专利名称：鞘氨基醇碱衍生物和其用途的利记博彩app
技术领域：
本发明涉及局部施用领域，特别是鞘氨基醇碱(sphingoidbase)衍生物的局部施用。
背景技术：
鞘氨基醇碱如鞘氨醇公知是皮肤细胞分化和增殖有效的效应器，通过干扰基本的生物化学细胞过程来进行(Hannun，Y.A.和Bell，R.M.(1989)，Science 243，500-507)。例如，游离的鞘氨醇抑制蛋白激酶C的活性，从而在信号转导和细胞分裂调节中起关键作用(Hannun，Y.A.等人(1986)，J.Biol.Chem.261，12604-12609)。游离鞘氨醇的作用在表皮细胞增殖的调节中是重要因素，以便平衡细胞由皮肤表面损失的速率(Downing，D.T.(1992)J.Lipid Res.，33，301-313)。此外，已经介绍了鞘氨基醇碱其它的生物活性，例如抗菌活性(Bibel，D.E.等人.(1992)，J.Invest.Dermatol.98，269-273)。
由于它们对皮肤细胞分化和增殖的作用和抗菌活性，鞘氨基醇碱可以作为活性成分包含在各种化妆组合物中。例如，已经介绍鞘氨醇适于治疗有关皮肤的各种异常和疾病，例如干皮病、皮肤干燥症和牛皮癣。鞘氨醇也可保护皮肤抵抗各种有害的或者不希望的作用，例如UV光和皮肤老化作用。尤其，鞘氨基醇碱已经被包括在局疗组合物中作为抗炎剂或抗菌剂(WO98/49999)。
鞘氨基醇碱的缺点是在含水环境中它们的难溶性。这种现象妨碍了这些化合物在含水制剂的使用。例如，为了显示有效的抗菌活性，使鞘氨基醇碱溶于含水制剂是重要的。
发明描述本发明公开了鞘氨基醇碱的衍生物，它们比其游离碱对应物具有显著升高的在水中的溶解度。因而，这些鞘氨基醇碱衍生物当其制备成含水组合物质时显示令人惊奇地改善的功效，本发明的鞘氨基醇碱衍生是鞘氨基醇碱的盐。
按照本发明，鞘氨基醇碱的盐的阴离子源自任何适当的酸。在那方面，适当的酸定义为一种酸，它在适当溶剂中与鞘氨基醇碱一起混合，产生一种在含水介质具有升高的溶解度的盐，与鞘氨基醇碱本身的溶解度相比较而言。
在本发明的一项实施方案中，这种酸是一种本身在局部施用中可具有疗效的酸。
在本发明的一项实施方案中，该酸是一种能够释放鞘氨基醇碱至化妆或药物组合物的水相的亲水酸。
优选地，该酸是亲水有机酸，例如α-羟基链烷酸、β-羟基链烷酸、α，β-二羟基链烷酸、链烷二酸或无机酸。亲水有机酸更优选的例子是乳酸、羟基乙酸(glycolic acid)、苹果酸、丙酮酸、琥珀酸、富马酸、柠檬酸、抗坏血酸、葡糖酸和/或焦谷氨酸(吡咯烷酮羧酸)。更优选的无机酸的例子是盐酸、硝酸和/或磷酸。
在本发明的另一项实施方案中，该酸是亲脂有机酸，这样以致于与鞘氨基醇碱的组合提高了亲脂酸以及鞘氨基醇碱的疗效。
本发明的鞘氨基醇碱可如下制备。在适当的有机溶剂中溶解鞘氨基醇碱，其中加入至少一当量的适当的酸。通常，酸的加入会导致pH下降至少大约3个单位。可以理解，pH的最终值会取决于采用的酸。鞘氨基醇碱在有机溶剂中的溶解优选在升高的温度产生，例如50℃至70℃。冷却混合物时，鞘氨基醇碱盐会沉淀。通过过滤和可任选以溶剂洗涤，优选与制备盐所用相同的溶剂，从反应混合物中回收结晶沉淀物。
适合的有机溶剂优选其中最终产物，即鞘氨基醇碱盐是不溶的溶剂。适合的有机溶剂，例如是乙醇或甲基异丁基酮。
在本发明的一项实施方案中，鞘氨基醇碱盐用作另一鞘氨基醇碱盐制备的原料化合物。
本发明的鞘氨基醇碱盐在它们使用之前制备是必要的，例如它们包含在局部组合物中。额外含有以上定义的一种或多种酸的阴离子的局部组合物中游离鞘氨基醇碱的包含物不会引起溶解度升高和/或疗效增高。
本发明的鞘氨基醇碱盐优选为鞘氨基醇碱鞘氨醇、二氢鞘氨醇或植物鞘氨醇的盐。更优选地，鞘氨基醇碱盐是植物鞘氨醇盐。
在本发明的一项实施方案中，经微生物发酵得到植物鞘氨醇。例如，植物鞘氨醇由Pichia ciferrii衍生的四乙酰基-植物鞘氨醇(TAPS)，通过适合的脱乙酰基反应得到。脱乙酰基作用可以是化学的，例如通过以氢氧化钾碱催化的水解，或者酶解。在TAPS的碱水解之后，可纯化所得的植物鞘氨醇。这样的纯化可通过本领域熟练技术人员公知的任何方法进行。酵母-衍生的植物鞘氨醇是人皮肤等同的，它被报道具有如哺乳动物植物鞘氨醇同样的立体化学构型，即，D-D-赤构型。
本发明的鞘氨基醇碱盐在含水环境中具有的溶解度显著高于游离鞘氨基醇碱的溶解度。通过本发明进一步令人惊奇地显示，与游离鞘氨基醇碱相比，鞘氨基醇碱盐具有增加的疗效，甚至在游离鞘氨基醇碱也是溶解形式的环境中也如此。游离鞘氨基醇碱在附加存在有机溶剂的含水介质和表面活性化合物时可以是溶解形式。
按照本发明包含鞘氨基醇碱衍生物的组合物适用于局部施用，这里局部施用理解成包含在皮肤、头发和口、鼻、眼、泌尿生殖道等等的上皮衬里上的化妆和/或皮肤病学应用。
本发明的鞘氨基醇碱衍生物优选以0.001至5重量％浓度掺入局部组合物中，优选0.005至5重量％，更优选0.01至2.5重量％，最优选0.02至1重量％，特别优选0.02至0.5重量％。
按照本发明包括鞘氨基醇碱衍生物的局部组合物特别适用于各种与炎症和/或微生物活性有关的局部发生的不希望和/或异常的症状。
本发明的包含鞘氨基醇碱衍生物的局部组合物可有利的应用的、局部发生不希望的和/或异常症状的例子是湿疹、牛皮癣、特异性皮炎、痤疮、皮脂溢性皮炎、口和/或唇感染、霉菌病、各种其它的皮肤感染疾病或阴道感染。包含所述鞘氨基醇碱衍生物的局部组合物进一步有益地作用于伤口愈合例如烧伤情形下，以及皮肤菌群的正常化。
由于它们的抗菌活性，本发明的鞘氨基醇碱衍生物在化妆和皮肤病学组合物中还可以起防腐剂的作用，以减小和/或取代已有的化学防腐剂。
实施例1PS.乳酸盐的制备
50克植物鞘氨醇和500ml无水乙醇的混合物搅拌并加热至65℃。接着以纸滤器趁热过滤该几乎澄清的溶液至1升3-颈烧瓶中。
(L)-乳酸(25.7g)搅拌时逐部分地加入滤液中，以将pH从9.9降至5.3，同时温度从66℃上升至71℃。混合物搅拌并冷却。大约45℃时开始结晶，同时持续冷却3/4小时至21℃。
滤出沉淀，滤饼以150ml乙醇置换(快速过滤和置换，总计2分钟)。
湿滤饼(110.8g)真空干燥产生51.2克的产品。NMR分析纯度为99.3％。
实施例2PS.羟乙酸盐的制备50克植物鞘氨醇和500ml无水乙醇的混合物搅拌并加热至65℃。接着以纸滤器趁热过滤该几乎澄清的溶液至1升3-颈烧瓶中。以20ml的热乙醇冲洗。滤液又加热至65℃。
羟乙酸(13.4g)搅拌时逐部分地加入滤液中，以将pH从9.9降至5.6，同时温度从65℃上升至68℃。混合物搅拌并冷却。大约66℃时开始结晶，同时冷却持续20分钟至25℃。
滤出沉淀，滤饼以150ml乙醇置换(快速过滤和置换，总计3分钟)。
湿滤饼(87g)真空干燥过夜产生56.6克的产品。NMR分析纯度为98.6％。
实施例3PS.盐酸盐的制备50克植物鞘氨醇和500ml无水乙醇的混合物搅拌并加热至65℃。接着以纸滤器趁热过滤该几乎澄清的溶液至1升3-颈烧瓶中。以20ml的热乙醇冲洗。
盐酸(36％，大约13ml)搅拌时加入滤液中，以将pH从10.3降至大约0，同时温度从45℃上升至50℃。混合物搅拌并冷却。在加入晶种之后34℃时开始结晶并持续冷却0.5小时至10℃。
滤出沉淀，滤饼以100ml冷乙醇置换(缓慢过滤和置换，总计3/4小时)。
湿滤饼(272g)真空干燥产生48.0克的产品。NMR分析纯度为96.7％。
实施例4PS.焦谷氨酸盐的制备25克植物鞘氨醇、200ml甲基异丁基酮(MIK)和2ml水的悬浮液搅拌并加热至66℃。
接着加入12克DL-焦谷氨酸，将pH从9.4变为5.8。
得到玻璃状沉淀物。在45℃采用经刮擦开始结晶的1ml样品。这用于在进一步冷却期间给混合物作为晶种。
下一步，混合物进一步冷却至17℃并以玻璃G3滤器过滤，以50ml新鲜MIK(快速过滤)冲洗/置换。湿滤饼(57g)真空干燥产生34.3克产品。
实施例5PS.柠檬酸盐的制备25克植物鞘氨醇、200ml甲基异丁基酮(MIK)和1ml水的悬浮液搅拌并加热至72℃。
下一步加入18克柠檬酸一水合物，将pH从9.4变为1.8。
得到沉淀物。下一步混合物冷却至14℃并以玻璃G3滤器过滤，以50ml新鲜MIK(快速过滤)冲洗/置换。湿滤饼(84g)真空干燥产生39.7克产品。NMR分析纯度为96.4％。
实施例6PS对酵母的抗菌活性采用两种不同的酵母菌株酿酒酵母ATCC 9763和白色念珠菌ATCC 10231。或者在30℃(酿酒酵母)或者37℃(白色念珠菌)进行所有培养。两种酵母菌株在YEPD2％培养基生长(20g/l葡萄糖，10g/l蛋白胨，20g/l酵母提取物，pH＝6.0)。培养物生长过液，通过离心采集50μl培养物中的细胞，以1ml无菌缓冲液(10mM HEPES(pH＝7.2，用NaOH)+20g/l葡萄糖)洗涤、离心和在0.5ml的无菌缓冲液中再悬浮。
在一种溶剂体系，它由1体积分数乙醇、2体积分数吐温20和17体积分数50％的甘油水溶液组成，制备植物鞘氨醇(PS)10mg/ml的备用液。以这种顺序，将该溶剂体系的成分加入植物鞘氨醇中，每次加入之后有力地振动溶液。当所有的溶剂都已加入，混合物加热至40℃达15至30分钟。在5％的乙醇水溶液制备备用液的稀释物(如果需要)。使用之前的24小时制备所有溶液，并保持在室温。
采用LIVE/DEAD酵母寿命试剂盒L-7009(Molecular ProbesInc.，Oregon，USA)研究植物鞘氨醇对这两种酵母的抗真菌作用。这种试剂盒采用两种不同的荧光染料，FUN-1TM和CalcofluorTM白色M2R，以在活的和死亡细胞之间显示区别，这可以采用具有适当滤光器的荧光显微镜观察。
对于这种分析，下列量的荧光染料加入0.5ml酵母细胞的无菌缓冲液悬浮液中，如前所述进行制备1μl FUN-1TM和2.5μlCalcofluorTM白色M2R。混合之后，这些悬浮液培养30分钟。接着加入50μl植物鞘氨醇备用液的适当稀释液，以得到如
图1a和1b显示的最终浓度。混合之后，培养这些悬浮液，活的和死亡细胞的分数随时间而变化。
0lympus BHB荧光显微镜用于显微观察，它具有两种不同的滤光装置1.分色镜蓝色(B)，激发滤器IF490，发射滤器0530(活的细胞在细胞中显示橙色颗粒，而死亡细胞均匀地着绿色/橙色)。
2.分色镜紫罗兰色(V)，激发滤器U95-B93，发射滤器Y455(活的细胞显示蓝色细胞壁，而死亡细胞并不显示)。
结果如图1a和1b所示。它清楚地表明，两种酵母菌株都以剂量依赖性形式被植物鞘氨醇(PS)杀死。
实施例7PS对饥饿细胞的抗真菌作用在其天然生活环境，大多数时间微生物细胞是饥饿状态。这提示我们研究PS的抗菌作用是否也显然抑制饥饿细胞。
为此目的，稍微修正实施例6介绍的方法(所有方法和条件是相同的除非特别说明)。通过离心由白色念珠菌ATCC 10231的过夜培养物收集细胞。采用两种不同的缓冲液以洗涤和重悬浮细胞如实施例6中使用的10mM HEPES(pH＝7.2，用NaOH)+20g/l葡萄糖，以及不含葡萄糖的相同缓冲液。
两种细胞悬浮液，含和不合葡萄糖(每个均为2.5ml)，在37℃培养10分钟。接着加入125μl植物鞘氨醇备用液的适当稀释物，得到图2所示的最终浓度。混合之后，进一步培养这些悬浮液，并且在显示的时间点，采100μl样品。细胞通过离心收集，细胞在含葡萄糖的100μl缓冲液中再悬浮，荧光染料的浓度与实施例6相同。这种分析混合物培养10分钟以上，以使染料分布入细胞，如实施例6所述的确定活的和死亡细胞的数量。
如图2所示，饥饿细胞对PS的抗真菌作用比饱餐的细胞更敏感。事实上，最初的迟滞期之后，250mg/l PS证明在杀死饥饿细胞上与500mg/l一样有效。迟滞期大概由于存在细胞内生能量贮备，这又显示PS对饥饿状态特别有效。
实施例8琼脂扩散试验中化妆品制剂内PS的抗菌作用以类似于实施例6介绍的方法制备金黄色葡萄球菌ATCC 14458的过夜培养物(BHI培养基(Difco)，37℃培养)。
为了扩散试验制备琼脂板，300ml的BHI培养基，和加入的1％琼脂及15％甘油，熔化并冷却至50℃。接着加入6ml无菌葡萄糖溶液(50％w/v)和6ml微生物的过夜培养物。皮氏培养皿填充入12.5ml的琼脂培养基，让培养基固化。
测试的制剂如图6所示制备，脂相为辛基十二烷基乳酸酯。它含有1，2或5g/l PS。
为了将试样加至试验板，不锈钢环(6mm内径)置入空的无菌皮氏培养皿。在此环内，放入2张圆纸片(6mm直径)以覆盖底部，50μl的试验制剂置入滤片上。环放在含有微生物的琼脂板的表面上，在表内显示的时期内琼脂板在5℃贮藏，以允许试验溶液的扩散，之后撤走环。随后，琼脂板在适合微生物生长的温度培养(37℃)。在微生物完全生长在琼脂板非抑制区之后，测量抑制程度，作为非生长(或减少生长)区，它由施用区域在两个直角方向延伸。
表1.化妆品制剂中PS的抗菌作用
这里给出的两个附图，第一个指非生长区，而第二个指减少生长区。
如表1显示的，存在PS剂量依赖性生长抑制。
实施例9PS和其部分衍生物的抗真菌作用已经发现部分植物鞘氨醇衍生物在含水体系中具有改善的溶解度。这提示我们将它们的抗菌活性与PS本身的抗菌活性比较。研究下列衍生物植物鞘氨醇的羟基乙酸、乳酸和盐酸盐。如实施例6就植物鞘氨醇介绍的方法制备植物鞘氨醇盐的备用液，并采用同样的实施条件。
发现试验的所有三种盐具有比游离碱具有的更强的抗真菌活性。这不归因于盐溶液中存在的阴离子，由于含适当量的乳酸盐、盐酸盐或羟基乙酸盐的空白组无作用(图3a)。在图3b中，可看出盐酸盐的效力是PS碱的效力的2.5倍以上。
实施例10PS及其部分衍生物在无溶剂体系中的抗真菌作用以类似于溶剂体系介绍的方法(实施例6)在去离子水中制备溶液，包括最后的加热步骤。
在图4a中可发现在样品制备期间溶剂的缺乏几乎消除了游离PS碱的抗真菌作用，而PS盐的效力并未减少。事实上，发现PS盐的效力在无溶剂体系甚至可以更高，如图4b和4c所示。
实施例11PS对细菌的抗菌作用采用两种不同的细菌菌株金黄色葡萄球菌ATCC 14458和大肠杆菌421.在37℃进行所有的培养。两种细菌如实施例8介绍的方法进行生长，通过离心收集50μl培养物，以1ml无菌去离子水洗涤，并在0.5ml无菌去离子水中重悬浮。
如前介绍的制备10mg/ml PS备用液。以5％乙醇水溶液制备这种备用液的稀释物(如果需要)。在使用之前24小时制备所有溶液，保持在室温。
采用LIVE/DEADBacLightTM细菌寿命试剂盒L-7012(MolecularProbes Inc.，Oregon，USA)研究植物鞘氨醇对这两种细菌的抗菌作用。这种试剂盒采用两种不同的荧光染料，SYTO9染料和propidium碘化物，以在活的和死亡细胞之间显示区别，这可以采用具有适当滤光器的荧光显微镜观察。
试剂盒提供的染料的溶液就在使用前1∶1混合，1.5μl的荧光染料混合物加入0.5ml的细菌悬浮液中。随后，加入50μl的植物鞘氨醇备用液的适当稀释物，以得到图5显示的最终浓度。混合之后，培养这些悬浮液，活的和死亡细胞的分数随时间而变化。
采用Olympus BHB荧光显微镜进行显微检测，它具有下列的滤光装置分色镜蓝色(B)，激发滤器IF490，发射滤器0530(活的细胞是绿色，而死亡细胞是橙色/黄色)。
发现金黄色葡萄球菌被强烈杀死。然而，这种作用并未量化，由于死亡细胞归因为溶解而不可检测以荧光染料的测量需要死亡细胞保持结构完整。因此，致死作用显然仅仅强烈减小活细胞数量。
大肠杆菌细胞也被有效杀死，在这种有机体中死亡细胞可以很容易量化(图5)。它显示细胞由PS以剂量依赖性方式杀死，这种细菌对该化合物比真菌更敏感。
实施例12PS衍生物在扩散试验中的抗菌和抗真菌作用指定试验的有机体的过夜培养物如实施例6和8介绍的方法制备，样品如实施例8介绍的涂布到试验板上。样品由如以前介绍制备的备用液制备成适当的稀释物。琼脂板在5℃贮藏过夜，以在试验溶液中扩散，之后撤走点样环。随后，琼脂板在适合微生物生长的温度培养(37℃)。在微生物在琼脂板非抑制区完全生长之后，测量抑制程度，作为非生长(或减少生长)区，它由施用区域在两个直角方向延伸(以mm计)。
表2.PS-衍生物在琼脂扩散试验中的抗细菌和抗真菌作用
*标记有星号的数据指抑制生长区；未标记数据指无生长区。
表2显示PS衍生物在扩散试验中具有完全地抗细菌和真菌活性，此作用具有明显的剂量依赖性。
权利要求
1.一种鞘氨基醇碱衍生物，它是鞘氨基醇碱的盐。
2.权利要求1的鞘氨基醇碱衍生物，其中盐的阴离子源自亲水性酸。
3.权利要求2的鞘氨基醇碱衍生物，其中亲水性酸是亲水性有机酸或无机酸。
4.权利要求3的鞘氨基醇碱衍生物，其中亲水性酸选自乳酸、羟基乙酸、苹果酸、丙酮酸、琥珀酸、富马酸、柠檬酸、抗坏血酸、葡糖酸和焦谷氨酸。
5.权利要求3的鞘氨基醇碱衍生物，其中亲水性酸选自乳酸、羟基乙酸、焦谷氨酸、柠檬酸和盐酸。
6.一种制备权利要求1的鞘氨基醇碱衍生物的方法，该方法包含加入至少一当量的酸至适当的溶剂内的鞘氨基醇碱溶液中，并从反应混合物中回收结晶的鞘氨基醇碱盐。
7.权利要求6的方法，其中的溶剂是乙醇或甲基异丁基酮。
8.局部施用的组合物，它包含权利要求1的鞘氨基醇碱衍生物。
9.权利要求8的组合物，它是一种化妆品组合物。
10.权利要求8或9的组合物，它包含浓度为0.001至5wt％的鞘氨基醇碱衍生物，优选0.005至5wt％，更优选0.01至2.5wt％，最优选0.02至1wt％，特别优选0.02至0.5wt％。
11.用作药物的按照权利要求1的鞘氨基醇碱衍生物。
12.按照权利要求1的鞘氨基醇碱衍生物在制备用于抗菌和/或抗炎治疗的药物中的应用。
全文摘要
本发明公开了鞘氨基醇碱衍生物,它是鞘氨基醇碱的盐。这些盐在含水环境具有显著升高的溶解度,并在局部施用的组合物中显示增强的疗效。
文档编号C07C215/10GK1360567SQ00807004
公开日2002年7月24日 申请日期2000年3月9日 优先权日1999年3月9日
发明者H·斯特里克斯特拉, P·G·维伯 申请人:科斯莫弗姆有限公司