专利名称：一种从总核糖核酸中有效分离全长、完整信使核糖核酸的方法
技术领域：
本发明涉及一种从总核糖核酸中有效分离全长、完整信使核糖核酸的方法。
背景技术：
在分子生物学和分子遗传学的研究中，尽管许多涉及核糖核酸(RNA)的分析研究可以用总RNA样品来做，但是在诸如构建反转录脱氧核糖核酸(cDNA)文库、检测稀有信使核糖核酸(mRNA)、S1核酸酶作图、体外翻译等的研究中必须采用高质量的全长、完整mRNA样品。因此，mRNA的分离纯化是从事分子生物学研究所必须掌握的基本方法之一。
在真核细胞的总RNA中，核糖体核糖核酸(rRNA)、转移核糖核酸(tRNA)等占了95％以上，而mRNA只占1～5％。由于绝大多数真核细胞的mRNA的3′端均有长度不等的多聚腺苷酸[Poly(A)]尾端，可与寡聚脱氧胸苷[Oligo(dT)]形成氢键，因而可以用Oligo(dT)纤维素亲和色谱法将mRNA分离纯化出来(Sambrook J，et al.Molecular Cloning aLaboratory Manual.2nd ed..New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989，)。
用Oligo(dT)纤维素亲和色谱法分离mRNA首先是由Aviv和Leder 1972年建立的(Aviv H，Leder P..Purification of biolgically active globin messenger RNA by chromatographyon oligothmisylic acid-cellulose.Proc Natl.Acad.Sci.U.SA.，1972，691408-1412.)，尽管后来对这一基本方法作过一些小修改，但其基本原理和基本操作并没有改变。
目前mRNA的分离方法有2种一种是直接从生物组织或细胞的裂解物中分离mRNA，另一种是从总RNA样品中分离mRNA。
mRNA易受核糖核酸酶(RNase)降解，而RNase又极为“顽固”不易灭活。因此要从总RNA样品中分离出高质量的全长、完整mRNA，必须
(1)对所用试剂、溶液、用具等进行严格的RNase灭活处理；
(2)在操作中小心避免外源性RNase对试剂、溶液、用具等的污染；
(3)对总RNA样品中残留的内源性RNase活性作有效的抑制或灭活处理。
目前市场上有各种mRNA分离试剂盒供应，这些试剂盒的主要特点是用微粒状的Oligo(dT)吸附剂代替纤维状的Oligo(dT)纤维素，用旋转柱法(Spin-column protocol)取代传统的柱色谱法(Chromatography column protocol)，并为用户准备好了分离mRNA用的全套试剂和材料，因而简化了操作步骤，缩短了分离时间，提高了工作效率。例如Qiagen公司的mRNA分离试剂盒用的吸附剂是将Oligo(dT)连接在聚苯乙烯胶粒上，成小珠状，商品名为Oligotex。该试剂盒的分离方法是(1)溶解用无RNase的水溶解总RNA；(2)变性加入由pH7.5的2mmol/L三羟甲基氨基甲烷(Tris)-盐酸(HCl)和2mmol/L乙二胺四乙酸(ETDA)和1mol/L NaCl和2g/L十二烷基硫酸钠组成的吸附缓冲液，再加入吸附剂Oligotex，然后于70℃水浴处理3分钟；(3)吸附从70℃水浴中取出变性样品，放室温下静置10分钟；(4)洗涤用由pH7.5的10mmol/L Tris-HCl和1mmol/L EDTA和0.15mol/LNaCl组成的洗涤缓冲液洗涤Oligotex 2次；(5)洗脱用预热至70℃的pH7.5的5mmol/LTris-HCl洗脱缓冲液，洗脱吸附在Oligotex上的mRNA(OligotexTM Handbook Qiagen，July1999.)。
尽管试剂盒给mRNA分离工作带来许多方便，但仍有不足之处(1)mRNA分离得率不高；(2)价格昂贵，这对于需大批量分离mRNA的实验室来说是难于承受的。
此外，目前普遍采用的总RNA分离方法，例如TRIZOL法和“一步法”(ChomzynskiP.，Sacchi N..Single-step method of RNA isolation by acid guanidiniumthiocyanate-phenol-chloroform extraction.Anal.Biochem.，1987，162156-159.)等，在其分离到的总RNA中常常残留有内源性RNase活性，因而常常造成mRNA分离的失败。因此，在本技术领域需要一种mRNA得率高、成本低廉并能有效抑制和消除总RNA样品中可能存在的内源性RNase活性，确保能够分离到全长、完整mRNA的方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种mRNA得率高、成本低廉，并能有效抑制和消除总RNA样品中的内源性RNase活性，确保能够分离到全长、完整mRNA的方法。
本发明的技术特征在于(1)用十二烷基硫酸钠或十二烷基磺酸钠作为RNase抑制剂，使用于总RNA溶解和mRNA分离的各个步骤中；(2)在洗涤中使用了两种加有十二烷基硫酸钠或十二烷基磺酸钠的缓冲液，比较彻底地洗去了mRNA以外的其他RNA，提高了mRNA的纯度，并且有效地除去了可能存在的RNase活性，从而可以使用较廉价的Oligo(dT)纤维素作吸附剂，达到高得率、低成本地从总RNA样品中成功分离全长、完整的mRNA，实现了本发明的目的。
本发明一种从总核糖核酸(英文缩写Total RNA)中有效分离全长、完整信使核糖核酸(英文缩写mRNA)的方法，包括(1)溶解，(2)变性，(3)吸附，(4)洗涤，(5)洗脱5个步骤，为了更清楚说明本发明技术特征，下面分别对5个步骤详细说明。
(1)溶解；把总核糖核酸干燥品溶解在含有0.5～5g/L十二烷基硫酸钠或十二烷基磺酸钠的无核糖核酸酶的水中，然后测定水中总核糖核酸的浓度，并用变性琼脂糖凝胶电泳检测总核糖核酸的质量，当观察到18S核糖体核糖核酸(英文缩写rRNA)带和28S rRNA带清晰，且两者亮度比为1∶2时，则可进行下一步骤。
所述的十二烷基硫酸钠或十二烷基磺酸钠的含量最好为1g/L，所述的变性琼脂糖凝胶电泳检测可以采用通常使用的方法，例如甲醛变性琼脂糖凝胶电泳检测或乙二醛-二甲基亚砜变性琼脂糖凝胶电泳检测法等。
(2)变性把上述检测合格的总核糖核酸水溶液放在60～70℃水浴中处理3～25分钟，以破坏核糖核酸的二级结构，使其多聚腺苷酸[英文缩写Poly(A)]尾端裸露出来，立即置冰浴或冰盐浴中冷却至4～10℃。
所述的水浴温度最好是65℃，处理时间最好是20分钟，冷却时间要求不是很严格，根据冷却浴的温度而异，只要冷却至4～10℃即可。
(3)吸附在上述经过变性的总核糖核酸溶液中加入与之等体积的吸附缓冲液，然后吸附剂按1mg总核糖核酸3～150mg湿重(最好120mg湿重)的比例加入，用亲和色谱法吸附总核糖核酸中的信使核糖核酸。
所述的吸附缓冲液组成为pH7.0～8.0的5～100mmol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸(即Tris-HCl)和1～10mmol/L乙二胺四乙酸(即EDTA)和0.8～1.2mol/L氯化钠(即NaCl)和0.5～5g/L十二烷基硫酸钠或十二烷基磺酸钠，最好的组成是pH7.5的20mmol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸和2mmol/L乙二胺四乙酸和1mol/L氯化钠和1g/L十二烷基硫酸钠(即英文缩写SDS)或十二烷基磺酸钠。
所述的吸附剂是寡聚脱氧胸苷[英文缩写Oligo(dT)]共价连接在载体上形成的物质，例如寡聚脱氧胸苷连接在纤维素上成纤维状，即商品名为Oligo(dT)纤维素的物质或寡聚脱氧胸苷连接在聚苯乙烯胶粒上，成小珠状，商品名为Oligotex的物质等，所述的吸附剂还可以是具有寡聚脱氧胸苷一样功能的、能与信使核糖核酸3′端的多聚腺苷酸通过氢键结合的物质连接在载体上形成的物质，例如聚尿苷酸-葡聚糖凝胶，即商品名为Poly(U)-Sephadex的物质。
所述的亲和色谱法是通常使用的方法，例如批量分离法、旋转柱法、柱色谱法等，也可以批量分离法和旋转柱法联用。
所述的吸附可以采用静置吸附，也可以水平振荡吸附，例如可采用室温下以50～80r/min水平振荡30～60分钟。
(4)洗涤上述吸附步骤完成后，分离去液相，固相的吸附剂先用平衡缓冲液洗涤，然后再用洗涤缓冲液洗涤，以除去吸附剂上信使核糖核酸以外的其它核糖核酸和可能存在的RNase活性，洗涤后分离去液相。
所述的平衡缓冲液的组成是pH7.0～8.0的5～100mmol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸和0.5～10mmol/L乙二胺四乙酸和0.4～0.6mol/L氯化钠和0.5～5g/L十二烷基硫酸钠或十二烷基磺酸钠，最好的组成是pH7.5的10mmol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸和1mmol/L乙二胺四乙酸和0.5mol/L氯化钠和1g/L十二烷基硫酸钠或十二烷基磺酸钠。
所述的洗涤缓冲液的组成是pH7.0～8.0的5～100mmol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸和0.5～10mmo1/L乙二胺四乙酸和0.1～0.2mol/L氯化钠和0.5～5g/L十二烷基硫酸钠或十二烷基磺酸钠，最好的组成是pH7.5的10mmol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸和1mmol/L乙二胺四乙酸和0.15mol/L氯化钠和1g/L十二烷基硫酸钠或十二烷基磺酸钠。
平衡缓冲液与洗涤缓冲液的用量和洗涤次数没有严格限制，用量少了可多洗几次，用量多了可少洗几次，用量多一些，洗涤次数多一些，也可以，但用量太多或洗涤次数太多，既浪费溶剂也浪费时间，还可能会造成mRNA的损失。最好按1mg总核糖核酸0.5-1mL平衡缓冲液或洗涤缓冲液的比例，洗涤2～3次。
所述的分离去液相的方法是采用通常的方法，例如离心、过柱、过滤等，根据所用的亲和色谱法不同，可以采用不同的方法，例如采用旋转柱法或批量分离法或批量分离法和旋转柱法结合的方法时可以采用离心分离去液相。
(5)洗脱用室温至70℃，最好是65℃的洗脱缓冲液把吸附在吸附剂上的信使核糖核酸洗脱出来，然后收集含有信使核糖核酸的洗脱缓冲液。
所述的洗脱缓冲液的组成是pH7.0～8.0的5～20mmol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸和0～5mmol/L 乙二胺四乙酸和0～1g/L十二烷基硫酸钠或十二烷基磺酸钠，最好的组成是pH7.5的10mmol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸和1mmol/L乙二胺四乙酸。
洗脱缓冲液的用量和洗脱次数根据所用亲和色谱而有所不同，对批量分离法和旋转柱法按1mg核糖核酸60～100μL洗脱缓冲液的比例，对柱色谱法用量要多一些。洗脱的次数最好2～3次。含有信使核糖核酸洗脱液的收集方法采用通常的方法，可以过柱分离，可以离心分离，也因所用色谱法而异。
本发明所述的总核糖核酸可以来自(1)人体组织或细胞，(2)动物组织或细胞，(3)植物组织或细胞，(4)其它真核生物组织或细胞，通过TRIZOL试剂法或酸性-硫氰酸胍-酚-氯仿法即“一步法”或其它分离方法沉淀得到。
本发明所用的水和溶液，除三羟甲基氨基甲烷(英文缩写Tris)溶液外，均需加入焦碳酸二乙脂(英文缩写DEPC)至1g/L处理过夜，然后高压灭菌。Tris溶液需用无RNase的Tris、水及容器配制，然后高压灭菌。
本发明所用的吸附剂需用0.1mol/L的NaOH悬浮洗涤离心5～7次，然后用平衡缓冲液悬浮洗涤离心5～7次，直至上清液pH为7.5。
上述对本发明所用水、试剂、容器和吸附剂的要求及处理方法均是本领域实验操作基本的要求和方法，不是本发明的特有技术。
本发明一种从总核糖核酸中有效分离全长、完整信使核糖核酸的方法，由于采用了如下的特征技术(1)在总RNA溶解、mRNA吸附、洗涤、洗脱的分离过程中都使用了十二烷基硫酸钠或十二烷基磺酸钠作为RNase的抑制剂，有效抑制了RNA样品中可能存在的内源性RNase活性，使之不会对mRNA造成破坏；(2)在洗涤过程中采用了两种加有十二烷基硫酸钠或十二烷基磺酸钠的缓冲液，首先使用平衡缓冲液，在该溶液条件下，mRNA能牢固保留在吸附剂上，而把mRNA以外的其它RNA洗脱出来，接着使用洗涤缓冲液，把与吸附剂非特异性结合的mRNA以外的其它RNA洗脱出来，这样提高了mRNA分离的纯度，并去除了可能存在的RNase活性，这样使本发明能够采用比较廉价的寡聚脱氧胸苷纤维素，即商品名Oligo(dT)纤维素的吸附剂，实现从总RNA中有效分离出全长、完整的mRNA
本发明具有如下优点
(1)成本低廉分离成本仅为3.4～5.0元/μgmRNA，
(2)mRNA得率高mRNA分离得率稳定在20～50μg/mg总RNA，因来自不同组织的总RNA样品而异；
(3)质量保证能有效抑制总RNA样品中可能存在的内源性RNase活性，确保能够分离到全长、完整的mRNA，且重复性好，所得的mRNA可直接或作适当纯化后用于NorthernBlots杂交分析、反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)，S1酶切分析、体外翻译等；
(4)适用范围广可用于不同种类的真核mRNA的分离，特别适用于从内源性RNase活性高的哺乳动物组织或细胞中提取的总RNA中分离纯化mRNA。
本发明与Qiagen公司的mRNA分离试剂盒的分离效果比较见下表
图1
小鼠的mRNA电泳图谱(2μg/泳道)；
M分子质量标准；
mRNA来源1.脑，2.心，3.肝，4.肺，5.脾，6.肾，7.睾丸，8骨骼肌。
图2
小鼠mRNANorthernBlots杂交图谱(mRNA 2μg/泳道)；
mRNA来源1.脑，2.心，3.肝，4.肺，5.脾，6.肾，7.睾丸，8.骨骼肌。
用DIG标记的β-actin探针(8ng/mL)杂交结果。
图3
RT-PCR扩增G3PDH基因片段(1.2kb)；
用小鼠肝mRNA为模版，模版用量1.905ng；2.452ng；3.181ng；4.90ng；5.18ng。
图4
人的mRNA电泳图谱(2μg/泳道)；
M分子质量标准；
mRNA来源1.脑，2.心，3.肝，4.肺，5.脾，6.胃，7.睾丸，8.骨骼肌。
图5
人mRNA Northern Blots杂交图谱(mRNA 2μg/泳道)；
mRNA来源1.脑，2.心，3.肝，4.肺，5.脾，6.胃，7.睾丸，8.骨骼肌。
用DIG标记的β-actin探针(8ng/mL)杂交结果。
图6
RT-PCR扩增p53基因片段(1.0kb)；
人肝mRNA为模版，模版量1.30ng，2.185ng，3.925ng。
具体实施例方式
下面的实施例是举例说明本发明，而不是进行限定。
实施例1从小鼠组织分离的总RNA中分离纯化mRNA。A所需试剂和材料
1.小鼠8种组织(脑、心、肝、肺、脾、肾、睾丸、骨骼肌)的总RNA(用“一步法”分离)。
2.无RNase水(加有1g/L SDS)。
3.吸附缓冲液pH7.5的20mmol/L Tris-HCl和2mmol/L EDTA和1mol/L NaCl和1g/L SDS。
4.平衡缓冲液pH7.5的10mmol/L Tris-HCl和1mmol/L EDTA和0.5mol/L NaCl和1g/L SDS 。
5.洗涤缓冲液pH7.5的10mmol/L Tris-HCl和1mmol/L EDTA和0.15mol/L NaCl和1g/L SDS。
6.洗脱缓冲液pH7.5的10mmol/L Tris-HCl和1mmol/L EDTA。
说明上述溶液除Tris外，均需加入DEPC(焦碳酸二乙酯)至1g/L处理过夜，然后高压灭菌。Tris溶液需用无RNase的Tris、水及容器配制，然后高压灭菌。
7.Oligo(dT)-Cellulose Type 7(Pharmacia公司产品)称取320毫克Oligo(dT)纤维素，加入0.1mol LNaOH浸泡10～20分钟，12000r/min离心3分钟去上清，再用0.1mol/L NaOH悬浮洗涤离心5次，然后用平衡缓冲液悬浮洗涤离心7次，直至上清pH为7.5，最后将Oligo(dT)纤维素悬浮在平衡缓冲液中备用。
8.旋转柱(MSK-100，Axygen)。B实验操作
1.将沉淀干燥出来的小鼠总RNA溶解在加有SDS的无RNase水中，取样测定总RNA浓度，并进行甲醛变性琼脂糖凝胶电泳检查总RNA的质量，如果质量合格(18S rRNA和28SrRNA带清晰，且亮度比为1∶2)则可用于mRNA分离，反之则不可用。
2.取500μL总RNA(浓度2mg/mL)到1.5mL离心管中，放65℃水浴中处理20分钟使RNA变性，然后立即放冰浴中冷却10分钟。
3.加入500μL吸附缓冲液混匀，按1mg总RNA加入120mg湿重的量加入Oligo(dT)纤维素，在室温下水平振荡(50～80r/min)60分钟吸附mRNA。
4.室温下，12000r/min离心3分钟去上清。
5.加入0.7mL平衡缓冲液悬浮洗涤Oligo(dT)纤维素，12000r/min离心3分钟去上清。共洗涤3次。
6.再加入0.7mL洗涤缓冲液悬浮洗涤2次，12000r/min离心3分钟去上清。
7.用0.7mL洗涤缓冲液将Oligo(dT)纤维素全部洗至旋转柱中，10000r/min离心1分钟除去洗涤缓冲液。
8.将旋转柱转移至另一干净的1.5mL管中，向柱内加入80μL洗脱缓冲液(65℃预热)，静置1分钟，在10000r/min离心30秒，收集洗脱出来的mRNA。
9.再加入80μL洗脱缓冲液(65℃预热)到柱子内，进行第二次洗脱。
10.将2次洗脱出来的mRNA合并，放-70℃保存。
11.结果
a.经甲醛变性琼脂糖凝胶电泳检测表明，用本发明方法分离到的8种小鼠组织mRNA的大小主要集中在0.5～8.0kb(千碱基对)范围内，无降解现象(见图1)。
b.用DIG标记的β-actin探针进行Northern Blots杂交分析，结果显示β-actm杂交带清晰锐利(见图2)，说明本发明分离到的mRNA是全长、完整的。
c.用分离到的小鼠肝mRNA作为模版进行G3PDH基因的RT-PCR扩增获得良好结果(见图3)，说明本发明分离出的mRNA完整、质量高。
实施例2从人体组织分离的总RNA中分离纯化mRNA。A所需试剂和材料
1.人体8种组织(脑、心、肝、肺、脾、胃、睾丸、骨骼肌)的总RNA(用TRIZOL试剂分离)。
2.无RNase水(加有1g/L SDS)。
3.吸附缓冲液pH7.5的20mmol/L Tris-HCl和2mmol/L EDTA和1mol/LNaCl和1g/L SDS。
4.平衡缓冲液pH7.5的10mmol/L Tris-HCl和1mmol/L EDTA和0.5mol/L NaCl和1g/L SDS。
5.洗涤缓冲液pH7.5的10mmol/L Tris-HCl和1mmol/L EDTA和0.15mol/L NaCl和1g/L SDS。
6.洗脱缓冲液pH7.5的10mmol/L Tris-HCl和1mmol/L EDTA。
说明上述溶液除Tris外，均需加入DEPC(焦碳酸二乙酯)至1g/L处理过夜，然后高压灭菌。Tris溶液需用无RNase的Tris、水及容器配制，然后高压灭菌。
7.Oligo(dT)-Cellulose Type 7(Pharmacia公司的产品)称取320毫克Oligo(dT)纤维素，加入0.1mol/L NaOH浸泡10～20分钟，12000r/min离心3分钟去上清，再用0.1mol/L NaOH悬浮洗涤离心5次，然后用平衡缓冲液悬浮洗涤离心7次，直至上清pH为7.5，最后将Oligo(dT)纤维素悬浮在平衡缓冲液中备用。
8.旋转柱(MSK-100，Axygen)。B实验操作
1.将沉淀干燥出来的人体总RNA溶解在加有SDS的无RNase水中，取样测定总RNA浓度，并进行甲醛变性琼脂糖凝胶电泳检测总RNA质量。如果总RNA质量合格(18S rRNA和28S rRNA带清晰，且亮度比为1∶2)则可用于mRNA分离，反之则不可用。
2.取500μL总RNA(浓度2mg/mL)到1.5mL离心管中，放65℃水浴中处理20分钟使RNA变性，然后立即放冰浴中冷却10分钟。
3.加入500μL吸附缓冲液混匀，按1mg总RNA加入120mg湿重的量加入Oligo(dT)纤维素，在室温下水平振荡(50～80r/min)60分钟吸附mRNA。
4.室温下，12000r/mim离心3分钟去上清。
5.加入0.7mL平衡缓冲液悬浮洗涤Oligo(dT)纤维素，12000r/min离心3分钟去上清。共洗涤3次。
6.再加入0.7mL洗涤缓冲液悬浮洗涤2次，12000r/min离心3分钟去上清。
7.用0.7mL洗涤缓冲液将Oligo(dT)纤维素全部洗至旋转柱中，10000r/min离心1分钟除去洗涤缓冲液。
8.将旋转柱转移至另一干净的1.5mL管中，加入80μL洗脱缓冲液(65℃预热)，静置1分钟，在10000r/min离心30秒，收集洗脱出来的mRNA。
9.再加入80μL洗脱缓冲液(65℃预热)到柱子内，进行第二次洗脱。
10.将2次洗脱出来的mRNA合并，放-70℃保存。
11.结果
a.经甲醛变性琼脂糖凝胶电泳检测表明，用本发明方法分离到的8种人体组织mRNA的大小主要集中在0.5～8.0kb范围内，无降解现象(见图4)。
b.用DIG标记的β-actin探针进行Northern Blots杂交分析，结果显示β-actin杂交带清晰锐利(见图5)，说明分离到的mRNA是全长、完整的。
c.用分离到的人肝mRNA作为模版进行p53基因的RT-PCR扩增获得良好结果(见图6)，说明本发明分离出的mRNA完整、质量高。
权利要求
1、一种从总核糖核酸中有效分离全长、完整信使核糖核酸的方法，包括5个步骤
(1)溶解把总核糖核酸干燥品溶解在含0.5～5g/L十二烷基硫酸钠或十二烷基磺酸钠的无核糖核酸酶的水中，然后测定水中总核糖核酸浓度，并用变性琼脂糖凝胶电泳检测总核糖核酸的质量，当观察到18S核糖体核糖核酸带和28S核糖体核糖核酸带清晰，且两者亮度比为1∶2时，则可进行下一步骤；
(2)变性把上述检测合格的总核糖核酸水溶液放入60～70℃水浴中处理3～25分钟，以破坏核糖核酸的二级结构，使其多聚腺苷酸尾端裸露出来，立即置冰浴或冰盐浴中冷却至4～10℃；
(3)吸附在上述经过变性的总核糖核酸溶液中加入与之等体积的吸附缓冲液，然后吸附剂按1mg总核糖核酸3～150mg湿重的比例加入，用亲和色谱法吸附总核糖核酸中的信使核糖核酸；所述的吸附缓冲液组成为pH70～8.0的5～100mmol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸和1～10mmol/L乙二胺四乙酸和0.8～1.2mol/L氯化钠和0.5～5g/L十二烷基硫酸钠或十二烷基磺酸钠，所述的吸附剂是寡聚脱氧胸苷，即英文缩写为Oligo(dT)的物质，共价连接在载体上形成的物质或具有寡聚脱氧胸苷一样功能的、能与信使核糖核酸3′端的多聚腺苷酸通过氢键结合的物质连接在载体上形成的物质；
(4)洗涤上述吸附步骤完成后，分离去液相，固相的吸附剂先用平衡缓冲液洗涤，然后再用洗涤缓冲液洗涤，以除去吸附剂上信使核糖核酸以外的其他核糖核酸和可能存在的核糖核酸酶活性，洗涤后分离去液相；所述的平衡缓冲液的组成是pH7.0～8.0的5～100mmol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸和0.5～10mmol/L乙二胺四乙酸和0.4～0.6mol/L氯化钠和0.5～5g/L十二烷基硫酸钠或十二烷基磺酸钠；所述的洗涤缓冲液的组成是pH7.0～8.0的5～100mmol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸和0.5～10mmol/L乙二胺四乙酸和0.1～0.2mol/L氯化钠和0.5～5g/L十二烷基硫酸钠或十二烷基磺酸钠；
(5)洗脱用室温～70℃的洗脱缓冲液把吸附在吸附剂上的信使核糖核酸洗脱出来，然后收集含有信使核糖核酸的洗脱缓冲液；所述的洗脱缓冲液的组成是pH7.0～8.0的5～20mmol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸和0～5mmol/L乙二胺四乙酸和0～1g/L十二烷基硫酸钠或十二烷基磺酸钠。
2、根椐权利要求1所述的一种从总核糖核酸中有效分离全长、完整信使核糖核酸的方法，其特征在于
(1)所述的溶解步骤中总核糖核酸溶解在含1g/L十二烷基硫酸钠或十二烷基磺酸钠的无核糖核酸酶的水中；
(2)所述的变性步骤中总核糖核酸水溶液放入65℃水浴中处理20)分钟；
(3)所述的吸附步骤中
①吸附剂按1mg总核糖核酸120mg湿重的比例加入；
②所述的亲和色谱法是指批量分离法和或旋转柱法或柱色谱法；
③所述的吸附缓冲液组成是pH7.5的20mmol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸和2mmol/L乙二胺四乙酸和1mol/L氯化钠和1g/L十二烷基硫酸钠或十二烷基磺酸钠；
④所述的吸附剂是寡聚脱氧胸苷-纤维素，即商品名为Oligo(dT)纤维素的物质，或是寡聚脱氧胸苷连接在聚苯乙烯胶粒上，即商品名为Oligotex的物质，或是寡聚尿苷酸-葡聚糖凝胶，即商品名为Poly(U)-Sephadex的物质；
⑤所述的吸附采用室温下以50～80r/min水平振荡30～60分钟的水平振荡吸附；
(4)所述的洗涤步骤中，所述的平衡缓冲液按1mg总核糖核酸0.5～1mL的比例加入，其组成是pH7.5的10mmol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸和1mmol/L乙二胺四乙酸和0.5mol/L氯化钠和1g/L十二烷基硫酸钠或十二烷基磺酸钠；所述的洗涤缓冲液按1mg总核糖核酸0.5～1mL的比例加入，其组成是pH7.5的10mmol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸和1mmol/L 乙二胺四乙酸和0.15mol/L氯化钠和1g/L十二烷基硫酸钠或十二烷基磺酸钠；
(5)所述的洗脱步骤中，用65℃的洗脱缓冲液把吸附在吸附剂上的信使核糖核酸洗脱出来；所述的洗脱缓冲液组成是pH7.5的10mmol/L的三羟甲基氨基甲烷-盐酸和1mmol/L乙二胺四乙酸。
3、根椐权利要求1所述的一种从总核糖核酸中有效分离全长、完整信使核糖核酸的方法，其特征在于
(1)所述的亲和色谱法是批量分离法和或旋转柱法或柱色谱法；
(2)所述的吸附剂是寡聚脱氧胸苷-纤维素，即商品名为Oligo(dT)纤维素的物质，或是寡聚脱氧胸苷连接在聚苯乙烯胶粒上，即商品名为Oligotex的物质，或是寡聚尿苷酸-葡聚糖凝胶，即商品名为Poly(U)-Sephadex的物质。
全文摘要
本发明涉及一种从总核糖核酸(Total RNA)中有效分离全长、完整信使核糖核酸(mRNA)的方法。其特征在于用十二烷基硫酸钠或十二烷基磺酸钠作为核糖核酸酶(RNase)抑制剂，在溶解总RNA的溶液中和在分离mRNA用的溶液系统中均加入十二烷基硫酸钠或十二烷基磺酸钠以防止RNase对mRNA的降解，并通过两种缓冲液洗涤以除去mRNA以外的其它RNA和可能存在的RNase活性，从而有效地分离出全长、完整的mRNA分子。本发明方法成本低廉、mRNA得率高，特别适用于从内源性RNase活性高的哺乳动物细胞或组织中抽提的总RNA中分离纯化mRNA。
文档编号C07H1/06GK1475493SQ0213456
公开日2004年2月18日 申请日期2002年8月16日 优先权日2002年8月16日
发明者叶志华, 梁培华, 郭俊, 张向阳, 丁野青, 丁达明, 梁建庆, 姚志海, 杜纲国, 高冬梅 申请人:深圳市君轩生物技术有限公司, 广东省微生物研究所