专利名称：新型重组人组织因子途径抑制物活性肽及其制备方法
技术领域：
本发明属生物技术领域，具体涉及新型重组人组织途径抑制物活性肽。更具体地，本发明涉及新型重组人组织途径抑制物活性肽1和活性肽2，与全长人组织途径抑制物相比，活性肽1保持抗组织因子/因子VIIa活性，活性肽2保持抗因子Xa活性。本发明还涉及本重组人组织因子途径抑制物活性肽的制备方法及其应用。
近年来，研究人员使用重组人TFPI进行了一系列的动物实验和若干临床实验，结果表明TFPI对于冠状动脉血栓形成、脓毒血症、弥漫性血管内凝血、中风、癌症、急性呼吸窘迫综合征和缺血再灌注损伤等均有很好的疗效，而且出血的危险性明显低于低分子肝素，是一种安全性好，疗效高的抗凝和抗血栓药物(Jeske W，et al.Seminars in thrombosis and hemostasis，1996；22(2)213-219)。
TFPI是分子量约40kd的单链糖蛋白，由276个氨基酸残基组成。TFPI的结构包括氨基端区，三个Kunitz型蛋白酶抑制区(结构域)。每个结构域均是51个氨基酸残基组成的环状结构，有三对二硫键。结构域1的活性位点位于Lys36-Ala37，结构域2的活性位点位于Arg107-Gly108，结构域3的活性位点位于Arg199-Ala200。TFPI有三个糖基化位点，分别位于Asn117，Asn167和Asn228，但糖基化的有无不影响TFPI的活性(Nakahara Y，et al.Biochemistry，1996；356450-6459；Burgering M，et al.J.Mol.Biol.1997；269395-407)。根据TFPI以上的特性，本发明设计了rhTFPI-AP1和rhTFPI-AP2的分子结构。rhTFPI-AP1保留了TFPI 22-79，Asp31和Asp32被替换为Lys31和Ala32。rhTFPI-AP2保留了TFPI 93-150，Asp100、Glu101、Glu102和Asn117被替换为Arg100、Arg101、Gly102和Gln103。表1序列表SEQ ID NO1，显示本发明rhTFPI-AP1的氨基酸序列，表2序列表SEQ ID NO2，显示本发明rhTFPI-AP2的氨基酸序列，表3序列表SEQ ID NO3，显示本发明rhTFPI-AP1的核甘酸序列，表4序列表SEQ ID NO4，显示本发明rhTFPI-AP2的核甘酸序列。
本发明还提供了制备本发明rhTFPI-AP1和rhTFPI-AP2的方法，包括制备至少包含表达生物活性的rhTFPI-AP1和rhTFPI-AP2编码序列部分的cDNA；在适合表达的载体中克隆cDNA片断；用该载体转染宿主细胞；在适于表达该cDNA片断的条件下培养该宿主细胞；及从培养物中回收和纯化所需rhTFPI-AP1和rhTFPI-AP2。
本发明中rhTFPI-AP1和rhTFPI-AP2基因的制备包括经过点突变后的基因，与质粒PUC19重组，DNA限制性内切酶酶切鉴定筛选阳性克隆，核苷酸序列分析验证基因是否正确。
将本发明的cDNA片断与表达载体重组，形成重组表达质粒。本发明不限于特定的表达质粒。在一优选实施方案中，本发明使用真核表达载体，例如pPIC9K等。
上述重组表达载体可按常规方法导入适宜宿主细胞。本发明不局限于任何特定的宿主细胞，只要它能够表达所述重组表达载体。在一优选实施方案中，本发明使用甲醇营养型酵母菌株如GS115，KM71等。
本发明的表达产物分泌到胞外，存在于宿主细胞培养液上清内。只需离心去除宿主细胞，即可对培养液上清进行分离和纯化所需产品。
以上技术方案中所有基本分子生物学操作均参照<分子克隆实验指南>。本发明应用基因工程方法对2种活性肽进行生产，所得产品具有高效的抗凝和抗栓功能，并且制备工艺简便、安全，与全长TFPI性质比较表明，rhTFPI-AP1和rhTFPI-AP2的抗凝和抗栓功能与TFPI类似，但分子量明显减少，为非静脉缓释注射剂和非注射剂的研究提供了原料，可用于预防和治疗血栓性疾病限制性内切酶购自BRL公司，大肠杆菌JM109、质粒pUC19、甲醇营养型酵母菌GS115、酵母多拷贝表达载体pPIC9K购自Invitrogen公司。
(2)筛选高拷贝高效表达菌株将质粒rhTFPI-AP1-pPIC9K和rhTFPI-AP2-pPIC9K电转化甲醇营养型酵母GS115，使其与酵母染色体发生重组，G418筛选高效表达菌株。
挑取上述阳性克隆接种于10ml低营养液BMG〖1.34％YNB，(4×10-5)生物素，1％甘油〗中，30℃快速振遥(250 RPM)，培养过夜。次日测定光密度OD600，离心弃除BMG培液，用无菌水洗涤后用BMM培液〖1.34％YNB，(4×10-5)生物素，0.5％甲醇〗稀释至OD600＝1。每天补加体积百分数为0.5％的甲醇。甲醇诱导培养7天，每隔24小时取样1ml，测定抗TF/FVIIa(rhTFPI-AP1)或抗Fxa(rhTFPI-AP2)活性。离心弃沉淀，上清于-20℃保存。直接取培液上清与2x上样缓冲液等体积混合后取20ul上样，作还原性SDS-PAGE电泳。考马斯亮蓝R-250染色后，Pharmacia Imagenaster VDS扫描定纯度、分子量。可见诱导后上清液在分子量约6kd处有一浓集的条带，经扫描，目的蛋白约占上清总蛋白的84％；结果表明表达产物rhTFPI-AP1有明显的抗TF/FVIIa作用，rhTFPI-AP2有明显的抗FXa作用。上述还原性SDS-PAGE按Laemmli方法进行。
(3)发酵表达工程菌按上述筛选高表达菌株作为工程菌，然后以5L发酵罐进行高密度发酵。从-70℃深低温冰箱中取出种子菌，室温下解冻，在种子菌培养室100级洁净度条件下划YPD平板，30℃温箱培养2-3天。从平板上挑取单菌落，同样在100级洁净度条件下接种于10ml BMG培养液中，30℃培养过夜，此为一级种子液。再将一级种子液加入140ml培养液中，30℃培养6-8小时，直至OD600＝6，此为二级种子液。种子菌接入后，自然增值，待基础培养基中预加的甘油被耗尽以后，开始补充甘油，补充速度16ml/L/h，待OD600达到120左右，停止补加甘油。待培养液中甘油全部耗尽后，开始甲醇诱导。甲醇补料速度从1ml/L/h逐渐升高至12ml/L/h，以后一直维持此速度。本发明的发酵技术是用低盐培养基扩增工程菌，诱导前用含微量元素的甘油溶液进行补料，到达一定菌体浓度后用含微量元素的甲醇溶液进行诱导表达。
甲醇诱导40h以后，停止发酵，从发酵罐中立即放出菌液进行离心，分离沉淀菌体，收集上清进行纯化。上清中rhTFPI-AP1对TF/FVIIa的抑制常数达Ki＝0.12uM，rhTFPI-AP2对FXa的抑制常数达Ki＝0.09uM。发酵参数为温度30℃，氧容量控制在35±5％，pH＝5，搅拌速度与DO连动。
(4)超滤浓缩脱盐将离心所获上清以1∶10稀释，经Millipore超滤装置(NMWL3000，Millipore公司)超滤浓缩至1.0L，脱去无机盐。
(5)凝胶过滤Sephadex G-50(Pharmacia公司)柱用20mmol/L PB(pH7.4)平衡后，将超滤浓缩液上样，加样时注意勿搅动Sephadex G-50胶面。然后用PB洗脱，流速10ml/min，收集活性峰。
(6)Q-Sepharose Fast Flow柱层析以10倍体积的50mmol/L PB(pH 7.4)平衡Q-Sepharose F.F.(Pharmacia公司)柱，凝胶过滤后收集的抗凝活力部分以50ml/min的速率将其吸附到Q-Sepharose F.F.柱上。用PB洗柱直至OD280达0.00，然后用0-1mol/L NaCl(50mmol/L PB pH 7.4)线性梯度洗脱，收集有抗凝活性部分，分装，冷冻干燥，-40℃保存。
本发明的色谱操作均为常规操作。
(7)纯度鉴定及分子量测定样品进行16.5％SDS-PAGE电泳，考马斯亮蓝R-250染色后，Pharmacia InagemasterVDS扫描测定纯度、分子量。所得产品纯度97％以上，分子量约6kD。
(8)抗TF/FVIIa活性测定使用稀释后的凝血酶原时间测定。
(9)抗FXa测定应用发色低物发测定。实施例2 制备rhTFPI-AP1和rhTFPI-AP2rhTFPI-AP1和rhTFPI-AP2真核表达质粒的构建，高拷贝高效表达菌株的筛选，工程菌的发酵表达均同实施例1。发酵液离心后收集上清液，按下法进行纯化制备纯品rhTFPI-AP1和rhTFPI-AP2。
(1)Poros HQ柱层析浓缩以10倍体积的50mmol/L PB(pH 7.4)平衡Poros HQ(Pharmacia公司)柱，发酵液离心后收集的上清以100ml/min的速率将其吸附到Poros HQ柱上。用PB洗柱直至OD280达0.00，然后用0-1mol/L NaCl(50mmol/L PB pH 7.4)线性梯度洗脱，收集有抗凝活力部分。
(2)凝胶过滤Sephadex G-50(Pharmacia公司)柱用20mmol/L PB(pH 7.4)平衡后，将Poros HQ柱层析浓缩液上样，注意加样时勿扰动SephadexG-50胶面。然后用PB洗脱，流速10ml/min，收集活性峰。
(3)Q-Sepharose Fast Flow柱层析以10倍体积的50mmol/L PB(pH 7.4)平衡Q-Sepharose F.F.(Pharmacia公司)柱，凝胶过滤后收集的抗凝活力部分以50ml/min的速率将其吸附到Q-Sepharose F.F.柱上。用PB洗柱直至OD280达0.00，然后用0-1mol/L NaCl(50mmol/L PB pH 7.4)线性梯度洗脱，收集有抗凝活性部分，分装，冷冻干燥，-40℃保存。
(4)纯度鉴定及分子量测定样品进行16.5％SDS-PAGE电泳，考马斯亮蓝R-250染色后，Pharmacia InagemasterVDS扫描测定纯度、分子量。所得产品纯度97％以上，分子量约6kD。
(5)抗TF/FVIIa活性测定(6)抗FXa测定实施例3 rhTFPI-AP1和rhTFPI-AP2在血栓性疾病中的应用应用本发明所制备的rhTFPI-AP1和rhTFPI-AP2进行抗血栓实验，证实其在血栓性疾病的防治中有良好的作用，与低分子肝素相比，抗栓效果明显，对凝血功能的影响明显小于低分子肝素。
(1)抑制静脉血栓形成损伤兔颈内静脉诱发静脉血栓形成。模型形成2小时后静脉注射给药。阴性对照组给予生理盐水，阳性对照组给予低分子肝素60抗Xa U/kg，治疗组分别给予rhTFPI-AP1和rhTFPI-AP2 0.5和1.0mg/kg。给药后4小时后取出血栓，称重。结果显示rhTFPI-AP1和rhTFPI-AP2比低分子肝素更能抑制静脉血栓形成，并且对凝血功能的影响很小。表5为rhTFPI-AP1和rhTFPI-AP2抑制静脉血栓形成实验结果。表5
(2)抑制动脉血栓形成用气囊导管损伤家兔股动脉内皮细胞，并结扎损伤部分的血管，使局部血流阻滞而诱发动脉血栓形成。阴性对照组给予生理盐水，阳性对照组给予低分子肝素60-120抗Xa U/kg，治疗组分别给予rhTFPI-AP1和rhTFPI-AP2 0.5-2.0mg/kg。实验结果表明，rhTFPI-AP1和rhTFPI-AP2可使动脉血栓形成率下降，并呈剂量相关性。表6为rhTFPI-AP1和rhTFPI-AP2抑制动脉血栓形成的作用。表6
(3)防治弥漫性血管内凝血(DIC)给家兔注射内毒素诱发DIC形成。与低分子肝素相比，静脉注射rhTFPI-AP1和rhTFPI-AP2可明显纠正DIC所致的凝血功能异常和血栓形成的程度。表7为rhTFPI-AP1和rhTFPI-AP2治疗DIC的作用。
表7
(4)冠状动脉成形术(PTCA)后血栓再形成的防治损伤狗的左冠状动脉前降支内皮细胞，诱发阻塞性冠脉血栓形成。应用rhTFPI-AP1和rhTFPI-AP2作为重组链激酶的附加用药，能促进冠脉再通，抑制血栓再形成，减少残余血栓的重量，并呈剂量的依赖性。与低分子肝素相比，发生再通的时间较短，再灌注的持续时间延长，且残留的血栓重量较轻。表8为rhTFPI-AP1和rhTFPI-AP2抑制动脉血栓再形成的作用。
表8
无需进一步详细阐述，相信采用前面所公开的内容，本领域技术人员可最大限度地应用本发明。因此，前面的优选具体实施方案应被理解为仅是举例说明，而非以任何方式限制本发明的范围。
从以上描述，本领域技术人员可很容易地明了本发明的本质特征，而且在不偏离其主旨和范围的情况下，可对本发明进行各种变更和改进。表1 SEQ ID NO11 11 21 31MHSFCEAFKAAKCPCKAIMK RFFFNIFTRQ CEEFIYGGCEG41 51NQNRFESLEE CKKNCTRD表2 SEQ ID NO 2111 21 31KPDFCFLGRRPGICRGYITR YFYNQQTKQC ERFKYGGCLG41 51NMNNFETLEE CKNICEDG表3 SEQ ID NO3ATG CAT TCA TTT TGT GCA TTC AAG GCGGCA AAGGGC CCA TGT AAA GCAATC ATG AAA AGA TTT TTC TTC AAT ATT TTC ACT CGA CAG TGC GAA GAATTT ATA TAT GGG GGA TGT GAA GGA AAT CAG AAT CGA TTT GAA AGT CTGGAA GAG TGC AAA AAA ATG TGT ACA AGA GAT表4 SEQ ID NO4AAG CCA GAT TTC TGC TTT TTGGGA CGA AGGCCT GGA ATA TGT CGA GGTTAT ATT ACC AGG TAT TTT TAT AAC AATCGAACA AAA CAG TGT GAA CGTTTC AAG TAT GGT GGA TGC CTG GGC AAT ATG AAC AAT TTT GAG ACA CTGGAA GAA TGC AAG AAC ATT TGT GAA GAT GGT
权利要求
1.新型重组人组织因子途径抑制物活性肽，其特征在于改变人组织因子途径抑制物结构域1和结构域2的结构，获得保持hTFPI特异、高效抗组织因子(TF)/FVIIa的活性肽1和抗FXa活性的活性肽2，活性肽1 rhTFPI-AP1具有SEQ ID NO1的氨基酸序列和SEQ IDNO3的核甘酸序列，活性肽2 rhTFPI-AP2具有SEQ ID NO2的氨基酸序列和SEQ ID NO4的核甘酸序列。
2.根据权利要求1所述的新型重组人组织因子途径抑制物活性肽，其特征在于所述的活性肽rhTFPI-AP1保留了TFPI 22-79，D59和D60被替换为K59和A60，rhTFPI-AP2保留了TFPI 93-150，D128、E129和E130被替换为R128、R129和G130。
3.一种制备新型重组人组织因子途径抑制物活性肽的方法，其特征在于采用下列步骤(1)根据对全长hTFPI的结构及其生化特性的分析，设计rhTFPI-AP1和rhTFPI-AP2分子结构；(2)在适于表达的载体中克隆rhTFPI-AP1和rhTFPI-AP2基因；(3)用该重组载体转染适于表达的宿主细胞；(4)在适于表达该cDNA片段的条件下培养宿主细胞，并从中回收和纯化所需产物。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所使用的载体不限于特定的表达载体，只要它能够与所述cDNA片段重组，形成适宜表达的质粒。
5.根据权利4所述的方法，其中所使用的载体为真核表达载体。
6.根据权利5所述的方法，其中所使用的载体为pPIC9K。
7.根据权利要求3所述的方法，其中所使用的宿主细胞不局限于任何特定的宿主细胞，只要它能够表达所述重组表达载体。
8.根据权利7所述的方法，其中所使用的宿主细胞为甲醇营养型酵母菌株GS115。
9.根据权利要求3所述的方法，其中培养宿主细胞所使用的方法为发酵方法，发酵参数为温度30℃，氧容量控制在35±5％，pH＝5，搅拌速度与DO连动。
10.根据权利要求3所述的方法，其中rhTFPI-AP1和rhTFPI-AP2终产物是通过工程菌发酵后离心收集上清，经超滤、凝胶过滤、离子交换三步法纯化而获得。
11.根据权利要求1-3所述的rhTFPI-AP1和rhTFPI-AP2在制备防治血栓性疾病的药物中的应用。SEQ ID NO 11 11 21 31MHSFCEAFKAAKCPCKAIMK RFFFNIFTRQ CEEFIYGGCEG41 51NQNRFESLEE CKKNCTRDSEQ ID NO 2111 21 31KPDFCFLGRRPGICRGYITR YFYNQQTKQC ERFKYGGCLG41 51NMNNFETLEE CKNICEDGSEQ ID NO 3ATG CAT TCA TTT TGT GCA TTC AAG GCGGCA AAGGGC CCA TGT AAA GCAATC ATG AAA AGA TTT TTC TTC AAT ATT TTC ACT CGA CAG TGC GAA GAATTT ATA TAT GGG GGA TGT GAA GGA AAT CAG AAT CGA TTT GAA AGT CTGGAA GAG TGC AAA AAA ATG TGT ACA AGA GATSEQ ID NO 4AAG CCA GAT TTC TGC TTT TTGGGA CGA AGGCCT GGA ATA TGT CGA GGTTAT ATT ACC AGG TAT TTT TAT AAC AATCGAACA AAA CAG TGT GAA CGTTTC AAG TAT GGT GGA TGC CTG GGC AAT ATG AAC AAT TTT GAG ACA CTGGAA GAA TGC AAG AAC ATT TGT GAA GAT GGT
全文摘要
本发明属生物技术领域,具体涉及具有抗凝和抗栓活性的重组人组织因子途径抑制物活性肽和制备方法及其应用。本发明根据对全长组织因子途径抑制物的结构及其生化特性的分析,设计了新型rhTFPI－AP1和rhTFPI－AP2结构。将突变后组织因子途径抑制物结构域1和结构域2基因与真核表达载体pPIC9K重组,转化甲醇营养型酵母GS115,筛选高表达工程菌。工程菌经发酵扩增,离心收集上清液,经三步法纯化rhTFPI－AP1和rhTFPI－AP2。所得产品冻干后,具有抗凝和抗栓活性,对于预防血栓性疾病的发生有明显的作用。
文档编号C07K14/435GK1367176SQ01126949
公开日2002年9月4日 申请日期2001年10月8日 优先权日2001年10月8日
发明者马端, 宋后燕 申请人:复旦大学