专利名称：咪唑并喹啉胺在dna疫苗接种中作为佐剂的用途的利记博彩app
技术领域：
本发明涉及对DNA疫苗接种的改进，并且特别而不仅仅涉及疫苗组合物，对哺乳动物进行疫苗接种从而抵抗疾病的方法，以及某些化合物在药物制备中的用途。
背景技术：
对传统疫苗接种技术已经知晓多年了，传统疫苗接种技术包括将能够诱导动物体内的免疫应答的抗原引入动物系统从而使动物能够抵抗感染。九十年代初期就观察到了质粒DNA能够直接转染动物体内细胞，接着进行了大量的研究从而在利用DNA质粒的基础上开发出一种疫苗接种技术，该疫苗接种技术是通过将编码抗原肽的DNA直接引入到动物体内来诱导免疫应答。这种被称作“DNA免疫接种”或“DNA疫苗接种”的技术目前已被用来在临床前使用的多种病毒、细菌和寄生虫病动物模型中激发保护性抗体(体液的)和细胞-介导的(细胞的)免疫应答。还对DNA疫苗接种技术在防治癌症、变态反应和自身免疫疾病中的应用进行了研究。
DNA疫苗通常由一种其中插入了一个强启动子、编码抗原肽的目的基因和一段聚腺苷酸化/转录终止序列的细菌质粒载体组成。由目的基因编码的免疫原可以是与病原体、肿瘤或其它需要预防的病原体相关的全蛋白或简单的抗原肽序列。在给宿主进行给药前，根据所要采用的给药方式使所述质粒在细菌如大肠杆菌体内进行繁殖然后进行分离并利用适当的介质进行配制。
有关DNA疫苗接种的有用背景技术信息被记载在″Donnelly，J等，免疫学年报(Annual Rev.Immunol).(1997)15617-648″中，该文献的全部内容被本文引入作为参考。
与传统疫苗接种技术相比，DNA疫苗接种具有许多优点。首先，可以预知由于由DNA序列编码的蛋白是在宿主体内进行合成的，所以所述蛋白的结构或构象与天然的疾病相关蛋白的结构或构象类似。通过产生识别源于保守蛋白的表位的细胞毒性的T淋巴细胞应答，DNA疫苗接种还可能提供抵抗不同病毒株的作用。而且，由于质粒被直接引入能够产生抗原蛋白的宿主细胞中，所以引发了持续时间较长的免疫应答。所述技术还提供了将不同免疫原组合成单一制剂从而有利于针对几种病症进行同时免疫的可能性。
尽管DNA疫苗接种比传统疫苗接种治疗有许多优势，然而仍然需要开发佐剂化合物，该化合物能够增强免疫应答，该免疫应答是由给动物给药的质粒DNA编码的蛋白诱导的。
DNA疫苗接种有时会伴随发生使免疫应答由Th1应答异常偏向Th2应答，尤其是当DNA被直接给药给表皮时更容易发生这种现象(Fuller和HaynesHum.Retrovir.(1994)101433-41)。已经认识到由核酸疫苗引起的免疫过程取决于所针对的疾病。优先引发的Th1应答似乎能够提供疫苗针对多种病毒疾病和癌症的效力，而优势的Th2型应答可能对与某些自身免疫疾病有关的限制性变态反应和炎症有效。因此定量增强免疫应答或将应答类型转变成对病症最有效的应答类型的方法可能是有用的。
因此，本发明的一个目的在于提供能够与DNA疫苗接种方法结合使用的佐剂化合物。另外一个目的在于提供含有相关佐剂的组合物，以及改进涉及这类佐剂的DNA疫苗接种的方法。本发明的其它目的将通过以下详细说明而显而易见。然而，至今要达到这些目的仍有困难，主要是由于DNA疫苗接种与传统疫苗接种技术相比具有本质上的差异。而且，合适化合物的鉴定并不简单，已经进行了将多种已知免疫增强剂与DNA免疫接种技术结合的尝试，结果是非常有限的或者最好也不过取得了很少的成功。例如，共同给药IFN-γ和狂犬病毒糖蛋白的基因已经对T辅助细胞应答和抗体应答产生了抑制作用(Xiang和Ertl)。
考虑到这种背景技术，非常惊奇地注意到本发明人报道了当作为DNA疫苗接种的佐剂时，能够有效促进免疫应答增强的佐剂化合物，尤其是能够有效促进细胞免疫应答增强的佐剂化合物。咪唑并喹啉胺衍生物是包括IFN-α，IL-6和TNF-α在内的细胞因子的诱导剂(参见，例如Reiter等，白细胞生物学杂志(J.Leukocyte Biology)(1994)55234-240)。这些化合物剂及其制备方法已经被公开在公开号为WO 94/17043的PCT专利申请中。本发明人已经说明了这些衍生物可以被有效用作DNA疫苗接种的佐剂。
本发明概述本发明的一个实施方案提供了一种含有(i)一种含有1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-4-胺衍生物的佐剂成分和(ii)一种含有编码抗原肽或疾病相关蛋白的核苷酸序列的免疫原成分的疫苗组合物，其中所述佐剂成分增强了哺乳动物体内针对抗原肽或蛋白的免疫应答。
另一方面，本发明提供了一种增强针对抗原的免疫应答的方法，所述方法包括顺序或同时给药一种编码抗原的核酸和一种咪唑并[4，5-c]喹啉-4-胺衍生物。
另一个实施方案提供了一种咪唑并[4，5-c]喹啉-4-胺衍生物在制备能够增强针对由核苷酸序列编码的抗原的免疫应答的药物中的用途，所述核苷酸序列与所述衍生物被顺序或同时给药。
本发明的另一个实施方案提供了一种含有咪唑并[4，5-c]喹啉-4-胺衍生物的药物组合物，该咪唑并[4，5-c]喹啉-4-胺衍生物用于增强针对由核酸序列编码的抗原的免疫应答。
优选地，1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-4-胺衍生物是一种由本文所述通式I-VI中的一个通式所定义的化合物。更优选地，它是一种由通式VI所定义的化合物。特别优选1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-4-胺衍生物是一种选自下列一组通式VI的化合物1-(2-甲基丙基)-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-4-胺；1-(2-羟基-2-甲基丙基)-2-甲基-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-4-胺；1-(2-羟基-2-甲基丙基)-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-4-胺；1-(2-羟基-2-甲基丙基)-2-乙氧基甲基-1-H-咪唑并[4，5-c]喹啉-4-胺。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种增强哺乳动物体内抵抗疾病的免疫应答的方法，包括向所述哺乳动物给药一种合适的载体和一种编码与疾病相关的抗原肽的核苷酸序列。还提供增强哺乳动物对免疫原的免疫应答的方法，包括以足以有效刺激免疫应答的量向所述哺乳动物给药合适载体和编码所述免疫原的核甘酸序列；另外以足以有效增强所述免疫应答的量向所述哺乳动物给药一种作为疫苗佐剂的1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-4-胺衍生物。在所述方法中，1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-4-胺衍生物优选地是一种通式VI的化合物。
在另一个实施方案中，本发明提供了1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-4-胺衍生物在制备用于增强由抗原肽或蛋白引发的免疫应答的药物中的用途，所述肽/蛋白是通过对哺乳动物给药了编码所述肽的核苷酸序列而被表达的。
附图的简要说明
图1.
在接种了编码流感病毒核蛋白的质粒(pVAC1.PR)后，咪喹莫特(imiguimod)增强了细胞毒性T-细胞的应答。pVACl由载体控制。
图2.
在免疫接种了编码卵白蛋白的质粒后，咪喹莫特增强了体内CD4 T细胞的克隆扩充，测定结果为CD4+T细胞的增殖水平被提高了。
图3.
在免疫接种了编码卵白蛋白的质粒后，咪喹莫特增加了体内被激活的CD4 T细胞的数目，测定结果为IFN-λ和IL-4产生细胞的数目增多了。
图4.
在免疫接种了编码卵白蛋白的质粒后，咪喹莫特既诱导了体内的Th1应答又诱导了Th2应答，测定结果为IFN-λ和IL-4-产生细胞的数目分别增多了。
图5.
在免疫接种了编码HIV抗原Gag和Nef的质粒(WRG7077.Gag/Nef)后，咪喹莫特增强了细胞毒性T细胞的应答。WRG7077由载体控制。
图6.
在免疫接种了编码卵白蛋白的质粒后，Resiquimod(1-(2-羟基-2-甲基丙基)-2-乙氧基甲基-1-H-咪唑并[4，5c]喹啉-4-胺)，咪喹莫特的一种类似物，增加了体内被激活的CD4 T细胞的数目，测定结果为IFN-λ和IL-4-产生细胞的数目增多了(分别由6A和6B所示)。
图7.
在免疫接种了编码卵白蛋白的质粒后，咪喹莫特的两种类似物，1-(2-羟基-2-甲基丙基)-2-甲基-1H-咪唑并[4，5c]喹啉-4-胺和1-(2-羟基-2-甲基丙基)-1H-咪唑并[4，5c]喹啉-4-胺，增加了体内被激活的CD4 T细胞的数目，测定结果为IFN-λ和IL-4产生细胞的数目增多了(分别由7A和7B所示)。
图8.
在免疫接种了编码HIV抗原Gag和Nef的质粒(WRG7077.Gag/Nef)后，局部给药咪喹莫特增强了细胞毒性T细胞的应答。WRG7077由载体控制。
图9.
在免疫接种了编码卵白蛋白的质粒进行后，咪喹莫特延缓了肿瘤在动物体内的生长，所述动物受到表达卵白蛋白的EG7.OVA肿瘤细胞的攻击。
图10.
咪喹莫特降低了被植入动物体内的表达卵白蛋白的EG7.OVA肿瘤细胞的致瘤力，所述动物预先免疫接种了编码卵白蛋白的质粒。
本发明的详细描述在整个说明书和所附权利要求书中，除非本文另有说明，术语“含有”和“包括”或其变化形式如现在分词形式的“含有”、第三人称单数形式的“含有”、现在分词形式的“包括”、第三人称单数形式的“包括”等被解释为包含的意思，即，使用这些术语隐含了可能包括全部要素或者没有具体列出的要素。
如上所述，本发明涉及免疫原性组合物如疫苗组合物、免疫接种方法和改进的免疫接种方法，该改进的免疫接种方法包括将编码免疫原的核苷酸序列引进哺乳动物体内，该免疫原是一种抗原蛋白或抗原肽，以便使得所述蛋白或肽在哺乳动物体内进行表达从而在哺乳动物体内诱导抵抗抗原蛋白或抗原肽的免疫应答。这种免疫接种方法是已经熟知的并且在上文所引用的Donnelly等人撰写的文章中已被进行了充分的描述。
如本文所使用的术语“疫苗组合物”是指含有一种编码免疫原的核苷酸序列的免疫原成分与一种含有1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-4-胺衍生物的佐剂成分的组合。所述组合是，例如处于单一药用制剂中的两种成分的混合物形式或者例如处于一个试剂盒中的各个成分的分离形式，所述试剂盒包括含有一种编码免疫原的核苷酸序列的免疫原成分和一种含有1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-4-胺衍生物的佐剂成分，其中所述两种成分是分开、顺序或同时进行给药的。优选地，两种组分基本上同时进行给药。
本说明书和权利要求中所述的1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-4-胺衍生物优选地是由下面的通式I-VI中的一个所定义的化合物
(贴第8页的化学结构式I) 其中R11选自直链或支链烷基、羟烷基、酰氧烷基、苄基、(苯基)乙基和苯基，所述苄基、(苯基)乙基或苯基取代基任选地被独立地选自一个至约四个碳原子的烷基、一个至约四个碳原子的烷氧基和卤素的一个或两个基团在苯环上进行了取代，条件是如果所述苯环被所述基团中的两个所取代，那么所述基团总共含有不超过6个碳原子；R21选自氢、一个至约八个碳原子的烷基、苄基、(苯基)乙基和苯基，所述苄基、(苯基)乙基或苯基取代基任选地被独立地选自一个至约四个碳原子的烷基、一个至约四个碳原子的烷氧基和卤素的一个或两个基团在苯环上进行了取代，条件是如果所述苯环被所述基团中的两个所取代，那么所述基团总共含有不超过6个碳原子；和每个R1独立的选自氢、一个至约四个碳原子的烷氧基、卤素和一个至约四个碳原子的烷基，以及n是0至2的整数，条件是如果n是2，那么所述R11基团总共含有不超过6个碳原子；(贴第8页的化学结构式II) 其中R12选自含有2至约10个碳原子的直链或支链烯基和含有2至约10个碳原子的被取代的直链或支链烯基，其中所述取代基选自含有1至约4个碳原子的直链或支链烷基和含有3至约6个碳原子的环烷基；和被含有1至约4个碳原子的直链或支链烷基取代的含有3至约6个碳原子的环烷基；以及R22选自氢、含有一个至约八个碳原子的直链或支链烷基、苄基、(苯基)乙基和苯基，所述苄基、(苯基)乙基或苯基取代基任选地被独立地选自含有一个至约四个碳原子的直链或支链烷基、含有一个至约四个碳原子的直链或支链烷氧基和卤素的一个或两个基团在苯环上进行了取代，条件是如果所述苯环被所述基团中的两个所取代，那么所述基团总共含有不超过6个碳原子；和R2独立的选自含有一个至约四个碳原子的直链或支链烷氧基、卤素和含有一个至约四个碳原子的直链或支链烷基，以及n是0至2的整数，条件是如果n是2，那么所述R2基团总共含有不超过6个碳原子；(贴第9页的化学结构式III) 其中R23选自氢、一个至约八个碳原子的直链或支链烷基、苄基、(苯基)乙基和苯基，所述苄基，(苯基)乙基或苯基取代基任选地被一个或两个独立地选自一个至约四个碳原子的直链或支链烷基、一个至约四个碳原子的直链或支链烷氧基和卤素的基团在苯环上进行了取代，条件是如果所述苯环被所述基团中的两个所取代，那么所述基团总共含有不超过6个碳原子；和R5独立的选自一个至约四个碳原子的直链或支链烷氧基、卤素和一个至约四个碳原子的直链或支链烷基，以及n是0至2的整数，条件是如果n是2，那么所述R3基团总共含有不超过6个碳原子； 其中R14是-CHRARB，其中RB是氢或碳-碳键，条件是当RB是氢时，RA是一个至约四个碳原子的烷氧基、一个至约四个碳原子的羟烷氧基、两个至约十个碳原子的1-炔基、四氢吡喃基、其中烷氧基部分含有一个至约四个碳原子以及烷基部分含有一个至约四个碳原子的烷氧基烷基、2-、3-或4-吡啶基，以及另外一个条件是当RB是碳-碳键时，RB和RA共同形成四氢呋喃基团，该基团任选地被一个或多个独立地选自羟基和一个至约四个碳原子的羟烷基的取代基所取代；R24选自氢、一个至约四个碳原子的烷基、苯基和被取代的苯基，其中取代基选自一个至约四个碳原子的烷基、一个至约四个碳原子的烷氧基和卤素；R4选自氢、含有一个至约四个碳原子的直链或支链烷氧基、卤素和含有一个至约四个碳原子的直链或支链烷基；(贴第11页的化学结构式V) 其中R15选自氢、含有一个至约十个碳原子的直链或支链烷基和被取代的含有一个至约十个碳原子的直链或支链烷基，其中所述取代基选自含有三个至约六个碳原子的环烷基和被含有一个至约四个碳原子的直链或支链烷基取代的含有三个至约六个碳原子的环烷基；含有两个至约十个碳原子的直链或支链烯基和被取代的含有两个至约十个碳原子的直链或支链烯基，其中所述取代基选自含有三个至约六个碳原子的环烷基和被含有一个至约四个碳原子的直链或支链烷基取代的含有三个至约六个碳原子的环烷基；一个至约六个碳原子的羟烷基；其中烷氧基部分含有一个至约四个碳原子以及烷基部分含有一个至约六个碳原子的烷氧基烷基；其中酰氧基部分是两个至约四个碳原子的链烷酰氧基基或苯甲酰氧基以及烷基部分含有一个至约六个碳原子的酰氧烷基；苄基；(苯基)乙基；和苯基；所述苄基，(苯基)乙基或苯基取代基任选地被一个或两个独立地选自一个至约四个碳原子的烷基、一个至约四个碳原子的烷氧基和卤素的基团在苯环上进行了取代，条件是当所述苯环被两个所述基团取代时，所述基团总共含有不超过六个碳原子；R25是 其中Rx和Ry独立地选自氢、一个至约四个碳原子的烷基、苯基和其中取代基选自一个至约四个碳原子的烷基、一个至约四个碳原子的烷氧基和卤素的被取代的苯基；X选自含有一个至约四个碳原子的烷氧基、其中烷氧基部分含有一个至约四个碳原子以及烷基部分含有一个至约四个碳原子的烷氧基烷基、一个至约四个碳原子的卤烷基、其中烷基含有一个至约四个碳原子的烷酰氨基、氨基、其中取代基为一个至约四个碳原子的烷基或羟烷基的被取代的氨基、叠氮基、一个至约四个碳原子的烷硫基；以及R5选自氢、一个至约四个碳原子的直链或支链烷氧基、卤素、一个至约四个碳原子的直链或支链烷氧基；或上述任意一种化合物的药用盐。
优选地烷基是C1-C4烷基，例如甲基，乙基，丙基，2-甲基丙基和丁基。最优选的烷基是甲基，乙基和2-甲基-丙基。优选的烷氧基是甲氧基，乙氧基和乙氧基甲基。
以上列举的化合物及其制备方法被公开在公开号为WO 94/17043的PCT专利申请中。
当n可以是0、1或2时，n优选地是0或1。
上述取代基R1-R5在本文中通常被称作“苯并取代基”。优选的苯并取代基是氢。
上述取代基R11-R15在本文中通常被称作“1-取代基”。优选的1-取代基是2-甲基丙基或2-羟基-2-甲基丙基。
上述取代基R21-R25在本文中通常被称作“2-取代基”。优选的2-取代基是氢、一个至约六个碳原子的烷基，其中烷氧基部分含有一个至约四个碳原子的以及烷基部分含有一个至约四个碳原子的烷氧基烷基。最优选的2-取代基是氢、甲基或乙氧基甲基。
特别优选地是1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-4-胺是一种由下面的通式VI所定义的化合物 其中Rt选自氢、含有一个至约四个碳原子的直链或支链烷氧基、卤素和含有一个至约四个碳原子的直链或支链烷基；Ru是2-甲基丙基或2-羟基-2-甲基丙基；和Rv是氢、一个至约六个碳原子的烷基，或其中烷氧基部分含有一个至约四个碳原子以及烷基部分含有一个至约四个碳原子的烷氧基烷基；或如果合适，上述任意一种化合物的药用盐。
在式V1中，Rt优选地是氢，Ru优选地是2-甲基丙基或2羟基-2-甲基丙基，以及Rv优选地是氢、甲基或乙氧基甲基。
优选的1 H-咪唑并[4，5-c]喹啉-4-胺包括下列化合物1-(2-甲基丙基)-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-4-胺(一种通式VI化合物，其中Rt是氢，Ru是2-甲基丙基以及Rv是氢)；1-(2-羟基-2-甲基丙基)-2-甲基-1H-咪唑[4，5-c]喹啉-4-胺(一种式VI化合物，其中Rt是氢，Ru是2-羟基-2-甲基丙基，以及Rv是甲基)；1-(2-羟基-2-甲基丙基)-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-4-胺(一种通式VI化合物，其中Rt是氢，Ru是2-羟基-2-甲基丙基，以及Rv是氢)；1-(2-羟基-2-甲基丙基)-2-乙氧基甲基-1-H-咪唑并[4，5-c]喹啉-4-胺(一种通式VI化合物，其中Rt是氢，Ru是2-羟基-2-甲基丙基，以及Rv是乙氧基甲基)；或其药用盐。
本申请的疫苗接种方法和组合物可适用于哺乳动物对各种疾病如病毒、细菌或寄生虫感染、癌症、变态反应和自身免疫疾病的防治。通过采用本发明的方法或组合物防治的机能紊乱或疾病的某些特定实例如下病毒感染甲型、乙型、丙型、丁型和戊型肝炎病毒，1，2，6和7型疱疹病毒、巨细胞病毒、水痘-带状疱疹病毒、乳头状瘤病毒、埃-巴二氏病毒、流感病毒、副流感病毒、腺病毒、柯萨奇病毒、细小核糖核酸病毒、轮状病毒、呼吸道合胞病毒、痘病毒、鼻病毒、风疹病毒、乳多空病毒、腮腺炎病毒、麻疹病毒。
细菌感染引起TB和麻风病的分支杆菌、肺炎球菌、需氧革兰氏阴性菌、支原体、葡萄球菌、沙门氏菌、衣原体。
寄生虫疟疾、利什曼病、锥虫病、弓形体病、血吸虫病、丝虫病。
癌症乳腺癌、结肠癌、直肠癌、头部和颈部癌症、肾癌、恶性黑色素瘤、喉癌、卵巢癌、子宫颈癌、前列腺癌。
变态反应由室内尘螨、花粉和其它环境变应原引起的鼻炎。
自身免疫疾病系统性红斑狼疮。
优选地，本发明的方法或组合物被用来预防或治疗病毒性疾病如乙型肝炎、丙型肝炎、人乳头状病毒、人免疫缺陷病毒或单纯性疱疹病毒；细菌疾病TB；乳腺癌、结肠癌、卵巢癌、子宫颈癌和前列腺癌；或哮喘自身免疫疾病、类风湿性关节炎和阿尔茨海默氏病。
应当认识到这些特定疾病只是举例说明性质的，而不是用来限定本发明的范围。
本申请所涉及的在哺乳动物系统内进行表达从而诱导抗原性应答的核苷酸序列可以编码全蛋白或者仅仅编码能够启动抗原性应答的短肽序列。在整个说明书和所附的权利要求书中，术语“抗原肽”或“免疫原”是指包括所有能够在所涉及的动物体内诱导免疫应答的肽或蛋白序列。然而，最优选地是所述核苷酸序列能够编码与疾病相关的全蛋白，这是由于全蛋白在哺乳动物系统内的表达与天然抗原模拟过程似乎更相似，从而能够诱发完全的免疫应答。与特定疾病相关的一些已知抗原肽的非限制性实例如下能够诱发抵抗人病原体的免疫应答的抗原，该抗原或抗原组合物得自于HIV-1，(如tat，nef，gp120或gp160，gp40，p24，gag，env，vif，vpr，vpu，rev)，人疱疹病毒如gH，gL gM gB gC gK gE或gD或其衍生物或早期蛋白如来源于HSV1或HSV2的ICP27、ICP 47、ICP 4、ICP36，巨细胞病毒，尤其是人的巨细胞病毒(如Gb或其衍生物)，埃-巴二氏病毒(如gp350或其衍生物)，水痘-带状疱疹病毒(如gp1，11，111和IE63)，或者来源于肝炎病毒如乙型肝炎病毒(例如乙型肝炎病毒表面抗原或肝炎核心抗原或pol)，丙型肝炎病毒抗原和丁型肝炎病毒抗原或来源于其它病毒病原体如副粘液病毒呼吸道合胞病毒(如F和G蛋白或其衍生物)，或来源于副流感病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒、人乳头状瘤病毒(例如HPV6，11，16，18，eg L1，L2，E1，E2，E3，E4，E5，E6，E7)，黄病毒(例如黄热病病毒、登革热病毒、蜱传播的脑炎病毒、日本脑炎病毒)或流感病毒细胞(如HA，NP，NA或M蛋白，或其混合物)的抗原，或得自于以下细菌病原体的抗原如包括淋病奈瑟氏菌和脑膜炎在内的奈瑟氏菌(例如转铁-结合蛋白、乳铁结合蛋白、PilC、粘附素)；酿脓链球菌(例如M蛋白或其片段、C5A蛋白酶)，无乳链球菌、变异链球菌；杜氏嗜血菌；包括粘膜炎莫拉氏菌在内的莫拉氏菌属，也被称作粘膜炎布兰汉氏球菌(例如高分子量和低分子量的粘附素和侵袭素)；包括百日咳博德特氏菌(例如pertactin，百日咳毒素或其衍生物，丝状血细胞凝集素，腺苷酸环化酶，菌毛)、副百日咳博德特氏菌和支气管炎博德特氏菌在内的博德特氏菌属；包括结合分枝杆菌(例如ESAT6，抗原85A，-B或-C，MPT 44，MPT59，MPT45，HSP10，HSP65，HSP70，HSP75，HSP90，PPD 19kDa[Rv3763]，PPD 38kDa[Rv0934])、牛分枝杆菌、麻风分枝杆菌、贪食分枝杆菌、副结核分枝杆菌、耻垢分枝杆菌在内的分枝杆菌属；包括侵肺军团菌在内的军团菌属；包括肠毒素大肠杆菌(例如定居因子、热不稳定毒素或其衍生物、热稳定毒素或其衍生物)、肠出血性大肠杆菌、肠致病性大肠杆菌(例如志贺氏毒素类毒素或其衍生物)在内的埃希氏杆菌属；包括霍乱弧菌(例如霍乱毒素或其衍生物)在内的弧菌属；包括宋内志贺氏菌、痢疾志贺氏菌、弗氏志贺菌在内的志贺氏菌属；包括小肠结肠炎耶尔森氏菌(例如Yop蛋白)、鼠耶尔森氏菌、假结核耶尔森氏菌在内的耶尔森氏菌属；包括空肠弯曲杆菌(例如毒素、粘附素和侵袭素)和大肠弯曲杆菌在内的弯曲杆菌属；包括伤寒沙门氏菌、副伤寒沙门氏菌、猪霍乱沙门氏菌、肠炎沙门氏菌在内的沙门氏菌属；包括单核细胞增生利斯特氏菌在内的利斯特氏菌属；包括幽门螺杆菌(例如脲酶、过氧化氢酶、空泡性毒素)在内的螺杆菌属；包括铜绿假单胞菌；包括金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌在内的葡萄球菌属；包括粪肠球菌、屎肠球菌在内的肠球菌；包括破伤风梭菌(例如破伤风毒素及其衍生物)、肉毒梭菌(例如肉毒毒素及其衍生物)、艰难梭菌(例如梭菌毒素A或B及其衍生物)在内的梭菌属；包括炭疽芽孢杆菌(例如肉毒毒素及其衍生物)在内的芽孢杆菌属；包括白喉棒状杆菌(例如白喉毒素及其衍生物)在内的棒状杆菌属；包括布氏疏螺旋体(例如OspA，OspC，DbpA，DbpB)、嘎氏氏疏螺旋体(例如OspA，OspC，DbpA，DbpB)、阿氏疏螺旋体(例如OspA，OspC，DbpA，DbpB)、B.Andersonii(例如OspA，OspC，DbpA，DbpB)、赫氏疏螺旋体在内的疏螺旋体属；包括马埃里希氏体和人粒细胞埃里希氏症病原体在内的埃里希氏体属；包括立氏立克次氏体在内的立克次氏体属；包括砂眼衣原体(例如MOMP、肝素-结合蛋白)、肺炎衣原体(例如MOMP、肝素-结合蛋白)、鹦鹉热衣原体在内的衣原体属；包括问号钩端螺旋体在内的钩端螺旋体属；包括苍白密螺旋体(例如稀有外膜蛋白)、齿垢密螺旋体、猪痢疾密螺旋体在内的密螺旋体属；或得自于寄生虫如包括恶性疟原虫在内的疟原虫属；包括鼠弓形体(例如SAG2，SAG3，Tg34)在内的弓形体属；包括溶组织内变形虫在内的内变形虫属；包括小耳巴贝虫(B.Microti)在内的巴贝虫属；包括克鲁斯氏锥虫在内的锥虫属；包括兰氏鞭毛贾第虫(G.lamblia)在内的贾第虫属；包括L.major在内的Leshmania；包括卡氏肺囊虫在内的肺囊虫属；包括阴道毛滴虫在内的毛滴虫属；包括S.mansoni在内的或得自于酵母菌如包括白色假丝酵母在内的假丝酵母属的Schisostoma；包括新型隐球菌在内的隐球菌属。
其它优选的特异性结核分枝杆菌抗原是例如Rv2557，Rv2558，RPFsRv0837c，Rv1884c，Rv2389c，Rv2450，Rv1009，aceA(Rv0467)，PstS1，(Rv0932)，SodA(Rv3846)，Rv2031c 16kDal.，Tb Ra12，Tb H9，Tb Ra35，Tb38-1，Erd 14，DPV，MTI，MSL，mTTC2和hTCC1(WO 99/51748)。结核分枝杆菌的蛋白还包括融合蛋白及其变异体，在所述融合蛋白及其变异体中结核分枝杆菌的至少两条，优选地是三条多肽被融合到较大的蛋白中。优选的融合体包括Ra12-TbH9-Ra35，Erd14-DPV-MTI，DPV-MTIMSL，Erd14-DPV-MTI-MSL-mTCC2，Erd14-DPV-MTI-MSL，DPV-MTI-MSL-mTCC2，TbH9-DPV-MTI(WO99/51748)。
最优选的衣原体抗原包括例如高分子量蛋白(HWMP)(WO 99/17741)，ORF3(EP 366 412)和推定膜蛋白(Pmps)。疫苗制剂中的其它衣原体抗原可以选自WO 99/28475中所记载的一组衣原体抗原。
优选的细菌疫苗含有得自于包括肺炎链球菌的在内的链球菌属的抗原(PsaA，PspA，链球菌溶血素，胆碱结合蛋白)和肺炎球菌自溶酶蛋白抗原(生物化学生物物理学学报(Biochem Biophys Acta)，1989，67，1007；Rubins等，微生物发病机理(Microbial Pathogenesis)，25，337-342)，及其突变去毒衍生物(WO 90/06951；WO 99/03884)。其它优选的细菌疫苗含有得自于包括乙型流感嗜血杆菌(例如PRP及其偶合物)、非典型流感嗜血杆菌(例如OMP26)在内的嗜血杆菌属，高分子量粘附素，P5，P6，蛋白D和脂蛋白D，和丝束蛋白和丝束蛋白蛋白衍生肽(US 5,843,464)或其多拷贝变异体或其融合蛋白的抗原。
可用于本发明的抗原可以进一步含有得自于导致疟疾的寄生虫的抗原。例如，得自于恶性疟原虫的优选抗原包括RTS，S和TRAP。RTS是一种含有恶性疟原虫的环子孢子蛋白(CS)的几乎全部C-端部分的杂合蛋白，其中所述C-端部分通过乙型肝炎表面抗原preS2部分的四个氨基酸与乙型肝炎病毒的表面(S)抗原进行连接。其完整结构被公开在国际专利申请PCT/EP92/02591中，该国际专利申请的公开号为WO 93/10152，同时要求了申请号为9124390.7的UK专利申请的优先权。当在酵母菌中进行表达时，RTS的产生形式为脂蛋白颗粒，当与HBV的S抗原进行共表达时，其产生一种被称作RTS，S的混合颗粒。TRAP抗原被记载在国际专利申请PCT/GB89/00895中，该申请的公开号为WO 90/01496。本发明的优选实施方案是一种疟疾疫苗，该疫苗中的抗原制剂含有RTS，S和TRAP抗原的混合物。可以作为多价疟疾疫苗的候选成分的其它疟原虫抗原是恶性疟原虫MSP1，AMA1，MSP3，EBA，GLURP，RAP1，RAP2，钳合蛋白，PfEMP1，Pf332，LSA1，LSA3，STARP，SALSA，PfEXP1，Pfs25，Pfs28，PFS27/25，Pfs16，Pfs48/45，Pfs230及其疟原虫属中的类似物。
本发明涉及抗肿瘤抗原的用途以及用于免疫疗法治疗癌症的用途。例如，肿瘤排斥抗原如用于前列腺、乳腺、结肠、肺、胰腺、肾或黑色素瘤癌症的那些肿瘤排斥抗原。范例性的抗原包括MAGE 1，3和MAGE 4或被公开在WO99/40188中的其它MAGE抗原，PRAME，BAGE，Lage(也被称作NYEos 1)SAGE和HAGE(WO 99/53061)或GAGE(Robbins和Kawakami，1996，免疫学中的最新观点(Current Opinions in Immunology)8，628-636页；Van denEynde等，国际临床和实验室研究杂志(International Journal of Clinical &Laboratory Research)(1997提交的)；Correale等.(1997)，国家癌症研究学院杂志(Journal of the National Cancer Institute)89，p293)。实际上，这些抗原在许多类型的肿瘤如黑色素瘤、肺癌、肉瘤和膀胱癌中进行了表达。
用于本发明的MAGE抗原可以以与一种表达增强子或一种免疫融合配对体形成融合蛋白的形式来进行表达。特别是，所述Mage蛋白可以被融合到乙型流感嗜血杆菌的蛋白D上。特别是，所述融合配对体可以含有蛋白D的前1/3部分。这种构成物被公开在Wo 99/40188中。其它可能含有癌症特异性表位的融合蛋白实例包括bcr/abl融合蛋白。
在一个优选的实施方案中，利用了前列腺抗原如前列腺特异性抗原(PSA)，PAP，PSCA(PNAS 95(4)1735-1740 1998)，PSMA或被称作前列腺酶(Prostase)的抗原。
前列腺酶(Prostase)是一种前列腺-特异性丝氨酸蛋白酶(胰蛋白酶类)，254个氨基酸的长度，具有一个保守的丝氨酸蛋白酶酶促三联体H-D-S和一个氨基端的前肽序列，表明具有潜在的分泌功能(P.Nelson，Lu Gan，C.Ferguson，P.Moss，R.Gelinas，L Hood & K.Wand，″前列腺酶的分子克隆和定性，一种由雄性激素调节的在前列腺中进行限制性表达的丝氨酸蛋白酶(Molecular cloning and characterisation of prostase，an androgen-regulated serineprotease with prostate restricted expression)，被记载在美国国家科学院院报(InProc.Natl.Acad.Sci.USA)中，(1999)96，3114-3119)。已经记载了一个推定糖基化位点。预测结构与其它已知丝氨酸蛋白酶的结构非常相似，表明成熟多肽折叠成单结构域。所述成熟蛋白是224个氨基酸长度，具有一个已被进行了天然加工的A2表位。
前列腺酶核苷酸序列和推定多肽序列以及同系物已在Ferguson等人撰写的文章(美国国家科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)1999，96，3114-3119)和国际专利申请WO 98/12302(以及相应的被授权专利US 5,955,306)，WO 98/20117(以及被授权专利US 5,840,871和US 5,786,148)(前列腺特异性血管舒缓素)和WO 00/04149(P703P)中被公开。
本发明提供了含有基于前列腺蛋白及其片段和同系物(“衍生物”)的前列腺酶蛋白融合体的抗原。这类衍生物适用于疫苗治疗剂，该治疗剂适于治疗前列腺肿瘤。典型地，所述片段含有至少20个，优选地50个，更优选地100个在上文引用的专利和专利申请中公开的连续氨基酸。
进一步优选的前列腺抗原被认为是W0 98/37814中记载的P501S，SEQID NO 113。设计出了由其基因编码的含有至少20个，优选地50个，更优选地100个在上文引用的专利申请中公开的连续氨基酸的免疫原片段和蛋白。一个特定片段是PS108(WO 98/50567)。
从WO 98/37418和WO/004149中了解到了其它的前列腺特异性抗原。另一种是STEAP PNAS 96 14523 145287-12 1999。
本发明的上下文中使用的其它的肿瘤相关抗原包括Plu-1(生物化学杂志(J Biol.Chem)274(22)15633-15645，1999)，HASH-1，HasH-2，Cripto(Salomon等，生物测定(Bioessays)199，2161-70，美国专利US 5654140)Criptin美国专利US 5981215。另外，与癌症治疗中使用的疫苗特别相关的抗原还含有酪氨酸酶和存活素(survivin)。
本发明还结合使用了乳腺癌抗原如Muc-1，Muc-2，EpCAM，her 2/Neu，乳珠蛋白(美国专利US5668267)或在WO/00 52165，W0 99/33869，W0 99/19479，WO 98/45328中公开的那些抗原。美国专利US5801005中公开了Her 2 neu抗原。优选地Her 2 neu含有全部的胞外区域(含有约1-645位的氨基酸)或其片段和至少胞内区域约580个C端氨基酸的免疫原部分或全部胞内区域。特别是，所述胞内部分应当含有磷酸化区域或其片段。这类构成物被公开在WO00/44899中。一个特别优选的构成物被认为是ECD PD，第二个被认为是ECD□DPD(参见WO/00/44899)。
本文中使用的her 2 neu可得自于大鼠、小鼠或人。
所述疫苗还可含有与肿瘤-支持机制(例如血管生成，肿瘤侵袭)相关的抗原如tie 2，VEGF。
本发明的疫苗还可被用于预防或治疗除变态反应、癌症或传染性疾病以外的其它慢性疾病。这类慢性疾病例如是哮喘、动脉粥样硬化和阿尔茨海默氏疾病和其它自身免疫疾病。还考虑了作为避孕药使用的疫苗。
与易患和患有阿尔茨害默氏神经变性疾病的患者的预防和治疗有关的抗原具体地是N-端39-43位氨基酸片段(AB淀粉样前体蛋白)和更小的片段。该抗原被公开在国际专利申请WO 99/27944-(雅典娜神经科学(AthenaNeurosciences)中。
可以作为自身免疫疾病的疫苗或避孕疫苗的潜在的自身抗原包括细胞因子、激素、生长因子或胞外蛋白，更优选地4-螺旋细胞因子，最优选地IL13。细胞因子包括，例如IL1，IL2，IL3，IL4，IL5，IL6，IL7，IL8，IL9，IL10，IL11，IL12，IL13，IL14，IL15，IL16，IL17，IL18，IL20，IL21，TNF，TGF，GMCSF，MCSF和OSM。4-螺旋细胞因子包括IL2，IL3，IL4，IL5，IL13，GMCSF和MCSF。激素包括，例如黄体化基素(LH)，促卵泡成熟激素(FSH)，绒毛促性腺激素(CG)，VGF，Grelin，agouti，agouti相关蛋白和神经肽Y。生长因子包括，例如VEGF。
本发明的疫苗特别适用于免疫治疗例如慢性病征和癌症这类疾病，但也适用于治疗持续感染。因此，本发明的疫苗特别适用于传染性疾病，例如结核病(TB)、HIV感染如AIDS和乙型肝炎(HepB)病毒感染的免疫治疗。
在一个特别优选的实施方案中，所述核酸编码一种或多种下列抗原HBV-PreS1 PreS2和表面包膜蛋白、核心蛋白和pol；HIV-gp120 gp40，gp160，p24，gag，pol，env，vif，vpr，vpu，tat，rev，nef；乳头状瘤-E1，E2，E3，E4，E5，E6，E7，E8，L1，L2；HSV-gL，gH，gM，gB，gC，gK，gE，gD，ICP47，ICP36，ICP4；
流感-血细胞凝集素，核蛋白；TB-分支杆菌超氧化物歧化酶，85A，85B，MPT44，MPT59，MPT45，HSP10，HSP65，HSP70，HSP90，PPD 19kDa Ag，PPD 38kDa Ag。
所述核苷酸序列可以是RNA或包括基因组DNA在内的DNA，合成DNA或cDNA。优选地，所述核苷酸序列是DNA序列以及最优选地是cDNA序列。为了获得哺乳动物细胞内的抗原肽的表达，需要将编码抗原肽的核苷酸序列引入适当的载体系统中。本文使用的“适当的载体”是指能够使抗原肽在哺乳动物体内进行大量的表达从而足以激发免疫应答的任何载体。
例如，所选择的载体可以含有按正确顺序排列的质粒、启动子和聚腺苷酸化/转录终止序列从而使抗原肽获得表达。含有这些组分以及任选地其它组分如增强子、限制酶切位点和选择基因如抗生素抗性基因的载体构成对于本技术领域的技术人员来说是熟知的而且在Maniatis等人所著的＂分子克隆实验室手册(Molecular CloningA Laboratory Manual)″，冷泉港实验室(ColdSpring Harbour Laboratory)，冷泉港出版社(Cold Spring Harbour Press)，1-3卷，第2版，1989中得到了详细的描述。
为了有利地防止质粒在哺乳动物宿主体内进行复制从而整合到所述动物的染色体DNA中，所述质粒优选地被制备成不含有在真核细胞中起作用的复制原点。
本发明的方法和组合物可以被用于例如包括家畜、实验室动物、农场动物、捕获的野生动物以及最优选地人在内的所有哺乳动物的疾病防治过程中。
本发明人已经证明了当1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-4胺衍生物在DNA疫苗接种过程中被用作佐剂时，其能够增强Th1和Th2细胞因子的作用。本文中所使用的术语佐剂或佐剂成分用于传送能够以所需方式增强和/或改变针对免疫原的体内应答的衍生物或含有该衍生物的组分。因此，佐剂例如可以被用来将免疫应答转换成优势Th1应答，或者同时增强两种应答。
TH1型的免疫应答的优选诱导物能够导致细胞介导的应答。高浓度的Th1-型细胞因子有利于诱导针对给定抗原的由细胞介导的免疫应答，而高浓度的Th2-型细胞因子有利于诱导针对给定抗原的体液免疫应答。
重要的是应当记住Th1和Th2-型免疫应答的差别不是绝对的。实际上，个体能够支持被记载为优势Th1或优势Th2的免疫应答。然而，通常容易想到由Mosmann和Coffman在小鼠CD4+ve T细胞克隆中所描述的细胞因子家族(Mosmann，T.R.和Coffman，R.L.(1989)TH1和TH2细胞导致不同功能特性的淋巴因子的不同分泌模式(different patterns of lymphokine secretion lead todifferent functional properties).免疫学年报(Annual Review of Immunology)，7，p145-173)。通常，Th1-型应答与T-淋巴细胞产生INF-γ和IL-2细胞因子有关。通常与Th-1型免疫应答的诱导直接有关的其它细胞因子不是由T-细胞产生的，诸如IL-12。相反，Th2-型细胞应答与II-4，IL-5，IL-6，IL-10分泌有关。
含有载体的免疫原成分能够以多种方式进行给药，其中所述载体含有编码一种抗原肽的核苷酸序列。所述载体能够以被悬浮在适当介质例如缓冲盐水溶液如PBS中的裸露形式(即不与脂质体制剂、病毒载体或促转染蛋白结合的裸核苷酸序列)进行肌内、皮下或静脉内注射来给药，尽管某些早期数据已经表明肌内或皮下注射是优选的(Brohm等，疫苗(Vaccine)16 No.9/10 949-954页(1998)，其公开的全部内容被本文引入作为参考)。所述载体还能够利用例如脂质体进行包封或者被包封在聚交酯乙交酯(PLG)颗粒(25)中以后，通过除上述途径以外的经口腔、鼻腔或肺部途径来进行给药。
根据本发明的优选实施方案，所述免疫原成分还可以通过皮内给药，优选地通过利用基因枪给药技术(特别是粒子轰击)来进行给药。这类技术涉及将免疫原成分包衣在金珠子上后在高压下给药到表皮内的过程，例如就象Haynes等人在生物技术杂志(J.Biotehnology)4437-42(1996)中所描述的那样。
含有编码抗原肽的核苷酸序列的载体是以能够进行有效预防和治疗的量进行给药的。所给药的每个剂量中核苷酸量对于由颗粒介导的给药过程通常在1皮克至1毫克的范围内，优选地是在1皮克至10微克的范围内，以及对于其它途径在10微克至1毫克的范围内。精确的量可以根据待被免疫的哺乳动物的种类和体重、给药途径、1H-咪唑并-[4，5-c]喹啉衍生物的效力和剂量、待治疗或预防的病症的性质、受体免疫系统产生免疫应答的能力和所期望的预防和治疗效果的程度来进行大幅度的调整。在这些变量参数的基础上，医师或兽医能够容易地确定出合适的剂量水平。
对含有编码抗原肽的核苷酸序列的免疫原成分可以进行单次给药或重复给药，例如在约1天至约18个月期间内给药1至7次，优选地给药1至4次。然而，这种治疗方案也可以根据所涉及到的动物的大小和种类、待治疗/预防的疾病、核苷酸序列的量、给药途径、所选用的1H咪唑并[4，5-c]喹啉-4-胺衍生物的效力和剂量以及其它对于熟练兽医或医师来说是显而易见的因素来进行大幅度的调整。
本文指定的佐剂成分可通过多种不同的给药途径，例如通过口腔、鼻腔、肺部、肌内、皮下、皮内或局部给药途径来进行类似给药。优选地，所述成分通过皮内或局部给药途径来进行给药。这种给药方式可以在给药核苷酸序列前约14天至给药核苷酸序列后约14天内进行，优选地在给药核苷酸序列前1天至给药核苷酸序列后约3天内进行。最优选的是佐剂成分与核苷酸序列基本上同时进行给药。“基本上同时”是指在给药核苷酸序列的同时优选地给药佐剂，或者，如果不完全同时，至少在给药核苷酸序列的前后几个小时内给药佐剂。在最优选的治疗方案中，所述佐剂成分基本上与核苷酸序列同时给药。显然，如果根据需要可以按照上述的变量类型对该方案进行调整。
而且，根据这些变量，所述衍生物的用药剂量也可以进行调整，例如调整范围是约0.1mg/kg至约100mg/kg，其中“每kg”指的是所涉及到的哺乳动物的体重。优选地重复进行1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-4胺衍生物的用药和核苷酸序列的相继或加强用药。最优选地，用药剂量的范围为约1mg/kg至约50mg/kg。
然而，所述佐剂成分可能只含有以原始化学状态进行给药的1H-咪唑并[4，5c]喹啉-4-胺衍生物，优选地是以药学制剂的形式进行给药。也就是说，所述佐剂成分优选地含有1H-咪唑并[4，5c]喹啉-4-胺和一种或多种药用载体或兽医学可接受载体，以及任选地含有其它治疗成分。所述载体必须在与制剂中的其它成分能够相容的意义上是“可接受的”，而且对其接受者无害。制剂的性质可以根据所要采用的给药途径来自然调整，并且所述制剂可以通过药学领域中的已知方法来制备。
所有方法都包括将1H-咪唑并[4，5c]喹啉-4-胺衍生物与一种或多种适当载体进行混合的步骤。所述制剂一般通过以下步骤来制备将所述衍生物与液体载体和/或细分的固体载体进行均匀的和紧密的混合，如果需要，还可以将产品制成所需的剂型。本发明适于口服的剂型可以是离散单位的形式如各自含有预定量的活性成分的胶囊剂、扁囊剂或片剂；粉剂或粒剂；在水液体或非水液体中的溶液或混悬液；或水包油液体乳浊液或油包水乳浊液。所述活性成分可以制成丸剂、药糖剂或糊剂。
片剂可以通过压片或模压来进行制备，任选地含有一种或多种辅助成分。可以通过在一种合适的机器中挤压处于自由流动形式如粉状或粒状的活性成分来制备压缩药片，任选地混合了结合剂、润滑剂、惰性稀释剂、润滑剂、表面活性剂或分散剂。模压的片剂可以通过在一种合适的机器中模压被惰性液体稀释剂湿润的粉状化合物来进行制备。
片剂可以任选地进行包衣或刻痕并且可以被配制成使得所述活性成分得到缓释或控释的形式。
通过例如肌内、腹膜内或皮下给药途径进行注射的制剂包括含水或不含水的无菌注射液，该注射液可含有抗氧化剂、缓冲剂、制菌剂和使制剂与接受者的血液达到等渗的溶质；和含水或不含水的无菌悬液，该悬液可含有悬浮剂和增稠剂。所述制剂可以是单剂型或多剂型的容器形式，例如密封的安瓿和小瓶，而且可以在冷冻干燥(冻干)的状态下进行保存，只需要在使用前加入无菌液体载体，例如注射用水，就能立刻进行使用。临时注射液和混悬液可以由上述无菌粉剂、粒剂和片剂来制备。适于通过颊或鼻腔进行肺部给药的制剂是以使含有活性成分的颗粒被输送到接受者的支气管树中的形式来提供的，所述颗粒的理想直径范围为0.5至7微米。这类制剂可能是细粉碎的粉剂，该粉剂或者可以适当地以适用于吸入装置的穿透胶囊的形式来提供，所述胶囊合适地是例如明胶，或者以自体推进制剂的形式来提供，所述自体推进制剂含有活性成分、合适的液体推进剂以及任选地含有其它成分如表面活性剂和/或固体稀释剂。还可以在活性成分以滴状溶液或混悬液的形式进行配药的时候使用自体推进制剂。这种自体推进制剂与本领域的已知自体推进制剂相类似并且可以通过已经建立起来的方法来制备。采用具备理想喷雾特性的手操作阀门或自动功能阀来适当地提供所述自体推进制剂；有利地是，所述阀门是一种计量型的输送固定体积的阀门，例如每对其操作一次，则输送例如50至100uL的体积。
所述佐剂还可以是适于雾化器使用的溶液形式，以便通过采用加速气流或超声搅拌来产生适于吸入的细小雾滴。
适合于鼻内给药的制剂通常包括与上述肺部给药相类似的成分，然而优选的是这类制剂的粒径范围为约10至约200微米，从而能够使制剂停留在鼻腔内。适当地通过利用大小合适的颗粒或选择合适的阀来达到这一目的。其它合适的制剂包括粒径范围为约20至约500微米的粗粉，这类制剂适于通过鼻道从靠近鼻子的容器中快速吸入来进行给药，并且鼻用滴剂含有约0.2至5％w/w的于含水溶液或含油溶液中的活性成分。在本发明的一个实施方案中，含有编码抗原肽的载体可以在与1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-4-胺衍生物的制剂相同的制剂中进行给药。
因此在该实施方案中，免疫原性和佐剂成分被包含在同一制剂中。
在一个优选的实施方案中，所述佐剂成分被制备成适于基因枪给药的形式，并且通过基本上与核苷酸序列同时给药的途径进行给药。为了制备适于以这种方式使用的制剂，需要将1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-4-胺衍生物冻干并且附着在例如适于基因枪给药的金珠子上。
在另一个实施方案中，所述佐剂成分可以以干粉的形式通过高压气体推进来进行给药。该给药方式优选地是基本上与核苷酸序列的给药同时进行。
即使不一起配制，佐剂成分与核苷酸序列同时或几乎同时给药也是合适的。
关于药物制剂的其它详细描述可以参见Remington′s PharmaceuticalSciences，Mack出版公司，Easton，Pennysylvania(1985)，其全部公开内容被本文引入作为参考。
本发明将通过下列非限制性的实施例进行进一步的说明。
实施例1.咪喹莫特增强细胞毒性T细胞对核酸疫苗的应答强度质粒的构建和DNA的制备所使用的质粒建立在获自于Micelle Young，Glaxo Wellcome，UK的pVAC1的基础上，哺乳动物表达载体pCI(Promega)的一种改构体，其中从EcoRl至Bst Zl的多克隆位点被EMCV IRES序列所取代，该序列的5′端侧翼具有单一Nhe I，Rsr II和Xho I限制酶切位点以及3′侧翼具有单一Pac I，Asc I和Not I限制酶切位点。
流感核蛋白表达质粒pVAC1.PR是通过将PCR扩增的cDNA连接到表达载体pVAC1上而构建的，所述cDNA编码甲型流感病毒株PR/8/34的核蛋白，该病毒株得自于pAR501(由来自联合王国，伦敦，NIMR的D.Kiossis博士赠送)。
质粒DNA在大肠杆菌中进行繁殖后利用质粒纯化试剂盒(QIAGEN Ltd，Crawle，UK)进行制备，然后在-20℃条件下以约1mg质粒DNA/ml的浓度保存在10mM Tris/EDTA缓冲液中。用于DNA免疫的筒装制剂用于Accell基因转移装置的柱体的制备方法在以前已经被描述过了(Eisenbraun等，DNA和细胞生物学(DNA and Cell Biology)，1993，第12卷，第9期，791-797页；Pertner等)。主要步骤包括，将质粒DNA包衣在2μm的金颗粒上(DeGussa Corp.，South Plainfield，N.J.，USA)并装入Tefzel管中，然后将该管切割成1.27cm的长度作为筒装制剂并在4℃的条件下干燥保存直到使用。在一种典型的免疫接种过程中，每个筒装制剂含有0.5mg的包衣了～0.05μg pVAC1.PR的金珠子并加入了总共能够提供0.5μg DNA/筒装制剂的空载体(pVAC1)。免疫为了检验咪喹莫特是否能够增强通过核酸免疫接种而产生的细胞毒性T细胞的应答，通过粒子介导的基因转移(0.05g/筒装制剂)将pVAC1.PR给药到小鼠的皮内。利用500Ib/in2的Accell基因转移装置(McCabe WO 95/19799)将两个筒装制剂中的质粒输送到C57BI/6小鼠(购自于Charles River UnitedKingdom Ltd，Margate，UK)腹部皮肤的剃过毛的靶位点。免疫接种后，通过单次皮下注射(0.05ml/10g体重能够提供30mg/kg的剂量)在免疫位点立刻给药咪喹莫特(被配制成在媒介物中的混悬液，该媒介物是含有0.3％(w/v)甲基纤维素和0.1％(v/v)吐温的无菌水)。质粒和咪喹莫特对照分别是空载体(pVAC1)和媒介物。细胞毒性T细胞应答通过对一周后收集到的脾细胞进行CD8+T细胞限制性IFN-γELISPOT试验来评估细胞毒性T细胞应答。通过拉颈法处死小鼠并将脾收集到冰冷的PBS中。将脾细胞挑出后放置到磷酸盐缓冲液(PBS)中，接着使血红细胞发生溶胞(在由155mM NH4CI，10mM KHCO3，0.1mM EDTA组成的缓冲液中保持1分钟)。用PBS冲洗两次去除了微粒物质后，将单细胞悬液等分分配到预先包被了IFN-γ捕捉抗体的ELISPOT平皿中并利用CD8-限制性关连肽进行刺激。过夜培养后，首先利用生物素标记的抗鼠IFN-γ抗体，然后利用结合了链霉抗生物素的碱性磷酸酶对IFN-γ-产生细胞(Pharmingen)进行肉眼观察，并通过图像分析进行定量。
该实验的结果(图1)表明经pVAC1.PR和咪喹莫特的组合物处理的小鼠脾中的细胞毒性T细胞的数目比只经pVAC1.PR+媒介物处理的小鼠脾中的细胞毒性T细胞的数目多三倍。而对照质粒(pVAC1)+咪喹莫特或媒介物之间没有差别，表明咪喹莫特的效果是受抗原限制的。这些结果清楚表明咪喹莫特是核酸免疫接种的有效佐剂。2.咪喹莫特增强CD4+T细胞针对核酸疫苗的应答强度质粒、DNA和筒装制剂的制备通过将来源于pUGOVA的编码鸡卵白蛋白的PCR扩增cDNA(由F.Carbone博士馈赠)连接到表达载体pVAC1上来构建鸡卵白蛋白表达质粒pVAC1.OVA并制备柱体(按照上述实施例1中描述的方法)。小鼠和免疫在Bury Green农场利用我们特定的不含病原体的动物育种装置对D0.11.10雄性或雌性转基因小鼠(6-10周龄)进行繁殖。这些小鼠表达的转基因产物是对连接于MHC-II分子(I-Ad)的鸡卵白蛋白肽残基(323-339位残基；OVA肽)具有特异性的T细胞受体(TCR)。能够特异性识别TCR的单克隆抗体KJ1-26被用于鉴定TCR-转基因T细胞。对这些小鼠中的一些小鼠进行的检测试验表明大部分(40-65％)的CD4+T细胞是KJ1-26+，尽管还存在极小部分的CD4-CD8+KJ1.26+T细胞(Pape等，免疫学综述(ImmunologicalReviews)(1997)15667-78)。从Charles River United Kingdom Ltd.(Margate，UK)购买的Balb/c小鼠利用能够提高待测免疫参数的灵敏度的过继转移模型来检测CD4+T细胞应答。在本文中，在进行免疫前将特异识别源自卵白蛋白的肽序列的T细胞从转基因动物中过继转移到幼稚野生小鼠体内。概括地说，在免疫前24小时，将DO.11.10脾细胞过继转移到6-8周龄的Balb/c小鼠体内。按照上述实施例1中的方法制备脾细胞。然后通过注射100μl的量(即25×106个脾细胞/小鼠)将细胞过继转移到尾侧静脉中。
然后按照实施例1中的描述，利用编码卵白蛋白的质粒(pVAC1.OVA；0.5μg/筒装制剂)和咪喹莫特(30mg/kg)，或者利用对照质粒或媒介物通过由颗粒介导的基因转移对小鼠进行免疫。CD4 T细胞应答通过拉颈法处死小鼠，收集腹骨沟和主动脉周的淋巴结来制备脾细胞(按照实施例1的方法)，只是省去血红细胞的溶胞步骤。
为了测定免疫后的CD4+T细胞的克隆扩充，采用关连卵白蛋白肽再次进行免疫攻击，然后对免疫后的第3天所收集到的淋巴结制品中的卵白蛋白-特异性T细胞的增殖情况进行评估。通过测定增殖细胞吸收含氚胸腺嘧啶核苷的量来评估增殖水平，结果表明利用pVAC1.OVA+咪喹莫特的组合物所导致的增殖水平比利用pVAC1.OVA+媒介物的组合物所导致的增殖水平高两倍(图2)。而对照质粒(pVAC1)+咪喹莫特或媒介物之间没有差别，表明咪喹莫特的效果是受抗原限制的。
通过对免疫后第6天收集到的淋巴结细胞进行IL-2 ELISPOT(上述实施例1)来测定CD4 T细胞的活化水平(图3)，结果发现采用pVAC1.OVA+咪喹莫特的组合物时的CD4 T细胞活化水平比只采用pVAC1.OvAA的CD4 T细胞活化水平有了显著的提高(提高了70％)。
这些结果表明咪喹莫特在体内的佐剂效应扩展到两种T细胞种群(即CD8+细胞毒性T细胞和CD4+辅助T细胞)。这些结果还证实了咪喹莫特作为核酸疫苗接种的佐剂的效力。3.咪喹莫特诱导针对核酸疫苗诱导Th1和Th2应答利用过继转移模型评估Th CD4+亚群(上述实施例2)。IFN-γ-产生细胞(Th1)和IL-4-产生细胞(Th2)通过ELISPOT来进行测定(上述实施例1)。咪喹莫特能够诱导两种细胞因子-产生细胞的增殖，尽管IFN-γ-产生细胞比IL-4-产生细胞的增殖得快(图4)。在空载体免疫的对照组中，没有检测到细胞因子-产生细胞。IFN-γ-产生细胞的倾向表明咪喹莫特不仅起着核酸疫苗接种的佐剂作用而且还优选诱导Th1型的应答，后者已由上述实施例1所证实。4.咪喹莫特对体液免疫应答的作用为了证实咪喹莫特是否能够增强由核酸免疫接种导致的体液应答，通过PMGT将一种编码抗原(例如源自流感病毒的核蛋白)的质粒给药到小鼠的皮肤内。初次免疫后进行一次或多次加强免疫，每次免疫接种之间间隔至少4个星期。每次免疫接种前和/或刚免疫接种后，通过在免疫接种位点进行单次注射来给药咪喹莫特。质粒和咪喹莫特对照分别是空载体(即不含抗原)和媒介物。免疫接种前的第1至3天以及免疫接种后间歇式地从尾静脉采集血样。分离出血清并保存在-20℃下以备以后进行抗体分析。
通过测定初次免疫和加强免疫后采集的血清中的具有抗原特异性的完整IgG抗体的浓度(例如源自流感病毒的核蛋白)来评估体液应答。将微量滴定板(NuncImmunoplate F96 maxisorp，Lifet Technologies)包被上10μg/ml的抗原并在4℃下温育过夜，然后用洗涤缓冲液(含有5％土温20和0.1％叠氮化钠的PBS)冲洗4次。然后在20℃下与用封闭缓冲液连续稀释的血清样品一起进行1小时的温育。进一步冲洗4次(如上所述)从而除去未被结合的抗体后，将微量滴定板与用封闭缓冲液稀释的连接了过氧化物酶的抗鼠IgG抗体(Southem Biotechnology)一起温育1小时。在进一步冲洗4次后测定结合抗体的量(按照上述)，然后加入TMB底物溶液(T-8540-Sigma)。在20℃和避光的条件下保持30分钟后，加入1M的硫酸以使反应终止，然后在450nm下测定吸光度。滴度被定义为OD达到0.2时的最高稀释度。经咪喹莫特处理的免疫小鼠的体内的抗体浓度比没经咪喹莫特处理的高，这一结果表明咪喹莫特对体液应答具有增强作用。5.咪喹莫特增强针对HIV抗原的免疫应答质粒、DNA和筒装制剂表达Gag和Nef抗原的质粒(即WRG7077Gag/Nef)是在WRG7077基础上构建的。原始质粒WRG7077通过以下步骤来构建用含有卡那霉素抗性基因的pUC4K(Amersham-Pharmacia)的EcoRl片段取代含有pUC19(获自于Amersham Pharmacia Biotech UK Ltd.，Amersham Place，Little Chalfont，Bucks，HP7 9NA)的Eam11051-Pstl片段的β-内酰胺酶基因，接着利用T4 DNA聚合酶将两个片段平端化。人巨细胞病毒IE1启动子/增强子、内含子A得自于马萨诸塞大学的Harriet Robinson博士赠送的质粒JW4303，并被插入到pUC19的Sal1位点而成为Xhol-Sal1片段，该片段中引入了牛生长激素聚腺苷酸化信号序列。Gag-Nef融合体通过以下步骤来产生通过PCR将平端化的Nef与除去了头65个氨基酸的基因的5′端的195个碱基对和p17p24(Gag)进行连接，所述基因来源于HIV-1病毒株248A(Genbank登记号为L15518，由G.Thompson赠送)，以及p17p24(Gag)来源于含有HIV-1分化B病毒株HXB2(Genbank登记号为K03455)的质粒pHXBAPr(Maschera等，1995)。接着将得到的Gag-Nef融合体连接到WRG7077中从而形成Notl-BamH1片段。质粒DNA和筒装制剂如实施例1中所述。小鼠和免疫按照实施例1中所述的方法，对Balb/c小鼠进行免疫接种，进行咪喹莫特的制备和给药。在本实验中，在小鼠获得初次免疫后的第42天，对其进行加强免疫。在加强免疫的过程中，只给药咪喹莫特(100mg/kg)。细胞毒性T细胞应答按照实施例1所述的方法进行IFN-γELISPOT测定，在加强免疫后的第5天利用Gag和Nef抗原的CD8限制性关连肽刺激所收集的脾细胞。
共同给药咪喹莫特后发现细胞毒性T细胞的数目比只给药了质粒和介质的试验组的细胞毒性T细胞的数目有了明显的增加(对于Gag和Nef分别为10倍和100倍)(图5)。这些发现表明咪喹莫特的佐剂效应不具有抗原特异性而且反映出对病毒抗原的功效，尤其是对HIV的功效。6.咪喹莫特类似物是核酸疫苗接种的有效佐剂利用pVAC1.OVA质粒制备筒装制剂，免疫接种和T细胞应答如实施例2所述。进行试验的咪喹莫特的类似物是1-(2-羟基-2-甲基丙基)-2-乙氧基甲基-1-H-咪唑并[4，5-c]喹啉-胺(即resiquimod)，1-(2-羟基-2-甲基丙基)-2-甲基-1H-咪唑并[4，5c]喹啉-4-胺和1-(2-羟基-2-甲基丙基)-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉4-胺。
在一个宽剂量范围内对Resiquimod进行测试，结果显然是1mg/kg最合适。在本试验中，对免疫5天后收集到的淋巴结细胞进行的分析结果表明产生IFN-γ的CD4 T细胞的数目增加了6倍，对产生IL-4的CD4 T细胞只具有适中的作用(图6)，进一步佐证了实施例3中的Th1边缘效应。
通过以30mg/kg的剂量单次给药其它两种类似物来研究这两种类似物对免疫5天后对T细胞的作用。通过给药1-(2-羟基-2-甲基丙基)-2-甲基-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-4-胺使得产生IFN-γ和IL-4的CD4 T细胞的数目增加了两倍。发现1-(2-羟基-2-甲基丙基)-1-H-咪唑并[4，5-c]喹啉-4-胺也具有相似的作用(图7)。
总之，该实施例中的这些结果表明不只是咪喹莫特具有佐剂作用，该化学分类中的许多化合物都具有佐剂的作用。7.局部涂敷是在核酸免疫接种过程中给药咪喹莫特的有效途径利用所制备的WRG7077Gag/Nef质粒进行筒装制剂的制备，PMID免疫和T细胞应答如实施例5所述。在本实验中，以30mg/kg的剂量皮下注射咪喹莫特。对于另外一个试验组，免疫接种后立刻在PMID部位局部涂敷20μl的5％(w/v)乳膏(即Aldara)来给药咪喹莫特。加强免疫后的第6天和第11天收集脾以便用于分析。
无论采用皮下注射还是局部涂敷来给药咪喹莫特，都发现细胞毒性T细胞数目比只是皮下注射了质粒和媒介物的实验组的细胞毒性T细胞数目有了明显的增加(即加强免疫后的第11天约为2倍)(图8)。这些结果表明局部涂敷的咪喹莫特是PMID的有效佐剂而且还表明在对与PIMD结合的佐剂进行研究的过程中，皮下注射是局部涂敷的一种相关取代途径。8.咪喹莫特是防止肿瘤生长的一种有效佐剂利用pVAC1.OVA质粒制备筒装制剂(如实施例2所述)。通过实施例5中所述的PMID对试验组中的12只小鼠进行免疫接种，不同的是筒装制剂含有0.1μg的DNA以及以30mg/kg的剂量皮下注射咪喹莫特。肿瘤攻击加强免疫后的第二个星期，通过在每只小鼠的侧腹进行皮下注射来植入EG7-OVA细胞(100,000个细胞/小鼠)，然后监控肿瘤的生长。E.G7-OVA细胞最初是由F.Carbone(Moore，M.W，Carbone，F.R.和Bevan，M.J.，细胞(Cell)，54，777-785，1988)通过转染小鼠腹水淋巴瘤原淋巴细胞系EL4而制备的，目的是用来稳定表达鸡卵白蛋白。
与只给药了pVAC1.OVA相比，通过利用pVAC1.OVA+咪喹莫特对小鼠进行免疫，在小鼠体内出现可触知肿瘤的期限被明显延迟了(图9)。而对于对照组中的小鼠(即，只用空载体±咪喹莫特免疫的小鼠)来说，体内可触知肿瘤出现得较早而且生长得最快。通过pVAC1.OVA+咪喹莫特免疫的小鼠的肿瘤发生能力为25％。而所有其它试验组的肿瘤发生能力大于40％(图10)。这些结果表明，咪喹莫特可提高PMID的抗肿瘤作用，并且还表明咪喹莫特将会成为一种核酸治疗疾病的有效佐剂。
权利要求
1.一种疫苗组合物，其含有(i)一种含有1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-4-胺衍生物的佐剂成分和(ii)一种含有编码抗原肽或与疾病相关蛋白的核苷酸序列的免疫原成分。
2.一种试剂盒，其含有(i)一种含有1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-4-胺衍生物的佐剂成分和(ii)一种含有编码抗原肽或与疾病相关蛋白的核苷酸序列的免疫原成分。
3.一种如权利要求2所述的组合物，其中所述成分基本上同时进行给药。
4.一种如权利要求1所述的组合物，其中所述成分处于单独药用制剂中。
5.一种如上述任意一项权利要求所述的组合物，其中1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-4-胺衍生物是由结构式I-VI中的一个结构式所定义的化合物 其中R11选自直链或支链烷基、羟烷基、酰氧烷基、苄基、(苯基)乙基和苯基，所述苄基、(苯基)乙基或苯基取代基任选地被独立地选自一个至约四个碳原子的烷基、一个至约四个碳原子的烷氧基和卤素的一个或两个基团在苯环上进行了取代，条件是如果所述苯环被所述基团中的两个所取代，那么所述基团总共含有不超过6个碳原子；R21选自氢、一个至约八个碳原子的烷基、苄基、(苯基)乙基和苯基，所述苄基、(苯基)乙基或苯基取代基任选地被独立地选自一个至约四个碳原子的烷基、一个至约四个碳原子的烷氧基和卤素的一个或两个基团在苯环上进行了取代，条件是如果所述苯环被所述基团中的两个所取代，那么所述基团总共含有不超过6个碳原子；和每个R1独立的选自氢、一个至约四个碳原子的烷氧基、卤素和一个至约四个碳原子的烷基，以及n是0至2的整数，条件是如果n是2，那么所述R11基团总共含有不超过6个碳原子； 其中R12选自含有2至约10个碳原子的直链或支链烯基和含有2至约10个碳原子的被取代的直链或支链烯基，其中所述取代基选自含有1至约4个碳原子的直链或支链烷基和含有3至约6个碳原子的环烷基；和被含有1至约4个碳原子的直链或支链烷基取代的含有3至约6个碳原子的环烷基；以及R22选自氢、含有一个至约八个碳原子的直链或支链烷基、苄基、(苯基)乙基和苯基，所述苄基、(苯基)乙基或苯基取代基任选地被独立地选自含有一个至约四个碳原子的直链或支链烷基、含有一个至约四个碳原子的直链或支链烷氧基和卤素的一个或两个基团在苯环上进行了取代，条件是如果所述苯环被两个这样的基团所取代，那么所述基团总共含有不超过6个碳原子；和R2独立的选自含有一个至约四个碳原子的直链或支链烷氧基、卤素和含有一个至约四个碳原子的直链或支链烷基，以及n是0至2的整数，条件是如果n是2，那么所述R2基团总共含有不超过6个碳原子； 其中R23选自氢、一个至约八个碳原子的直链或支链烷基、苄基、(苯基)乙基和苯基，所述苄基，(苯基)乙基或苯基取代基任选地被一个或两个独立地选自一个至约四个碳原子的直链或支链烷基、一个至约四个碳原子的直链或支链烷氧基和卤素的基团在苯环上进行了取代，条件是如果所述苯环被两个这样的基团所取代，那么所述基团总共含有不超过6个碳原子；和R5独立地选自一个至约四个碳原子的直链或支链烷氧基、卤素和一个至约四个碳原子的直链或支链烷基，以及n是0至2的整数，条件是如果n是2，那么所述R3基团总共含有不超过6个碳原子；(贴第42页的化学结构式IV) 其中R14是-CHRARB，其中RB是氢或碳-碳键，条件是当RB是氢时，RA是一个至约四个碳原子的烷氧基、一个至约四个碳原子的羟烷氧基、两个至约十个碳原子的1-炔基、四氢吡喃基、其中烷氧基部分含有一个至约四个碳原子以及烷基部分含有一个至约四个碳原子的烷氧基烷基、2-、3-或4-吡啶基，以及另外一个条件是当RB是碳-碳键时，RB和RA共同形成四氢呋喃基团，该基团任选地被一个或多个独立地选自羟基和一个至约四个碳原子的羟烷基的取代基所取代；R24选自氢、一个至约四个碳原子的烷基、苯基和其中取代基选自一个至约四个碳原子的烷基、一个至约四个碳原子的烷氧基和卤素的被取代的苯基；R4选自氢、含有一个至约四个碳原子的直链或支链烷氧基、卤素和含有一个至约四个碳原子的直链或支链烷基； 其中R15选自氢、含有一个至约十个碳原子的直链或支链烷基和被取代的含有一个至约十个碳原子的直链或支链烷基，其中取代基选自含有三个至约六个碳原子的环烷基和被含有一个至约四个碳原子的直链或支链烷基取代的含有三个至约六个碳原子的环烷基；含有两个至约十个碳原子的直链或支链烯基和被取代的含有两个至约十个碳原子的直链或支链烯基，其中取代基选自含有三个至约六个碳原子的环烷基和被含有一个至约四个碳原子的直链或支链烷基取代的含有三个至约六个碳原子的环烷基；一个至约六个碳原子的羟烷基；其中烷氧基部分含有一个至约四个碳原子以及烷基部分含有一个至约六个碳原子的烷氧基烷基；其中酰氧基部分是两个至约四个碳原子的链烷酰氧基或苯甲酰氧基以及烷基部分含有一个至约六个碳原子的酰氧烷基；苄基；(苯基)乙基；和苯基；所述苄基，(苯基)乙基或苯基取代基任选地被一个或两个独立地选自一个至约四个碳原子的烷基、一个至约四个碳原子的烷氧基和卤素的基团在苯环上进行了取代，条件是当所述苯环被两个所述基团取代时，所述基团总共含有不超过六个碳原子；R25是 其中Rx和Ry独立地选自氢、一个至约四个碳原子的烷基、苯基和其中取代基选自一个至约四个碳原子的烷基、一个至约四个碳原子的烷氧基和卤素的被取代的苯基；X选自含有一个至约四个碳原子的烷氧基、其中烷氧基部分含有一个至约四个碳原子以及烷基部分含有一个至约四个碳原子的烷氧基烷基、一个至约四个碳原子的卤烷基、其中烷基含有一个至约四个碳原子的烷酰氨基、氨基、其中取代基为一个至约四个碳原子的烷基或羟烷基的被取代的氨基、叠氮基、一个至约四个碳原子的烷硫基；以及R5选自氢、一个至约四个碳原子的直链或支链烷氧基、卤素、一个至约四个碳原子的直链或支链烷基； 其中Rt选自氢、含有一个至约四个碳原子的直链或支联烷氧基、卤素和含有一个至约四个碳原子的直链或支链烷基；Ru是2-甲基丙基或2-羟基-2-甲基丙基；和Rv是氢、一个至约六个碳原子的烷基，或其中烷氧基部分含有一个至约四个碳原子以及烷基部分含有一个至约四个碳原子的烷氧基烷基；或上述任意一种化合物的药用盐。
6.一种如权利要求4所述的组合物，其中1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-4-胺衍生物是结构式VI的化合物。
7.如权利要求5所述的组合物，其中Rt是氢。
8.如权利要求6所述的组合物，其中Ru是2-甲基丙基或2-羟基-2-甲基丙基，以及Rv是氢、甲基或乙氧基甲基。
9.如权利要求7所述的组合物，其中所述化合物选自1-(2-甲基丙基)-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-4-胺；1-(2-羟基-2-甲基丙基)-2-甲基-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-4-胺；1-(2-羟基-2-甲基丙基)-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-4-胺；1-(2-羟基-2-甲基丙基)-2-乙氧基甲基-1-H-咪唑并[4，5-c]喹啉-4-胺。
10.一种如上述任意一项权利要求所述的疫苗组合物，其中每一成分是一种适于通过口、鼻、局部、肺部、肌内、皮下或皮内的任意途径进行给药的形式。
11.如权利要求10所述的疫苗组合物，其中免疫原成分是一种适于利用由颗粒介导的基因转移技术进行给药的形式。
12.如权利要求11所述的疫苗组合物，其中佐剂成分是一种适于利用由颗粒介导的基因转移技术进行给药的形式。
13.一种增强针对抗原的免疫应答的方法，包括顺序或同时给药一种编码抗原的核酸和一种咪唑并[4，5-c]喹啉-4-胺衍生物。
14.一种增强哺乳动物针对免疫原的免疫应答的方法，包括给所述哺乳动物给药一种如权利要求1至12种任意一项权利要求所述的疫苗组合物的步骤。
15.如权利要求13或14所述的方法，其中在给药免疫原成分的前约7天和后约7天之内给药1至7次的佐剂成分。
16.如权利要求15所述的方法，其中所述佐剂成分的给药与免疫原成分的给药基本上同时进行。
17.如权利要求13或14所述的方法，其中1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-4-胺衍生物以约1mg/kg至50mg/kg的剂量给药。
18.1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-4-胺衍生物在制备用于增强由抗原肽诱导的免疫应答的药物中的用途，所述肽是由于给哺乳动物给药了编码所述肽的核苷酸序列而表达。
19.如权利要求18所述的用途，其中1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-4-胺衍生物如权利要求5中所定义。
20.如权利要求19所述的用途，其中1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-4-胺衍生物如权利要求6中所定义。
21.如权利要求1 8至20中的任意一项权利要求所述的用途，其中1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-4-胺衍生物以1mg/kg至50mg/kg的剂量给药。
22.一种由在DNA疫苗接种过程中单独、连续或同时进行给药的成分组成的组合物，含有一种编码免疫原的核苷酸序列和一种1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-4-胺衍生物，所述免疫原是一种抗原肽，所述衍生物能够增强由抗原肽诱导的免疫应答。
23.如权利要求21所述的组合物，其中1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-4-胺衍生物如权利要求5中所定义。
24.如权利要求23所述的组合物，其中1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-4-胺衍生物如权利要求6中所定义。
全文摘要
本发明涉及1H－咪唑并[4，5－c]喹啉－4－胺衍生物作为核酸疫苗接种过程中使用的佐剂的用途。
文档编号C07D215/42GK1473051SQ0181861
公开日2004年2月4日 申请日期2001年9月20日 优先权日2000年9月20日
发明者林迪·L·汤姆森, 约翰·P·泰特, 彼得·托普利, P 泰特, 托普利, 林迪 L 汤姆森 申请人:葛兰素集团有限公司