环状单链三特异抗体的利记博彩app

专利名称：环状单链三特异抗体的利记博彩app
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本发明涉及一种基因工程环状单链三特异抗体，编码这种抗体的DNA序列，含有所述序列的表达载体和含有这种表达载体的宿主细胞。
三特异抗体的构建基于在同一个分子上引进三个不同的抗原结合部位。构建时所选用的抗体基因不同，从而产生不同的生物学功能。已报道的三特异抗体的构建主要采用化学嵌合方法，杂交瘤细胞进一步杂交或通过融合基因表达而制得；其中各抗体大都采用抗体Fab片段或在三个抗体中只有一个抗体采用单链抗体小片段(Fay TN，et al.，1988；Tutt A，et al.，1991；Jung G，et al.，1991；Schott ME，et al.，1993；French RR，1998；Somasundaram C，et al，1999；Schoonjans R，et al.，2000a；Schoonjans R，etal.，2000b；Wong WM，et al.，2000)。
本发明的环状单链三特异抗体的构建是基于在肿瘤免疫治疗中起主要作用的T细胞需要双重信号激活而设计的一种新型工程抗体。在肿瘤的免疫治疗中，以T细胞为主的细胞免疫起主要作用。T细胞的激活需要双重信号，第一信号由TCR-CD3复合体提供，与抗原特异性相关；第二信号为APC表面的多个辅助刺激分子提供的共刺激信号。CD3由5种不同的肽链构成，CD3与TCR呈非共价键结合，形成完整的TCR-CD3复合物，共同参与对抗原刺激的免疫应答。如果只有第一信号而没有共刺激信号刺激可导致T细胞的无能甚至凋亡。共刺激信号没有抗原特异性，亦不受MHC限制，但可介导细胞因子分泌，T细胞增殖及效应功能的发挥。CD28是T细胞最主要的一个共刺激信号接受体，在T细胞共刺激信号受体中如CD2，CD4，CD8等，只有CD28可以阻止诱导T细胞产生无能(Slavik et al.1999)。根据这些特点，可以利用抗CD3抗体和抗CD28抗体分别作为它们的配体而起激活T细胞的作用。随着抗体工程技术的不断发展，尤其是基因工程技术在抗体改造上的应用，使得人们可以根据需要对抗体进行改造以更利于应用。目前，已根据抗体的靶向性，构建了既针对肿瘤细胞又可以激活效应细胞的双特异抗体，双特异单链抗体等。
采用基因工程制备的抗体在肿瘤免疫治疗研究报道中，基于抗肿瘤相关抗原抗体(TAA)与抗CD3抗体或抗CD28抗体构成的双特异抗体(BsAb)或单克隆抗体(McAb)的研究报道较多。早期BsAb用于肿瘤免疫治疗的临床试验为单独连接触发分子TCR-CD3和TAA，发现效果不佳，可出现活化的T细胞克隆无能和凋亡，后来采用IL-2或丝裂原植物凝聚素(Lectin)作为共刺激因子在体外予刺激活化T细胞的方法取得一定的效果。随着双信号识别理论的确立以及CD28分子的深入研究，发现抗CD28 McAb可以同B7家族一样传递共刺激信号，协同抗CD3/TAA触发T细胞的充分活化。Demanet et al.(1996)用抗CD3/Id BsAb加抗CD28McAb对BCL1淋巴瘤的Balb/C小鼠模型多次注射，可使负荷105个细胞的淋巴瘤消退，其疗效较单独使用BsAb提高了20倍，而BsAb的用量仅为单独使用的1/10。Bohlen et al.(1997)等用抗CD3/CD19 BsAb和抗CD28 McAb介导自体T细胞治疗人类慢性B淋巴细胞白血病的SCID小鼠模型，得到较好的肿瘤抑制效果，且具有预防复发的价值。进一步的研究是将抗CD3和抗CD28 BsAb共同使用以增强肿瘤的特异性，如Renner et al.(1994)将抗CD3/CD30和抗CD28/CD30两种BsAb联合使用，治疗人何杰金氏淋巴瘤的SCID小鼠取得良好效果。Mazzoni etal.(1996)将抗CD3×抗FBP(卵巢癌TAA)和抗CD28×抗FBP两种双特异抗体同时使用，体外杀伤实验表明，双重信号能有效的激活CD8+T细胞，对带有FBP的卵巢癌细胞特异地杀伤。Manzke et al.(1999)将CD3×CD19双特异抗体和CD28双价抗体联合使用，在治疗B细胞介导的淋巴细胞癌中，比单独使用CD3×CD19双特异抗体效果明显。BsAb在实体瘤的治疗上也取得明显效果，Grosse-Hovest et al.(1999)发现抗CD3/tumorBsAb在与B16黑瘤细胞共育的肺癌细胞小鼠模型中有明显的治疗作用，抗CD28 BsAb的合用可明显地提高对肿瘤细胞的攻击率，且在静脉注射BsAb治疗过的小鼠中用肿瘤细胞再次攻击，长期存活的数量明显提高，表明BsAb可诱导小鼠产生长期的保护免疫。因此，如果将抗肿瘤相关抗原抗体，抗CD3抗体及抗CD28抗体的基因融合表达，可以在更有效激活效应细胞，提高肿瘤的治愈率的同时，大大简化生产工艺流程，提高生产效率，降低生产成本。然而，如果简单地将这三种抗体串联成线状分子，不利于在体内运输，而且不稳定。为了解决这一问题，本发明用抗体铰链区片段将这一分子环化，构建成环状单链三特异抗体。
鼠源抗体在治疗中也存在许多需要解决的问题，特别是鼠原抗体的异源性引起病人产生HAMA(human anti-mouse immunoglobulin antibodies)反应，加快了抗体的清除，封闭其治疗效果，并引起过敏反应。目前很难制备人源单克隆抗体，因此对鼠源抗体进行人源化改造，是充分发挥鼠源抗体在肿瘤治疗中应用的可选择途径。抗体人源化的分子基础是抗体具有清晰的结构与功能域。这个Y-字型的分子具有两条相同的重链和轻链，每一条链由一个可变区(variable region)和一个或多个恒定区(constant region)组成，可变区主要负责与抗原结合，恒定区主要负责结合效应分子。在每一个可变区内有三个在序列和晶体结构上都高度变化的柔性环区(loop)，它们主要负责抗原的识别，被称为互补决定区(complementarity-determining regions，CDRs)，而可变区的其余部分相对稳定，由较为刚性的β-折叠(β-sheet)组成，被称为框架区(frameworkregions，FRs)。CDRs与FRs间隔排列而形成“三明治”结构。重链和轻链及两条重链之间均以二硫键相连。抗体的这种结构相对保守，有利于应用蛋白质工程对抗体分子加以改造，以达到保持抗原结合位点特异性和有效引发效应功能的同时，最大程度地降低免疫原活性并发挥抗体的临床治疗作用。第一代人源化抗体是嵌合抗体，由鼠源抗体可变区和人源抗体的恒定区组成。有数据表明，嵌合抗体有效地提高了药物动力学系数并明显降低了免疫源性，一些嵌合抗体已成功地进入临床实验。但经反复用药仍有一半以上的病人产生了抗鼠源可变区抗体。第二代人源化抗体被称作CDR-移植抗体(CDR-grafted antibody)或改形抗体，即将鼠源CDRs移植到人源抗体框架内，这就在保留鼠源抗体的抗原结合特异性基础上，较嵌合抗体进一步人源化。实际上，同一个人源框架可植入不同的鼠源CDRs，而生成多种不同序列的改形抗体。然而，简单将鼠源CDRs移植到人源抗体的FRs中，常常导致人源化抗体的免疫学活性下降甚至消失。因此要考虑CDRs和FRs氨基酸残基之间的相互作用，对维持抗体空间结构的鼠源FRs中个别氨基酸残基必须予以保留。例如从抗人淋巴细胞表面抗原的鼠源单抗出发构建改形抗体时，仅仅将CDRs进行移植并不能得到与原抗原相结合的活性，用计算机模拟VHCDRs与FRs时发现FR1的Phe27与CDR1密切接触，而人源框架中的相应位置为Ser27。当把Ser27诱变为Phe27后，改形抗体获得了原抗原与抗体的结合活性。实际上，一些改形抗体在进行个别氨基酸残基诱变后，亲和力可以提高三倍。CAMPATH-1H是进入临床的第一个改形抗体，在治疗非何杰金(non-Hodgkin)淋巴瘤和类风湿关节炎中取得了良好效果。类似的还有HuRSV-19，D1.3VHFNS/VK。残基替换的一般策略是，选择与鼠源FRs同源性最高的人源序列作为构建改形抗体的框架，参照已知可变区的晶体结构及所属抗体家族的保守序列，在计算机的辅助下建立分子模型，进行取舍。残基替换在提高亲和力的同时，也增加了异源性，因此，在改形抗体的构建中，应权衡二者，优化组合。在环形三特异抗体的构建中，我们采用了由本实验室构建筛选的改形抗CD3的单链抗体和改形抗CD28 VH单域抗体，这为环形三特异抗体降低鼠源性及进一步临床应用奠定了基础。
在环形三特异抗体的构建中，连接不同抗体基因的域间连接肽(Interlinker)的选用十分重要，它关系到所构建的抗体是否成功。本发明中分别采用了人免疫球蛋白IgG的Fc片段，人血清白蛋白HSA的片段以及人免疫球蛋白IgG3’CL的铰链区片段；同时在各个连接肽与抗体基因片段之间加入具有柔韧性的短肽Gly4Ser，这为各抗体在空间的正确折叠提供了条件。Interlinker Fc小分子抗体在应用中的主要问题是，由于缺少Fc，不能引发效应功能。有研究表明，在人IgG四种亚类中，IgG1引发ADCC和CDC的能力最强。它通过CH2 C端的一段序列与C1q结合，引发补体的经典激活途径，其中Glu318，Lys320及Lys322在空间构象上靠近成族，位于Fc分子表面，直接与C1q结合。在对Fc引发效应功能的作用方式的研究中发现，尽管糖基化不影响抗原抗体的结合，但却对Fc引发的ADCC及CDC至关重要。IgG的糖基化位点在CH2的Asn297上。因此，本研究选择人IgG1 CH2中297-322长26aa的片段，包含糖基化位点Asn297。C1q结合位点Glu238，Lys320及Lys322，作为scBsAb载体构建中的一种interlinker，使scBsAb具有类似Fc引发CDC效应的功能。Interlinker HSA小分子抗体在应用中的另一个问题是，在血清中的半衰期短，易被清除。这些虽有利与免疫诊断和中和毒素，却不利于发挥治疗作用。HAS广泛分布于人体的各个部分，在血液中非常丰富，是最主要的血清蛋白。它主要经肝脏缓解清除，体内半衰期可长达几周。尤其重要的是它几乎没有酶学和免疫学活性，与具有生物学活性的目的蛋白偶联不会引起副作用。因此，HAS可以作为稳定的，惰性的天然载体，在体内传输治疗性分子。有研究表明，与HAS偶联的目的蛋白在动物体内的稳定性增加20-40倍，并主要经肝脏清除，降低对肾脏的毒害作用。成熟的HAS长585个氨基酸，含有17个二硫键，由三个几乎相同的结构域组成。有实验表明，结构域III可以起到整个HSA的作用。因此，本研究选取结构域III中的403-427位上的25个氨基酸残基作为构建中的interlinker。人免疫球蛋白铰链区IgG3’CL hinge人免疫球蛋白铰链区具有半胱氨酸，其天然空间结构形成时易于通过二硫键将抗体的两条重链连接到一起。人IgG3’CL铰链区具有两个二半胱氨酸共17个氨基酸。该序列的长度以及半胱氨酸的数目对构建三特异抗体较为适宜，本研究采用人IgG3’CL中的铰链区17个氨基酸残基序列，将构建的三特异抗体连接成为环形。[参考文献1.黄华梁，基因工程抗体，单克隆抗体通讯，1991，7(3)1-4；2.刘喜富，黄华梁，基因工程抗体研究进展，生物工程进展，1994，14(1)54；3.黄华梁，人源化抗体，小分子抗体与肿瘤治疗，单克隆抗体通讯，1993，9(3)19；4.Slavik，J.M.，Hutchcroft，J.E.&Bierer，B.E.(1999)CD28/CTLA-4 andCD80/CD86 families，signaling and function.Immunologic Research.19/11-24；5.Demanet C，Brissinck J，Leo O et al.Bispecific antiboddy-mediatedimmunotherapy of the BCL1 lymphomaincreasd efficacy with multipleinjections and CD28-induced costimulation.Blood 1996；874390-4398；6.Bohlen H，Manzke O，Titzer S et al.Prevention of Epstein-Barr virus-induced human B-cell lymphoma in severe combined immunodeficient micetreated with CD3×CD19 bispecific antibodies，CD28 monospecific antibodies，and autologous T cells.Cancer Res.1997；571704-1709；7.Renner C，JangW，Sahin U et al.Science 1994；264833-835；8.Mazzoni A，Mezzanzanica D，Jung G et al.CD3-CD28 costimulation as a means to avoiding T cellpreactivation in bispecific monoclonal antibody-based treatment of ovariancarcinoma.Cancer Res.1996；565443-5449；9.Manzke，O.，Berthold，F，Huebe，K.et al.(1999)CD3×Cd19 bispecific antibodies and CD28 bivalentantibodies enhance T-cell reactivity against autologous leukemic cells inpediatric B-All bone marrow.Int.J.Cancer，80715-722；10.Grosse-HovestL，Brandl M，Dohlsten M et al.Int.J.Cancer 1999；80138-144；11.Boulianne，G.L.，Hozumi，N.&Shulman，M.J.(1984)Production of functionalchimeric mouse/human antibody.Nature.312，643-646；12.Neuberger，M.S.，Williams，G.T. & Fox，R.O.(1984)Recombinant antibodies possessing noveleffector functions.Nature 312，604-608；13.Jones，P.T.，Dear，P.H.，Foote，J.et al.(1986)Replacing the complementarity-determining regions in a humanantibody with those from a mouse.Nature，321，522-525；14.Riechmann，L.，Clark，M.，Waldmann，H.et al.(1988)Reshaping human antibodies fortherapy.Nature，332，323-327；15.Fay TN，Jacobs I，Teisner B.et al.(1988)Two fetal antigens(FA-1 and FA-2)and endometrial proteins(PP12 and PP14)isolated from amniotic fluid；preliminary observations in fetal and maternaltissues.Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol，29(1)73-85；16.Tutt A，StevensonGT，Glennie MJ(1991)Trispecific F(ab′)3 derivatives that use cooperativesignaling via the TCR/CD3 complex and CD2 to activate and redirect restingcytotoxic T cells.J Immunol 147(1)60-9；17.Jung G，Freimann U，VonMarschall Z，et al.(1991)Target cell-induced T cell activation with bi-andtrispecific antibody fragments.Eur J Immunol 21(10)2431-518.FrenchRR，(1998)Production of bispecific and trispecific F(ab)2 and F(ab)3 antibodyderivatives.Methods Mol Biol，80121-134；19.Somasundaram C，Sundarapandiyan K，Keler T，et al.，(1999)Development of a trispecificantibody conjugate that directs two distinct tumor-associated antigens to CD64on myeloid effector cells.Hum Antibodies，9(1)47-54；20.Schoonjans R，Willems A，Schoonooghe S，et al.(2000a)Fab chains As an efficientheterodimerization scaffold for the production of recombinant bispecific andtrispecific antibody derivatives.J Immunol，165(12)7050-7；21.Schoonjans R，Willems A，Grooten J，et al.，(2000b)Efficient heterodimerization ofrecombinant bi-and trispecific antibodies.Bioseparation，9(3)179-83；22.Wong WM，Vakis SA，Ayre KR，et al.，(2000)Rheumatoid arthritis T cellsproduce Th1 cytokines in response to stimulation with a novel trispecificantibody directed against CD2，CD3，and CD28. Scand JRheumatol，29(5)282-7；23.Schott ME，Frazier KA，Pollock DK，et al.，(1993)Preparation，characterization，and in vivo biodistribution properties ofsynthetically cross-linked multivalent antitumor antibody fragments.Bioconjug Chem，4(2)153-65]。
卵巢癌发病率居妇科恶性肿瘤的第二位。由于起病隐匿，临床发现多属晚期，且术后易复发，五年存活率仅为30％。敏感的早期诊断和术后残留病灶的尽早清除，是改善预后的重要环节。因此，该环形三特异抗体在卵巢癌的免疫治疗上的应用有着广阔前景。
本发明的目的是提供一种用基因工程技术构建及表达的具有独特设计，低毒，高效，生产工艺简单等特点的，导向治疗肿瘤的生物制剂---抗人肿瘤×改形抗人CD3×改形抗人CD28 VH环状单链三特异抗体。
本发明的另一个目的是提供一种用于构建通用的环状单链三特异抗体的表达载体。
本发明的又一个目的是提供一种含有用于构建通用的环状单链三特异抗体的表达载体的宿主细胞。
本发明的又一个目的是提供一种编码所述的环状单链三特异抗体的核苷酸序列。
抗体分子具有两条相同的重链和轻链，每一条链由一个可变区(variable region)和一个或多个恒定区(constant region)组成，可变区主要负责与抗原结合，恒定区主要负责结合效应分子。在每一个可变区内有三个在序列和晶体结构上都高度变化的柔性环区(loop)，它们主要负责抗原的识别，被称为互补决定区(complementarity-determiningregions，CDRs)，而可变区的其余部分相对稳定，由较为刚性的β-折叠(β-sheet)组成，支撑着，被称为框架区(framework regions，FRs)，CDRs与FRs间隔排列而形成“三明治”结构。在本发明中，所使用的一些术语具有如下的含义“Fab抗体”是指由Fd段(重链VH+CH1构成)和完整的轻链组成，二者通过一个链间二硫键连接，形成异二聚体，它是完整抗体分子的三分之一，仅有一个抗原结合位点。
“单链抗体(scFv)”是用基因工程构建的一种抗体片段，由抗体重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)通过一连接肽连接而成的重组蛋白，约为完整抗体分子的六分之一。
“单域抗体”是由抗体重链可变区(VH)或轻链可变区(VL)构成，这种抗体只有一个结构域构成，故称为单域抗体，它是完整抗体分子的十二分之一。
“最小识别单位(Minimal recognizing unit，MRU)”是由单个CDR构成，约为完整抗体分子的七十分之一或八十分之一。
“改形抗体(Reshaping antibody)”也叫做CDR移植抗体(CDR-grafted antibody)。用基因合成或定点突变的方法将鼠源CDRs置换人源抗体中的CDRs，从而保留鼠源抗体的抗原结合特异性。但在构建时要考虑人源FRs中某些氨基酸残基会影响鼠源CDRs构成的抗原结合部位的构象，因此需对FRs中个别氨基酸残基进行突变，才能获得既具有高亲和力又最大程度上达到人源化的抗体。
本发明提供了一种抗人肿瘤的环状单链三特异抗体，它是由抗肿瘤的Fab、单域抗体或单链抗体，改形抗人CD3的Fab、单域抗体或单链抗体以及改形抗人CD28的Fab、单域抗体或单链抗体连接而成的。
在本发明的环状单链三特异抗体中，抗肿瘤的Fab、单域抗体或单链抗体可以是抗卵巢癌的Fab、单域抗体或单链抗体。
本发明的环状单链三特异抗体最好是由抗肿瘤的单链抗体，改形抗人CD3的单链抗体，改形抗人CD28的单域抗体连接而成的。
在本发明的环状单链三特异抗体中，所述的改形抗人CD28的单域抗体最好是VH，它最好具有如下两种氨基酸序列中的一种Q V Q L Q E S G P G L V K P S Q TL S L T C T V S G F S L S D Y GV H W V R Q P P G K G L E W L G VI W G G G T N Y N S A L M S R R VT S S D D T S K N Q F S L K L SS V D T A V Y Y C A R S Y Y Y S MD Y W G Q G T L V T V S S和Q V Q L Q E S G P G L V K P S Q TL S L T C T V S G F S L S D Y GV H W V R Q P P G K G L E W L G VI W A G G G T N Y N S A L M S R RV T S S D D T S K N Q F S L K LS L S S V D T A V Y Y C A R D K GY S Y Y Y S M D Y W G Q G T L V TV S S在本发明的环状单链三特异抗体中，抗肿瘤的Fab、单域抗体或单链抗体，改形抗人CD3的Fab、单域抗体或单链抗体以及改形抗人CD28的Fab、单域抗体或单链抗体之间最好有一种连接肽。所述的连接肽可以具有如下所示的氨基酸序列中的一种(1)pelbM K Y L L P T A A A G L L L L A A Q P A1ATGAAATACCTATTGCCTACGGCAGCCGCTGGATTGTTATTACTCGCTGCCCAACCAGCCTACTTTATGGATAACGGATGCCGTCGGCGACCTAACAATAATGAGCGACGGGTTGGTCGGM A Q V K L61 ATGGCCCAGGTGAAACTG
TACCGGGTCCACTTTGAC(2)Gly4SerG G G G S1 GGTGGTGGTGGTTCTCCACCACCACCAAGA(3)(Gly4Ser)3G G G G S G G G G S G G G G S1 GGTGGTGGTGGTTCTGGTGGTGGTGGTTCTGGTGGTGGTGGTTCTCCACCACCACCAAGACCACCACCACCAAGACCACCACCACCAAGA(4)HUMAN-IgG-FcN S T Y R V V S V L T V L H Q D W L N G1 AACAGCACGTACCGGGTTGTAAGCGTCCTCACCGTACTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCTTGTCGTGCATGGCCCAACATTCGCAGGAGTGGCATGACGTGGTCCTGACCGACTTACCGK E Y K C K61 AAGGAATACAAATGCAAGTTCCTTATGTTTACGTTC(5)HSAF Q N A L L V R Y T K K V P Q V S T P T1 TTCCAGAATGCGCTGCTGGTTCGTTACACCAAGAAAGTACCCCAAGTGTCAACTCCAACTAAGGTCTTACGCGACGACCAAGCAATGTGGTTCTTTCATGGGGTTCACAGTTGAGGTTGAP V E V S61 CCTGTAGAGGTCTCAGGACATCTCCAGAGT(6)C-mycE Q K L I S E E D L N1 GAACAAAAACTCATCTCAGAAGAGGATCTGAATCTTGTTTTTGAGTAGAGTCTTCTCCTAGACTTA本发明的环状三特异抗体最好是通过下述域间连接肽连接成环状分子的(1)HINGE(反向)HUMAN-IgG3’CL
P C R P C T H T T D G L P T K L E(2)HINGE(正向)HUMAN-IgG3’CLE L K T P L G D T T H T C P R C P本发明还提供了一种编码本发明的环状单链三特异抗体的核苷酸序列。
本发明还提供了一种含有上述序列的表达载体。这种表达载体可以是pTRI。
本发明还提供了一种含有上述载体的宿主细胞。这种宿主细胞可以是大肠杆菌。
本发明的环状单链三特异抗体的构建是基于双特异抗体在肿瘤免疫治疗中起主要作用的T细胞需要双重信号激活而设计的一种新型工程抗体，它将针对肿瘤细胞的抗体基因与激活T细胞的两个主要刺激信号的改形抗体基因融合表达。不同于其它三特异抗体的构建，该结构具有以下特点1.该结构为环状。三特异抗体链状分子的两端引入人抗体分子铰链区片段，它们通过形成二硫键而使单链分子变成环状。环状的形成，使分子更稳定，并使同一分子中的不同抗体与其靶向位点有更大的空间结合而相互不影响，而且有利于抗体药物在人体内的运输；2.三种抗体都是小分子抗体单链抗体或单域抗体。尤其是共刺激信号CD28抗体为单域抗体。该结构使整个分子不会很大，分子量约为84kDa，有利于肿瘤的治疗；3.负责激活T细胞的两种抗体，抗人CD3和抗人CD28抗体，都是经过人源化改造的改形抗体(Reshaping antibody)，消除了免疫原性；4.在每种抗体之间，通过特定的域间连接肽(interlinker)，使每种抗体不仅能充分折叠形成正确的空间结构，还可引入其它一些生物学功能；
5.三种抗体连接在一条链上成一个分子，使这一分子具有三种不同的功能；6.该分子中针对特定肿瘤的抗体可容易地改换成针对其他肿瘤或细胞因子的抗体，从而扩大其使用范围；7.直接用大肠杆菌发酵生产，产物无需经体外修饰，生产工艺简化，使用方便，大大降低生产成本。
附图简要说明

图1.构建及表达抗肿瘤环状单链三特异抗体的流程图。
图2.抗肿瘤环状单链三特异抗体(anti-tumor scFv×anti-CD3 scFv×anti-CD28VH)各基因及其域间连接肽接头基因的连接结构图。
图3.二种改形抗CD28 VH单域抗体基因的核苷酸序列及所编码的氨基酸序列。
图4.各种连接肽接头的核苷酸序列及所编码的氨基酸序列。
图5.重叠PCR过程示意图。
图6.抗肿瘤环状单链三特异抗体的通用表达质粒pTRI的物理图谱。
图7.抗卵巢癌环状单链三特异抗体在pTRI表达的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳结果。
实施例设计合成适当大小的核苷酸片段，通过重叠PCR扩增得到部分域间连接肽的基因序列。将该序列插入到质粒pUC19中构成新载体pUHM1。从含有抗卵巢癌的双特异抗体质粒中用XhoI，BamHI双酶切得到双特异抗体基因并且将该基因插入到克隆载体pUHM1中，得到载体pUHM2。将含有改形抗CD28单域抗体基因和含有连接肽的基因插入到表达载体pTMF中，构成表达载体pTCH1。然后将pUHM2中含有抗卵巢癌双特异抗体及部分连接肽的序列插入到pTCH1中，构成表达质粒pTRI。用构建好的表达质粒pTRI转化宿主细胞BL21。挑取鉴定后的阳性克隆菌转接到含卡那霉素50μg/ml的LB中，37℃培养至OD550为0.4-0.5时，向培养物中加入终浓度为0.8mmol/L的IPTG，诱导培养4小时。收集表达产物，超声破碎菌体，12000rpm离心10min，上清及沉淀分别进行8％和12％SDS-PAGE电泳。具体操作流程(见附图1)如下一.克隆载体pUMH1的构建本克隆载体由质粒pUC19改建而来，将含有5’-HindIII-pelB-HumanIgG3’CL hinge(反向)-Gly4Ser-XhoI-BamHI-Gly4Ser-HSA-Gly4Ser-NdeI-EcoRI-3’的连接肽片段插入到pUC19的HindIII，EcoRI双酶切位点中而构成。设计合成6个大小不同的核苷酸片段，P15’-CCCAAgCTTATgAAATACCTATTgCCTACggC-3’ 32ntsP25’-GCCCAGGTGAAACTGCCGTGCCGTCCATGTACTCACACCACTGACGGTCTGCCGACCAAATTGGAAGGTGGTGGTGGTTC-3’ 80ntsP35’-CTGCTGGTTCGTTACACCAAGAAAGTACCCCAAGTGTCAACTCCAACTCCTGTAGAGGTCTCAGGTGGTGGTGGTTCTCAT-3’ 81ntsRE15’-CCggAATTCCATATgAgAACCACCACCACC-3’30ntsRE25’-TTCTTGGTGTAACGAACCAGCAGCGCATTCTGGAAAGAACCACCACCACCGGATCCCTCGAGAGAACCACCACCACCTTCC-3’ 81ntsRE35’-GGCACGGCAGTTTCACCTGGGCCATGGCTGGTTGGGCAGCGAGTAATAACAATCCAGCGGCTGCCGTAGGCAATAGGTATT-3’ 81nts采用重叠PCR将6个片段扩增得到285bp的核苷酸片段。1.重叠PCR扩增连接肽核苷酸序列重叠PCR采取两步扩增获得全长片段，操作见重叠PCR过程示意5。第一步获得P1，P2，RE3，RE2的PCR双链产物M1以及P3，RE1的PCR补平双链片段M2；第二步将所得到的两个片段M1，M2等摩尔加入，通过重叠PCR获得全长。1).M1的获得将P1，P2，RE3，RE2各个片段溶液4ul(约为10pmol)加入到离心管中，分别加入10×PCR Buffer 3ul，4uldNTPs(2.0mmol/l each)，1ul pfu DNA聚合酶(3u/ul)，用ddH2O补足到总体积到30ul，加入100ul液体石蜡，混匀，进行30轮PCR循环94℃变性1min.，55℃退火30秒，72℃延伸40秒。PCR产物进行2.5％琼脂糖凝胶电泳，利用华舜琼脂糖凝胶DNA回收Kit，回收所需的DNA片段。2).M2的获得将P3，RE1，两个片段溶液4ul(约为10pmol)加入到离心管中，分别加入10×PCR Buffer 3ul，4ul dNTPs(2.0mmol/l each)，1ul pfuDNA聚合酶(3u/ul)，用ddH2O补足到总体积到30ul，加入100ul液体石蜡，混匀，进行30轮PCR循环94℃变性1min.，60℃退火30秒，72℃延伸40秒。PCR产物进行2.5％琼脂糖凝胶电泳，利用华舜琼脂糖凝胶DNA回收Kit，回收所需的DNA片段。3).全长PCR产物的获得将M1，M2各个片段溶液10ul加入到离心管中，分别加入P1，RE1各4ul，10×PCR Buffer 3ul，4ul dNTPs(2.0mmol/l each)，1ul pfu DNA聚合酶(3u/ul)，用ddH2O补足到总体积到30ul，加入100ul液体石蜡，混匀，进行30轮PCR循环94℃变性1min.，55℃退火30秒，72℃延伸40秒。PCR产物进行2.5％琼脂糖凝胶电泳，利用华舜琼脂糖凝胶DNA回收Kit，回收所需的全长DNA片段。2.PCR扩增产物的限制性内切酶消化及纯化用HindIII和EcoRI对PCR全长DNA进行消化取约1ug DNA片段在40ul反应体系中(1×Buffer M，30u的HindIII和30u的EcoRI)，37℃酶解4小时，1％琼脂糖凝胶电泳检测消化完全后，在长波长紫外灯下切胶回收所需的条带，参照华舜生物技术有限公司产品kit说明，用柱回收和纯化所需的酶切片段。3.载体质粒pUC19的提取采用减法小量提取质粒挑取pUC19/DH5α单菌落，在5ml LB培养液(含Amp 100μg/ml)中37℃培养过夜，12000rpm离心1分钟收集菌体。沉淀悬于100ul SolutionI(50mmol/l Glucose，10mmol/l EDTA，25mmol/l TirspH8.0)，充分混匀。加入200ul新配制的SolutionII(0.2mol/l NaOH，1％SDS)，盖紧管盖，快速颠倒4-5次，将离心管置于冰浴中放置3分钟。加入150ul予冷的SolutionIII(3mol/l KAc，pH4.8)，混匀后与冰浴放置5分钟。4℃，12000rpm离心10分钟，转移上清至另一离心管中，加入2倍体积的予冷无水乙醇，室温放置10分钟，然后4℃，12000rpm离心20分钟。DNA沉淀用70％乙醇洗一遍，待DNA干燥后，将其溶于100ulddH2O中(含RNase 50ug/ml)，37℃消化1小时。加入等体积的酚∶氯仿(1∶1)，震荡混匀，室温，12000rpm离心5分钟。转移水相至另一离心管中，加入等体积的氯仿/异戊醇(24∶1)震荡混匀，室温，12000rpm离心5分钟。转移上清至另一离心管中，加入1/10体积的NaAc(3mol/l，pH5.2)，2倍体积的无水乙醇，4℃放置1小时。4℃，12000rpm离心20分钟，弃上清，DNA沉淀用70％乙醇洗一遍，干燥后沉淀溶于25ul ddH2O。4.载体质粒pUC19的限制性内切酶消化及纯化用HindIII和EcoRI对载体DNA进行消化取1ug质粒pUC19在40ul反应体系中(1×Buffer M，30u的HindIII和30u的EcoRI)，37℃酶解4小时，1％琼脂糖凝胶电泳检测消化完全后，在长波长紫外灯下切胶回收所需的条带，参照华舜生物技术有限公司产品kit说明，用柱回收和纯化所需片段。5.DNA的连接反应取回收的双酶切pUC19约40ng，双酶切PCR全长片段20ng，加入2ul 10×T4DNA连接酶缓冲液，1ul T4DNA连接酶(约20u)，加ddH2O至总体积20ul，混匀，16℃连接过夜。6.感受态细胞的制备用氯化钙制备大肠杆菌的感受态细胞挑取LB平板上的野生Top10单菌落，接种于3ml LB液体培养基中，37℃震荡培养过夜。以1％的接种量转接于30ml的LB液体培养基中，37℃震荡培养至OD值为0.3-0.4时，将菌液置于冰浴中10分钟，4℃，4000rpm离心10分钟，弃去上清，沉淀溶于20ml予冷的0.1mol/l CaCl2中，冰浴放置30分钟，4℃，4000rpm离心10分钟，弃去上清，加入2ml予冷的0.1mol/l CaCl2(含20％甘油)重悬细胞，以200ul分装。未及时使用的各管于-70℃保存。7.重组DNA的转化，阳性克隆的筛选及测序鉴定10ul连接混合物加入到200ul的感受态细胞中，混匀，冰浴放置30分钟，42℃水浴90秒，立即置于冰浴中5分钟，涂布于LB(含100ug/mlAmp.)的平板上，表面干燥后，37℃倒置培养过夜。挑取平板上生长的单菌落，采用碱法小量提取质粒，分别用HindIII，EcoRI双酶切；以P1，RE1片段为引物的PCR鉴定插入外源片段的质粒。将鉴定后的质粒送生工生物工程公司测序鉴定，鉴定后测序正确的阳性质粒为pUMH1。二.克隆载体pUMH2的构建载体pUMH2是由质粒pUMH1在XhoI，BamHI位点插入以人IgG1 CH2中Fc片段为interlinker的抗卵巢癌scFV×抗CD3 scFv双特异抗体(BsAb)片段构成。PALM-Fc质粒是本实验室构建的含有抗卵巢癌scFV×抗CD3 scFv双特异抗体(BsAb)基因的中间载体，该双特异抗体片段的顺序为-XhoI-抗Ovarian carcinomaVH-(Gly4Ser)3-抗OvariancarcinomaVL-Fc-抗CD3VL-(Gly4Ser)3-抗CD3VH-BamHI-。1.双特异抗体片段的制备及纯化采用碱法小量提取质粒pALM-Fc，用XhoI和BamHI对载体质粒DNA进行消化取约1ug质粒pALM-Fc在40ul反应体系中(1×BufferM，30u的XhoI和30u的BamHI)，37℃酶解4小时，1％琼脂糖凝胶电泳检测消化完全后，在长波长紫外灯下切胶回收所需的条带，参照华舜生物技术有限公司产品kit说明，用柱回收和纯化所需片段。2.载体质粒pUMH1的限制性内切酶消化及纯化用XhoI和BamHI对载体DNA进行消化取1ug质粒pUMH1在40ul反应体系中(1×Buffer M，30u的XhoI和30u的BamHI)，37℃酶解4小时，1％琼脂糖凝胶电泳检测消化完全后，在长波长紫外灯下切胶回收所需的条带，参照华舜生物技术有限公司产品kit说明，用柱回收和纯化所需片段。3.DNA的连接反应，重组DNA的转化，阳性克隆的筛选取回收的双酶切pUMH1约40ng，双酶切双特异抗体片段20ng，加入2ul10×T4DNA连接酶缓冲液，1ul T4DNA连接酶(约20u)，加ddH2O至总体积20ul，混匀，16℃连接过夜。10ul连接混合物加入到200ul的感受态细胞中，混匀，冰浴放置30分钟，42℃水浴90秒，立即置于冰浴中5分钟，涂布于LB(含100ug/ml Amp.)的平板上，表面干燥后，37℃倒置培养过夜。挑取平板上生长的单菌落，采用碱法小量提取质粒，分别采用HindIII，EcoRI双酶切；XhoI，BamHI双酶切鉴定插入的外源片段。鉴定后的阳性质粒为pUMH2。三.环状单链三特异抗体的构建与表达环状单链三特异抗体是由表达载体pTCH1和含有域间连接肽的双特异抗体克隆载体pUMH2提供的片段构建而成。pTCH1是由表达载体pTMF插入-NdeI-(anti-CD28VH)-(c-myc)-Gly4Ser-Human IgG3’CL(17Aa，正向)-BamHI-片段后构成。1.表达质粒pTCH1的构建采用碱法小量提取含有-NdeI-(anti-CD28 VH)-(c-myc)-Gly4Ser-HumanIgG3’CL(17Aa，正向)-BamHI-片段的质粒pUC19，取约1ug该质粒加入到40ul反应体系中(1×Buffer M，30u的BamHI和30u的NdeI)，37℃酶解4小时，用于制备-NdeI-(anti-CD28VH)-(c-myc)-Gly4Ser-HumanIgG3’CL(17Aa，正向)-BamHI-片段；在同样条件下用NdeI和BamHI水解表达载体pTMF。1％琼脂糖凝胶电泳检测消化完全后，在长波长紫外灯下切胶回收所需的条带，参照华舜生物技术有限公司产品kit说明，用柱回收和纯化所需片段。取回收的双酶切pTMF约40ng，双酶切的anti-CD28 VH片段20ng，加入2ul 10×T4DNA连接酶缓冲液，1ul T4DNA连接酶(约20u)，加ddH2O至总体积20ul，混匀，16℃连接过夜。10ul连接混合物加入到200ul的大肠杆菌BL21感受态细胞中，混匀，冰浴放置30分钟，42℃水浴90秒，立即置于冰浴中5分钟，涂布于LB(含50ug/ml Kna.)的平板上，表面干燥后，37℃倒置培养过夜。挑取平板上生长的单菌落，采用减法小量提取质粒，分别采用质粒大小；HindIII，NdeI双酶切鉴定插入的外源片段。鉴定后的阳性质粒为pTCH1。2.表达质粒pTCH1的限制性内切酶消化及纯化用HindIII和NdeI对载体DNA进行消化取1ug质粒pTCH1在40ul反应体系中(1×Buffer M，30u的HindIII和30u的NdeI)，37℃酶解4小时，1％琼脂糖凝胶电泳检测消化完全后，在长波长紫外灯下切胶回收所需的条带，参照华舜生物技术有限公司产品kit说明，用柱回收和纯化所需片段。3.含有域间连接肽双特异抗体片段的制备及纯化采用碱法小量提取质粒pUMH2，用HindIII和NdeI对质粒DNA进行消化取约1ug质粒pUMH2在40ul反应体系中(1×Buffer M，30u的HindIII和30u的NdeI)，37℃酶解4小时，1％琼脂糖凝胶电泳检测消化完全后，在长波长紫外灯下切胶回收所需的条带，参照华舜生物技术有限公司产品kit说明，用柱回收和纯化所需片段。4.DNA的连接反应，重组DNA的转化，阳性克隆的筛选取回收的双酶切pTCH1约40ng，双酶切的含有域间连接肽双特异抗体片段20ng，加入2ul 10×T4DNA连接酶缓冲液，1ul T4DNA连接酶(约20u)，加ddH2O至总体积20ul，混匀，16℃连接过夜。10ul连接混合物加入到200ul的感受态细胞中，混匀，冰浴放置30分钟，42℃水浴90秒，立即置于冰浴中5分钟，涂布于LB(含50ug/ml Kna.)的平板上，表面干燥后，37℃倒置培养过夜。挑取平板上生长的单菌落，采用碱法小量提取质粒，分别采用HindIII，NdeI双酶切鉴定插入的外源片段。鉴定后的阳性质粒为pTRI。5.环状单链三特异抗体的表达挑取鉴定后含有质粒pTRI的阳性克隆单菌落转接到含卡那霉素50μg/ml的LB中，37℃培养至OD550为0.4-0.5时，向培养物中加入终浓度为0.8mmol/l的IPTG，诱导培养4小时。收集表达产物，超声破碎菌体，12000rpm离心10min，上清及沉淀分别进行12％和8％SDS-PAGE电泳。聚丙烯酰胺凝胶的配制浓缩胶分 离 胶 分 离 胶 封口胶5％ 12％ 8％30％Acr/Bis(29∶1)(ml)0.56.0 4.00.531.5M Tris-HCl(pH8.8)(ml) - 3.8 3.8-1.0M Tris-HCl(pH6.8)(ml) 0.38 - - 0.510％SDS(ml) 0.03 0.15 0.15 0.0210％AP(ml)0.03 0.15 0.15 0.02TEMED(ml) 0.003 0.006 0.009 0.0012ddH2O(ml)2.14.9 6.90.93样品的处理适量蛋白样品与等体积的2×SDS凝胶加样缓冲液(100mmol/l Tris-HCl pH6.8，200mmol/l DTT，4％SDS，0.2％溴酚蓝，20％甘油)混合，沸水浴加热5分钟，待上样。电泳电泳缓冲液25mmol/l Tris-HCl，pH8.3，0.1％SDS。取适量体积的样品上样，恒压60V，待样品进入分离胶，恒压120V。染色及脱色采用考马斯亮兰R250染色(0.25g考马斯亮兰R250溶于100ml甲醇-水-冰乙酸溶液中(90ml甲醇∶水(1∶1，v/v)和10ml冰乙酸)，室温染色6-12小时。用甲醇-水-冰乙酸溶液脱色，室温脱色至具有明显条带，照相。
权利要求
1.一种抗人肿瘤的环状单链三特异抗体，它是由抗肿瘤的Fab、单域抗体或单链抗体，改形抗人CD3的Fab、单域抗体或单链抗体以及改形抗人CD28的Fab、单域抗体或单链抗体连接而成的。
2.按照权利要求1所述的环状单链三特异抗体，其中，抗肿瘤的Fab、单域抗体或单链抗体是抗卵巢癌的Fab、单域抗体或单链抗体。
3.按照权利要求1所述的环状单链三特异抗体，它是由抗肿瘤的单链抗体，改形抗人CD3的单链抗体，改形抗人CD28的单域抗体连接而成的。
4.按照权利要求3所述的环状单链三特异抗体，其中，所述的改形抗人CD28的单域抗体是VH，它具有如下两种氨基酸序列中的一种Q V Q L Q E S G P G L V K P S Q TL S L T C T V S G F S L S D Y GV H W V R Q P P G K G L E W L G VI W G G G T N Y N S A L M S R R VT S S D D T S K N Q F S L K L SS V D T A V Y Y C A R S Y Y Y S MD Y W G Q G T L V T V S S和Q V Q L Q E S G P G L V K P S Q TL S L T C T V S G F S L S D Y GV H W V R Q P P G K G L E W L G VI W A G G G T N Y N S A L M S R RV T S S D D T S K N Q F S L K LS L S S V D T A V Y Y C A R D K GY S Y Y Y S M D Y W G Q G T L V TV S S
5.按照权利要求1所述的环状单链三特异抗体，其中，抗肿瘤的Fab、单域抗体或单链抗体，改形抗人CD3的Fab、单域抗体或单链抗体以及改形抗人CD28的Fab、单域抗体或单链抗体之间有一种连接肽。
6.按照权利要求5所述的环状单链三特异抗体，其中，所述的连接肽具有如下所示的氨基酸序列中的一种(1)M K Y L L P T A A A G L L L L A A Q P AM A Q V K L(2)G G G G S(3)G G G G S G G G G S G G G G S(4)N S T Y R V V S V L T V L H Q D W L N GK E Y K C K(5)F Q N A L L V R Y T K K V P Q V S T P TP V E V S(6)E Q K L I S E E D L N
7.按照权利要求5所述的环状单链三特异抗体，它是通过下述域间连接肽连接成环状分子的P C R P C T H T T D G L P T K L E或者E L K T P L G D T T H T C P R C P
8.一种编码权利要求1至7中任何一项所述的环状单链三特异抗体的核苷酸序列。
9.一种含有权利要求7所述序列的表达载体。
10.按照权利要求8所述的载体，它是pTRI。
11.一种含有权利要求8或9中任何一项所述的载体的宿主细胞。
12.按照权利要求10所述的宿主细胞，它是大肠杆菌。
全文摘要
本发明提供了一种抗人肿瘤的环状单链三特异抗体,它是由抗肿瘤的Fab、单域抗体或单链抗体,改形抗人CD3的Fab、单域抗体或单链抗体以及改形抗人CD28的Fab、单域抗体或单链抗体连接而成的。本发明还提供了编码这种抗体的DNA序列,含有这种DNA序列的表达载体和含有这种表达载体的宿主细胞。
文档编号C07K7/64GK1380341SQ0111055
公开日2002年11月20日 申请日期2001年4月11日 优先权日2001年4月11日
发明者黄华樑, 程巨龙, 王祥斌, 张众, 林晴, 顾莹 申请人:中国科学院遗传研究所, 北京安波特基因工程技术有限公司