专利名称：与人cd95结合的多肽基序及其多肽的利记博彩app
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本发明涉及与人细胞膜蛋白分子CD95结合的多肽基序及其多肽分子，特别是与CD95胞外区结合的功能性多肽。此外，本发明涉及编码这些多肽的DNA、RNA。由于这些多肽与CD95分子胞外区的结合位点进行结合，可阻断或诱导细胞引发自身死亡程序而使细胞死亡，因此本发明还涉及这些多核苷酸和多肽在制备可用于诊断和治疗与CD95系统相关的疾病的试剂或药品中的应用。
自1980年Wyllie首次提出细胞程序性死亡的概念(Wyllie-AH,Glucocorticoid-induced thymocyte apoptosis is associated withendogenous endonuclease activation.Nature.1980 Apr 10；284(5756):555-6)以来，人们逐渐认识到，细胞程序性死亡是多细胞生物体内普遍存在的细胞死亡方式。多细胞生物体依靠细胞程序性死亡，与细胞增殖和分化共同平衡着体内细胞的数量和种类，保证生物体正常的发育和生理过程。这种通过激活自身的死亡程序杀死自身的死亡方式，具有特征形态的典型变化，又称做细胞凋亡。启动细胞凋亡的关键性蛋白分子是细胞表面膜蛋白分子CD95，常称做Fas或死亡分子。[Itoh-N；Nagata-S；Cell.1991 Jul 26；66(2):233-43]，一旦CD95与其天然配体结合后，便可激活该细胞的死亡程序来消除自身。由此可见，正常凋亡功能是机体一切正常活动的根本，临床上也常观察到不能正常进行细胞凋亡过程的个体常伴有重大疾病的发生，如癌症、自身免疫性疾病和病毒感染等。此外，许多以细胞退化作为特征的疾病如神经退化性失调、获得性免疫缺陷综合症等，也存在细胞凋亡加速的作用。其中，CD95系统扮演着重要的角色。
CD95所诱导的细胞凋亡与多种疾病密切相关，所诱导凋亡的水平高低直接影响着疾病的发生、发展和愈合。例如，病毒感染性疾病的一个典型例子便是AIDS[J.Clin.Invest.102,79(1998)；Adv.Cancer Res.,78,159(2000)]。患者体内由HIV直接感染而引起的CD4*细胞死亡，仅占被破坏的CD4+细胞中的少数。而大量CD4+细胞的死亡是通过凋亡而消除的HIV病毒表面蛋白gp120与人体内细胞表面CD4分子结合，并刺激感染细胞产生多种细胞因子，这些细胞因子或HIV感染又进一步促进细胞表达CD95增加，从而导致细胞走向凋亡。病毒性肝炎，包括慢性乙肝患者和丙肝患者的肝细胞损害也与T淋巴细胞使用CD95受体-配体系统诱导凋亡有关[Galle-PR,J-Exp-Med.,182(5):1223,1995；Taya-N,Br-J-Haematol.,110(1):89,2000；Ryo-K,Am-J-Gastroenterol.,95(8):2047,2000；Viral.Hepat.,4,303,1997]。在病毒感染的肝脏中，浸润淋巴细胞识别肝细胞表面病毒抗原而受到活化并表达CD95L，对CD95表达增强的肝细胞进行凋亡诱导而杀死肝细胞[Hayashi-N,J-Viral-Hepat.,6(5):357,1999]。另外，凋亡的调控功能失常与肿瘤的发生关系密切。机体突变细胞往往异常增生而CD95诱导凋亡的功能下降，使之存活而发生肿瘤。良性肿瘤向恶性肿瘤转化时，也常常是由于恶性肿瘤细胞死亡速率下降所致。用CD95系统可诱导成人T细胞白血病细胞系发生凋亡[Debatin,Blood.81(11):2972,1993]，这些实验结果提示调控CD95诱导凋亡的作用可以作为肿瘤治疗的一个新思路。此外，目前许多中枢神经退行变性疾病，包括老年性痴呆、Alzheimer和帕金森综合症(Parkinson)，多是由于神经系统的细胞凋亡过多，是正常神经组织细胞也通过凋亡而消除，影响了神经系统的功能，导致神经退化性疾病[Mogi-M,Neurosci-Lett.,220(3):195,1996；Hartmann-A,Ann-Neurol.,44(3):425,1998；Sohn-YK,J-Neurol-Sci.,152(1):73,1997；Nishimura-T,Brain-Res.,695(2):137,1995]。
此外，表达CD95L的组织细胞与淋巴细胞表面的CD95结合诱导细胞凋亡可以来消灭前来进攻的活化淋巴细胞以使组织获得免疫豁免。这一现象可用于异种器官移植将移植组织细胞转入FasL基因使之表达FasL，通过建立免疫豁免来提高器官移植的成功率[Science,273,109-112(1996)]。
由于CD95与疾病的发生、发展及愈后都密切相关，因此临床上可利用调节CD95诱导细胞凋亡的功能来达到治疗的目的。目前能够与CD95结合并具有一定功能的分子仅有人工制备的抗CD95抗体和天然的人CD95L。天然的人CD95L表达并不广泛，仅在激活的淋巴细胞表面。纯化天然CD95L不仅技术困难，而且规模化的制备不现实，因此不适用于临床，目前仅有少量的人CD95L用于科研实验，并且价格昂贵。人工制备的抗CD95L抗体是小鼠抗人CD95的抗体，对于人体是一种异种蛋白抗原分子，会产生免疫排斥反应，存在鼠源性问题，不能用于临床。另外，与细胞表面CD95竞争结合CD95L来达到抑制凋亡目的的分子有可溶性Fas分子(Fas胞外区部分)[Science,263,1759-1762(1994)]、Fas.Fc(Fas胞外区部分与人IgG的Fc段融合分子)。
本发明从另一个角度，从蛋白分子相互作用的机理出发，以小分子量多肽分子模拟人天然的FasL对Fas的结合位点对Fas进行结合，从而诱导细胞发生凋亡或者用多肽占据它们的作用位点达到阻断凋亡的目的。与单抗相比较，小分子量的多肽结构清楚，与Fas的结合区域局限，不易发生多肽与多肽之间的空间位阻效应，也没有Fc段的干扰。此外，多肽的抗原性低(几乎没有)，不存在鼠源性单抗人源化的问题，副作用小，也很容易制备成多价交联状态以增强其活性，而且易于大规模生产、使用方便等特点，因而在相关药物研制方面具有巨大的应用潜力。此外，与人CD95特异性结合的多肽可作为检测、诊断试剂。将具有诱导凋亡功能的多肽编码DNA制备转基因动物，使转基因动物的组织细胞表达该多肽。由于多肽具有诱导凋亡的功能，因此可以诱导前来进攻的淋巴细胞发生凋亡，以在受体体内产生免疫豁免，延长异种器官的存活，这也是异种器官移植研究中的一个策略。
这里，与CD95或Fas结合是指细胞膜表面膜蛋白受体分子CD95、可溶性Fas分子、Fas.Fc融合型分子等含有Fas蛋白分子胞外区的各种形式的分子。CD95，又名Fas、APO-1，它们均是同一个蛋白分子。CD95L有时也称做FasL、APO-1L，均是指同一个蛋白分子，是CD95的天然配体。
本发明所涉及的多肽是指与细胞膜表面蛋白受体CD95胞外区结合的多肽，或者与可溶性CD95分子结合的多肽，包括融合型多肽和游离型多肽。CD95受体的多肽配体包含Motif IDNo:1或Motif ID No:2序列特点或与其实质上等同的序列代表的氨基酸序列的任何多肽。例如，除包含MotifID No:1或MotifID No:2氨基酸序列特点的多肽或蛋白质外，本发明的配体多肽包括包含某些氨基酸序列的蛋白质，所说的氨基酸序列与含有Motif ID No:1或Motif IDNo:2序列特点的多肽配体的氨基酸序列同源性为50-99.9％，优选地为70-99.9％，更优选的为80-99.9％，尤其优选地为90-99.9％，并具有诱导或阻断凋亡的功能活性。这里所使用的术语“实质上的等同物”意思是所说蛋白质的活性(例如所说的配体和所说的受体的结合活性)和物理特性实质上相同。氨基酸的取代，缺失或插入有时在多肽的物理和化学特性上不产生根本的变化。其中，包含取代、缺失或插入的多肽将被认为与缺乏取代、缺失或插入的多肽是实质上的等同物。在所说的序列上的一个氨基酸的实质上等同的取代基可以是选自所说的氨基酸所说类别的其它成员。非极性(疏水性)氨基酸包括丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、经氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和甲硫氨酸。极性中性氨基酸包括甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酞胺。正电荷(碱性)氨基酸包括精氨酸、赖氨酸和组氨酸。负电荷(酸性)氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。因此，即使存在程度上的差别(如受体连接活性的强度和多肽的分子量)也是允许的。
本发明所涉及的多肽包括游离型多肽和融合型多肽，可以与功能或性质已知的蛋白质融合，即包括了含有本发明所涉及的多肽基序的氨基酸序列的蛋白质分子或嵌合分子等，这些蛋白分子含有与本发明所涉及的多肽相同活性位点，换句话说，本发明包括一些含有该多肽的融合型蛋白分子或嵌合分子，这些蛋白分子含有该多肽的受体结合活性、信号转导活性及其类似活性。实施例为SEQ ID No 1、SEQ ID No 2、SEQ ID No 3、SEQ ID No 4、SEQ ID No 5以及SEQ ID No 6、SEQ ID No 7、SEQ ID No 8、SEQ ID No 9、SEQ ID No 10、SEQ ID No 11、SEQID No 12。
本发明所涉及的多肽基序(motif，有时也翻译为结合模型)是通过噬菌体肽库筛选技术，从肽库中直接钓取与CD95受体分子结合的多肽。将这些多太序列结合概率统计的分析，获得多肽与CD95受体分子的结合模型，也就是CD95受体分子的多肽配体基序。这些特定氨基酸的特定位置是多肽配体与CD95受体结合的活性位点或关键性氨基酸，决定了与CD95结合的多肽的活性特征。实施例为Motif ID No:1、Motif ID No:2。
与本发明有关的DNA是编码上述多肽的DNA。与本发明有关的编码多肽的DNA序列可单独或与其他蛋白分子的编码基因一同使用，制备转基因动物，用于异种器官移植。通过该多肽与活化的淋巴细胞表面Fas分子结合而消灭前来攻击的免疫细胞，使移植物处于免疫豁免状态，延长异种器官移植的存活率。
在本申请的说明书和附图中，用于表示碱基(核苷酸)，氨基酸等的缩写是由生化命名IUPAC-IUB委员会推荐的那些和本领域常用的那些。它们的例子在以下给出。可能有旋光异构的氨基酸是指L形的，除非有其它说明。
DNA脱氧核糖核酸cDNA互补脱氧核糖核酸A腺嘌呤T胸腺嘧啶G鸟嘌呤C胞嘧啶RNA核糖核酸mRNA信使核糖核酸dATP脱氧腺苷三磷酸dTTP脱氧胸苷三磷酸dGTP脱氧鸟苷三磷酸dCTP脱氧胞苷三磷酸ATP腺苷三磷酸EDTA乙二胺四乙酸SDS十二烷磺酸钠酶ELISA酶免疫测定
G,Gly甘氨酸(或甘氨酰)A,Ala丙氨酸(或丙氨酰)V,Val缬氨酸(或缬氨酰)L,Leu亮氨酸(或亮氨酰)I,Ile异亮氨酸(或异亮氨酰)S,Ser丝氨酸(或丝氨酰)T,Thr苏氨酸(或苏氨酰)C,Cys半胱氨酸(或半胱氨酰)M,Met甲硫氨酸(或甲硫氨酰)E,Glu谷氨酸(或谷氨酰)D,ASp天门冬氨酸(或天门冬氨酰)K,LyS赖氨酸(或赖氨酰)R,A:g精氨酸(或精氨酰)H,HIS组氨酸(或组氨酰)F,Phe苯基丙氨酸(或苯基丙氨酰)Y,Tyr酪氨酸(或酪氨酰)W,Trp色氨酸(或色氨酰)P,Pro脯氨酸(或脯氨酰)N,Asn天冬酰胺(或天冬酰胺酰)Q,Gin谷酰胺(或谷酰胺酰)pGlu焦谷氨酸(或焦谷氨酰)Me甲基Et乙基Bu丁基Ph苯基TC噻唑烷基-4(R)-羧酰胺在本说明书中，取代，保护基以及通常使用的试剂由下列缩写表示BHA二苯甲基胺pMBKA:p-甲基二苯甲胺Tos:p-甲苯磺酰CHO甲酰基
HONB:N-羟基-5-降冰片烯-2,3-联羧基亚胺OcHex环己基酯Bzl苄基Bom苄氧甲基Br-Z:2-溴苯氧羧基Boc叔-丁氧羧基DCM二氯甲烷HOBt:1-羟基苯并三唑DCC:N,N-二环己基碳化二亚胺TFA三氯乙酸DIEA二异丙基乙酰胺Fmoc:N-9-芴基甲氧羧基DNP二硝基苯基Bum叔-丁氧甲基Trt三苯甲基本说明书中描述的肽，按照肽说明的惯例，左末端是N-末端(氨基末端)，右末端是C-末端(羧基末端)。通常，当多肽的C-末端是羧基(-COOH)或羧酸盐(-COO-)时，它可以是酰胺(-CONH2)或酯(-COOR)形式。酯残基R包括C1-6烷基(如甲基、乙基、n-丙基、异丙基、n-丁基等)、C3-8环烷基(如环戊基、环己基等)、C6-12芳基(如苯基、α-萘基等)和C7-14烷基(如苯-C1-2烷基(例如苄基、苯乙基、二苯基甲醇基等)或α-萘C1-2烷基。
实施本发明的最佳方式按照本发明的配体多肽是能够结合CD95受体蛋白、并包含Motif ID No:1或Motif IDNo:2或与其实质上等同的序列代表的氨基酸序列或其部分肽，或其酰胺或酯或其盐的多肽。
现在详尽描述上述的配体多肽、其酰胺或酯或其盐(下文有时简称为配体多肽或多肽)的产生方法以及该多肽的用途。
本发明的多肽可以通过下述方法生产采用基因工程的方法构建分泌型载体，使重组入载体的DNA序列翻译、合成并分泌到胞浆中或培养基中，再分离纯化；或者在设计载体时在多肽的一侧引入Asp-Pro残基，然后通过盐酸胍在低pH条件下进行切割。也可以通过目前已知的肽合成方法产生。用于肽合成的方法可以是任意有固相合成法和液相合成法。固相合成法中较为方便地在美国ABI公司的多肽合成仪上进行，合成及切割步骤依据ABI公司多肽合成操作手册进行。目标肽也可以通过缩合部分肽或能够以其残基部分构成蛋白质的氨基酸产生，当产物有保护基时，脱去保护基，由此，可产生所需的肽。已知的用于缩合和脱保护的方法包括在下列文献(1)-(5)中描述的方法。
(1)M.Bodanszky和M.A.Ondetti，肽合成，纽约国际科学出版社，1966。
(2)Schroeder和Luebke，肽，纽约学院出版社，1965。
(3)Nobuo Izumiya等，肽合成的原理和实验，Maruzen,1975。
(4)Haruaki Yajima和Shumpei Sakakibara，生化实验系列1，蛋白质化学Ⅳ,205,1977。
(5)Haruaki Yajima(编者)，药物延续的发展，14，肽合成，HirokawaShoten.
反应后，可通过结合使用常规的纯化技术(如溶剂萃取、柱层析、液相层材以及重结晶)纯化和分离蛋白质。如上述的分离的蛋白质是游离化合物时，可通过已知的方法把它转化为适合的盐。相反，当分离的产物是盐时，可用已知方法把它转化为游离肽。
酞胺多肽可通过利用适于酰胺化的肽合成树脂获得。树脂包括氯甲基树脂、羟甲基树脂、二苯甲基胺树脂、氨乙基树脂、4-苄氧基苯甲醇树脂、4-甲基二苯甲胺树脂、PAM树脂、4-羟甲基苯甲基乙酰氨甲基树脂、聚丙烯酰胺树脂、4-(2’,4’-二甲氧苯基-羟甲基)苯氧基树脂、4-(2’,4’-二甲氧苯基-Fmoc氨乙基)苯氧基树脂等。利用这类树脂时，按照目标肽的序列，利用各种本身已知的缩合技术，在树脂上缩合氨基酸，其中该氨基酸的a-氨基基团和侧链的功能基已适当的保护。在系列反应的最后，从树脂除去肽或保护肽，除去保护性基团以获得目标多肽。
为缩合上述的保护氨基酸，可利用各种肽合成激活剂，但碳化二亚胺化合物是尤其合适的。碳化二亚胺包括DCC、N,N’-二异丙基碳化二亚胺和N-乙基-N’-3-二甲基氨丙基)碳化二亚胺。为用这类试剂活化，把外消旋抑制剂添加剂(例如HOBt)和保护氨基酸直接加至树脂，或把预先活化的保护氨基酸作为对称酸酐、HOBt酯或HOOBt酯加至树脂。用于活化保护氨基酸或用树脂缩合的溶剂可从已知的对肽缩合反应有用的那些溶剂中适当地选择。例如，N,N-二甲基甲酰胺、N-甲基吡咯烷、三氯甲烷、氯仿、三氟乙醇、二甲基亚砜、DMF、吡啶、二氧六环、甲叉氯化物、四氢呋哺、乙腈、乙酸乙酯或它们的适合混合物可提及。反应温度可选自迄今已知的利于肽键形成的范围，通常选自约-20C至50C的范围。活化的氨基酸衍生物通常以1.5-4倍过量的比例使用。如果利用茚三酮反应通过检验发现缩合不充分，可重复进行缩合反应以达到充分缩合而无须除去保护基。如果重复缩合仍不能提供足够的缩合度，未反应的氨基可用乙酐或乙酰咪唑乙酰化。
用于开始物质氨基酸的氨基保护基包括Z、Boc、三-戊氧羰基、异冰片羰基、4-甲氧苄基羰基、Cl-Z、Br-Z、金钢烷氧羰基、三氟乙酰、苯甲基、甲酰基、2-硝基苯亚氧硫基、二苯基亚磷酸噻吨基或Fmoc。可利用的羧基保护基包括但不限于上述的C1-6烷基、C3-8环烷基和C7-14烷基以及2-金刚烷基、4-硝基苄基、4-甲氧苯甲酰、4-氯苯基、苯酰基、苄氧羰基酰肼基、叔丁氧羰基酰肼基和三苯甲游基酰肼基。
丝氨酸和苏氨酸的羟基可以通过酯化或醚化保护。适于所说的酯化的基团包括碳衍生的基团(如较低的烷酰基团(例如乙酰基等)、芳酰基团(例如苯甲酰基等)、苄氧羰基以及乙氨基羰基。适于所说的醚化的基团包括苄基、四氢吡喃基和叔丁基。
用于酪氨酸的酚羟基的保护性基因包括Bzl、Cl2-Bzl、2-硝基苄基、Br-Z及三-丁基。
用于组氨酸的组咪唑的保护基包括Tos、4-甲氧基-2,3,6-三甲基苯磺酰、DNP、苄氧基甲基、Bum、Boc、Trt和Fmoc。
起始氨基酸的活化的羧基基团包括对应的酸酐、叠氮化物和活化的酯，例如醇(如五氯苯酚、2,4,5-三氯苯酚、2,4-二硝基酚、氰甲基醇、对硝基苯酚、HONB、N-羟丁二酰亚胺、N-羟基苯二甲酰亚胺、HOBt等)酯。开始氨基酸的活化的氨基基团包括对应的六甲基磷酰胺。
用于除去保护性基团的方法包括在催化剂(如钯黑或钯-碳)存在时，利用氢气催化还原；用无水氟化氢、甲磺酸、三氟甲磺酸、三氟乙酸或这类酸的混合物的酸处理；用二异丙基乙胺、三乙胺、哌啶、哌嗪的碱处理；在液态氨中用金属钠还原。利用上述酸处理的消除反应通常可以在-20℃至40C进行，并可加入阳离子受体(如茵香醚、酚、苯甲硫酸、间甲酚、对甲酚、二甲基硫化物、1,4-丁烷二巯基化物、1,2-乙烷二巯基化物)以利于进行。用于保护组氨酸咪唑基的2,4-二硝苯基可通过用苯硫酚处理除去，而用于保护色氨酸吲哚基的甲酰基通过用稀释的氢氧化钠溶液或稀释的氨水的碱处理除去，在1,2-乙烷二疏基化物、1,4-丁烷二巯基化物存在时也可用上述的酸处理除去。
用于保护不该参与起始物质反应的官能团的方法、可利用的保护性基团、除去保护性基团的方法以及活化将参与反应的官能团的方法都可恰当的从已知的基团与方法中选择。
获得酰胺形式的多肽的另一种方法包括首先，酰胺化C端氨基酸的a-羧基，然后，向N端侧延伸肽铁直到达到所要求的链长度，然后有选择地使C端肽的-氨基和将形成目标多肽残基的氨基酸或肽的α-羧基脱保护，并缩合为两种片段，其α-氨基和侧链官能团已用上述的适合保护剂在混合溶剂(如上文描述)中保护。这种缩合反应的参数可与上文描述的相同。
通过缩合获得的保护肽中，所有的保护性基团都可用上述的方法除去以获得所要求的粗制肽。这种粗制肽可通过已知的纯化方法纯化，冷冻干燥主要组分以提供酰胺化的目标多肽。
为获得多肽酯，把C端氨基酸的α-羧基与所需的乙醇缩合以获得氨基酸酯，然后接着进行上述的产生酰胺的过程。
本发明所涉及的多肽还包括为增强多肽活性，以上述发明的多肽为单体所构建或缩合而成的各种形式的多聚体，包括该多肽的二聚体、三聚体等多聚体或者以上述的多肽为单位化学合成支链肽或者以乳胶颗粒、多支链蛋白等颗粒为核心交联成多聚体。
上述的配体多肽或多肽的多聚体或多肽的偶联剂可用作制备抗配体多肽抗体的抗原。作为抗原的多肽包括N-末端肽、C-末端肽或其融合型多肽或融合蛋白的多肽核心部分。抗体的制备方法按照目前已知的常规方法进行。制备抗多肽配体的抗血清一般选用家兔或鸡多其他种属的动物来制备，注射途径一般采用皮下注射的方法。为了延长多肽抗原在动物体内的半寿期或者使多肽抗原在免疫部位缓慢、持续释放以提高抗血清的效价，有时可以添加佐剂来免疫。具体的操作方法参见J.Sambrook和E.F.Fritsch，分子克隆实验指南，冷泉港实验室出版，1989。制备多肽配体的单抗采用常规方法进行。单抗制备一般从超免疫的供体中获取脾细胞，再与带有遗传标记并已适应于组织培养的骨髓瘤细胞融合，然后测定所获得的杂交细胞混合群体分泌所需特异性抗体的能力，最后对单个细胞进行克隆建株。已知的制备单抗的方法包括在下列文献中(1)-(5)描述的方法。
(1)Kohler,G.,Nature,256:495,1975(2)Campbell,A.M.,Monoclonal antibody technology.Laborator techniques in biochemistry andmolecular biology,vol.13,Elsevier,Amsterdam 1984(3)Goding,J.W.,Monoclonal antibodies:Principles and practice,2nd edition.Academic Press,London,1986(4)Kipps,T.J.和L.A.Herzenberg,Schemata for the production of monoclonal antibody-producing hybridomas.In Handbook of experimental immunology:Applications ofimmunological methods in biomedical sciences,4th edition,vol.4,p.108,Blackwell ScientificPublications,Oxford,1986(5)Harlow,E.和D.Lane,Antibodies:Alaboratory manual.Cold Spring Harbor Laboratory,ColdSpring Harbor,New York,1988融合型多肽或融合蛋白分子常用基因克隆的方法构建。将编码该配体多肽的DNA与编码其他蛋白分子或多肽的DNA克隆在同一个表达载体上，使之转录翻译为一个融合蛋白分子。构建融合型蛋白分子的表达载体多种多样，可以是原核表达载体、真核表达载体、酵母表达载体、噬粒表达载体等。下面以构建与噬菌体外壳蛋白gp8融合的融合型多肽为例，说明融合型多肽在没有空间位阻或其他影响多肽活性发挥的情况下，融合型多肽与游离型多肽一样具有相同的生物学活性。
一般采用化学合成法直接合成编码该多肽的DNA以及片断两端与所用表达载体相吻合的限制性核酸内切酶的识别位点序列。按照Felici等人的方法[J.Mol.Biol.,222,301-310]，将合成的单链DNA片断与引物混合，通过退火，在DNA多聚酶的作用下，以合成的单链DNA片断为模板进行延伸，如此获得双链DNA片断。按照Sambrook等人的方法[Sambrook、Fritsch、Maniatis编集、Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989年刊]，将制备的编码外源DNA片断，使用限制性酶通过常规方法切断后，重组入噬粒表达载体或噬菌体衍生载体。
作为可重组的噬粒或噬菌体衍生载体，只要是在宿主细胞内可自我复制并能保持cDNA稳定，在或不在辅助噬菌体的作用下可分泌重组噬菌体，用哪种都可以。作为具体的例子如pC89[J.Mol.Biol.,222,301-310(1991)]、M13East[Biochemistry,34,15430-1535(1995)]、fdH[J.Mol.Biol.,220,821-827(1991)]、M13LP67[Science,249,404-406(1990)]、fUSE5[Science,249,386-390(1990)]等。
外源DNA片断可与编码噬菌体外壳蛋白gpⅧ或者编码外壳蛋白gpⅢ的基因相融合，哪一个都可以，只是外源DNA片断与不同的噬菌体外壳蛋白融合，外源DNA片断所编码的多肽在噬菌体表面所呈现的价数不同。
将外源DNA重组入pC89等噬粒或fUSE5等噬菌体衍生载体后，按照William J.Dower等人的方法[Nucleic Acids Research,16,6127-6145(1988)]利用电穿孔法将重组的噬粒或重组的噬菌体衍生型载体导入大肠杆菌属的宿主细胞中；也可以采用其他的转化方法，例如Sambrook等人[Sambrook、Fritsch、Maniatis编集、Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989年刊]所介绍的磷酸钙沉淀法、脂质转染法等。
通过常规方法将重组的噬粒转入噬菌体的宿主菌——大肠杆菌雄性细菌中，作为噬菌体的宿主细胞可以举出以下一些例子Escherichia coli XL1-Blue、Escherichia coli XL2-Blue、Escherichia coli DH5α、Escherichia coli MC1000、Escherichia coli JM109、Escherichia coliHB101、Escherichia coli K91、Escherichia coli K91Kan、Escherichia coli K91BluKan、Escherichiacoli K802、Escherichia coli NY49、Escherichia coli W3110等。
培养大肠杆菌属的细菌所用的培养基，只要是含有该生物能吸收的碳源、氮源、无机盐类等使重组噬菌体的包装、分泌有效进行的培养基，无论是天然培养基还是合成培养基都可以。
作为碳源，只要是各种微生物能吸收消化的都可以，可以使用葡萄糖、半乳糖、蔗糖、含有这些糖的糖蜜、淀粉或淀粉水解产物等的糖、醋酸、丙酸等有机酸、乙醇、丙醇等醇类。
作为氮源可以使用氨、硫酸氨、醋酸氨、磷酸氨等各种无机酸和有机酸的氨盐、其它的含氮化合物、以及胨、肉汤提取物、酵母提取物、玉米浆、酪蛋白水解物、大豆槽和大豆槽水解物、各种发酵母体和其消化物等。
作为无机物可以使用磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、磷酸镁、硫酸镁、氯化纳、硫酸铁、硫酸锰、硫酸铜、碳酸钙等。
培养是在振荡培养或深部通气搅拌培养等好氧条件下进行。培养温度15～40℃为宜，最好37℃。培养时间通常为5～24小时。培养中pH值保持在3.0～9.0之间。调整pH值可以用无机或有机酸、碱溶液、尿素、碳酸钙、氨等进行。
另外，根据需要，也可以在培养基中添加氨卞青霉素或四环素、卡拉霉素等抗生素。
在培养用诱导性启动子的表达载体转化的细菌时，根据需要在培养基添加诱导剂。例如，在培养使用了lac启动子的表达载体转化的细菌时，可以添加异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)等，而在培养使用了trp启动子的表达载体转化的细菌时，可以添加吲哚乙酸(IAA)等。
如果使用噬粒表达载体，需要加入辅助噬菌体以提供噬菌体的其他外壳蛋白，帮助完成重组噬菌体的包装和分泌。辅助噬菌体是不含抗性或含有卡拉霉素抗性的野生型噬菌体，例如M13KO7、VCSM13、F1IR1等。
将转入重组噬粒的大肠杆菌菌株与辅助噬菌体混合培养，在诱导剂诱导的情况下分泌重组型噬菌体，即在噬菌体外壳蛋白gp8上表面呈现本发明的融合型多肽。
另外，本发明另一方面是与CD95受体蛋白结合的多肽配体的多肽基序(结合模型)。多肽基序是多样性巨大的肽库中能够与CD95受体分子特异性结合的所有多肽序列的共同特征。这些特定位置上的特定类型或种类的氨基酸反映了多肽配体与CD95受体蛋白分子结合所必需的关键性氨基酸，这些特定氨基酸所在的特定位置的空间构象反映了多肽配体与CD95受体蛋白胞外区的活性位点或结合位点相结合的关键性相互作用位点，而其他位置的氨基酸由于出现的频率较小，说明在结合的过程中所起的作用较弱或者为辅助作用，因此，基序中除特定氨基酸在特定位置上以外，其余位置上可以为任意氨基酸残基或其他化学衍生物。任意氨基酸残基包括甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸、组氨酸、赖氨酸、精氨酸、谷氨酸以及一些修饰性氨基酸，如碘代酪氨酸、羟脯氨酸、羟赖氨酸等。实施例有[Motif IDNo:1]和[Motif ID No:2]。
与本发明有关的多肽由于能与细胞表面上的CD95受体蛋白结合诱导细胞发生凋亡或者由于非关键位置的氨基酸位阻作用而使多肽具有阻断凋亡的功能，因而可作为临床药物研制的前体或一种药用组合物，它包含作为活性物质的本发明的DNA分子、本发明的多肽或本发明的抗体。选择性地含有常见药用辅助物质、稀释剂、添加剂和载体。
说明书序列表中的各Motif ID No指下列多肽基序[Motif ID No:1](Y/S)(R/K)KK(Y/S)其中Y/S表示第一位置上不是酪氨酸便是丝氨酸；R/K表示第二个位置上不是精氨酸便是赖氨酸；第3和第4个位置上均为赖氨酸，最后一个位置上不是酪氨酸便是丝氨酸。这种特定氨基酸在特定位置上的排列特征，便是基序。其余位置上(排列组合前后)可以为任意氨基酸。RKX(R/K)其中X表示为任意氨基酸，此多肽基序表示在精氨酸的后面必定为赖氨酸，而赖氨酸的后面可以为任意氨基酸，而在第4位上不是精氨酸便是赖氨酸。其余位置上(排列组合前后)可以为任意氨基酸。
说明书中各SEQ ID No指下列多肽序列[SEQ ID No 1]:EGEFSRKKYDQYADPAK[SEQ ID No 2]:EGEFYKKKSMLQADPAK[SEQ ID No 3]:EGEFYKKKSLQVQDPAK[SEQ ID No 4]:EGEFPRKARVDTSDPAK[SEQ ID No 5]:EGEFYARKIKPTADPAK[SEQ ID No 6]:SRKKYDQYA[SEQ ID No 7]:YKKKSMLQA[SEQ ID No 8]:YKKKSLQVQ[SEQ ID No 9]:PRKARVDTS[SEQ ID No 10]:YARKIKPTA说明书中各SEQDNANo指以下DNA序列[SEQ DNA No 1]:
GAATTCACCCTCAGCGCGTTCTTTATGCTAGTTATACGCCTAGGGCGTTTT[SEQ DNA No 2]:
AATTCACCCTCAGATGTTTTTTTTTAGCTACGACGTTCGCCTAGGGCGTTTT[SEQ DNA No 3]:
AATTCACCCTCAGATGTTTTTTTTCAGAGAAGTTCAGGTCCTAGGGCGTTTT[SEQDNANo4]:
AATTCACCCTCAGGGGCGCATTTCGATCTCAGCTATATGTAGCCTAGGGCGTTTT:
AATTCACCCTCAGATGCGGTCTTTTTAATTCGGGTGGCGCCTAGGGCGTTTT[SEQ DNA No 6]: AGCGCGTTCTTTATGCTAGTTATACGC[SEQ DNA No 7]: GATGTTTTTTTTTAGCTACGACGTTCGC[SEQ DNA No 8]: GATGTTTTTTTTCAGAGAAGTTCAGGTC[SEQ DNA No 9]: GGGCGCATTTCGATCTCAGCTATATGTAGC[SEQ DNA No 10]: ATGCGGTCTTTTTAATTCGGGTGGCGC用下列实施例和附图进一步阐述本发明。
本发明有如下附图附
图1为多肽质谱分析图；附图2为噬菌体克隆对Fas.Fc的特异性结合试验结果示意图；附图3为噬菌体克隆对Jurkat细胞表面天然fas受体的特异结合试验结果示意图；附图4为噬菌体克隆3A8对Jurkat细胞的毒性作用试验结果示意图；附图5为电子显微镜下观察各组细胞的形态变化电镜图；附图6为PI染色检测细胞DNA含量的变化试验结果示意图；附图7为多肽对APO-1与Fas.Fc结合的竞争抑制实验曲线；附图8为多肽P2对Jurkat细胞增殖的影响。
实施例1 化学合成多肽及其质谱检测基于[Motif ID No:1]或[Motif ID No:2]特征的多肽因组合可以产生非常多种多肽序列，以下仅举基于[Motif ID No:1]的一种多肽[SEQ ID No 2]为例，说明多肽可以用以下方法获得。多肽[SEQ ID No 2]的合成采用固相合成法，在ABI公司多肽合成仪上进行。所用的载体树脂是HMP氨基酸树脂，氨基酸的量为1mmol，即氨基酸∶树脂=4∶1。按多肽[SEQ ID No 2]的氨基酸序列，依次序加入各氨基酸的成分进行固相合成。多肽合成后，按照PE公司推荐的步骤，将冰浴后合成物加入处于冰浴条件下的10ml切割液进行切割。将反应后的混合液经G4玻砂漏斗过滤以滤掉树脂，将滤液在常温下低压蒸发至1～2ml，加入50ml预冷后的乙醚沉淀多肽，4℃放置过夜。经G6玻砂漏斗过滤，真空抽干至少3小时，得多肽粗产物。采用SephadexG10柱纯化，用0.1N冰醋酸洗脱，收集第一峰，浓缩、除去酸，用少量水溶解、冷冻干燥得干粉。将合成的多肽[SEQ ID No 2]在质谱检测仪上分析，所得的多肽分子量大小与理论值相近，为1969.84。表明此多肽正是多肽[SEQ ID No 2]。实验结果见附图1。
实施例2 制备融合型多肽1)编码多肽的DNA和引物的合成
DNA合成仪是以固相合成为手段，所用的载体树脂由ABI公司提供，操作步骤按照ABI公司提供的实验手册进行。编码多肽的DNA序列两端各设计成EcoRⅠ和BamHⅠ核酸内切酶的识别序列。以[SEQ ID No 2]多肽的融合型多肽(与噬菌体外壳蛋白gp8融合)为例，详细说明融合型多肽的构建、合成和分泌。编码[SEQ ID No 2]多肽的DNA序列[SEQ DNA No 2]合成时输入的程序如下A5’GCGGGATCCGATGTTTTTTTTTAGCTACGACGTTCGCGAATTCACCCG3’B引物为5’CGGGTGAATTC3’合成完毕后，取下树脂按照ABI公司提供的操作手册进行切割，脱盐采用过OPC柱纯化(OPC柱为ABI公司提供的配套产品)，最后冷冻干燥，得干粉产物DNA A和B。
2)外源DNA片断重组入噬粒表达载体pC89按照Sambrook等人的方法[Sambrook、Fritsch、Maniatis编集、Cold Spring HarborLaboratory Press,1989年刊]，将A和B混合，进行退火，使之碱基互补配对。再在DNA多聚酶KlenowⅠ的作用下，互补链进行延伸、合成，获得双链DNA片断。
按照双链DNA片断用EcoRⅠ和BamHⅠ核酸内切酶进行消化，37℃酶切反应2小时。终止酶切反应后，通过20％聚丙烯酰胺凝胶电泳和Sephadex G50凝胶过滤来纯化。同样对噬粒表达载体进行EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切反应，凝胶电泳分离片断，回收大片断，纯化后备用。
将载体pC89与双链DNA片断混合，于15℃过夜。连接混合物65℃ 5分钟，在经1mlSephadex G50凝胶过滤纯化。
以下是反应示意图退火5’GCGGGATCCGATGTTTTTTTTTAGCTACGACGTTCGCGAATTCACCCG3’3’CTTAAGTGGGC5’↓Klenow DNA聚合酶5’GCGGGATCCGATGTTTTTTTTTAGCTACGACGTTCGCGAATTCACCCG3’←……………CTTAAGTGGGC5’↓EcoRⅠ和BamHⅠ↓↓5’GCGG GATCCGATGTTTTTTTTTAGCTACGACGTTCGCGAATTCACCCG3’CGCCCTAG G………………………………CTTAA GTGGGC5’↓插入载体
3)采用电穿孔方法将重组载体导入大肠杆菌XL1-Blue细菌细胞中。
按照Dower等人的方法[Nucleic Acids Research,16,6127-6145(1988)]，将重组载体与XL1-Blue细胞混合。在BioRad公司的Gene Pulser电穿孔仪上将重组载体导入大肠杆菌XL1-Blue。所用电压2.5kV,25μF(平均每次4.8毫秒)。
3)扩增，感染，培养，获得与噬菌体外壳蛋白gp8融合的多肽[SEQ ID No 2]。
将转入重组载体的XL1-Blue立即重悬于SOC培养基中，37℃培养1小时，再将菌液铺于氨卞抗性的LB平板上，使得每个菌落分隔良好。氨卞抗性的LB平板置37℃过夜，从中挑取单菌落，接种到含50ug/ml氨卞青霉素抗性的LB培养液中，37℃培养，再加入辅助噬菌体进行超感染以获得重组噬菌体培养上清液，滴度大约有1×1010个转化单位/ml。离心培养菌液，取噬菌体培养上清液，加入1/4体积的PEG/NaCl，置4℃过夜。次日离心1hr沉淀噬菌体，弃上清液，加入TBS/NaN3重悬。于70℃孵育20min,17,000g离心15min以除去细菌碎片。将上清液移入新管，加入1/4体积PEG/NaN3，混匀，于4℃静置2hr。17,000g离心30min，加入TBS/NaN3重悬噬菌体。
实施例3 融合型多肽与CD95受体蛋白的结合活性(与Fas.Fc和细胞)按照刘北一等人的方法[免疫学杂志，14,54-55,1998]，将表面呈现本发明的多肽重组型噬菌体克隆用PEG纯化两次，酶联板各孔分别加入各克隆1×1011个噬菌体颗粒，37℃待水分蒸发。加入10％甲醛固定后，PBS-T漂洗，加入Fas.Fc稀释液(CD95受体蛋白分子胞外区和人IgG的Fc段的融合分子)进行结合反应。加入酶标抗体HRP-羊抗人抗体及其底物溶液显色，终止反应后检测OD490nm。各克隆均设有野生型噬菌体阴性对照组和无包被物、无一抗的空白对照。其中，1F4克隆为[SEQ ID No 6]多肽的融合形式；3A8克隆为[SEQ ID No 7]多肽的融合形式；1A1克隆为[SEQ ID No 8]多肽的融合形式；3A4克隆为[SEQ ID No 9]多肽的融合形式；2H10克隆为[SEQ ID No 10]多肽的融合形式；53为野生型噬菌体。实验结果见附图2，实验结果说明融合型多肽能特异性与可溶性CD95受体蛋白分子的胞外区结合。
按照Ghebrehiwet B等人的方法[J.Immunol.,137,618-624(1986)]，取对数生长期的Jurkat细胞(Jurkat细胞为有Fas受体分子表达的细胞株)包被酶联板，再用10％甲醛室温固定10min，洗涤后BSA封闭。洗板后，每孔加入1×1012个纯化的噬菌体颗粒，于37℃ 1hr。PBS-T漂洗后，加入HRP-羊抗M13多抗100μl/孔，于37℃ 1hr。漂洗后，加入底物溶液进行显色，终止反应后在全自动酶联仪上检测OD490nm。实验设立空白对照组，包括各克隆的无细胞包被孔、野生型噬菌体对照孔53以及无噬菌体克隆孔PBS。实验结果见附图3，证实与本发明有关的融合型多肽能特异性与细胞表面表达的天然CD95受体蛋白结合。
实施例4 融合型多太对表达CD95的细胞增殖的抑制作用从这些融合型多肽中任选一个多肽观察融合型多肽对有Fas受体分子表达的细胞增殖的影响(实验选多肽[SEQ ID No 2]作为融合型多肽的代表，Jurkat细胞为有Fas受体分子表达的细胞株)采用3H-TdR掺入法。取对数生长期的Jurkat细胞，接种于96孔细胞培养板，5×104个/孔。随即加入纯化的表面呈现多肽[SEQ ID No 2]的重组噬菌体克隆，1×1012/孔，于37℃培养24hr。各孔加入3H-TdR至终浓度1μCi/ml,37℃继续培养18hr后，用多头细胞收集器将细胞收集在玻璃纤维滤膜上，以蒸馏水充分洗涤、烘干，剪下滤膜放入5ml闪烁液中，在液体闪烁计数仪上测量样品的cpm值。以无噬菌体孔作为空白对照，以野生型噬菌体wt53作为阴性对照。实验结果用三孔平均值表示，见附图4，结果显示与噬菌体外壳蛋白gp8融合的多肽[SEQ ID No 2]可抑制Jurkat细胞的DNA合成，进而抑制Jurkat细胞的增殖，而相同用量的没有外源多肽呈现的野生型噬菌体则对细胞增殖影响不大。
通过电子显微镜观察经融合型多肽3A8处理后的细胞的形态变化。实施例5融合型多肽对表达CD95阳性细胞具有诱导凋亡的作用细胞作如下处理将Jurkat细胞接种于96孔细胞培养板，5×104/孔。加入PEG两次纯化的呈现融合型多肽[SEQ ID No 2]的噬菌体克隆，1×1012/孔，置37℃孵箱培养24hr。没有处理过的细胞为正常组对照。
在电子显微镜下观察各组细胞的形态变化附图5A为正常细胞，可见染色质均匀分布于胞核中。附图5B～D为实验组中凋亡细胞不同时期的形态。附图5B细胞核形态规则，核膜完整，异染色质聚集核膜下，并聚集成块，是死亡早期的变化。附图5C中的细胞染色质聚集成块，核碎裂，线粒体空化。附图5D的细胞外可见有5个有膜包绕的凋亡小体，凋亡小体内可见有核的碎片及部分胞浆。
同时，也可以通过PI染色检测细胞DNA含量的变化，观察是否有凋亡特征峰的出现。按照Asahara H等人的方法[Immunology,92,317-320(1997)]，将处理的细胞洗涤后，用酒精室温固定30min。PBS洗涤细胞后，加入100μl PI染色液，混匀，室温30min。流式细胞仪检测样品的DNA含量。实验对照组为没有外源多肽表面呈现的野生型噬菌体Wt53阴性对照，实验结果见附图6，可见出现了凋亡特征峰。
以上实施例3～5都证实融合型多肽可与CD95受体蛋白分子或细胞表面的CD95膜蛋白受体分子结合，并且通过诱导细胞凋亡来抑制细胞的增殖，发挥细胞毒作用。
实施例6 游离型多肽对Jurkat细胞增殖的影响以基于多肽基序[Motif ID No:1]的多肽[SEQ ID No 2]为例，说明游离型多肽对表达CD95阳性细胞的细胞增殖具有抑制作用。采用3H-TdR掺入法，观察它对Jurkat细胞增殖的影响。结果见附图7，结果说明化学合成的游离型多肽[SEQ ID No 2]可抑制Jurkat细胞的DNA合成，进而抑制Jurkat细胞的增殖。多肽[SEQ ID No 2]对细胞增殖的抑制作用随多肽剂量的增加而加强。
由于多肽序列的相似性，可以与鉴于多肽[SEQ ID No 2]相似的多太通过与CD95结合可能同样具有诱导细胞凋亡的作用或者与CD95结合占据CD95L对CD95的结合位点阻断细胞凋亡的发生。因此，这些融合型多肽和游离型多肽对表达CD95的阳性细胞凋亡具有调节作用，可用于临床药物的研制。
实施例7 游离型多肽对抗人CD95的诱导型单抗Apo-1与Fas.Fc结合的竞争抑制实验以0.05μg/ml的Fas.Fc包被96孔酶联板。次日弃包被液，PBS-T漂洗两次备用。用PBS连续10倍稀释合成多肽[SEQ ID No 2]，取50μl各个稀释度的多肽[SEQ ID No 2]加入上述酶联板中，另取一孔加入50μl PBS作为无多肽空白对照孔，均于4℃过夜。酶联板不经漂洗，直接加入50μl抗Fas单抗Apo-1(50ng/ml)，于37℃孵育1hr，加入羊抗鼠IgG-HRP(1∶1000,50μl/孔)，于37℃孵育1hr，加入底物显色，测定OD490nm。以无多肽空白对照孔OD值作为基准，计算不同合成多肽[SEQ ID No 2]加入量对Apo-1与Fas.Fc结合的竞争性抑制率。
抑制率百分率=(ODC-ODP)/ODC*100％ODC空白对照孔；ODP多肽实验孔实验结果见附图8，结果说明合成多肽P2能与Fas.Fc在液相中结合，并可抑制Fas与Apo-1的结合，且呈剂量效应关系，在100μg/ml时，抑制率为36.6％。
权利要求
1．一种配体多肽，是与CD95结合的多肽，并含有[Motif ID No:1]或[Motif ID No:2]的多肽基序特征的多肽或与其实质上等同的序列代表的氨基酸序列或其部分肽，或其酰胺或酯或其盐的多肽。
2．如权利要求1所述的与CD95结合的多肽，包括游离型多肽、融合型多肽和嵌合型多肽以及以多肽为单体的各种形式的聚合体，即包括了含有[Motif ID No:1]或[Motif ID No:2]特征多肽基序的氨基酸序列特点的蛋白质分子、嵌合蛋白分子或聚合体。
3．如权利要求1所述的与CD95结合的多肽，包括与可溶性Fas分子、Fas.Fc及含有Fas蛋白分子胞外区或者CD95胞外区的活性位点或结合位点的各种融合型分子和嵌合分子以及细胞膜表面膜蛋白受体分子Fas,Fas又名CD95、APO-1，它们均是指同一个蛋白分子。
4．如权利要求1所述的多肽基序，其特征为除此基序中特定氨基酸排布外，其余位置上为任意氨基酸残基或其他化学衍生物。任意氨基酸残基包括甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸、组氨酸、赖氨酸、精氨酸、谷氨酸以及一些修饰性氨基酸，如碘代酪氨酸、羟脯氨酸、羟赖氨酸等。
5．如权利要求2所述的多肽，包括多肽的多聚体或多肽的偶联剂。
6．一种DNA，该DNA包含具有编码权利要求1或2所要求的多肽的DNA。
7．一种抗体，该抗体所针对的抗原为权利要求1或2所述的多肽或者权利要求5所述的多肽多聚体或其偶联剂。该抗体包括抗血清或单抗。
8．一种检测试剂，含有权利要求1-5的多肽序列或权利要求6的DNA序列的CD95分子检测试剂。
9．权利要求1或权利要求2或权利要求4或权利要求5作为前体或药用组合物在制备治疗与CD95系统功能失调有关的疾病的药剂上的应用。
10．权利要求8的药用组合物用于制备诊断与CD95系统功能失调有关的疾病的药剂上的应用。
全文摘要
本发明涉及与人细胞膜表面膜蛋白分子CD95结合的多肽基序(motif,又称多肽结合模型)及其多肽,以及编码这些多肽的DNA序列。这些多肽通过与CD95胞外区结合,诱导或阻断人体内CD9文档编号C07K16/18GK1313338SQ0110720
公开日2001年9月19日 申请日期2001年2月26日 优先权日2001年2月26日
发明者李华, 邹强朱, 锡华 申请人:中国人民解放军第三军医大学