标单链DNA分子的有无及多少，蛋白质芯片主要通过蛋白质与样品中靶蛋白分子的识别及结合检测靶蛋白分子的有无及多少。因此基因芯片不能检测蛋白质，蛋白质芯片也难于检测DNA，这限制了运用DNA芯片直接对蛋白质的检测，而DNA与蛋白质的识别及相互作用在基因组稳定性维持及基因的表达调节中发挥极其重要的作用。传统分子生物学中用来研究DNA与蛋白质相互作用的常规方法主要是凝胶迁移实验(gel shift mobility assay)，但这种方法对实验样品数量需求大、实验耗时长、分析效率低，而且存在放射性标记对实验人员及环境的危害。
双链核酸微阵列芯片是一种生物芯片。双链核酸微阵列芯片能够克服单链核酸微阵列不能检测蛋白质的缺陷，因为DNA结合蛋白常常识别和结合的是双链DNA，籍此在基因的表达调控中发挥重要作用。双链核酸微阵列芯片的制备是这种芯片应用的关键。Lockhart等最早在1996年就提出在固相介质上制备双链DNA探针分子的方法(US patent No.5,556,752)，其基本方法是将两段碱基互补的寡核苷酸运用连接分子连接在一起，将一段固定到固相介质上，通过退火使两段碱基互补的寡核苷酸复性，形成带有突环的双链核酸单分子，用于检测DNA结合生物分子；这一方法由于化学合成两段寡核苷酸，因此生产效率低，成本较高。Bulyk等在1999年最早提出双链核酸微阵列芯片概念，并运用核酸聚合酶引物延伸方法制备双链核酸微阵列(US.Pat.6,326,489)。其主要内容是首先在玻片上通过光刻掩膜原位合成单链寡核苷酸微阵列，合成的每条单链寡核苷酸靠近玻片的3′含有通用引物退火序列，单链寡核苷酸微阵列与通用引物退火后，进行聚合酶引物延伸反应，合成第二链核酸，从而形成双链核酸微阵列。这一方法的缺点是需要在固相介质表面合成含有引物结合位点的较长的寡核苷酸，不利于降低生产成本。
我们先前已经发明了一种双链核酸微阵列制备技术(中华人民共和国国家专利申请号02112780.8)，但其生产成本仍然较高，
发明内容
(1)发明目的本发明的目的是提供一种便于在普通设备条件下固相支持物表面制备双链核酸的方法，而且制备成本低、双链核酸的碱基错配率较单纯互补单链核酸复性制备双链核酸的方法低。可以用来在固相支持物表面生产价值更大的单碱基突变双链核酸。
(2)技术方案本发明是固相支持物表面双链核酸的制备方法，其特征在于该制备方法包括如下步骤(a)化学合成两种单链寡核苷酸片段，其中一个为通用单链寡核苷酸片段，该单链寡核苷酸片段5′端含有两段反向碱基互补序列，3′端含有一段突出的单链寡核苷酸片段，在两段反向碱基互补序列中间间隔C6胺化的脱氧胸腺嘧啶核苷酸；另外一个为探针单链寡核苷酸片段，该单链寡核苷酸片段3′端含有一段能够与通用单链寡核苷酸片段3′端突出的单链寡核苷酸片段碱基完全互补的单链寡核苷酸片段；(b)在液相反应体系中将该通用单链寡核苷酸片段与探针单链寡核苷酸复性并进行核酸连接酶连接反应，从而形成在3′端带有发卡结构的单分子核酸样品；(c)将单分子核酸样品点样到表面被醛基修饰的固相支持物表面，经胺化的脱氧胸腺嘧啶核苷酸将单分子核酸连接在固相支持物表面；(d)寡核苷酸微阵列经核酸聚合酶延伸反应，填平固定的单分子核酸的单链寡核苷酸部分，在支持物表面合成完整的双链核酸分子。固定的单链寡核苷酸片段包括核糖核酸和脱氧核糖核酸两类核酸；用于进行核苷酸聚合反应的核酸聚合酶包括核糖核酸聚合酶、脱氧核糖核酸聚合酶及反转录酶；用于进行核苷酸聚合反应的核苷酸包括所有核糖核苷酸、所有脱氧核糖核苷酸及特殊稀有核苷酸；用于固定单链寡核苷酸的固相支持物包括可用于表面化学研究的拥有刚性和半刚性表面的材料。
(3)技术效果本发明提出的固相支持物表面双链核酸制备方法在标准化、批量化生产上具有三点重要价值一是提出的固相支持物表面双链核酸制备方法依靠合成的特定的通用寡核苷酸本身的特点与探针单链寡核苷酸进行液相互补序列退火与连接反应，形成含有部分双链核酸的特定单分子寡核苷酸，这种特定单分子寡核苷酸能够依靠自身携带的C6胺化的脱氧胸腺嘧啶核苷酸结合到醛基修饰的固相支持物表面，再通过聚合酶延伸反应填平固定的单分子寡核苷酸的单链部分，从而在固相支持物表面合成完整的双链核酸；这种方法若用于在固相支持物表面生产双链核酸微阵列，则能极大地交底生产成本，提高生产效率；本发明提出的固相支持物表面双链核酸生产中，只需在一次性合成的通用寡核苷酸基础上合成多用途单链探针寡核苷酸(如含有DNA结合蛋白结合位点的单链探针寡核苷酸)，就可以经过简单的核酸复性、核酸连接、芯片点样和核酸聚合酶延伸反应四个常规实验，即可大量生产多用途双链寡核苷酸微阵列；二是本发明提出固相支持物表面双链核酸制备方法通过核酸聚合酶延伸合成双链核酸，由于核酸聚合酶的保真性、进行性较化学合成的高，因此对于较长或含有简并核苷酸的核酸片段合成具有重要意义；三是本发明提出的固相支持物表面双链核酸微合成方法，能够保证合成的双链核酸中极低的碱基错配率，这对于生产具有更大商业价值的固相支持物表面单碱基突变双链核酸具有非常重要的价值；这一方法能够克服高价合成一套与在片合成的单链核酸互补的单链核酸却不能通过杂交复性的方法生产具有单碱基突变特征的双链核酸的致命缺陷。
本发明提出的固相支持物表面双链核酸制备方法对DNA结合蛋白的研究尤其具有重要价值。DNA与蛋白质的相互作用在基因组稳定性维持及基因表达调控中发挥着极其重要的作用，特别是序列特异性DNA结合蛋白，这类蛋白质虽然只占细胞核总蛋白的不到0.1％，但这类蛋白质常常是包括转录因子在内的调控基因以一定的时空性、数量性表达的重要反式作用因子，它们通过自己特殊的结构如亮氨酸拉链、锌指结构等基因组中序列特异性双链DNA识别结合，精确调节一类功能相关基因的表达，因此对这类蛋白质及其特异性识别结合的DNA位点的研究在分子生物学、基因组学及目前已成为重点研究对象的蛋白质组学中都占据非常重要的地位。然而对这类蛋白质及其特异性识别结合的DNA位点的研究目前除了传统分子生物学中发展的凝胶迁移实验、DNA酶I足迹实验等方法外，没有一种高通量的标准化筛选方法，且目前已经发展的固相支持物表面单链DNA基因芯片及蛋白质芯片都难以进行这类蛋白质的高效筛选及鉴定。本发明提出的固相支持物表面双链核酸制备技术若用于生产双链核酸微阵列，则可以低价高效制备含有DNA结合蛋白结合为点的双链核酸微阵列，从而用双链核酸微阵列在细胞核全蛋白组范围内高通量筛选序列特异性DNA结合蛋白及其DNA识别位点的研究。这一研究平台的建立，对于研究如下课题具有重要价值。
一是运用本发明提出的固相支持物表面双链核酸制备方法生产双链核酸微阵列可以通过基因芯片点样仪标准化高效制备出某种序列特异性双链DNA结合蛋白如NF-kB的低密度全套单碱基突变双链DNA微阵列芯片，这种芯片与荧光基团标记的对应序列特异性双链DNA结合蛋白如NF-kB反应，通过标准化基因芯片扫描仪对杂交信号的获取的分析，就能够获得这种DNA结合蛋白识别及结合的序列特异性双链DNA位点的碱基构成特点，发现那些参与DNA与蛋白质识别及结合的最关键的碱基及其作用规律。
二是运用本发明提出的固相支持物表面双链核酸制备方法生产双链核酸微阵列可以通过机器点样制备出含有6～10碱基所有可能组合的功能序列的高密度双链DNA微阵列芯片，如含有8碱基所有可能组合功能序列的66536个双链探针的双链DNA微阵列、含有10碱基所有可能组合功能序列的1048576个双链探针的双链DNA微阵列，运用这样一个双链DNA微阵列芯片与某种细胞全细胞核蛋白进行反应，就可以获得某种细胞全细胞核蛋白中所有可能的序列特异性DNA结合蛋白对芯片上其DNA结合序列的识别及结合信息，从而扫描出芯片上存在的所有可能的DNA结合蛋白识别的DNA位点，同时扫描出与芯片上DNA位点结合的所有可能的DNA结合蛋白。这对于高通量筛选DNA结合蛋白及DNA结合蛋白DNA识别位点非常有价值。
三是运用本发明提出的固相支持物表面双链核酸制备方法可以通过点样制备出适当密度但含有目前已研究发现的所有DNA结合蛋白结合位点DNA片段的双链DNA微阵列芯片，通过与处于不同器官组织、不同发育阶段、不同病理状态等的细胞全细胞核蛋白杂交反应，就可以获得与双链DNA微阵列芯片上所有DNA结合的DNA结合蛋白在不同器官组织、不同发育阶段、不同病理状态等细胞中的表达信息，从而揭示它们的功能和相互关系；这种数据信息若结合常规表达型基因芯片的基因表达信息，就可以获得某种DNA结合蛋白参与调控的所有可能的基因，并可将不同的基因进行功能归类，理顺基因表达的相互关系，这对于研究生物的发育、病理及分子医学诊断、治疗、新药开发等重大生物学问题具有非常重要的价值。
本发明创立的独特的固相支持物表面双链核酸制备方法可特别用于精确、高效、经济地在固相支持物如玻片上合成双链核酸微阵列，这种双链核酸微阵列不但其制备基础与国内外基因芯片制备技术完全兼容，而且在应用中与通用基因表达芯片的反应、检测设备完全兼容，提高了该发明产品的使用简便性。因此本发明提出新的在固相支持物表面制备方法双链核酸的方法，在用于生产双链核酸微阵列芯片时，不需要在片原位合成的复杂过程，只需要化学合成一通用单链寡核苷酸和单链探针寡核苷酸，通过退火、连接及点样制作成单分子寡核苷酸微阵列，再通过一个聚合酶延伸反应，就可以将单分子寡核苷酸微阵列转变成双链核酸微阵列，不仅便于普通设施条件下制备双链核酸微阵列，而且制备成本较低、芯片双链核酸的碱基错配率较单纯地互补单链核酸复性制备双链核酸的方法低。最重要的是这种双链核酸微阵列制备方法可以用来生产价值更大的单碱基突变双链核酸微阵列芯片，而这是依靠单纯地互补单链核酸复性制备双链核酸的方法不能解决的。
四
图1是固相支持物表面合成的单分子双链寡核苷酸图2是固相支持物表面合成单分子双链寡核苷酸的流程示意五具体实施方式
1、固相支持物的准备用于本发明制备双链核酸的固相支持物可以是LB膜、(聚)四氟乙烯膜，(聚)偏二氟乙烯膜，聚苯乙烯膜，聚碳酸酯等化学膜、凝胶体、表面化学修饰的玻璃、硅、金等固相化学所用材料；固相支持物表面含有活性基团如羧基、醛基、氨基、羟基、硫醇基等类似基团。
2、单链寡核苷酸的化学合成及单分子核酸样品的制备设计合成探针单链寡核苷酸(附图2A)和通用单链寡核苷酸(附图2B)，合成后将两种寡核苷酸退火(附图2C)、连接形成单分子寡核苷酸(附图2D)。
3、单分子核酸样品在固相支持物表面的固定固相化学合成的单分子寡核苷酸合成后通过机器、手工或电泳等适当方式转移到固相支持物表面，在适当条件下单分子寡核苷酸连接到固相支持物表面(附图2E)。
4、单分子核酸在固相支持物表面的核酸聚合酶反应固相支持物加核酸聚合酶反应溶液，在适宜温度反应适当时间，形成完整的双链核酸分子。(附图2F)。
5、经5中聚合酶聚合反应后的固相支持物依次用2×SSD、0.1％SDS和0.2×SSD、0.1％SDS洗涤，最后用重蒸水简单洗涤，置4℃保存备用。
设计和合成下列单链寡核苷酸进行本发明双链核酸合成的可行性验证探针单链寡核苷酸5′HO-AGTTGAGGGGACTTTCCTTTTTTGGCCCGTACGC-OH 3′通用单链寡核苷酸5′P-GGAATCCCCCTGGGGGATTCCGCGTACG-OH 3′(TC6胺化的脱氧胸腺嘧啶核苷酸)运用这种单链寡核苷酸进行如下两个实验。
1、荧光标记(Cy3)ATP渗入法证实聚合酶合成反应(1)将上面合成的单链寡核苷酸退火、连接，借助C6胺化的脱氧胸腺嘧啶核苷酸点样连接到硅烷化戊二醛处理的玻片上形成3×3阵列，4℃过夜后用硼氢化钠浸泡封闭，再用重蒸水洗涤玻片。
(2)将玻片沸水中煮沸5分钟，冷却至55℃后吹干，迅速在单链寡核苷酸微阵列处滴加55℃预热的核酸杂交缓冲液，盖玻片覆盖后，玻片放湿盒内在55℃水浴保温2小时。
(3)用重蒸水简单洗涤除去杂交缓冲液，玻片寡核苷酸微阵列处滴加含dGTP、dCTP、dTTP、Cy3-dUTP及DNA聚合酶(Klenow酶)的聚合反应缓冲液，盖玻片覆盖后，玻片放湿盒内置37℃水浴保温2小时。
(4)用重蒸水简单洗涤除去聚合反应缓冲液，吹干玻片后基因芯片扫描仪中扫描。(结果有荧光信号)(5)将扫描后的玻片取出后，在玻片寡核苷酸微阵列处滴加HaeIII及其酶切缓冲液，盖玻片覆盖后，玻片放湿盒内在37℃水浴保温2小时。
(6)用重蒸水简单洗涤除去聚合反应缓冲液，吹干玻片后基因芯片扫描仪中扫描。(结果无荧光信号)2、荧光标记(Cy3)NF-kB与双链DNA微阵列结合证实本发明制备的双链DNA微阵列与DNA结合蛋白识别结合的可行性(1)将上面合成的单链寡核苷酸退火、连接，借助C6胺化的脱氧胸腺嘧啶核苷酸点样连接到硅烷化戊二醛处理的玻片上形成3×3阵列，4℃过夜后用硼氢化钠浸泡封闭，再用重蒸水洗涤玻片。
(2)将玻片沸水中煮沸5分钟，冷却至55℃后吹干，迅速在单链寡核苷酸微阵列处滴加55℃预热的核酸杂交缓冲液，盖玻片覆盖后，玻片放湿盒内在55℃水浴保温2小时。
(3)用重蒸水简单洗涤除去杂交缓冲液，在玻片寡核苷酸微阵列处滴加含dGTP、dCTP、dTTP、dATP及DNA聚合酶(Klenow酶)的聚合反应缓冲液，盖玻片覆盖后，玻片放湿盒内置37℃水浴保温2小时。
(4)用重蒸水简单洗涤除去聚合反应缓冲液，甩干玻片后在玻片寡核苷酸微阵列处滴加含Cy3标记的NF-kB及DNA结合缓冲液，盖玻片覆盖后，玻片放湿盒内置25℃水浴保温30分钟。
(5)用重蒸水简单洗涤除去结合反应缓冲液，吹干玻片后基因芯片扫描仪中扫描。(结果有荧光信号)(6)将扫描后的玻片取出后，在玻片寡核苷酸微阵列处滴加HaeIII及其酶切缓冲液，盖玻片覆盖后，玻片放湿盒内在37℃水浴保温2小时。
(7)用重蒸水简单洗涤除去聚合反应缓冲液，吹干玻片后基因芯片扫描仪中扫描。(结果无荧光信号)
权利要求
1.一种在固相支持物表面制备双链核酸的方法，其特征在于该制备方法包括如下步骤(a)化学合成两种单链寡核苷酸片段，其中一个为通用单链寡核苷酸片段，该单链寡核苷酸片段5′端含有两段反向碱基互补序列，3′端含有一段突出的单链寡核苷酸片段，在两段反向碱基互补序列中间间隔C6胺化的脱氧胸腺嘧啶核苷酸；另外一个为探针单链寡核苷酸片段，该单链寡核苷酸片段3′端含有一段能够与通用单链寡核苷酸片段3′端突出的单链寡核苷酸片段碱基完全互补的单链寡核苷酸片段；(b)在液相反应体系中将该通用单链寡核苷酸片段与探针单链寡核苷酸复性并进行核酸连接酶连接反应，从而形成在3′端带有发卡结构的单分子核酸样品；(c)将单分子核酸样品点样到表面被醛基修饰的固相支持物表面，经胺化的脱氧胸腺嘧啶核苷酸将单分子核酸连接在固相支持物表面；(d)寡核苷酸微阵列经核酸聚合酶延伸反应，填平固定的单分子核酸的单链寡核苷酸部分，在支持物表面合成完整的双链核酸分子。
2.根据权利要求1所述的双链核酸制备方法，其特征在于步骤(a)中化学合成的通用单链寡核苷酸片段，其5′端两段反向碱基互补序列所含的核苷酸数目完全相等，并且两段反向碱基互补序列退火后在3′端突出的单链寡核苷酸片段与探针单链寡核苷酸片段3′端核苷酸碱基序列完全互补；通用单链寡核苷酸片段其5端是磷酸基团，3′端是羟基基团。
3.根据权利要求1所述的固相支持物表面双链核酸制备方法，其特征在于步骤(a)中化学合成探针单链寡核苷酸，其3′端含有包括第一个核苷酸在内的一段单链寡核苷酸，该单链寡核苷酸与通用单链寡核苷酸3′端突出的单链寡核苷酸片段的核苷酸数目完全相等，并且碱基序列完全反向互补；探针单链寡核苷酸3′端是羟基基团，5′端最好是羟基基团。
4.根据权利要求1所述的固相支持物表面双链核酸制备方法，其特征在于步骤(a)中化学合成的通用单链寡核苷酸片段5′端两反向碱基互补序列间插入的C6胺化的脱氧胸腺嘧啶核苷酸，其数目可以适当增加，但最好为一个，以便更加有利于两反向碱基互补序列退火形成发卡结构。
5.根据权利要求1所述的固相支持物表面双链核酸制备方法，其特征在于步骤(a)中化学合成的通用单链寡核苷酸片段5′端两反向碱基互补序列间插入的C6胺化的脱氧胸腺嘧啶核苷酸，可以被其他化学修饰的核苷酸或化学分子代替，但代替分子必须与固相支持物表面的化学基团发生化学反应，形成稳定牢固的化学键，从而将步骤(b)形成的单分子寡核苷酸连接到固相支持物表面。
6.根据权利要求1所述的固相支持物表面双链核酸制备方法，其特征在于步骤(b)中化学合成的通用单链寡核苷酸片段与探针单链寡核苷酸在液相反应体系中只经过退火和核酸连接酶连接两个反应就形成3′端带发卡结构的单分子寡核苷酸，而不需要其他更多反应。
7.根据权利要求1所述的固相支持物表面双链核酸制备方法，其特征在于步骤(b)用于连接退火后的通用单链寡核苷酸片段与探针单链寡核苷酸的核酸连接酶包括核糖核酸连接酶和脱氧核糖核酸连接酶，如大肠杆菌DNA连接酶。
8.根据权利要求1所述的固相支持物表面双链核酸制备方法，其特征在于步骤(c)中用于固定单分子寡核苷酸的固相支持物，其表面醛基修饰可以依据权利要求5中通用单链寡核苷酸片段5′端两反向碱基互补序列间插入的C6胺化的脱氧胸腺嘧啶核苷酸的替代分子的化学特性，做相应的改变，以便代替分子与固相支持物表面的化学基团发生化学反应，形成稳定牢固的化学键，将步骤(b)形成的单分子寡核苷酸连接到固相支持物表面。
9.根据权利要求1所述的固相支持物表面双链核制备方法，其特征在于用于步骤(c)固定单分子核酸样品的固相支持物包括LB膜、(聚)四氟乙烯膜、(聚)偏二氟乙烯膜，聚苯乙烯膜，聚碳酸酯、凝胶、玻璃珠、玻璃管、硅颗粒、玻片、硅片等。
10.根据权利要求1所述的固相支持物表面双链核制备方法，其特征在于用于步骤(d)进行核苷酸聚合反应的核酸聚合酶包括核糖核酸聚合酶、脱氧核糖核酸聚合酶及反转录酶，参与核苷酸聚合反应的核苷酸包括所有核糖核苷酸、所有脱氧核糖核苷酸及特殊稀有核苷酸。
全文摘要
固相支持物表面双链核酸的制备方法是基础分子生物学及生物医学领域中在固相支持物制备双链核酸的一种独特方法,运用这种方法制备连接双链核酸的固相支持物。该制备方法包括如下步骤:(a)化学合成两种单链寡核苷酸片段,其中一个为通用单链寡核苷酸片段,另外一个为探针单链寡核苷酸片段,(b)在液相反应体系中将该通用单链寡核苷酸片段与探针单链寡核苷酸复性并进行核酸连接酶连接反应,(c)将单分子核酸样品点样到表面被醛基修饰的固相支持物表面,经胺化的脱氧胸腺嘧啶核苷酸将单分子核酸连接在固相支持物表面;(d)寡核苷酸微阵列经核酸聚合酶延伸反应,填平固定的单分子核酸的单链寡核苷酸部分,在支持物表面合成完整的双链核酸分子。
文档编号C07H21/00GK1389569SQ0213794
公开日2003年1月8日 申请日期2002年7月12日 优先权日2002年7月12日
发明者王进科, 白云飞, 陆祖宏 申请人:东南大学