专利名称：提纯重组体人血清清蛋白的方法
本申请是申请号为95117159.3、申请日为1995年8月31日、发明名称为“提纯重组体人血清清蛋白的方法”的发明专利申请的分案申请。
本发明涉及一种简易提纯通过基因操作以高产率获得的人血清清蛋白的方法。本发明还涉及一种含重组体人血清蛋白的组合物，该组合物显示出极低的显色度，这是重组体人血清清蛋白特征的重要问题。
人血清清蛋白(以下简写为HSA)是含在血浆中的最大量的蛋白质。它有助于维持血液中的渗透压，并与营养物和代谢物结合，从而输送这些物质。具有这些功能的HSA一直被用作治疗因清蛋白损失或清蛋白合成减少和在出血性休克中引起的血清蛋白减少的药物。
HSA一直主要由采集血液的分馏物生产。然而，由血液生产HSA的方法有这样一些问题，血液的分散供应，经济上的缺点及不希望物质的污染，如肝炎病毒。因此，一直存在着开发一种可用来代替天然存在HSA的材料的急迫需求。
在这些环境下，随重组体DNA技术进层，借助基因操作大规模生产和提纯HSA(作为起源于血液的HSA的替代物)一直被开发。
为提纯由基因操作而得到的HSA(以后称为重组体HSA，并简写为rHSA)，不适合应用提纯源于血浆中的HSA同样的常规方法。这是因为欲从rHSA中去除的杂质与含在源于血浆中的HSA中的杂质全然不同。换句话说，rHSA被，比如，赋予重组体HSA特征的显色物质，源于宿主细胞的蛋白质，多糖等污染。特别是，必须充分去除源于宿主细胞中的组分，因为它们对于活的生物，包括人类，是外来物质，因此可引起抗原性的问题。
因此，一直进行着各种研究，以便通过培养将源于宿主细胞及培养组分中的组分所产生的rHSA分离和提纯到足够的程度。以这样一种工艺作为常规工艺的一种例证，它包括使含rHSA的酵母培养基受压制→超滤性膜处理→加热→超滤性膜处理，然后用如采用阳离子交换剂和阴离子交换剂的色谱法和疏水色谱法的工艺处理[JP-A-5-317079(相当于EP-A-570916)(本文所用术语＂JP-A＂是指未审查的日本专利申请)，Biotechnology of Blood Proteins，，1993，227，293-298]。此外，有上述工艺接着螯合树脂或硼酸/硼酸盐处理方法的报道(EP-A-570916，JP-A-6-245789(相当于EP-A-612761))。
在上述常规方法中，主要的是要求进行包括上述的一些步骤的提纯，借此消除源于宿主细胞中的抗原，并达到高的纯度。另一方面，这种工艺有这样一些缺点，rHSA的产率下降，以及由于大量的步骤而拖长了处理时期。虽然一直努力提高每个步骤的产率，以便改善rHSA的产率，但似乎在产率上未作出进一步的改进，这样rHSA的产率已达到了上限。此外，上述的常规工艺还有另外的难题在一开放系统中进行压制，这样就有被污染的风险。即，卫生学上的控制，这在作为药物生产rHSA是极重要的，这是极困难的。此外，rHSA的显色程度最低只可降到约0.015的A350/A280之比(在含250mg/ml，rHSA的溶液情况下)(JP-A-7-170993和JP-A-7-170994(相当于EP-A-658569))。
另一方面，一直在开发从粗培养基中直接回收目标蛋白质的方法，该法在培育完成后不进行任何的诸如消除细胞或浓缩培养基的预处理(如，Pharmacia开发的，采用扩张床吸附技术的Streamline法，International Publication in Japan No.6-500050)(相当于EP-A-538467))。
直到目前未见关于将上述扩张床吸附技术用于提纯rHSA，特别是从酵母培养基中回收和提纯rHSA的情况的报道。因此仍不知道这类方法对rHSA提纯的合理地处理及对其产率的改进是否实际上是有效的。然而，期待着将这种方法或与其类似的方法用于提纯rHSA将有助于简化包括若干步骤的常规提纯处理。
然而，产生了一个问题，为使用上述方法在通过Streamline柱吸附(吸附剂Streamline SP)采用的酸性条件下，该培养基中所含的rHSA被含在该培养基中的蛋白酶迅速降解，从而使rHSA的产率严重下降。因此，就应用上述扩张床吸附技术来提纯rHSA而言是困难的。
因此，急需开发这样一种工艺，用它可在稳态下高产率提纯rHSA而无损于扩张床吸附技术的优点(如提纯工艺的简化和合理化等)。
本发明的目的是提供在短时间内将重组体HSA提纯到一个高纯度水平和卓越的质量水平的简单方法。本发明的另一目的是提供一种rHSA，从其中充分地消除了源于宿主、培养基等的基因操作特征的显色物质，并提供一种含所得rHSA的组合物。
为解决上述难题，本发明人进行了大量的研究。结果，他们发现通过直接加热其中仍保留宿主细胞的HSA生产系统的培养基可简单而有效地使蛋白酶失话。基于这一发现，他们进一步发现，当将此加过热的溶液直接与悬浮在流化床中吸附剂颗粒接触而不去除该细胞时，可以高产率提纯rHSA。而且，他们发现，上述加热处理与吸附剂颗粒处理结合就有可能将常规的提纯rHSA的工艺步骤从5个(即压制-超滤性膜处理-加热-超滤膜处理-阳离子交换剂处理)减到2个(加热-吸附剂颗粒处理)，从而大大地缩短了提纯时间，而同时又提高了产率。
此外，本发明人还发现，他们的工艺使获得rHSA成为可能，这种rHSA基本上不含任何源于宿主细胞的杂质，而且与用常规工艺所得的rHSA相比，显示出大为降低的显色程度。
因此，本发明所涉及的是一种提纯rHSA的工艺，它包括加热含rHSA及产生rHSA的宿主的培养基，将此加过热的溶液与悬浮于流化床中的吸附剂颗粒相接触，然后回收被吸附的部分。更具体地说，本发明涉及一种提纯rHSA的工艺，它包括加热含rHSA和产生rHSA的宿主的培养基，将此加了热的溶液向上供入其中悬浮着吸附剂颗粒的流化床中，以便此加过热的溶液与该吸附颗粒接触，然后倒换流向并朝下输入缓冲液以洗脱和回收被吸附剂颗粒吸附的rHSA。
本发明还涉及一种提纯工艺，其中产生rHSA的宿主的培养基经1分钟至10小时被加热到50-100℃的温度，一种提纯rHSA的工艺，其中被加热的溶液在0.1-50ms的导电性气氛中，PH值约3-5，同吸附剂颗粒相，以及一种提纯rHSA的工艺，其中吸附剂颗粒是那些有强的阳离子交换基团的吸附剂颗粒。
本发明还涉及一种提纯rHSA的工艺，其中，含rHSA的已吸附部分(它是按上述的提纯工艺从流化床中回收的)经受至少一种选自由疏水色谱法、阴离子交换剂处理、螯合树脂处理、硼酸/硼酸盐处理及超滤性膜处理构成的方法组中的提纯处理，最好是在还原剂存在下加热后进行。
本发明进而还涉及一种含重组体人血清清蛋白的组合物，当配成25％清蛋白溶液(即rHSA浓度250mg/ml)时它显示出低于0.015的A350/A280之比。
图1是显示加热处理对rHSA培养基稳定性影响的图。
图2是显示在加过热的溶液与吸附剂颗粒相接触的气氛下的导电性与结合到吸附剂颗粒的rHSA的性能之间的关系曲线图。
图3是流程图，它显示了用streamlineSP从培养基(含酵母细胞)中提纯rHSA的最优流程。
图4显示了Streamline SP洗脱物的凝胶过滤HPLC分布图，它包括加热步骤(加热→吸附剂颗粒)处理[a]和无加热步骤(无加热→吸附剂颗粒)处理[(b)]。(吸光度于280nm测得)。
图5显示通过监测每个步骤的rHSA的显色程度(A350/A280)的变化比较常规工艺和本发明工艺。
图6是以本发明工艺所得的rHSA与以常规工艺所得的rHSA的吸附谱的比较。
图7是显示用本发明的方法所得的rHSA的GPC-HPLC分析结果的色谱(吸光度于280nm测得)。
在这些图中，各符号含意如下A参照组。
B68℃，30分钟，pH6.0。
C68℃，30分钟，pH6.8。
D68℃，30分钟，pH7.5。
E68℃，30分钟，pH8.2。
F60℃，2小时，pH6.0。
G60℃，2小时，pH6.8。
H60℃，2小时，pH7.5。
I60℃，2小时，pH8.2。
J60℃，2小时，pH6.8，10mM半胱氨酸。
K60℃，2小时，pH7.5，10mM半胱氨酸。
L室温(25℃)，2小时，pH6.0。
M室温(25℃)，2小时，pH8.2。
1用常规工艺(压制→膜→加热→膜→阳离子交换剂-疏水色谱法-阴离子交换剂处理)。接着用螯合树脂处理提纯的rHSA。
2按实施例1工艺，用阴离子交换剂(DEAE)处理的rHSA。
3按实施例1工艺用螯合树脂处理的rHSA。(1)按基因操作所得的HSA在本发明中，用基因操作而得的产生HSA的宿主，只要它是按基因操作而制备成的，则不受特别限制。就是，无论是在公知文献中被报道过的，还是将来将被开发的那些宿主都可对其作适应的选择。更具体地是，可以产生HSA的，用基因操作而得的微生物(大肠杆菌、酵母、枯草杆菌(Bacillus Subtilis)等)和动物细胞作这类宿主的例子。特别优选地是使用酵母，特别是属于Saccharomyces属的(如，S.Cerevisiae)或Pichia属(如，P.pastoris)的酵母作宿主。还有，营养缺陷型的菌株和抗菌素敏感的菌株是有用的。更优选的是，采用Saccharomyces cerevisiae AH22菌株(a，his4，leu2，Can1)和Pichia pastoris GTS115菌株(his4)。
制备产生HSA的宿主，通过培养产生rHSA并从培养过的肉汤中分离和回收rHSA均按已知方法进行，此法可作稍许修改。比如，制备产生HSA的宿主可用这样的工艺完成，其中使用天然HSA基因(JP-A-58-56684，相应于EP-A-73646，JP-A-58-90515，相应于EP-A-79739及JP-A-58-150517，相应于EP-A-91527)；一种其中采用修饰人血清清蛋白基因的工艺(JP-A-62-29985和JP-A-1-98486，相应于EP-A-206733)；一种其中采用合成信号顺序的工艺(JP-A-1-240191，相应于EP-A-329127)，一种其中采用血清清蛋白信号顺序的工艺(JP-A-2-167095，相应于EP-A-319641)；一种其中将重组件质粒引入染色体的工艺(JP-A-3-72889，相应于EP-A-399455)；一种其中宿主被融合的工艺(JP-A-3-53877，相应于EP-A-409156)；一种其中在含甲醇的培养基中产生突变的工艺；一种其中采用突变AOX2启动子的工艺(EP-A-506040)，一种其中HSA在B.Subtilis中表达的工艺(JP-A-62-215393，相应于EP-A-229712)；一种其中HSA在酵母中表达的工艺(JP-A-60-41487，相应于EP-A-123544，JP-A-63-39576，相应于EP-A-248657，及JP-A-63-74493，相应于EP-A-251744)及一种其中HSA在Pichia中93，相应于2-104290，相应于EP-A-344459)。
在这些方法中，其中在含甲醇的培养基诱发突变的方法以下列方式进行。适宜的宿主转化体，优选是一种Pichia酵母，例证是菌株GTS115(NRRL保存号No.Y-15851)是以此常用方式通过引入质粒而得到的，该质粒含一种通过它将HSA在AOX1启动子的控制下表达到该宿主的AOX1基因区中的转录单位(参见JP-A-2-104290)。这种转化体在含甲醇的培养基中几乎不生长。因此，将此转化体在含甲醇的培养基中培养以产生突变体，而且与能在此培养基中生长的菌株分离。在此培养基中的甲醇浓度范围比如可以是0.0001-5％。该培养基既可以是合成的，又可以是天然的。此培养可在，比如，15-40℃的温度下进行约1-1000小时。
产生HSA宿主的培养可用上述专利中的每一种方法完成，可用这样的一种方法完成其中产生者细胞和产物是通过分批供料培养(一种半批培养)以高浓度获得的，该法是以适当小量通过逐渐供应高浓度葡萄糖，甲醇等溶液进行，以避免高浓度基质对生产者细胞的抑制(JP-A-3-83595)；或用这样一种方法完成其中HSA的产率是通过往该培养基中添加脂肪酸而改善的(JP-A-4-293495相应于EP-A-504823和美国专利5,334,512)。
通常在用具有10-26个碳原子的脂肪酸或其盐补充的工艺中采用的培养基可被用作培养转化宿主的培养基，而该转化体的培养可在已知的条件下进行。该培养基可以是合成的或是天然的。但最好是液态的培养基。比如，适宜的合成培养基可由碳源，如各种糖类；氮源，如尿素、铵盐、硝酸盐；痕量营养素，如各种维生素、核苷酸；及无机盐，如Mg、Ca、Fe、Na、K、Mn、Co和Cu的盐构成。这培养基的说明性的例子是YNB液体培养基，它由0.7％的YeastNitrogen Base(Difco)和2％的葡萄糖组成。有用的天然培养基的说明性的例子是YPD液体培养基，它由1％的Yeast Extract(Difco)，2％的Bacto Peptone(Difco)和2％的葡萄糖组成。该培养基的pH值可以是中性的、弱碱性和或弱酸性的。在甲基营养宿主的情况下，该培养基可用约0.01-5％量的甲醇进一步补充。
培养温度的范围最好是15-43℃(对酵母是20-30℃，对杆菌是20-37℃)。培养周期的范围是1-1000小时，较好是20-360小时，用静态的或振动培养、或在搅动和充气条件下的分批、半分批或连续培养。在分批培养之前，借助静态或振动培养或分批的、半分批的或在搅动和充气条件下的连续培养制备种子培养物是期望的。种子培养可使用上述的YNB液态培养基或YPD液态培养基进行，最好是在30℃(对酵母)或37℃(对杆菌)进行10-100小时。(2)提纯rHSA(i)加热处理按本发明的提纯rHSA的工艺，在上述培养步骤中，所获得的产生HSA的宿主培养基可被直接加热处理，同时包含该宿主细胞而不进行任何分离步骤，如离心分离或超滤性膜处理。这就是说，在本发明的提纯工艺中第一步进行加热处理。
通常以50-100℃，1分钟至10小时，较好是60-80℃，20分钟至3小时，更好是68℃，30小时进行加热。最好是在有稳定剂存在时进行这种处理。稳定剂的例子包括乙酰色氨酸、具有6-18个碳原子的有机羧酸及其盐。这些稳定剂可一起使用。加入乙酰色氨酸使最终浓度达到，如约1-100mM的量。具有6-18个碳原子的有机羧酸的例子包括己酸、辛酸、癸酸、月桂酸、棕榈酸和油酸。最好用10mM的辛酸。其盐的例子包括碱金属盐(钠盐、钾盐等)及碱土金属盐(钙盐等)。加入这些具有6-18个碳原子的有机羧酸或其盐的量可以为，比如约1-100mM。
为抑制加热引起的显色，有效的是加入约1-100mM，更好是530mM的硫醇化合物(如，巯基乙醇、半胱氨酸、被还原的谷胱甘肽等)，而且，最好是在加热步骤中进一步加入10-1000mM的氨基胍(JP-A-3-103188)。
按常规方法，加热无论是经离心分离或过滤宿主培养基所得的上清液(滤液)或细胞。这是因为，怕当直接加热含细胞培养基时，杂质、脂类、核酸、蛋白酶等渗入会对目标物的提纯产生不希望的影响。因此，还不知道直接加热含细胞的培养基对目标物的提纯是否有效。
然而，根据本发明已揭示，当直接加热含rHSA和宿主细胞的培养基时，无论是rHSA的结构功能，还是其产率均未恶化，但含在培养基中的充满活力的蛋白酶却被有效地失活。这样，使蛋白酶失活的方法可简化。此外，以基因操作而获得的HSA可用下文将述及的工艺有效地提纯。(ii)稀释加热的溶液及调整其性能然后将于上述(i)中所得的加热的溶液与悬浮在流化床中的吸附剂颗粒一起处理。在这一处理之前，最好稀释加热的溶液，以便使之与导电率为0.1-50ms，较好是0.5-35ms，更好是5-15ms的气氛中的吸附剂颗粒接触。如在下文试验例3中所述，与该吸附剂颗粒结合的rHSA的量随加热的溶液稀释度提高及加热的颗粒与吸附剂接触气氛的导电率下降而增加，而且当导电率为8-12ms左右时该量达到最大值。用作稀释剂的溶剂无特别限制，只要该加热的溶液中的rHSA的结构功能不因此而恶化即可。在考虑吸附条件的同时可对其作适当选择。该稀释剂的例子是浓度为50mM或更低的乙酸盐缓冲液或蒸馏水。从方便的观点看，用蒸馏水较好。
接着，将此溶液的pH值调到酸性的水平，这适于被吸附剂颗粒吸收。通常将它调到pH3-5，较好是pH4-4.8，更好是约pH4.5。虽然任何酸性溶液都可用来调整pH值而无限制，但用乙酸为好。(iii)吸附剂颗粒处理在稀释和调整pH值之后，将所得到的加热的溶液与吸附剂颗粒接触。
吸附剂颗粒的例子包括具有阳离子交换基团的载体(如阳离子吸附剂)、如磺基基团类或羧基基因类的吸附剂颗粒。磺基基团类吸附颗粒的例子有磺基-琼脂糖(Streamline SP、S-Sepharos，二者均由Pharmacia制造)、磺基-纤维素(S-Cellulofine，chisso Corporation制造)，磺丙基-琼脂糖(SP-Sepharose，Pharmacia制造)、SP-Cellthru-Big Beads(Sterogene制造)、磺丙基-葡聚糖(SP-Saphadex，Pharmacia制造)、及磺丙基-聚乙烯(SP-Toyopearl，Tosoh Corporation制造)。羧基基团类吸附剂颗粒的例子有羧甲基-琼脂糖(CM-Cellthru-Big Beads，Sterogene制造)、羧甲基-葡聚糖(CM-Sephadex，Pharmacia制造)、及羧甲基纤维素(CM-Cellulofine，Chisso Corporation制造)。最好采用磺基基团类的强阳离子吸附剂颗粒的，特别优选Streamline SP(Pharmacia制造)。
该吸附剂颗粒尺寸范围通常是，比如30-1100μm，以100-300μm为佳。
接触可在pH值约为3-5，较好是4-4.8，更好是约4.5，盐浓度约0.01-0.2M，更好是约0.05-0.1M的条件下进行。
最好是预先使吸附剂颗粒在上述的接触条件下平衡。更具体地是，最好用50mM的含50mM氯化钠的乙酸盐缓冲液(pH4.5)使该吸附剂颗剂平衡。
通常使该吸附剂颗粒平衡，而试样则被注入含此吸附剂颗粒的流化床、与该吸附剂颗粒接触，然后按下列步骤从流化床洗脱。
就是，首先将上述的吸附剂颗粒填入合适的柱中，并使其下沉。然后将平衡缓冲液从该柱的底部入口朝上送入，借此使该吸附剂颗粒悬浮。在此步骤中，向上流动的缓冲液的流速对因重力作用而产生的吸附剂颗粒的沉降起着平衡的作用，该吸附剂颗粒以平衡的状态均匀的悬浮着(即所谓的流化床)。含细胞的，已按上述(i)加热和(ii)稀释步骤处理过的粗培养基从该柱的底部入口供入其中已形成上述流化床的柱中。然后目标rHSA与吸附剂颗粒结合，而细的颗粒及源于该宿主细胞或培养基的杂质就这样在流化床中的吸附颗粒中间穿过，从而从柱的顶部排出。还有，与吸附剂颗粒松散结合的杂质用连续和向上供入的洗涤缓冲液洗去。最好是按扩张床吸附技术[Journal of Chromatography，597(1992)，129-145]完成这些步骤。
平衡缓冲液作为洗涤缓冲液使用。
通过倒换流向和从柱的顶部入口向下供入洗脱缓冲液而回收rHSA。可在pH值范围约8-10，较好约8.5-9.5，而更好约9，盐浓度范围约0.2-0.5M，较好约0.3-0.4M的条件下进行rHSA的洗脱。缓冲液的具体例子是含0.3M氯化钠的0.1M的磷酸盐缓冲液(pH9)。
包括使吸附剂颗粒平衡，将试样注入含吸附剂颗粒的流化床，与吸附剂颗粒接触，从流化床洗脱等的上述工序可通过采用装有Streamline柱(吸附剂Streamline SP，Pharmacia制造)的Streamline系统(Pharmacia制造)以高重现性方便而有效地进行。
这样可得到高纯度的rHSA。通过上述吸附剂颗粒处理所得的rHSA的纯度几乎可与按含多个步骤的常规方法所得的rHSA纯度相比，所述的步骤包括压制→超滤性膜处理→加热→超滤性膜处理→阳离子交换剂处理。此外，rHSA可以稳态(即不被降解)高产率获得，这归因于用吸附剂颗粒处理之前先加热培养基。因此，本发明使将上述的提纯rHSA的常规工艺的步骤数目从5个减到2个成为可能因而大大地缩短了提纯周期。本发明还使从培养基中提纯rHSA的产率的提高成为可能，此产率可与常规方法相比。
通过这些处理而得到的rHSA可用常规提纯工艺进一步提纯。此处使用的提纯工艺的例子包括通常使用的工艺，如疏水色谱法、超滤性膜处理、阴离子交换剂处理、螯合树脂处理及硼酸/硼酸盐处理。无论是这些处理中的一种，或是它们的组合均可采用。为获得改善质量的提纯rHSA产物，最好是按如下顺序进行，疏水色谱法、超滤性膜处理、阴离子交换剂处理、超滤性膜处理、螯合树脂处理、碱酸/硼酸盐处理及超滤性膜处理。
在上述提纯之前，最好在溶液与吸附剂颗粒接触后，在有还原剂存在时再次加热洗脱的吸附部分。如下文试验例6中所示，这种加热处理对降低rHSA的显色特性的程度是十分有效的，但rHSA的产率不受影响，从而可与省掉加热处理的情况相比。就是，这种加热处理使通过后续的提纯步骤大大地消除显色物成为可能。
加热温度一般为50-100℃，约60-80℃较好，而更好是60℃。加热时间一般为10分钟至10小时，约30分钟至5小时较好，而更好是1小时。
本文所用的还原剂无特别限制，只要它有还原效果即可。它的例子包括具有SH基团的低分子量化合物(如，半胱氨酸、半胱胺、胱胺、甲硫氨酸、谷胱甘肽等)、亚硫酸盐、焦亚硫酸盐、亚磷焦亚硫酸盐及抗坏血酸。最好使用半胱氨酸。关于加入量，比如，半胱氨酸可以使最终浓度为约1-100mM的量加入，而亚硫酸盐则可以最终浓度为约0.001-10％的量加入。
最好是有稳定剂存在时进行此处理。稳定剂的例子包括乙酰色氨酸和具有6-18个碳原子的有机羧酸或其盐。这些稳定剂可一起使用。乙酰色氨酸比如可使该溶液的最终浓度为约1-100mM的量加入。具有6-18个碳原子的有机羧酸的例子包括己酸、辛酸、癸酸、月桂酸、棕榈酸和油酸。用10mM的辛酸为好。其盐的例子包括碱金属盐(如钠盐、钾盐等)及碱土金属盐(如钙盐等)。这些具有6-18个碳原子的有机羧酸或其盐可以，比如1-100mM的量加入。通过进一步加入10-1000mM的氨基胍，可消除因加热而引起的显色(JP-A-3-103188)。(a)疏水色谱法可以常规方式进行疏水色谱法。用于疏水色谱法的载体的例子包括具有载带4-18个碳原子的烷基(丁基、辛基、十八烷基等)或苯基的不溶解载体。最好采用具有苯基的载体，如苯基纤维素(Phenyl-Cellulofine，Chisso Corporation制造)。在此步骤中，可将rHSA回收入未吸附的部分。接触可在，比如，pH为约6-8，较好为约6.5-7、盐浓度为约0.01-0.5M，较好为约0.05-0.2M的条件下进行。(b)阴离子交换剂处理也可以常规的方式进行阴离子交换剂处理。任何阴离子交换剂都可使用，只要它是一种具有阴离子交换基团的不溶载体即可。这种阴离子交换基团的例子包括二乙氨乙基(DEAE)基团和季氨乙基(QAE)基团。最好是用具有DEAE基团的阴离子交换剂，如DEAE-琼脂糖(DEAE-Sepharose，Pharmacia制造)、DEAE-葡聚糖(DEAE-Sephedex，Pharmacia制造)和DEAE-聚乙烯基(DEAE-Toyopearl，Tosoh Corporation制造)。在此步骤中，rHSA被回收到未吸附部分中。接触可在，比如，pH约6-8，较好是约6.5-7，盐浓度为约0.01-0.1M的条件下进行。
通过此阴离子交换剂处理可消除显色物及痕量杂质。(c)超滤性膜处理。
在完成疏水色谱分离和/或阴离子交换剂处理之后，如此回收的含rHSA部分最好经超滤性膜处理。可通过此超滤性膜处理消除热原。在此超滤膜处理中，最好是使用分子量界限为100-300K的超滤性膜。作为其具体的例子，可引证Pellicom过滤片膜100K(Millipore制造)。(d)螯合树脂处理螯合树脂处理对消除通过基因操作而得的为HSA特征的显色物尤为有效。按上述的提纯工艺，这种处理最好在疏水色谱分离-超滤性膜处理-阴离子交换剂处理-超滤性膜处理之后进行。通过使具有特定配位体的螯合树脂与rHSA接触来完成这一处理，然后在通过的馏分中得到rHSA。该螯合树脂载体部分是一种具有疏水性的为佳。其例子包括一种苯乙烯/二乙烯基苯共聚物和一种丙烯酸/异丁烯酸共聚物。另一方面，该螯合树脂的配位体部分的例子包括在分子中有多个亚氨基基团、氨基基团、亚乙基氨基基团的多羟基化合物基团，如N-甲基葡糖胺、多胺基团(包括聚亚烷基多胺，如聚乙烯多胺)和硫脲基团。方便的是采用市售的那些具有苯乙烯/二乙烯基苯共聚物载体的螯合树脂，如DI-AION CRB02(配位体N-甲基葡糖胺基团，Mitsu bishi Kasei Corporation制造)、LEWATIT TP214(配位体NHCSNH2、Bayer制造)及AmberliteCG4000。
适于螯合树脂处理的条件如下pH酸性或中性或碱性(pH3-9，最好是pH4-7)。
时期1小时或更长，最好是6小时或更长。
离子强度50mmho或更低，以1-10mmho为佳。
混合比每250mg HSA 0.1-100g，较好1-10g(湿基准)树脂。(e)硼酸/硼酸盐处理通过用硼酸或硼酸盐(本文指的是硼酸/硼酸盐)进一步处理通过上述处理而得到的含rHSA溶液则可消除具有抗原性，源于宿主的杂质及可用苯酚-硫酸法检测的非抗原性游离杂质。
本文可用的硼酸的例子包括原硼酸、偏硼酸和四硼酸。硼酸盐的例子包括碱金属盐(如钠盐、钾盐等)及碱土金属盐(如钙盐等)。最好用四硼酸钙。硼酸或硼酸盐可以使最终浓度为0.01-1M，较好是约0.05-0.2M的量添加。这种处理，比如，在pH约8-11，较好是约pH9-10、经约1-100小时，较好是约5-50小时的条件下进行。在此步骤中，这种含rHSA的低导电率的溶液是格外希望的。比如，该含rHSA的溶液的导电率是1ms或更低。还有，这种具有高rHSA浓度的含rHSA溶液也是格外希望的。比如，此rHSA的浓度为5％或更高，较好是约15-25％。
完成上述硼酸/硼酸盐处理后，用常规方法，如离心分离或超滤从上清液中回收rHSA。(3)源于基因操作的高度提纯的HSA的性能这样获得的高度提纯的rHSA是一种均一的物质，其分子量约为67000而等电点为4.9。它单独地由单体构成，基本上无二聚物，多聚物或分解产物(分子量约43000)。它基本上还没有源于产生者宿主的任何抗原性杂质或多糖。当配成250mg/ml的rHSA溶液(25％的溶液)时，它具有低于0.015，较好是0.013或更低，更好是约0.01-0.015的A350/A280之比。可通过采用各种已知提纯技术的适当组合(上述技术(a)-(e)等)而得到显色度如此降低(即低的A350/A280比值)的rHSA。
本发明首次使提供这样一种重组体HSA(或含其的组合物)成为可能当配成25％的rHSA溶液时显示出低于0.015的A350/A280之比。(4)配制用已知的方法(超滤性膜处理、加稳定剂、防腐过滤、吸管吸取、冷冻干燥等)可将按本发明方法而得的rHSA配制成各种制品。这样获得的rHSA制品可作为血清清蛋白制品，以与源于质粒的常规HSA情况采用的同样剂量和方式用于临床。它们还被作为药剂的稳定剂、填充剂或载体使用。
本文所用的术语＂含rHSA的组合物＂指的是这样一种材料它以高浓度，但低于100％含有本发明的高纯度rHSA并含痕量的其它组分。
为进一步详述本发明，但又不作任何限制，则提出以下实施例。实施例1(1)培养基的加热处理按EP-A-655503中所述的方法获得并培育产生HSA的酵母picnia pastoris。
将放2.8升这样获得的含细胞的培养基以30分钟加热到68℃。此加热处理在有10mM辛酸钠存在时进行。该培养基的pH值为6。接着，将此加过热的溶液快冷到约15℃，然后用蒸馏水稀释约1倍(总体积5.5升)。然后用乙酸溶液将其pH值调到4.5。(2)吸附剂颗粒处理(Streamline SP处理)向Streamline SP柱(C50，5×100cm，凝胶体积300ml，Pharmacia制造，它已用50mM的含50mM氯化钠的乙酸盐缓冲液(pH4.5平衡)向上输入5.5升用上述加热处理(1)而得到的含酵母细胞的培养基(导电率＜10ms)。输入在搅动下，以100cm/时的流速进行。接着，将与用来平衡该柱相同的缓冲液(体积为该柱容量的2.5倍)向上供入该柱，借此以100cm/时的流速洗涤此柱1小时，再用300cm/时的流速洗涤30分钟。接着使流动方向反向，再将洗脱液(100mM磷酸盐缓冲液(pH9)，含300mM氯化钠、流速50cm/时)供入该柱。这样就得到了含rHSA的馏分。
这样洗脱的含rHSA馏份通过测量280nm的吸光度而被检测。(3)加热处理将这样得到的，含rHSA的馏分在10mM半胱氨酸，5mM辛酸钠和100mM氨基胍氢氯化物(pH7.5)存在下在60℃加热1小时。(4)疏水色谱法将上述(3)中加过热的rHSA溶液倒入装有Phenyl-Cellulofine的柱中(5×25cm，凝胶体积500ml，Chisso Corporation制造)，该柱用50mM磷酸盐缓冲液(pH6.8)(含0.15M的氯化钠)平衡。在这些条件下，rHSA未被此Phenyl-Cellulofine柱吸收，但是通过它。用分子量截止为30000的超滤性膜(Millipone制造)将通过此柱的含rHSA溶液浓缩至约0.2升的体积，并用50mM的磷酸缓冲液(pH6.8)替换该含rHSA的溶液。(5)阴离子交换剂处理完成疏水色谱分离后，将已浓缩的含rHSA的溶液及替换的缓冲液注入装有DEAE-Sepharose FF的，并用50mM磷酸盐溶液(pH6.8)平衡的柱(5×25cm，凝胶体积500ml，Pharmacia制造)中。在这些条件下，rHSA未被DEAE-Sepharose柱吸收，但是通过它。用分子量截止为30000的超滤性膜(Millipore制造)将通过该柱的rHSA浓缩至体积为0.2升，再用蒸馏水替换此含rHSA溶液。(6)螯合树脂处理向0.2升提纯的浓度约为7％的rHSA中加入乙酸以将pH值调到4.5。然后将其注入装有DIAION CRBO2的，用50mM乙酸钠缓冲液(pH4.5)平衡的柱(5×2.5cm，凝胶体积500ml，MitsubishiKaseiCorporation制造)中，然后循环一夜。在这些条件下，rHSA未被凝胶吸收，但是通过该柱。
(7)硼酸/硼酸盐处理将rHSA浓度调到2.5％，同时将该溶液的导电率调到1ms或更低。向其中加入四硼酸钠，以使最终浓度为100mM。接着，往其中加入氯化钙，以使最终浓度为100mM，而同时将pH值保持在9.5。使之静置约10小时后，去除因此而形成的沉淀，回收上清液，再将之浓缩和脱盐。然后用分子量截止为30000的超滤性膜(millipore制造)将其浓缩，然后再经缓冲液替换。若需要，通过用0.22μm滤器(Millipore制造)过滤消毒后添加稳定剂(辛酸钠和乙酰色氨酸)。可将所得的rHSA溶液用于注射。试验例1加热处理对rHSA培养基的稳定效果含在rHSA培养基中的有效的蛋白酶使rHSA降解是公知的。如表1所示，在pH4的酸性条件下rHSA的降解进行得极快。
表 1rHSA培养基的pH稳定性试样 贮存条件贮存pH值 HSA浓度 产率(mg/ml) (％)培养基(含 15℃，15小时对照 7.6100.0酵母细胞) (静止) 6.07.7100.94.57.294.04.03.039.9rHSA被约pH4.5的Streamline SP吸收。因此检测约pH4.5的rHSA稳定性，并且将加热的溶液的pH值调至4.5并使之在室温下静置一夜后通过测定rHSA的稳定性来检测使蛋白酶失活有效的，作为在静态下保持rHSA的预处理的加热条件。图1示出了结果。在此加热阶段，往每份试样中加辛酸钠，以使最终浓度为10mM。所用的加热条件如下
A对照物B68℃，30分钟，pH6.0。
C68℃，30分钟，pH6.8。
D68℃，30分钟，pH7.5。
E68℃，30分钟，pH8.2。
F60℃，2小时，pH6.0。
G60℃，2小时，pH6.8。
H60℃，2小时，pH7.5。
I60℃，2小时，pH8.2。
J60℃，2小时，pH6.8，10mM胱氨酸。
K60℃，2小时，pH7.5，10mM胱氨酸。
L室温(25℃)，2小时，pH6.0。
M室温(25℃)，2小时，pH8.2。
结果表明，30分钟加热至68℃比2小时加热至60℃更有效。调整pH值，在pH6左右得到最为期望的结果，这是被加热的培养基的起始pH值。试验例2rHSA培养基的pH值和与吸附剂结合能力之间的关系用乙酸将该培养基(rHSA55.6mg)的pH值调到不同水平(pH4.5-4.9)，接着再加入1ml用50mM乙酸盐缓冲液平衡的Stream-Line SP凝胶。在室温混合和搅拌1小时后，再用每种平衡缓冲液洗涤，测定留在未吸附馏份中的rHSA的量(％)。结果发现与吸附剂结合的rHSA的量随pH值的下降而增加，并于pH4.5左右达到最大值(表2)。
表 2rHSA培养基的pH值和与凝胶的结合能力试样 未吸附的馏份 未吸附的馏份(吸附状态)中的rHSA(mg) 中的rHSA(％)原料 55.6 100.0未加凝胶pH 4.551.0 91.7加1ml凝胶pH 4.55.1 9.2pH 4.67.6 13.7pH 4.714.9 26.8pH 4.833.1 59.5pH 4.949.4 88.8试验例3加热的溶液与吸附剂颗粒接触的气氛的导电性和rHSA与吸附剂颗粒结合能力之间的关系加热后，该培养基[导电率约20ms(于25℃)，rHSA47.1mg]用蒸馏水稀释得到各种稀释度，并用乙酸将每份稀释液的pH值调到4.5，接着加入1ml用含50mM氯化钠的50mM的乙酸盐缓冲液(pH4.5)平衡的Streamline SP凝胶。在室温下混合1小时，再用平衡缓冲液洗涤后，用含0.3M氯化钠的0.1M磷酸盐缓冲液(pH9)洗脱。结果发现，与吸附剂颗粒结合的rHSA的量随稀释度的增加和该溶液的导电率的下降而增加，并且在气氛(在凝胶混合物中)导电率(该加热的溶液与吸附剂颗粒相接触的导电率)为约8-12ms时达到最大程度(图2)。试验例4Streamline SP洗脱液的稳定性用蒸馏水将培养基稀释一倍，再用乙酸将pH值调到4.5。然后将定量的，用含50mM的氯化钠的50mM乙酸盐缓冲液(pH4.5)平衡的Streamline SP凝胶加入，并于室温搅拌混合物1小时。接着用平衡缓冲液洗涤凝胶。并用含0.3mM的氯化钠的0.1M磷酸盐缓冲液(pH9)将rHSA洗脱。然后测馏份(pH8)中的rHSA的稳定性。结果表明，三天后在事先加热(68℃，30分钟)的培养基中的rHSA来显出变化，而由于降解，源于未处理的培养基中的rHSA则降低到约50％(表3)。
表 3Streamline SP洗脱液的稳定性(室温，3天，pH8)试样 贮存前的rHSA 贮存后的rHSA 残留率(mg/ml) (mg/ml)(％)未加热rHSA培养基的洗脱液 4.39 2.44 55.7加热的rHSA培养基(60℃，2小时) 4.55 4.45 97.6的洗脱液加热的rHSA培养基(68℃，30分钟) 4.52 4.67 103.4的洗脱液试验例5比较(加热→吸附剂颗粒)处理和(未加热→吸附剂颗粒)处理之间的rHSA产率和显色程度基于试验例1-4的结果，确立了加热→吸附剂颗粒处理工艺的最优流程(图3)。
按图3的流程，试验用Streamline SP柱(5×100cm，凝胶体积300ml)从含酵母细胞的培养基(2.8升)提纯rHSA。另一方面，将含酵母细胞的培养基(2.7升)用没有初始加热的吸附剂颗粒处理，以提纯rHSA。
结果，通过(未加热→吸附剂颗粒)处理达到的总产率为50％，而通过本发明的(加热→吸附剂颗粒)处理达到一个较高的总产率(约85％)。还有，按(未加热→吸附剂颗粒)处理而得的rHSA显示出按A350/A280的显色程度为0.048，而按本发明(加热→吸附剂颗粒)处理所得的rHSA显示出较低的显色程度(0.0345)(表4)。图4示出了按(加热→吸附剂颗粒)处理的Streamline洗脱液的凝胶过滤HPLC曲线图和按(未加热→吸附剂颗粒)处理的Streamline SP洗脱液的凝胶过滤HPLC曲线图之间的比较。后者显示出rHSA的严重的分解和降解。
表 4用Streamline SP柱提纯rHSA体积rHSA产率 显色程度试样 (升) (g)(％) (A350/A280)加热的试样培养基2.8 19.3100 0.0475加热(68℃，30分) 5.5 17.590.50.0291柱通过液 10.51.3 6.6 -柱洗脱液 1.2 16.585.40.0345未加热的试样培养基2.7 11.9100 0.0482加于柱中的溶液(稀释，pH调整) 5.3 10.084.20.0366柱通过液 10.51.0 8.8 -柱洗脱液 1.2 5.9 50.00.0480试验例6随半胱氨酸一同加热对rHSA显色程度的影响将被用作起始原料的，上述表4的(加热→吸附剂颗粒)处理中的Streamline SP柱的rHSA洗脱液经受实施例1(4)和(5)中所述的疏水色谱法和阴离子交换剂处理，然后评价显色程度(A350/A280)。在此评价中，采用了两种Streamline SP洗脱液试样，即一种由在半胱氨酸存在下(最终浓度10mM)加热得到的试样，而另一是在半胱氨酸存在下，但未加热得到的试样。结果，无论是否有半胱氨酸存在，这两种试样的rHSA产率几乎相同。然而关于显色程度，在阴离子交换剂处理后(表5)，在有半胱氨酸存在下加热的试样显示为0.0128，这大大低于未加热试样的0.0184。
表 5Streamline步骤后提纯rHSA试 样 显色程度(A350/A280)Streamline洗脱液 0.0311与半胱氨酸一同加热 0.0212苯基处理 0.0197超滤(UF30K-R)0.0205DEAE处理 0.0128Streamline洗脱液 0.0311苯基处理 0.0270超滤(UF30K-R)0.0275DEAE处理 0.0184试验例7通过引入Streamline SP处理降低显色程度(A350/A280)
图5示出了按常规工艺中每个步骤的rHSA和按本发明工艺的rHSA之间的显色程度(A350/A280)改变的比较，本发明的工艺包括Streamline SP步骤直到阴离子交换剂步骤。在使用StreamlineSP处理和此后在半胱氨酸存在下立即进行加热的本发明工艺中，与常规工艺大的区别在疏水色谱步骤可看到。在完成阴离子交换剂处理后，看到了极低的显色程度(0.0128)。图6示出了如表5所示的按常规工艺的螯合树脂处理后所得试样(曲线1)和如实施例1所述的在本发明的提纯工艺中的阴离子交换剂处理和螯合树脂处理之后所得试样(曲线2和3)之间的吸收谱的对比。结果，与如表5所示的按常规方法在螯合树脂处理后所得的试样相比，按本发明方法在阴离子交换剂处理后提纯的rHSA的吸收谱已在整个可视区域(350-700nm)显示出令人瞩目的低的图形。在按本发明方法用螯合树脂处理后，这区别变得更为明显。试验例8用凝胶过滤HPLC的本发明方法得到的rHSA分析图7示出了凝胶过滤高性能液体色谱法(GPC-HPLC)分析rHSA试样的结果，该试样是在实施例1中所述的本发明规定各步骤(rHSA培养基、Streamline SP洗脱、Streamline SP未吸附馏份、DEAE后处理馏份)后而得的。结果，变得清楚的是，含在该培养基中的除rHSA外的高分子量物质和低分子量物质大部分与酵母细胞一起被高效地洗掉进入Streamline SP未吸附馏份，而清蛋白被专门地回收于该洗脱液中。用此馏份作原料并进一步用阴离子交换剂(DEAE)处理而制得的试样的HPLC图形显示出一个单独的清蛋白(HSA单体)的尖锐的峰。这样，其纯度比得上，甚至超过由常规提纯工艺的DEAE步骤所得试样的纯度。
基于这些试验例，算出由常规提纯工艺的DEAE步骤所得的rHSA产率和由包括吸附剂颗粒(Streamline SP)处理步骤的工艺的DEAE浓缩步骤得到的rHSA产率并将其彼此相比。按照包括吸附剂颗粒(Streamline SP)处理的工艺，步骤数目从常规工艺的5个(即压制→膜→加热→膜→阳离子交换剂处理)减少到2个。因此处理时间大大缩短而产率提高30％。试验例9源于宿主的杂质的分析按与本发明实施例1中所述工艺的同样方式提纯不产生清蛋白的酵母培养基。然后用其对兔作免疫接种。通过采用这样获得的抗血清，对提纯的清蛋白溶液中的源于酵母的杂质进行检测试验。为此改用酶免疫测定(EIA)。该试样的清蛋白浓度被调到250mg/ml。
结果，从在硼酸/硼酸盐处理后所得的提纯清蛋白中，以0.1mg/ml的检测极限，未检到源于酵母的抗原性杂质。试验例10按实施例1工艺提纯的本发明rHSA的性质(1)分子量用上述的HPLC凝胶过滤法测分子量。按本发明方法提纯的rHSA的分子量约为67000，这几乎与源于质粒的HSA的分子量相同。(2)等电点按Allen等人的方法(J.Chromatog.，146，1(1978))使用聚酰胺凝胶测定等电点。按本发明方法提纯的rHSA的等电点约为4.9，即，几乎与源于质粒的HSA的等电点相同。(3)显色程度通过采用提纯的rHSA溶液(清蛋白浓度250mg/ml)，测量此溶液在280和350nm的吸光度，及计算A350/A280之比确定显色程度。按本发明方法提纯的rHSA显示了极低的约0.012的显色程度(A350/A280)。实施例2(1)培养基的加热处理将约1000升的，包含由EP-A-6555503中所述方法，以与实施例1相同的方式而得的细胞的培养基30分钟加热到68℃。该加热处理是在10mM的辛酸钠存在下进行的。该培养基的pH值为6。接着，所此加热的溶液冷至25℃，再用蒸馏水稀释约一倍(总体积约2000升)。在稀释前以该培养基体积的约1.1％(v/v)的量的乙酸溶液(99.7％)将其pH值调到4.5。(2)吸附剂颗粒处理(Streamline SP处理)向用含50mM的氯化钠的50mM乙酸盐缓冲液(pH4.5)平衡的Streamline SP柱(C1000，100×110cm柱凝胶体积150升，Parmacia制造)向上输入按上述加热处理(1)所得的2000升含酵母细胞的培养基。此输入在搅动下以100-250cm/时的流速进行，直到往该柱中加入此培养基完成为止，以免细胞沉淀。接着，将同样的缓冲液(体积为该柱容量的5倍)作为用于平衡该柱的缓冲液向上供入该柱，借此以100-500cm/时的流速洗涤此柱。接着，反转流向，将洗脱液(含300mM氯化钠的磷酸盐缓冲液(pH9)、流速50-100cm/时)供入该柱。这样就获得含rHSA的馏份。
通过测量在280nm的吸光度测定这样洗脱的含rHSA的馏份。(3)加热处理将这样得到的含rHSA的馏份，在10mM半胱氨酸、10mM的辛酸钠、每摩尔rHSA 4摩尔的量的油酸钠，以及100mM氨基胍氢氯酸盐(pH7.5)存在下，于60℃，加热1小时，以降低rHSA的显色程度并促进二聚物向单体的转化。
表6示出了用1吨培养基的依次4次试验的结果。68℃，30分钟加热处理和有半胱氨酸的加热处理后的平均产率分别为98.6％和88.4％。四次试验总产率的好的结果为87.1％，这与实施例1的结果极为一致，在实施例1中用的是实验规模的柱(C50)。因此，证明了本发明方法有大范围的重现性。
表 6批号步骤体积rHSA产率 显色程度No. (升)(g) (％) (A350/A280)1培养基 922 5868100.0 0.0596加热(68℃，30分) 1900539992.0 0.0379柱通过液 6000- - -柱洗脱液 200 - - -有半胱氨酸加热 62 484082.5 0.02682培养基 943 6246100.0 0.0547加热(68℃，30分) 19606351101.7 0.0375柱通过液 6400- - -柱洗脱液 300 - - -有半胱氨酸加热 61 567490.9 0.02483培养基 937 6200100.0 0.0539加热(68℃，30分) 18776261101.1 0.0307柱通过液 5777462 7.4-柱洗脱液 200 - - -有半胱氨酸加热 111 559490.2 0.02274培养基 916 6845100.0 0.0520加热(68℃，30分) 1885681899.6 0.0556柱通过液 5885- - -柱洗脱液 300 - - -有半胱氨酸加热 111 580484.8 0.0235参考例1鉴定rHSA(评估产率)在上述试验例1-8和10中，通过使含rHSA的溶液经凝胶过滤HPLC从数量上对其作了评估(包括产率)。详细的洗脱条件如下。
将含rHSA的溶液倒入用含0.1％的NaN3和0.3％的NaCl的50mM磷酸钠缓冲液(pH6.5)平衡的TSK-GeL G3000 SWxL柱(0.78×30cm，Tosoh Corporation制造)。然后用此平衡缓冲液作洗脱液以1ml/分的流速将rHSA洗脱，然后通过测量280nm和350nm的吸光度进行鉴定。
基于发现了通过这样地直接加热含酵母的培养基可使蛋白酶简单而有效地失活，从而完成了本发明。因此，本发明提供了一种通过加热其中保留酵母细胞的培养基，然后使此加热的培养基直接与悬浮于流化床中的吸附剂颗粒接触，简便而有效地提纯rHSA的方法。从而，步骤数目从常规工艺的5步(包括压制→膜→加热→膜→阳离子交换剂处理)减少到加热→吸附剂颗粒处理两步。因而处理时间大为缩短，而产率提高。此外，对重组体HSA的显色特性的难题通过本发明提纯工艺可以解决，由此可有效地消除引起显色的显色物质。
进而，按照本发明，包括从培养细胞到提纯的各步骤的全部生产重组体HSA的工艺可在一封闭系统线上进行，因而带来了这样一些优点，即可使HSA的生产自动化，而符合卫生学的管理(这是在生产作为医药的rHSA时的基本要求)则可方便地进行。
因此，本发明的工艺作为提纯rHSA的工艺是高度有效的，它不仅使缩短处理时间的提高产率成为可能，而且还改进了产品的质量。
此外，本发明使提供一种不含与产生者宿主等有关的杂质并显示充分抑制对作为药物无用的显色性的rHSA成为可能。
尽管本发明详细地及通过参照其特定的实施方案而陈述的，但本领域中的普通技术人员很清楚，在其中可作各种变更和修改而不违背其精神和范围。
权利要求
1.一种含人血清清蛋白的组合物，当配制成25％的所述清蛋白溶液时，它含具有A350/A280比低于0.015的重组体人血清清蛋白。
全文摘要
本发明提供了一种通过加热含rHSA及产生rHSA的宿主细胞的培养基,将所述经加热的溶液向上供入其中悬浮着吸附剂颗粒的流化床,以使之与该吸附剂颗粒接触,而然后回收含rHSA的吸附馏分的提纯重组体人血清清蛋白(rHSA)的方法,及一种当配制成25%的所述清蛋白溶液时,含有显示出低于0.015的A350/A280之比的rHSA的组合物。
文档编号C07K14/765GK1364643SQ0112305
公开日2002年8月21日 申请日期2001年7月19日 优先权日1994年8月31日
发明者野田宗宏, 鹫见昭典, 大村孝男, 横山和正 申请人:卫福有限公司