专利名称：高效抗真菌苦瓜几丁酶基因的利记博彩app
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种高效抗真菌苦瓜几丁酶的全长cDNA基因。
背景技术：
真菌病害是作物减产和品质下降的主要原因之一。基因工程是植物抗真菌育种的新途径。几丁质是真菌细胞壁的主要成分。几丁酶能专一催化几丁质的水解，从而抑制真菌的生长增殖。由于在植物和动物中没有几丁质存在，几丁酶对人畜和植物是安全的。正因为如此，几丁酶基因被认为是植物抗真菌基因工程的理想目的基因。将几丁酶基因作为抗病因子，通过遗传转化提高植物抗真菌病害的能力，已有少数成功的例子。但从总体上看，转几丁酶基因植物普遍存在抗性水平低、抗菌谱窄等缺点。造成这种结果的可能原因是，①目的基因所编码的几丁酶活性不强，不能在低浓度时有效抑制病原真菌的生长；②病原真菌在与植物长期的共进化过程中产生了能抑制寄主植物几丁酶的抑制物；③几丁质酶在转基因植物的细胞内表达，不能抑制胞外生长的病原真菌。要在转几丁酶基因植物研究中取得突破，关键在于克隆抗真菌活性强的几丁酶基因。
在自然界的几乎所有生物门类中都发现了几丁酶的存在，目前已经克隆了数百种几丁酶基因。在众多已克隆的几丁酶基因中，只有少部分进行了蛋白质活性的研究，大多数是通过序列相似性确定为几丁酶基因的，对相应蛋白的抗真菌活性研究很少。目前我国尚缺乏具有自主知识产权、抗真菌活性强且能显著提高作物抗病能力的几丁酶基因。分子生物学的研究表明，植物几丁酶与病原真菌之间存在共进化的关系，因此，本身病害少的植物所产生的几丁酶会有更强的抗真菌活性和更广的抗菌谱。苦瓜是我国特有的蔬菜，具有病害少的特点。研究表明，苦瓜各种器官均有很强的几丁质酶活性，纯化的苦瓜几丁酶在体外对棉花黄萎病菌有很强的抑制作用。因此，从苦瓜中克隆几丁酶基因，就能得到较强的抗真菌活性和较广谱的抗真菌几丁酶基因，为植物抗病基因工程提供目的基因。
发明内容
本发明的目的在于提供一种抗真菌活性强的苦瓜几丁酶的全长cDNA基因。
本发明通过以下步骤实现(1)制备免疫亲和吸附剂用扁豆几丁酶免疫家兔，获得抗扁豆几丁酶的抗体，将此抗体与Sepharose4B偶联，得免疫亲和吸附剂；(2)蛋白质纯化将苦瓜叶片的粗提液经过免疫亲和吸附柱后，获得电泳纯的苦瓜几丁酶，纯化的苦瓜几丁酶经电泳回收后测序，得到的N端序列为EQCGRQANGALCPNRLCCSQ；(3)苦瓜几丁酶基因3’末端的扩增根据几丁酶N-端氨基酸序列测定结果，设计一条简并引物5’-GAGCAATGTGGGCG(A/T/G/C)CA(A/G)GC-3’，用3’-RACE试剂盒扩增苦瓜几丁酶的3’端序列，将扩增片段克隆到pUCm-T载体上，得到编码苦瓜几丁酶的部分cDNA基因，包含了成熟蛋白的所有编码序列；(4)苦瓜几丁酶全长cDNA基因的获得用常规方法构建苦瓜叶片的cDNA文库，用扩增得到的苦瓜几丁酶3’端序列作探针，从苦瓜叶片cDNA文库中钓取苦瓜几丁酶的cDNA克隆，得到苦瓜几丁酶的全长cDNA基因；(5)序列同源性分析相似性比较在NCBI站点上用BLAST完成。
BLAST分析表明，苦瓜几丁酶与植物的I、II类几丁酶有很高序列相似性。其中相似性最高的为南瓜几丁酶和大豆I类几丁酶，相同氨基酸为81％和70％，相似氨基酸达85％和78％。通过保守域查询发现，苦瓜几丁酶包含两个保守域，即几丁质结合域和几丁酶催化域。用苦瓜几丁酶与植物典型的I、II类几丁酶序列进行多序列比较。结果表明，苦瓜几丁酶具有I类几丁酶的几丁质结合域，但没有这类几丁酶C-端的液泡定位信号，可能是一种胞外表达的几丁酶。
上述方法获得的苦瓜几丁酶全长cDNA基因的核苷酸序列及推断的氨基酸序列如下ATATCAAGGAGAAAGTACTCCGTTGTTGAAGTGATCTTCTCATACACCAAACAACAATG-AAG-CTT-CAT-ACG-CTT-ATT-GTC-TTA-GCC-TTT-GCC-TTC-GTT-TTG-GGA-GCC-GCA-GCA-GAGM K L H T L IV L A F A FV L G A A A ECAA-TGT-GGG-CGG-CAG-GCC-AAT-GGC-GCC-CTC-TGC-CCC-AAT-CGC-CTC-TGC-TGC-AGC-CAG-CACQ C G R Q A N G A L C P N R L C C S Q HGGG-TGG-TGC-GGC-TCC-ACT-GAT-GAG-TAC-TGC-AAA-AAT-GGT-TGC-CAG-AGC-CAG-TGT-GGC-GGCG W C G S T D E Y CK N G C Q S Q C G GCAA-ACT-CCT-ACA-CCC-ACA-AAC-CCG-GGA-TCG-GGA-GAC-GTT-GGC-AGG-ATC-ATC-ACC-CCT-GCCQ T P T P T N P G S G D V G R I I T P AATC-TTC-GAC-CAA-ATG-CTC-AAG-TAT-CGA-AAC-GAC-GCA-CGA-TGC-CCT-AGT-AAT-GGG-TTC-TATI F D Q M L K Y R N D A RC P S N G F YAGT-TAC-AAT-GCT-TTC-ATT-TCT-GCT-ACG-AGA-TCC-TTT-CCT-GGC-TCT-GGA-ACA-ACA-GGA-GATS Y N AF I S A T R S F P G S G T T G DGAT-GCT-ACC-CGT-AAA-AGG-GAG-TTG-GCG-GCT-TTC-TTG-GGC-CAA-ACT-TCT-CAT-GAA-ACT-ACTD A T R K R E L A A F L G Q T S H E T TGGA-GGA-TGG-CCA-AGT-GCA-CCA-GAT-GGC-CCA-TTC-GCA-TGG-GGA-TAT-TGT-TTC-ATT-AGG-GAGG G W P S A P D G P F A W G Y C F I R EAGA-AAT-CAA-GAC-ACT-TAT-TGT-TCA-CCC-AAC-CAA-CAA-TGG-CCT-TGT-GCT-CCC-GGC-CAG-AAAR N Q D T Y CS P N Q Q W P C A P G Q KTAT-TAC-GGC-CGT-GGA-CCA-ATT-CAA-CTC-ACT-CAC-AAC-TAC-AAC-TAC-GGG-CCA-GCA-GGT-AGAY Y G R G P I Q L T H NY N Y G P A G RGCA-CTA-GGA-CTG-AAT-TTG-TTG-AAC-AAC-CCT-GAT-TCG-GTA-GCC-ACA-GAT-CCA-ACT-GTA-TCAA L G L N L L N N P D S V A T D P T VSTTC-AAA-ACA-GCC-ATC-TGG-TTT-TGG-ATG-ACA-CCA-CAA-GGA-AAC-AAA-CCA-TCA-AGT-CAC-GATF K T A I W F W M T P Q G N K P S S H DGTT-ATC-ATC-GGC-AAG-TGG-CAG-CCG-TCA-GGT-GCC-GAT-AGT-GCT-GCA-GGA-AGG-GTT-CCT-GGCV I I G K W Q P S G A D S A A G R V P GTAT-GGT-GTT-ATC-ACC-AAC-ATC-ATT-AAC-GGT-GGA-CTT-GAA-TGT-GGG-CGC-GGT-CCT-GAT-AGTY G V I T N I I NG G L E C G R G P D SAGA-GTT-GCC-GAC-AGA-ATT-GGA-TTT-TTC-AAA-AGA-TAT-TGC-GAC-ATA-TTG-CGT-ATC-GGC-TATR V A D R I G F FK R Y C D I L R I G YGGC-AAC-AAC-TTA-GAT-TGC-AAC-AAT-CAA-AGG-CCT-TTT-GCC-TAAG N N L D C N N Q R P F AACATTTCCTCCATAAGCAATAAAATGTGTTTCCCATATCGTTAAAGACCAATATGAATTATGGTATGTGTAATGTCTAAATTATGTAATAGACATGTAACTTGCAATAAAAGATTGAAGAGATATTCAATTCCTTAACACAAAAAAAAAAAAAAA
本发明的优点是(1)苦瓜几丁酶具有抗真菌活性高，胞外表达等特点。本发明获得的基因为全长cDNA基因，它所编码的信号肽序列可以指导苦瓜几丁酶的正确加工和运输。用该基因构建植物表达载体以转化各种植物，可提高转基因植物的抗真菌能力，在植物抗真菌基因工程中有广阔的应用前景。
(2)苦瓜几丁酶具有较强的耐热性和较宽的适宜pH范围，因此，该蛋白可作为抗真菌蛋白在医药中应用。利用本发明克隆的基因构建原核表达载体转化大肠杆菌，可以通过微生物高效稳定的表达来直接生产医药中所需要的抗真菌蛋白。
具体实施例方式用扁豆几丁酶免疫家兔，获得抗扁豆几丁酶的抗体，将此抗体与Sepharose4B偶联，得免疫亲和吸附剂。将苦瓜叶片的粗提液经过免疫亲和吸附柱后，获得电泳纯的苦瓜几丁酶，纯化的苦瓜几丁酶经电泳回收后测序，得到的N端序列为EQCGRQANGALCPNRLCCSQ。根据几丁酶N-端氨基酸序列测定结果，设计一条简并引物5’-GAGCAATGTGGGCG(A/T/G/C)CA(A/G)GC-3’，用3’-RACE试剂盒扩增苦瓜几丁酶的3’端序列，将扩增片段克隆到pUCm-T载体上，得到编码苦瓜几丁酶的部分cDNA基因。用常规方法构建苦瓜叶片的cDNA文库，用扩增得到的苦瓜几丁酶3’端序列作探针，从苦瓜叶片cDNA文库中钓取苦瓜几丁酶的cDNA克隆，得到苦瓜几丁酶的全长cDNA基因。在NCBI站点上用BLAST完成相似性比较。
权利要求
1.一种高效抗真菌苦瓜几丁酶基因，其特征在于，该基因具有如下的核苷酸序列及推断的氨基酸序列ATATCAAGGAGAAAGTACTCCGTTGTTGAAGTGATCTTCTCATACACCAAACAACAATG-AAG-CTT-CAT-ACG-CTT-ATT-GTC-TTA-GCC-TTT-GCC-TTC-GTT-TTG-GGA-GCC-GCA-GCA-GAGM K L H T L I V L A F A F V L GA A A ECAA-TGT-GGG-CGG-CAG-GCC-AAT-GGC-GCC-CTC-TGC-CCC-AAT-CGC-CTC-TGC-TGC-AGC-CAG-CACQ C G R Q A N G A L C P N R L C C S Q HGGG-TGG-TGC-GGC-TCC-ACT-GAT-GAG-TAC-TGC-AAA-AAT-GGT-TGC-CAG-AGC-CAG-TGT-GGC-GGCG W C G S T D E Y C K N G C Q SQ C G GCAA-ACT-CCT-ACA-CCC-ACA-AAC-CCG-GGA-TCG-GGA-GAC-GTT-GGC-AGG-ATC-ATC-ACC-CCT-GCCQ T P T P T N P G S G D V G R I I T P AATC-TTC-GAC-CAA-ATG-CTC-AAG-TAT-CGA-AAC-GAC-GCA-CGA-TGC-CCT-AGT-AAT-GGG-TTC-TATI F D Q M L K Y R N D A R C P SN G F YAGT-TAC-AAT-GCT-TTC-ATT-TCT-GCT-ACG-AGA-TCC-TTT-CCT-GGC-TCT-GGA-ACA-ACA-GGA-GATS Y N A F I S A T R S F P GS G T T G DGAT-GCT-ACC-CGT-AAA-AGG-GAG-TTG-GCG-GCT-TTC-TTG-GGC-CAA-ACT-TCT-CAT-GAA-ACT-ACTD A T R K R E L A A F L G Q T S H E T TGGA-GGA-TGG-CCA-AGT-GCA-CCA-GAT-GGC-CCA-TTC-GCA-TGG-GGA-TAT-TGT-TTC-ATT-AGG-GAGG G W P S A P D G P F A W G Y C F I R EAGA-AAT-CAA-GAC-ACT-TAT-TGT-TCA-CCC-AAC-CAA-CAA-TGG-CCT-TGT-GCT-CCC-GGC-CAG-AAAR N Q D T Y CS P N Q Q W P C A P G Q KTAT-TAC-GGC-CGT-GGA-CCA-ATT-CAA-CTC-ACT-CAC-AAC-TAC-AAC-TAC-GGG-CCA-GCA-GGT-AGAY Y G R G P I Q L T H N Y N Y G P A G RGCA-CTA-GGA-CTG-AAT-TTG-TTG-AAC-AAC-CCT-GAT-TCG-GTA-GCC-ACA-GAT-CCA-ACT-GTA-TCAA L G L N L L N N P D S V A T D P T V STTC-AAA-ACA-GCC-ATC-TGG-TTT-TGG-ATG-ACA-CCA-CAA-GGA-AAC-AAA-CCA-TCA-AGT-CAC-GATF K T A I W F W M T P Q G N K P S S H DGTT-ATC-ATC-GGC-AAG-TGG-CAG-CCG-TCA-GGT-GCC-GAT-AGT-GCT-GCA-GGA-AGG-GTT-CCT-GGCV I I G K W Q P S G A D S A A G R V P GTAT-GGT-GTT-ATC-ACC-AAC-ATC-ATT-AAC-GGT-GGA-CTT-GAA-TGT-GGG-CGC-GGT-CCT-GAT-AGTY G V IT N I I N G G L E C G R G P DSAGA-GTT-GCC-GAC-AGA-ATT-GGA-TTT-TTC-AAA-AGA-TAT-TGC-GAC-ATA-TTG-CGT-ATC-GGC-TATR V A D R I G F FK R Y C D I L R I G YGGC-AAC-AAC-TTA-GAT-TGC-AAC-AAT-CAA-AGG-CCT-TTT-GCC-TAAG N N L D C N N Q R P F AACATTTCCTCCATAAGCAATAAAATGTGTTTCCCATATCGTTAAAGACCAATATGAATTATGGTATGTGTAATGTCTAAATTATGTAATAGACATGTAACTTGCAATAAAAGATTGAAGAGATATTCAATTCCTTAACACAAAAAAAAAAAAAAA
全文摘要
从具有抗病性较强的苦瓜中克隆的一种高效抗真菌苦瓜几丁酶的全长cDNA基因,用该基因构建植物表达载体以转化各种植物,蛋白质具有抗真菌活性高,胞外表达等特点,它所编码的信号肽序列可以指导苦瓜几丁酶的正确加工和运输。同时,苦瓜几丁酶具有较强的耐热性和较宽的适宜pH范围,因此,该蛋白可作为抗真菌蛋白在医药中应用。利用本发明克隆的基因构建原核表达载体转化大肠杆菌,通过微生物高效稳定的表达来直接生产医药中所需要的抗真菌蛋白。
文档编号C07H21/04GK1386743SQ02103870
公开日2002年12月25日 申请日期2002年4月5日 优先权日2002年4月5日
发明者裴炎, 肖月华, 侯磊, 罗小英, 杨星勇, 杨光伟 申请人:西南农业大学