专利名称：蝎抗心律失常肽及其制备方法和应用的利记博彩app
技术领域：
本发明涉及一种蝎抗心律失常肽，以及产生蝎抗心律失常肽的方法。具体地说，本发明涉及一种高效生物活性的蝎抗心律失常肽，采用基因工程和生物化学手段产生蝎抗心律失常肽的方法，产生的蝎抗心律失常肽在制备抗心律失常药中的应用。
本发明的还有一个目的在于提供一种蝎抗心律失常肽在抗心律失常药中的应用。
本发明的再一个目的在于提供一种用基因工程方法产生的蝎抗心律失常肽在抗心律失常药中的应用。
一种蝎抗心律失常肽，其特征是，该活性肽的氨基酸序列如下DGYIRGSNGCLWGNEGCNKECKGFGYCWTWGLACWCEGLTWKSESNTCG。
本发明提供的蝎抗心律失常肽与从蝎抗心律失常肽cDNA推导的成熟氨基酸序列一至，并且不含有影响生物活性的额外组氨酸片段和其它氨基酸序列。蝎抗心律失常肽呈可溶状态，不形成包含体，圆二色谱显示其二级结构与其它天然蝎毒多肽相似，即这种肽能真实反应蝎抗心律失常基因的功能。本发明提供的重组肽不仅有抗癫痫的作用而且有明显的抗心律失常作用。
一种生产蝎抗心律失常肽的方法，包括设计PCR引物，用PCR从东亚钳蝎蝎毒cDNA库中扩增蝎抗心律失常肽基因片段，并通过表达载体转化到大肠杆菌中表达。其特征是设计的PCR引物含小肠激酶酶切位点，用PCR扩增的蝎抗心律失常肽基因片段克隆到pGEX-5x-1表达载体中，转化到大肠杆菌BL21中获得重组大肠杆菌BL21(pGEX/BmKIM)，经IPTG诱导后，用小肠激酶酶切表达的融合蛋白，再经过脱盐而获得可溶的蝎抗心律失常肽。
从构建的蝎毒腺cDNA文库(Xian-chun Zeng，Wen-Xin Li，Shun-Yi Zhu，Fang Peng，Toxicon 2000 38893-899)中筛选到与抗神经兴奋肽基因相似的cDNA序列，在推导的氨基酸序列中，其信号肽区有三个氨基酸的差异，其它区域相同，称此cDNA序列为蝎抗心律失常肽基因 上述为蝎抗心律失常肽的cDNA序列，下划线的部分为信号肽区，阴影部分是蝎毒多肽在体内加工成熟的过程中按照贯例会被切除的部分，加点的区域为引物设计区，加黑字母表示与蝎抗神经兴奋肽不同的氨基酸。根据蝎抗心律失常肽基因序列设计上游、下游引物，将蝎抗心律失常肽基因扦入表达载体pGEX-5x-1质粒，构建重组表达载体，转化大肠杆菌BL21，获得重组大肠杆菌BL21(pGEX/BmKIM)。经IPTG诱导，表达谷胱甘肽转移酶-蝎抗心律失常肽融合蛋白，经谷胱甘肽亲和层析柱纯化后用小肠激酶酶切，酶切产物经过SephadexG-50纯化和脱盐，得到可溶的且有活性的重组蝎抗心律失常肽。
一种优化的生产蝎抗心律失常肽的方法，其特征是PCR上游引物A1，5’-GCCGGATCCCCGATGACGATGACAAGGATGGATATATAAGA-3’，该引物含有BamHI限制性内切酶酶切位点和小肠激酶酶切位点；PCR下游引物A2，5’-GCCCTCGAGTCAACCGCATGTATTACTTTCAG-3’该引物含有XohI限制性内切酶酶切位点。
用此引物经PCR扩增所得产物经BamHI和XohI酶切后克隆到pGEX-5x-1，经转化得到重组大肠杆菌BL21(pGEX/BmKIM)。IPTG诱导表达，用小肠激酶对表达的融合蛋白进行酶切，获得可溶性的蝎抗心律失常肽。
根据蝎抗心律失常肽基因的成熟肽段，即不包括信号肽段和在体内加工时会被切去的最后三个氨基酸的基因片段设计引物，即蝎抗心律失常肽cDNA 64-79nt处设计PCR上游引物A1，5’-GCCGGATCCCCGATGACGATGACAAGGATGGATATATAAGA-3’含有BamHI限制性内切酶酶切位点和小肠激酶酶切位点；根据蝎抗心律失常肽cDNA 226-246nt处设计下游引物A2，5’-GCCCTCGAGTCAACCGCATGTATTACTTTCAG-3’含有XohI限制性内切酶酶切位点。由于PCR上游引物中含有小肠激酶酶切位点基因序列，这使得重组大肠杆菌表达获得的融合蛋白谷胱甘肽转移酶-蝎抗心律失常肽中含有了小肠激酶酶切位点，从而通过小肠激酶酶切就可以分开谷胱甘肽转移酶和蝎抗心律失常肽，以获得不含有额外氨基酸的蝎抗心律失常肽。
一种优化的生产蝎抗心律失常肽的方法还包括1.用谷胱甘肽转移酶亲和层析柱对表达的蛋白质进行纯化。
重组大肠杆菌BL21(pGEX/BmKIM)经IPTG诱导表达重组融合蛋白谷胱甘肽转移酶-蝎抗心律失常肽，利用谷胱甘肽转移酶亲和层析柱进行纯化，可以有效地将融合蛋白与其它杂蛋白分离，融合蛋白挂在柱子上。
2.小肠激酶酶切融合蛋白得到具有抗心律失常活性的蝎抗心律失常肽。
被挂在柱子上的融合蛋白直接经小肠激酶酶切，可以使融合蛋白中的谷胱甘肽转移酶与蝎抗心律失常肽分开，谷胱甘肽转移酶留在柱子上，蝎抗心律失常肽从亲和层析柱中流出。最后，酶切产物通过Sephadex G-50脱盐得到具有生物活性的蝎抗心律失常肽。
蝎抗心律失常肽在制备抗心律失常药中的应用。
利用基因工程方法生产的蝎抗心律失常肽在制备抗心律失常药中的应用。
本发明提供的蝎抗心律失常肽以及通过本发明的方法生产的蝎抗心律失常肽可以用于制备抗心律失常药物。这种蝎抗心律失常肽可与药学上可接受的载体，例如；赋形剂如葡萄糖、乳糖、甘露醇、甘氨酸、水等；填充剂如淀粉、蔗糖等；润滑剂如滑石粉、硬脂酸钙、聚乙二醇等；吸收促进剂如脱氧胆酸钠、牛磺甘胆酸盐、N-甲基吡咯烷酮、EDTA、Tween-80、SDS、Brij-78等；增粘剂如甲基纤维素、聚丙烯酰胺、玻璃酸钠等或与其它治疗抗心律失常药物混合使用。本发明生产的蝎抗心律失常肽可以组合物的形式通过注射、眼结膜吸收、鼻吸入、皮肤吸收、直肠内给药的方式以水剂、固定剂或其它剂型使用。本发明生产的蝎抗心律失常肽可以与一种或多种载体混合，然后按照药学领域的常规生产方法将其制成所需的剂型。这种药物组合物含有重量比可以为0.2％-97％的活性成分。
由于不同生产方法所得到的不同重组肽在功能上也必然有所差异。根据本发明的生产方法，所得到的重组蛋白质有以下优点和效果A、重组肽中不含由多个His氨基酸或其它氨基酸组成的额外片段，与由cDNA推测的成熟肽一至。B、所得到的重组肽是可溶的，非包涵体状态而且产量高，产量为2mg蝎抗心律失常肽/L培养物。C、通过大白鼠癫痫模型证明所得到的重组肽无论在大白鼠表观上、脑电图上、还是脑的电镜照片上都有十分有效的抗癫痫(神经兴奋)作用，可以延长癫痫发作时间47％。D、本发明所得到的重组肽不仅有抗癫痫(神经兴奋)作用而且具有十分明显的抗心律失常的作用，可以增加诱发心律失常所需乌头碱的用量50％-100％。
图1为SDS-PAGE蛋白质电泳图。第一列为没有诱导的重组大肠杆菌的总蛋白，第二列为IPTG诱导了的重组大肠杆菌的总蛋白，第三列为蛋白质标记，分别是31，20，16，14，6.3，3.5KDα，第四列为通过谷胱甘肽转移酶亲和层析柱纯化得到的融合蛋白谷胱甘肽转移酶-蝎抗心律失常肽，第五列为谷胱甘肽转移酶，第六列为小肠激酶酶切后的融合蛋白，第七列为纯化的蝎抗心律失常肽。
图2为重组蝎抗心律失常肽与其它两种蝎毒多肽的圆二色谱图。BmKIM为蝎抗心律失常肽，AaHIT2为一种α型蝎毒多肽，CssII为一种β型蝎毒多肽。
图3为全细胞电压膜片钳记录的钠通道电流图。A为对照，B为加入重组蝎抗心律失常肽后的心室细胞钠通道电流。
图4为重组肽作用癫痫大鼠的脑电图。A图为脑内注射重组肽后再注射至癫剂的脑电图；B图为脑内注射生理盐水后再注射至癫剂的脑电5为重组肽作用癫痫大鼠海马超微结构电镜图。A图为脑内注射重组肽后再注射至癫剂的大鼠脑海马超微结构电镜图；B图为脑内注射生理盐水后再注射至癫剂的大鼠脑电图。
NaCl 9mg制备方法将活性成分和氯化钠溶解于1升注射水中，过滤所得溶液，在无菌条件下装入安瓿瓶中。
权利要求
1.一种蝎抗心律失常肽，其特征是，该活性肽的氨基酸序列如下DGYIRGSNGCLWGNEGCNKECKGFGYCWTWGLACWCEGLTWKSESNTCG。
2.一种实现权利要求1的蝎抗心律失常肽的制备方法，包括下列步骤设计PCR引物，用PCR从东亚钳蝎蝎毒cDNA库中扩增抗心律失常肽基因片段，并通过表达载体转化到大肠杆菌中表达，设计的PCR上游引物含小肠激酶酶切位点，用PCR扩增的抗心律失常肽基因片段经过限制性内切酶酶切，克隆到pGEX-5x-1表达载体中，转化到大肠杆菌BL21中获得重组大肠杆菌BL21(pGEX/BmKIM)，经IPTG诱导后，经谷胱甘肽转移酶亲和层析柱纯化，用小肠激酶酶切表达所得的融合蛋白，并脱盐而得到可溶的抗心律失常肽。
3.根据权利要求2所述的蝎抗心律失常肽的制备方法，其特征是PCR上游引物A1，5’-GCCGGATCCCCGATGACGATGACAAGGATGGATATATAAGA-3’，该引物含有BamHI限制性内切酶酶切位点和小肠激酶酶切位点；PCR下游引物A2，5’-GCCCTCGAGTCAACCGCATGTATTACTTTCAG-3’该引物含有XohI限制性内切酶酶切位点；用PCR扩增所得产物经BamHI和XohI酶切后克隆到pGEX-5x-1，转化大肠杆菌得到重组大肠杆菌BL21(pGEX/BmKIM)、用IPTG诱导表达后经谷胱甘肽转移酶亲和层析柱纯化，用小肠激酶对融合蛋白进行酶切获得可溶性的抗心律失常肽。
4.权利要求1所述的蝎抗心律失常肽在制备抗心律失常药中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种蝎抗心律失常肽及其制备方法和应用,该活性肽的氨基酸序列为GYIRGSNGCLWGNEGCNKECKGFGYCWTWGLACWCEGLTWKSESNTCG。制备蝎抗心律失常肽包括设计PCR引物,用PCR从东亚钳蝎蝎毒cDNA库中扩增抗心律失常肽基因片段,并通过表达载体转化到大肠杆菌中表达,其特征是:设计的PCR上游引物含小肠激酶酶切位点,用PCR扩增的抗心律失常肽基因片段经过限制性内切酶酶切,克隆到pGEX－5x－1表达载体中,转化到大肠杆菌BL21中获得重组大肠杆菌BL21(pGEX/BmKIM),经IPTG诱导后,经谷胱甘肽转移酶亲和层析柱纯化,用小肠激酶酶切表达所得的融合蛋白,并脱盐而得到可溶的抗心律失常肽。本发明具有高效抗心律失常活性,所得到的重组肽是可溶性的,而且产量高,可在制备抗心律失常肽药中广泛应用。
文档编号C07K14/435GK1379042SQ0211548
公开日2002年11月13日 申请日期2002年1月30日 优先权日2002年1月30日
发明者李文鑫, 彭方, 曾宪春, 何小华, 朱顺义 申请人:武汉大学