抗cd3免疫毒素及其治疗用途的利记博彩app

专利名称：抗cd3免疫毒素及其治疗用途的利记博彩app
技术领域：
本发明涉及包含CD3结合域和假单胞菌外毒素A突变体的重组免疫毒素。
每个成熟T细胞表面是由α和β(或者γ和δ)多肽链的异二聚体组成的T细胞受体(TCR)分子。每个细胞上有约30000个TCRαβ异二聚体，它们与抗原呈递细胞表上(APC)的主要组织相容性复合体(MHC)衔接，导致所有功能性T细胞种类对抗原的识别。TCRαβ异二聚体本身并不涉及TCR与特定MHC-肽抗原复合体衔接后的信号传导。实际情况是，此功能是由与所有外周T细胞和成熟胸腺细胞表面的TCRαβ或TCRγδ异二聚体稳定结合的蛋白复合体即CD3复合体完成的。人CD3复合体通常包含四种不同的链γ、δ、ε和ζ，共六种多肽。三种不同的二聚体组成CD3复合体(γε、ζε和ζζ)，[Kishimoto等(Eds.)，《白细胞分类VI》(Leukocyte Typing VI)，Garland出版公司，(1998)44]。CD3蛋白对细胞表面T细胞受体链的表达是绝对必要的。缺失任何TCR链或者CD3复合体的γ、ε或δ链的突变体都不能在细胞表面表达任何TCR复合体[Janeway和Travers，《免疫学》(Immunobiology)。健康和疾病状态下的免疫系统，第4章(“T淋巴细胞的抗原识别”)，当代生物学有限公司London and Garland出版有限公司，纽约(1996)]。
当APC向静息的T淋巴细胞传递两种信号时，发生抗原特异性T细胞活化和克隆扩增。第一个信号给免疫反应赋予特异性，在识别在MHC环境中呈递的抗原肽后通过TCR介导。通过TCR的最适宜的信号传导需要TCR与辅助受体CD4或CD8的聚集。继而引起胞液中的酪氨酸激酶与TCR和CD3的胞浆尾端以及CD45的结合增加。CD3ε和ζ的胞浆区的磷酸化导致其与酪氨酸激酶的结合，引发一系列细胞内的反应，导致T细胞的增殖和分化。第二信号被称为“共刺激”信号，它既不是抗原特异性的也不是MHC限制性的，它由APG表达的一个或多个不同的表面分子提供的[Janeway和Travers，同上第4-28页]。T细胞接受抗原特异性信号和共刺激信号后活化，这可包括T细胞增殖和细胞因子分泌。抗原和共刺激信号的结合诱导原初T细胞表达IL-2和IL-2受体。IL-2诱导原初T细胞的克隆增殖，并使它的子代细胞分化成效应T细胞，效应T细胞能够合成行使辅助、炎症和细胞毒性T细胞等的特化功能所需要的所有蛋白，参见，例如Janeway和Travers，同上§§7-8，7-9。
上述的获得性免疫机制是器官移植成功的主要障碍。当把包含有核细胞的组织从供体向移植物接受者移植时，接受者体内T细胞对移植物中典型的高多态性MHC分子的反应几乎总是引发T细胞介导的即刻抗移植器官的反应。有效的免疫抑制剂如环胞素A和FK-506的抑制T细胞活化的应用已使移植物的存活率明显增加，但这同时伴有某些缺点，包括移植物接受者终生对药物的依赖。
寻找针对接受器官移植或患T细胞介导的免疫性疾病的患者的更好的免疫抑制方法已经成为移植领域长期的目标。此领域工作者的具体目标是开发能在患者体内诱导供体特异的免疫耐受的治疗剂，使患者摆脱对免疫抑制剂的持续依赖。
术语“免疫耐受”是指受到诱发耐受的抗原攻击的患者的免疫系统的无应答状态。具体地，在移植情况下它指移植物接受者发动免疫反应的能力受到抑制，否则，移植物中非自身MHC抗原输注到接受者体内可引起免疫反应。免疫耐受的诱发涉及体液机制、细胞机制或两者兼有。
在用供体细胞进行骨髓移植以前，全身或整个淋巴系统用射线照射，通过嵌合方式动物模型和人体可获得系统的供体特异性的免疫耐受[Nikolic和Sykes，《免疫学研究》(Immunol.Res.)16217-228(1997)]。然而，迫切需要在不使用射线照射时也可产生多细胞系混合的同种异体稳定嵌合体和长时间供体特异耐受的同种异体骨髓移植的调节方法。血液异常包括地中海贫血和镰刀状细胞病、自身免疫疾病和几种类型的酶缺乏疾病已经不使用骨髓移植策略，因为建立完全同种异体骨髓重建体的调节方法可导致与此相关的某些疾病的发生。不涉及射线照射的调节方法可以很明显地扩大骨髓移植对非恶性疾病的应用范围。
包含与毒素连接的抗体的免疫毒素已被推荐用于器官移植排斥的预防和治疗和免疫耐受的诱导。例如，一种直接针对恒河猴CD3ε的化学结合的白喉免疫毒素，即FN18-DT390，已经用于灵长类同种异体移植耐受模型和灵长类胰岛异种移植模型[Knechtle等，《移植》(Transplantation)631(1997)；Neyille等，《免疫治疗杂志》(J.Immunother.)1985(1996)；Thomas等，《移植》64124(1997)；Contreras等，《移植》651159-1169(1998)]。另外，化学偶联的假单胞菌免疫毒素，LMB-1B3(Lys)-PE38，已经用于临床实验治疗严重的实体肿瘤[Pai和Pastan，Curr.Top.Microbiol.Immunol.23483-96(1998)]。然而，产物异质性是化学结合的免疫毒素所面临的明显的实际困难。
包含抗CD3抗体UCHT-1的可变区和白喉毒素的单链重组免疫毒素，已经推荐作为治疗剂(WO96/32137，WO98/39363)。然而，对普通人群进行的早期抗白喉接种引起人们对业已存在的抗体对许多患者体内毒素的作用的关心。另外，包含与PE38连接的抗Tac的重组免疫毒素也被推荐作为抗器官移植和自身免疫病的预防和治疗剂[Mavroudis等，《骨髓移植》(Bone Marrow Transplant.)17793(1996)]。
人们的目标是获得对T细胞有高水平的定向毒性作用的重组免疫毒素，从而对移植排斥的预防和治疗、免疫耐受的诱导、以及移植物抗宿主疾病(GVHD)、自身免疫病和其它T细胞介导的疾病的预防和治疗提供改进。
提供一种免疫毒素，在正常情况下，接受者不存在针对它的抗体，这也是人们的目标。
目前，我们已发现CD3结合域和假单胞菌外毒素A突变体的重组融合提供了一种具有有效抗T细胞作用的免疫毒素。本发明的免疫毒素能改善对下列疾病的临床治疗和预防，这些疾病是移植物排斥、移植物抗宿主疾病(GVHD)、T细胞介导的自身免疫病、T细胞白血病、或携带CD3表位的淋巴瘤、获得性免疫缺陷综合症(AIDS)和其它T细胞介导的疾病或病症。
本发明指向包含CD3结合域和假单胞菌外毒素A成分的分离的重组免疫毒素和它们可药用盐；用免疫毒素或它们可药用盐治疗和预防器官移植排斥和移植物抗宿主疾病、和诱导免疫耐受、以及治疗或预防自身免疫疾病、AIDS和其它T细胞介导的免疫疾病、和T细胞白血病或淋巴瘤的体内和离体方法；和包含该新的免疫毒素或它们的可药用盐的药物组合物。
本发明也涉及作为主题重组免疫毒素制备过程中的中间物质的多核苷酸和生理功能相同的多肽；包含所述多核苷酸的重组表达载体、原核和真核表达系统和用所述表达系统合成免疫毒素的方法；和纯化本发明的免疫毒素的方法。
具体地，本发明涉及新的重组免疫毒素scFv(UCHT-1)-PE38，它是小鼠抗人CD3单克隆抗体，UCHT-1，的单链(“sc”)Fv片段与绿脓假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)外毒素A的截短的片段，即PE38，融合形成的。例如，我们已发现上述scFv(UCHT-1)-PE38在体外对T细胞的杀伤是高效的；并且，我们也进一步发现该免疫毒素在人CD3ε转基因小鼠体内能以剂量依赖方式高水平消除小鼠CD3/人CD3双阳性T细胞。
1.CD3结合域术语“CD3结合域”是指能与哺乳动物，更优选灵长类，甚至更优选人的T细胞或淋巴细胞上的CD3抗原结合或以其它关式关联的氨基酸序列。
本发明免疫毒素的CD3结合域优选抗CD3多克隆或单克隆抗体，更优选单克隆抗CD3抗体。甚至更优选抗CD3抗体是能与人CD3ε链上的表位或由人CD3ε链和γ链形成的表位结合的单克隆抗体。
此处所用术语“抗体”包括完整的免疫球蛋白和各种形式已修饰过或改变了的抗体，包括抗体的片段，如Fv片段，由二硫键连接的Fv片段，或Fab或(Fab)’2片段，单链抗体，和保持亲代抗体的抗原结合功能和特异性的其它片段。抗体可以是动物(尤其是小鼠或大鼠)或人来源的，或是嵌合的或人源化的。能与CD3抗原，尤其是人CD3抗原特异结合的抗体可以用杂交瘤制备，杂交瘤可以用人们熟知的来源于Kohler和Milstein[《自然》(Nature)256495-97(1975)]工作的方法制成。本领域熟知抗体的“重”或“轻”链有N末端可变区(V)和C末端恒定区(C)。可变区是抗体分子中结合与抗体有关联的抗原的部分，而恒定区决定抗体的效应功能。免疫球蛋白全长或抗体的重链包含大约116个氨基酸的可变区和大约350个氨基酸的恒定区。免疫球蛋白全长或抗体的轻链包含一个大约110个氨基酸的N末端可变区，和大约110个氨基酸的COOH末端恒定区。重链可变区被称作VH而轻链可变区被称作VL。典型的VL包括VL和J1(即结合区)基因片段编码的轻链部分[Sakans等，《自然》280288-294(1979)]，VH包括由VH、DH(即多变区)和JH基因片段编码的重链部分[Early等，《细胞》(Cell)19981-92(1980)]。VH和VL片段一起被称为Fv。完整抗体的Fv区是VH和VL域的异二聚体(即在不同链上包含VH和VL域)。
上述“(Fab)2”术语是指抗体的二价片段，包括铰链区和重链、轻链的可变区和第一个恒定区，它可通过胃蛋白酶消化天然的抗体分子产生，或通过重组方式产生。术语“Fab”是指抗体的单价片段，包括重链和轻链的可变区和第一个恒定区，可通过(Fab’)2片段的二硫键桥还原产生，或通过重组方式产生。
本领域熟知，免疫球蛋白轻链或重链可变区包含三个高变区，也称为互补决定区(CDR’s)，其侧翼有四个相对保守的“构架区”(FR’s)。轻链和重链构成的组合构架区起到定位和对齐CDR’s的作用。CDR’s主要负责结合抗原表位，并且典型地称为CDR1、CDR2和CDR3，从可变区链的N末端开始顺序编号。构架区同样编号。许多构架区和CDR’s已有描述[Kabat和Wu，有免疫学兴趣的蛋白质序列，美国Government PrintingOffice，NIH出版号91-3242(1991)]。CDR和FR多肽片段是基于对已存在的抗体或编码这些抗体的DNA的Fv区的序列分析凭经验确定的。通过对感兴趣的抗体序列和在Kabath和Wu和它处公布的抗体序列进行比对，可以确定抗体或其它感兴趣的CD3结合域的构架区和CDRs。
“嵌合的”一般指基因工程抗体，其包含来自一个以上的天然抗体的序列。在嵌合抗体的一个实例中，构架和CDRs是不同来源的，比如，非人的可变区连接到人的恒定区上。作为它们的亚类，“人源化”抗体应通常被理解为包含这样一种抗体，其中，把非人CDRs整合到至少一部分是人源的构架区中。
本文所用“单链抗体”术语(或术语“单链免疫毒素”)是指CD3结合域在单个多肽链上的一种分子。单链抗体的典型的制备方法是确定和分离结合的抗体的每个重链和轻链的结合域，然后，提供允许保持结合功能的连接部分。这样，大体本质上形成了在一条多肽链上仅存在结合抗原所必需的那部分可变区的大大简短的抗体。制备单链抗体的方法在美国4,946,778，中有描述，其并入此文作为参考。
根据本发明的单链免疫毒素包含这样一种单链抗体片段。毒素成分优选与CD3结合域融合，任选通过一个连接肽进行，但它也可以作为单独的多肽链存在，通过一个或多个二硫键与包含CD3结合域的链连接。
本发明的免疫毒素可以是“单价的”，它是指免疫毒素的多肽链上包含一个CD3结合域(例如，一种抗体的VH和VL结合在一起的可变区)。
本发明的免疫毒素也可以是“二价的”，它是指免疫毒素包含二个CD3结合域。这两个抗原结合区可位于单独的一条链上，或位于二条或多条由二硫键连接或由于吸引力(例如氢键)而紧密关联的链上。当两个CD3结合域位于一条多肽链上时，它们可以以串联形式存在(即在链中前后连续存在，通过肽键或接头连接在一起)，或者被插入的PE突变体或其它的功能区分开。
依赖不同的表达系统，通过和其它的单链(或双链)分子形成链间二硫键，或通过域与它们的配偶体之间的固有亲和力，单链抗体(或单链免疫毒素)可以在表达后多聚化。这些链可形成同型二聚体或异型二聚体。
本发明免疫毒素的CD3结合部分优选“重组”抗体。同样，本发明的免疫毒素是“重组的”免疫毒素。术语“重组的”理解为抗体(或免疫毒素)是由基因工程产生的核酸(例如DNA)片段在细胞中合成的。术语“分离的”是指多肽已离开它的天然环境。在本发明中，在重组宿主细胞中产生和/或包含的多肽被认为是分离的。也存在“分离的多肽”的称谓，它是指已经部分或基本上从重组宿主细胞中纯化的多肽本发明免疫毒素的CD3结合部分优选为单链(“sc”)抗体。本发明免疫毒素优选单价的。
最优选的情况是本发明的CD3结合部分包含抗体的单链Fv区(或它们的CD3结合片段)，即，其中VH区(或它们的CD3结合部分)与VL区(或它们的CD3结合部分)融合，任选通过连接肽融合。
VL区优选通过它的羧基端与VH区的氨基端连接；或者，VH区通过它的羧基端与VL区的氨基端连接。
优选连接VL和VH区的任何连接肽允许CD3结合域独立的折叠和保持活性；没有产生可能干扰CD3结合域或在患者体内引起免疫反应的有序二级结构的倾向，并且存在可能与CD3结合域相互作用的最小的疏水性或电荷特征。
连接肽优选含有1-500个氨基酸；更优选含有1-250个氨基酸；甚至更优化仅含有1-100个(例如，约1-25或10-20个)氨基酸。
对于上述每种优选情况，优选的连接肽是线性的。
通常，包含甘氨酸、丙氨酸和丝氨酸的连接肽可以期望满足此类肽的标准。例如，在scFv(UCHT-1)-PE38中，连接VL域的羧基末端和VH域氨基末端的连接肽，是[GGGS]4(SEQ ID NO5)。
其全部或片段适合用作本发明CD3结合域的特异抗-CD3抗体的实例是(1)UCHT-1[Beverley和Callard，《欧洲免疫学杂志》(Eur.J.Immunol.)11329(1981)；Burns等，《免疫学杂志》(J.Immunol.)1291451(1982)]，它的scFv序列包括在SEQ ID NO2中。UCHT-1是有IgGl，κ同种型的小鼠抗人单克隆抗CD3抗体。此抗体与胸腺、骨髓、外周淋巴组织和血液中的T细胞反应。完整的抗体可从Biomeda(分类号为K009，V1035)或Coulter公司购得。可变区包含本发明SEQ ID NO2的第3-112(轻链)和128-249(重链)位残基。UCHT-1作为Fv片段是非活化的，并且已经用作融合成分与抗HER2双特异性免疫结合物融合，使T细胞靶向人乳腺和卵巢肿瘤细胞[Shalaby等，《实验医学杂志》(J.Exp.Med.)175217(1992)]。
(2)SP34(由Beth Israel Deaconess医院的C.Terhorst第一次分离)，可以与灵长类和人的CD3反应。SP34与UCHT-1和BC-3不同在于，SP34识别仅存在于CD3ε链上的表位(参见Salmeron等，《免疫学杂志》(1991)1473047)，而UCHT-1和BC-3识别由ε和γ链共同形成的表位。该完整的抗体可以从Pharmingen购得。
(3)BC-3(Fred Hutchinson癌症研究所)(用于GvHD的I/II期实验)[Anasetti等，《移植》54844(1992)]。
对CD3抗原有特异的亲和力并且至少有一些来源于人的序列的其它单克隆抗体被认为是在上述抗体的类似物范围内。这些抗体包括(1)有与例如UCHT-1(或SP34或BC3)一致的CDRs，并且含有至少一个来源于人的至少5个氨基酸的序列片段的单克隆抗体；和(2)单克隆抗体，其与例如UCHT-1竞争结合至少约80％的人CD3抗原，更优化的情况是至少约90％的人CD3抗原，在摩尔水平上与UCHT-1同样有效，并且，至少含有5个人源氨基酸的至少一个序列片段。“特异的结合亲和力”是指通过结合分子表面非共价相互作用如疏水键、盐键和氢键确定的结合力。除非另有说明，对双分子反应，“特异的结合力”指至少约106升/摩尔的结合常数。
有与例如UCHT-1基本同源的CDRs的本发明抗体也在本发明的范围之内，并且能通过体外突变产生。能插入恒定区或可变区中并能基本保持此同系物的亲和力和特异性的突变是那些导致保守氨基酸替代的那些突变例如本领域人员熟知的。对于UCHT-1，这些突变形式的抗体优选含有与UCHT-1的可变区至少80％相同、更优选至少90％相同的可变区。甚至更优选这类突变形式的抗体的每一个CDRs与UCHT-1的相应CDR至少80％、更优选至少90％或至少95％相同。
在实践方面，任何特定的多肽序列与另一个至少80％、90％或95％多肽“相同”可用已知的计算机程序如Bestfit程序(Wisconsin序列分析包，Version 8 for Unix，Genetics Computer Group，UniversityResearch Park，575 Science Drive，Madison，Wis.53711)常规确定。根据本发明，当用Bestfit或任何其它对照程序确定一特定序列是否与参考序列例如95％相同时，当然，参数的设置使得序列的相同百分比是对参考氨基酸序列的全长计算的，并且允许同源性断缺区达参考序列中氨基酸残基总数的5％。
在优选实施方案中本发明的CD3结合部分识别由ε和γ链共同形成的人CD3表位，且该结合部分优选为UCHT-1，更优选为UCHT-1的Fv区(或它们的CD3结合片段)。CD3结合部分甚至更优选为UCHT-1的一个单链片段，最优选为UCHT-1的单链Fv区(或它们的CD3结合片段)。
已发现UCHT-1的Fv区当作为单链重构并与缺失了细胞结合区的绿脓假单胞菌外毒素A片段融合时，其在标准体外检测和体内人CD3ε杂合转基因小鼠中表现高效的T细胞杀伤作用。
2.假单胞菌毒素成分假单胞菌毒素A(下文称PE)是一种极具活性的单体蛋白，含613个氨基酸(分子量为66Kd)，由绿脓假单胞菌分泌，该蛋白通过催化延伸因子2的ADP核糖基化(即催化氧化NAD上的ADP核糖基部分转移到EF-2分子上)，使延伸因子2(EF-2)，一种必需的真核翻译因子失活，从而抑制真核细胞中的蛋白合成[Kreitan和Pastan《血液》(Blood)83426(1994)]。成熟多肽的氨基酸序列呈现在本发明的SEQ ID NO3中，通常，在它之前有25个氨基酸残基的信号序列，这个信号肽呈现在SEQ ID NO4中。
在天然PE中有三个结构明显不同的域，它们协调作用，促进细胞毒性(US4892827，US5696237和US5863745，全部纳入本发明作为参考)。域Ia，在氨基端(通常指定在SEQ ID NO3的第1-约252个残基)，介导细胞的靶向和结合作用。域II(在SEQ ID NO3的第253-364个残基之间)，负责转运穿越细胞膜进入细胞质中；域III(在SEQ ID NO3的第405-613个残基之间)介导延伸因子2的ADP核糖基化，导致该蛋白失活和细胞死亡。域III包含羧基末端序列(REDLK)(SEQ ID NO6)，它指导内吞和加工后的毒素进入胞浆内质网。当域Ib(在SEQ ID NO3的第365-404个残基之间)与域III协同作用时，此域第365-380残基的删减不会引起活性的丧失。
本发明免疫毒素的“PE突变体”或“PE成分”是天然PE的突变体形式，其具有转运和催化(即ADP-核糖基化)功能，但细胞结合能力已基本消除或缺失。已发现细胞结合域Ia全部或基本上全部的破坏或缺失可相当大程度地降低天然PE的细胞结合能力和非特异的毒性。例如，域Ia的缺失产生40kDa的蛋白，PE40，尽管它仍分别保持了域II和的域III的转运和ADP核糖基化功能(Kondo等，《生物化学杂志》(J.Biol.Chem.)，2639470-9475(1988))，但它自身已没有了细胞毒性。
PE38是PE的一个38kDa的片段，基本上不含成熟PE蛋白的域Ia(例如，缺乏SEQ ID NO3的第1-250位氨基酸)，也不含SEQ ID NO3的第365-380位之间的氨基酸残基，所以具有包含SEQ ID NO3第的251-364和381-613位的氨基酸序列(参见SEQ ID NO2的255-601残基)。参见例如，US5,608,039，col.10，II.1-20(其中的PE是指截短的毒素，其由天然PE的253-364位和381-613位氨基酸残基组成)。其优点是PE38不存在天然蛋白第372和379位的半胱氨酸残基，否则它们在复性过程中可能和其它半胱氨酸形成二硫键，导致无活性嵌合毒素的形成。
本发明多肽的PE毒素成分包含与SEQ ID NO2第255-601残基所确定的序列至少90％，更优选至少95％，甚至更优选至少99％相同的蛋白。术语“相同”具有前面指定的含义。
除了毒素羧基末端从原来序列REDLK(SEQ ID NO6)变为KDEL(SEQID NO8)外，PE38KDEL具有上述PE38的氨基酸序列。
为增加融合蛋白针对靶细胞的细胞毒性，或减少针对无相应CD3抗原的细胞的非特异性细胞毒作用，可以对PE进行其它的删减或改变，或附加一个接头，如IgG恒定区，给PE连接一个抗体。与使用天然PE分子或在域II进行无显著缺失的PE分子相比，删减PE域II氨基末端的一部分可增加细胞毒活性。其它的修饰包括重组PE分子适当羧基末端序列以辅助此分子转运至靶细胞胞质中。已发现有效的氨基酸序列包括REDLK(SEQ ID NO6)(在天然PE中存在)、REDL(SEQ ID NO7)或KDEL(SEQ ID NO8)(在上面讨论的PE38KDEL中存在)，或这些序列的重复，或其它能使蛋白保持进入内质网中或循环使其进入内质网的序列，参见US5,489,525，其纳入作参考。其它突变体可以包含单个氨基酸的替代(例如，在第590和606位用谷氨酰胺替代赖氨酸)。
将识别部分插入PE的域III的其它PE突变体在US5,458,878中有描述，该文献纳入作参考。
3.免疫毒素的构建此发明包括CD3结合域与一个或多个假单胞菌突变体的融合；也包括包含两个或多个CD3结合域和至少一个PE突变体的免疫毒素的融合物。
此处所用术语“融合的”或“融合物”指这样一些多肽，其中(i)“第一多肽域”在它的羧基末端通过化学键(即肽键)与“第二多肽域”的氨基末端结合，任选通过肽连接物结合，或相反，其中(ii)(i)中的“第二多肽域”在它的羧基末端通过化学键(即肽键)与(i)的“第一多肽域”的氨基末端结合，任选通过肽连接物结合。
同样地，当“融合的”的使用同本发明的多核苷酸中间物相联系时是指编码第一功能域的核苷酸序列的3’-[或，相反5’-]末端与编码第二功能域的核苷酸序列的相应的5’-[或，相反3’-]末端或者直接通过化学键(即共价键)或间接通过核苷酸序列连接物结合，这个核苷酸序列连接物本身在其末端通过化学键(即共价键)与第一功能域的编码核苷酸序列和第二功能域的编码核苷酸序列连接。
参与融合的其它肽序列可以从全长或截短的人蛋白(如其可溶性胞外片段)中选择。这些肽序列的实例包括人免疫球蛋白蛋白域、来自人血清其它蛋白的域、或能被多聚化的其它域[Kostelny等，《免疫学杂志》1481547-1553(1992)；WO 93/11162；Pack和Pluckthun，《生物化学》(Biochemistry)311579-1584(1992)；Hu等，《癌症研究》(Can.Res.)563055-3061(1996)；WO94/09817；Pack等，《分子生物学杂志》(J.Mol.Biol.)24628-34(1995)]。所述其它功能域也可作为肽连接物，例如，连接CD3抗原结合域与PE成分；或所述其它域可以位于融合分子任何部位，例如，在它们的氨基端或羧基端。
在本发明的优选实施方案中，抗CD3抗体的Fv单链与截短的PE片段融合，此PE片段具有转运和催化功能但基本没有细胞结合能力。
识别CD3抗原的抗体结合区优选插入替代PE分子缺失的域Ia。所以，在本发明的各种不同实施方案中，优选CD3结合部分通过它的羧基末端(任选通过肽连接物或其它功能域)与PE毒素成分的氨基末端连接。
或者，PE毒素成分可通过羧基末端与CD3结合部分的氨基末端连接(也任选通过肽连接物或其它功能域)。
如果一条单链上存在多个CD3结合域，那么这些CD3结合域可以通过肽键或接头串联连接在一起，否则便通过插入的PE成分或其它的功能区彼此分隔。
任何连接CD3结合域和PE成分的肽连接物优选能使CD3结合域独立折叠和保持活性；没有产生可能干扰CD3结合域或在患者体内引起免疫反应的有序二级结构的倾向，并且存在可能与CD3结合域相互作用的最小的疏水性或电荷特征。该连接物优选为1-500个氨基酸；更优选为1-250个氨基酸；甚至更优选仅1-100(例如，1-25、1-10、1-7或1-4)个氨基酸。
对于上述每种优选情况，优选的肽连接物是线性的。
通常，连接CD3结合域和PE成分的包含小分子量无电荷氨基酸的肽连接物可期望符合这样的肽连接物的标准。例如，在sc(UCHT-1)-PE38中的肽连接物是赖氨酸-丙氨酸-丝氨酸-甘氨酸-甘氨酸(KASGG)(SEQ ID NO9)。各种长度和序列组合的其它肽也可利用。
本发明的免疫毒素最优选是单链多肽，其包含通过羧基末端，任选通过肽连接物与PE38的氨基末端融合的UCHT-1的Fv区(或其CD3结合片段)。
sc Fv(UCHT-1)-PE38是600个氨基酸的蛋白，预计分子量为64，563道尔顿(64.5KD)。
应指出的是在正常情况下Met提供给编码序列以起始从大肠杆菌(E.coli)的转录，由于对Met的不完全切割，上述分子的大肠杆菌的实际翻译产物可能包括一个N末端附加的甲硫氨酸(Met)残基。另外，根据实施例1制备的sc Fv(UCHT-1)-PE38多肽可能包含在N末端或在2位上(即甲硫氨酸之后)添加的丙氨酸(ALa)，丙氨酸作为添加在N末端的序列便于克隆。UCHT-1轻链可变区的成熟氨基末端在SEQ ID NO2的第3位即天冬氨酸(Asp)开始。因此，根据使用的表达菌株和准确的发酵和纯化条件的不同，根据实施例1制备的分子的大肠杆菌表达可产生下列一种或多种功能相同的产物由SEQ ID NO1第1-1803个核苷酸编码的具有SEQ ID NO2第1-601位序列的多肽；由SEQ ID NO1第4-1803个核苷酸编码的具有SEQ ID NO2第2-601位序列的多肽；和由SEQ ID NO1第7-1803个核苷酸编码的具有SEQ ID NO2第3-601位序列的多肽。
应该了解，本文所用的术语“sc Fv(UCHT-1)-PE38”包含这种形式的任何蛋白(或相应的核酸)，除非另有说明。
本发明也包括这样多肽，它们与具有SEQ ID NO2序列的多肽至少80％相同，更优选至少90％相同，甚至更优选至少95％相同，其中，术语“相同”具有前述的含义。
某些免疫毒素分子可以通过多肽链上的域之间的吸引力或通过半胱氨酸残基之间形成的二硫键“二聚化”。例如，二聚体可以由二个多肽链形成，或由二对链形成。二聚体可以是同源二聚体或异源二聚体(异源二聚体的一个实例是PE毒素只存在于二条链中的一条链上的结构)。根据本发明的某些二价单链免疫毒素结构或二聚化的结构，在

图1中说明。在图1A、C、D、E和F中展示的二聚化的免疫毒素结构包含二个(或多个)链。在图1B中展示的结构是二价的单链免疫毒素。在1E中展示的分子是与毒素连接的重组制备的全长抗体。图1F的结构是与毒素连接的重组制备的F(ab’)2片段(即包含二对链的二聚体)。在图1展示的结构中PE毒素优选是PE38，并且抗体的可变域来自UCHT-1。
具体地，本发明二聚体免疫毒素的第一个说明性实施方案是双倍体(diabody)，其在图1A中展示。“双倍体”是指包括二个(优选相同的)单链的免疫毒素结构，每个链包含VL和VH区及PE突变毒素，上述链由于可变区之间的吸引力(例如，氢键，未在图1A中显示)而不是二硫键而相互结合。图1A展示一对具有构型VL-L-VH-PE突变毒素的单链。
与单链免疫毒素对比，为防止链内Fv的形成，在双倍体的每个多肽链中，优选VL和VH域之间的接头L基本是刚性的，并且通常不多于10个氨基酸，更优选不多于1-5个氨基酸，如接头的实例(Gly)4Ser(SEQID NO10)所示，并甚至可以完全不存在。(相反，在单链免疫毒素的VL和VH之间的接头优选至少约14个氨基酸)。所以，双倍体中功能性的Fv区实际上是通过二个链的相互作用形成的。双倍体可以从哺乳动物细胞和大肠杆菌表达。双倍体的结构总体上已由Hollinger等[美国国家科学院院刊(Proc.Nat.Acad.Sci.)906444(1993)]和Wu等[Immunotech 221(1996)]描述。
在本发明的另一个说明性的实施方案中，串联的单链结构，象在图1B中展示的，包含二个连续连接的抗CD3 Fv区，即它们通过肽键或任选可弯曲的肽接头连接。图1B展示结构的构型为VL-L-VH-X-VL-L-VH-Y-毒素，其中，X和Y可从肽键或接头中独立选择。具体地，L可以是接头，即(GGGS)4(SEQ ID NO5)，并且每个X和Y可以有如sc Fv(UCHT-1)-PE38的“连接物”序列(即KASGG，SEQ ID NO9)一样的序列。与sc Fv(UCHT-1)-PE38结构相同，二个Fv区中的每一个Fv区的VL和VH域都被可弯曲的肽接头分开(在图1B和图1C和D中通过连接每个VL和VH域的环线显示)，此肽接头优选包含大约10-30氨基酸，更优选包含大约14-25个氨基酸。在图1B展示的结构中的二个Fv区优选都是抗CD3结合域。所以，在一个实施方案中，Fv区可结合CD3的同一个表位，甚至Fv区可以是相同的(或为促进表达或抑制重组可以修饰每个区或它的编码核苷酸序列)；或可以选择每个Fv与人CD3抗原上的不同表位结合。本发明的PE毒素成分可与Fv区中的一个Fv区的羧基或氨基端(任选通过插入的接头或功能序列)连接。(或者，多PE毒素片段也可以出现在该分子中)。在图1B中，PE序列与Fv区之一的羧基末端连接。
在串联的单链抗体分子中抗原结合区可以与不同的抗原结合，使此分子具备“双特异性”，这由Gruber等[《免疫学杂志》1525368(1994)]、Kurcucz和Segal[《免疫学杂志》1544576(1995)]和Mallender等[《生物化学杂志》(J.Biol.Chem.)269199(1994)]Mack等[美国国家科学院院刊927021(1995)]进行了总体描述。
本发明的另一个结构是从二个多肽链制备的，每一个多肽链包含通过结合力(例如，氢键)而不是二硫键促进链之间二聚化的“二聚化区”。(在此提到的结合力在图1C中以园点表示，图1D中也是如此)。在图1C中每个二聚化区用一对星号表示，其可以位于链内部，例如，在Fv区和PE毒素成分之间(见图示)；另一方面，二聚化区可以位于Fv区的N末端(未显示)；另一方面，二聚化区还可以位于PE毒素的C末端(未显示)。在图1C中显示的结构每条链有构型VL-L-VH-二聚化区-PE突变毒素。二聚化区由Pack和Pluckthun[《生物化学》311579(1992)]和Kostelny等，同上，进行了总体描述。适合的二聚化区可来自异源二聚体转录因子或两性螺旋，并且可在哺乳动物细胞和大肠杆菌中表达。
根据本发明的另一个二聚化结构是从单链免疫毒素制备的，该单链免疫毒素包含Ig的铰链区和第三个恒定区(“CH3”)，它们是通过二硫键的形成和CH3片段之间的吸引力进行二聚化的。
如在图1D中展示的，本发明的“微体”(Minibody)-毒素包括二个(例如，相同的)单链，每个单链包含一个Fv区，其通过铰链区(“H”)和CH3，例如人IgG1的CH3和PE毒素部分连接。在图1D中每一个浅影的椭圆代表铰链区和CH3区。所以，每个链有构型VL－L－VH－H＋(H3-PE突变毒素。多肽链通过各自的铰链和CH3区之间的二硫键(在图1D、1E和F中粗线代表)和结合力(园点代表)连接。(在图1D中有一个改变了的结构称为“微体-毒素”，其通过把铰链区中通常与天然抗体的重链和轻链配对的半胱氨酸替换为例如丝氨酸或丙氨酸，并使在铰链区剩余的与重链结合的二个半胱氨酸保持完整来进行突变，以防止半胱氨酸的错误配对)。
其它的变体则利用来自其它同型免疫球蛋白或其它类型哺乳动物如小鼠的IgG’s的铰链区。“微体”已由Hu等在《癌症研究》563055(1996)中进行了总体描述。
本发明另一个说明性的结构包括通过重链(图1E左图)或轻链的(图1E右图)C末端与根据本发明的PE突变毒素融合的重组抗体。象天然抗体一样，链与链之间通过二硫键连接(连接链之间的粗线)。上述全长抗体毒素通常成对二聚化。在此结构中，非-huFcγ-受体结合Ig，如鼠IgG2b或人IgG4可以替代天然Fc。任选地，重链和轻链中都存在PE毒素成分(未显示)。
根据本发明的另一个结构包含重组制备的F(ab’)2片段(包括指出的铰链区)，它通过重链(图1F左图)或轻链(图1F右图)(任选通过接头，未显示)的羧基端与PE毒素连接。所述F(ab’)2毒素分子通常成对地二聚化。(图1F中的浅影椭圆代表重链的恒定区(“CH”)或轻链的恒定区(“Cκ”))。该多肽链的铰链区来自恒定区的以二硫键连接的连接物，冠以“铰链”的标记。所以，各自的链具有构型VL-Cκ和VH-CH-铰链-PE毒素(图1F，左侧)，或VL-Cκ-PE毒素和VH-CH1-铰链(图1F，右侧)。
上述结构可从已知的起始材料通过本领域技术人员已知的重组工程技术制备。
本发明也旨在包括多肽的同系物(和编码所述多肽的DNA分子)，它们和公开的各种类多肽不同的在于，例如，在基本上不影响CD3结合能力或免疫毒素的催化活性的情况下，它们对整个公开多肽中的氨基酸有保守的替代，或进行残基的微小删减或添加。
“保守的替代”是指一个或多个氨基酸由其它的有相似特性的氨基酸替代，以致多肽化学领域的技术人员可以预测至少该多肽二级结构，优选三级结构基本不改变。保守的替代一般在侧链有关系的氨基酸家族中进行。典型的氨基酸替换包括丙氨酸或缬氨酸替代甘氨酸，天冬酰胺替代谷氨酰胺，丝氨酸替代苏氨酸和精氨酸替代赖氨酸。
在此公开的各类免疫毒素的同系物也在本发明的范围内。
术语“同系物”或“同源性”是指二个肽或二个核酸分子之间的序列相似性。同源性能通过比较可能为了比较的目的而对比的每个序列中的位置而确定。当比较序列中的一个位置被相同的碱基或氨基酸占据时，那么在那个位置上这些分子的同源的。序列之间的同源性程度是序列共有的匹配或同源位置数的函数。
优选地，本发明中各种免疫毒素多肽的任何同系物至少80％，优选至少90％，更优选至少95％与所述本发明免疫毒素多肽相同。
本发明的多肽的所有氨基酸(除甘氨酸外)优选为天然存在的L-氨基酸。
分离的编码本发明重组免疫毒素多肽和它们的同系物的多核苷酸(例如cDNA)也在本发明的范围内，这些多核苷酸尤其是编码具有SEQ ID NO2第1-601、2-601或3-601个残基的sc(UCHT-1)-PE38，或至少有100个(优选至少200个)氨基酸的sc(UCHT-1)-PE38片段的多核苷酸。
本发明不仅包括在SEQ ID NO1中显示的核酸，而且包括分离的编码SEQ ID NO2的多肽或它们的片段的核酸，其序列由于遗传密码的简并性而不同于SEQ ID NO1显示的核苷酸序列；本发明也包括前述核酸的互补链。
另一方面，本发明提供如下多核苷酸(优选至少具有300个碱基(核苷酸)，更优选至少具有600个碱基，甚至更优选至少具有900个碱基)，该多核苷酸可与编码本发明多肽，如SEQ ID NO2的多肽的多核苷酸杂交。所述杂交反应可以在低或高严紧的条件下进行。
适当的促进DNA杂交的严紧条件(例如，用6.0×氯化钠/硝酸钠(SSC)在大约45℃杂交，然后用2.0×SSC在50℃洗涤)对本领域的技术人员是熟知的或能在“当代分子生物学实验手册”John Wiley和Sons，N.Y.(1989)，6.3.1-6.3.6.中找到。例如，洗涤步骤中的盐浓度可从大约2.0×SSC、50℃的低严紧条件到0.2×SSC，50℃的高严紧条件选择。除此之外，洗涤步骤中的温度可从大约22℃的室温(RT)的低严紧条件增加到大约65℃的高严紧条件。术语“严紧杂交条件”是指在包含50％甲酰胺，5×SSC，750mM NaCl，75mM柠檬酸三钠，50mM磷酸钠(PH7.6)，5×Denhardt’s溶液，10％硫酸葡聚糖，和20μg/ml变性的剪切鲑鱼精子DNA的溶液中42℃孵育过夜，然后在约65℃ 0.1×SSC中洗涤滤膜。
“分离的”多核苷酸是指已离开它们的天然环境的核酸分子，DNA或RNA。例如，为了本发明的目的，包含在载体中的重组DNA分子被认为是分离的。分离的DNA分子的进一步实例包括在异源宿主细胞中的重组DNA分子或溶液中(部分或基本)纯化的DNA分子。分离的RNA分子包括本发明DNA分子的体内体外RNA转录本。根据本发明的分离核酸分子进一步包括合成产生的这类分子。
本发明也包括编码本发明的肽连接物和/或接头的分离的寡核苷酸。应该把这些寡核苷酸和编码CD3结合域和PE成分的多核苷酸“在阅读框中融合”，并且，优选该分子中包含独特限制位点。
“在阅读框中融合”是指(1)在CD3结合域或PE成分的阅读框中没有由接头寡核苷酸引起的移码；并且(2)在CD3结合域和PE成分的阅读框之间无翻译终止。
本发明进一步包含本发明新融合多肽的生理功能相同的蛋白，其是该新多肽合成过程中的中间物。术语“生理功能相同的”是指包括本发明融合多肽的更大分子，此更大分子已经添加了例如本发明的成熟重组融合蛋白从特定的宿主细胞中有效表达和分泌所必需或期望的氨基酸序列。这种添加的序列典型地存在于成熟蛋白的氨基末端，并且，通常构成前导(即信号)序列，指导蛋白进入分泌途径，且在正常情况下，在蛋白从细胞分泌的同时或之前从蛋白中被剪切下来。信号序列可来自相关蛋白的天然N末端区，或者从编码分泌蛋白的宿主基因获得，或者来自已知可增加目的多肽分泌的任何序列，包括合成的序列和“前”和“原”区之间的所有组合。信号序列和编码成熟蛋白的序列之间的接合部应该与在宿主内的剪切部位相对应。
在本发明的多肽中，CD3结合域引导表达，即在融合分子中处于其它编码序列的上游，所以，利用信号序列有效地获得从哺乳动物系统(如CHO，COS)，或酵母(例如，P.pastoris)的表达可能是可行的。然而，附加的信号序列不一定是天然免疫球蛋白链的信号序列，它可以从任何适合的来源获得，只要它适合实现成熟多肽从特定宿主细胞的表达/分泌。
在本发明蛋白的氨基或羧基末端附加便于纯化的其它序列被认为是本发明的部分。这些序列的实例包括为在镍亲和树脂上纯化的多组氨酸标记和为抗c-myc或血凝素(HA)抗体所识别的肽序列。这类肽“标记”对本领域的技术人员是熟知的。
在PE毒素成分引导表达的本发明免疫毒素多肽中，适合的前导序列可能包含天然PE外毒素A前导序列(SFQ ID NO4)，以完成成熟的异源多肽从大肠杆菌、哺乳动物细胞(例如，CHO，COS)或酵母的分泌。然而，其它的前导序列，它们对PE或宿主细胞不一定是天然存在的，也可以提供在某些宿主中的成熟融合蛋白的有效表达。
4.制备本发明重组免疫毒素的一般方法a. 制备产生来自抗体的CD3结合部分克隆一个或多个抗体区域的一般策略从提取杂交瘤中的RNA开始，然后用随机六聚体作引物进行RNA反转录。
具体地，为克隆抗体的Fv片段，每个VH和VL域都通过多聚酶链或反应(PCR)扩增。重链序列能用根据重链的氨基末端蛋白序列设计的5’末端引物和根据共有的免疫球蛋白恒定区序列设计的3’引物扩增(Kabat和Wu，同上)。轻链Fv区用根据抗体轻链的氨基末端蛋白序列设计的5’末端引物和C-kappa引物扩增。尽管本领域的技术人员将了解可以从本文提供的序列表中获得其它适合的引物，但分离UCHT-1的Fv区的适合引物在实施例1中已经提到。
将粗PCR产物亚克隆到适当的克隆载体中。鉴定通过DNA限制性消化包含正确大小插入片段的克隆。用靠近克隆位点的测序引物从双链质粒DNA测定重链或轻链编码区的核酸序列。商业供应的试剂盒(例如，Sequenase试剂盒，美国生物化学公司，Cleveland Ohio，美国)可用于方便测定DNA的序列。
人们也可以理解，给定本发明公开的序列信息，利用熟知的方法本领域普通的技术人员可以轻易制备编码这些序列的核酸。所以，编码Fv区的DNA可以通过任何适当的方法制备，这些方法包括如扩增技术如连接酶链式反应(LCR)和维持自身的序列复制，适当序列的克隆和限制性消化，或直接化学合成，如通过磷酸三脂法、磷酸二脂法、二乙基亚磷酰胺法和固体支持法的化学合成。化学合成产生单链寡聚核苷酸。这可以通过与互补序列杂交或通过用单链作模板、用DNA酶进行聚合反应转化成双链DNA。尽管有可能化学合成整个单链Fv区，但优选合成大量短序列(大约100-150个碱基)，然后将它们连接在一起。或者，克隆亚序列，然后用适当的限制酶剪切适当的亚序列。然后连接各片段产生所要的DNA序列。
一旦获得Fv可变的轻链和重链DNA，用本领域技术人员熟知的技术就可以或直接，或通过编码肽接头的DNA序列，或通过PCR把这些序列连接起来。在优选实施方案中，重链和轻链区通过可弯曲的肽接头连接，肽接头起始于轻链Fv域的羧基末端，终止于重链Fv区的氨基末端。整个序列是以单链CD3结合部分的形式编码Fv域的。
b.将CD3结合区与PE成分融合可以把Fv区直接和毒素部分融合，或者通过连接肽将它们连接在一起。连接肽只是用来提供抗体和毒素部分之间的空间或者增加这些区域之间的移动性使它们各自获得最佳的构象。包含连接肽的DNA序列也可提供序列(如引物位点或限制位点)便于克隆或保持编码抗体和毒素部分的序列之间的阅读框。
通常，根据本发明的免疫毒素融合蛋白的克隆涉及分别制备编码CD3结合部分的DNA和编码PE毒素部分的DNA，然后在质粒或其它载体中重组这些DNA序列形成编码这一特定目的融合蛋白的结构。载体可以是包含适当启动子序列等的表达质粒，或者免疫毒素编码DNA片段随后可以被转移到表达质粒中。另一个方法涉及把编码CD3结合部分的DNA插入编码PE毒素部分的已形成的结构中。
c.重组免疫毒素的表达本发明的蛋白可以在各种宿主细胞中表达，这些细胞包括大肠杆菌、其它细菌宿主、酵母和各种高等真核细胞如COS、CHO和HeLa细胞系和骨髓瘤细胞系。可以把重组蛋白基因可操作地连接到针对每个宿主适当的表达控制序列上。对大肠杆菌来说，控制序列包括启动子如T7、trp、tac或λ启动子、核糖体结合部位，并优选包括转录终止信号。对真核细胞来说，控制序列包括启动子和优选来自免疫球蛋白基因、SV40、巨细胞病毒等的增强子，和聚腺苷酸化序列，并且可以包括剪接的供体和受体序列。
白喉毒素和假单胞菌外毒素都可通过延伸因子-2(EF-2)(一种必需的真核转录因子)的ADP-核糖基化阻止真核细胞中的蛋白合成。所以，对于真核表达，优选使用EP-2被突变因而对假单胞菌外霉素引起的ADP-核糖基化具有抗性的细胞。此突变宿主和突变EF-2蛋白对哺乳动物[(Moehring等，《体细胞遗传学》(Somatic Cell Genetics)5469-480(1979)；Kohno等，《生物化学杂志》26212298-12305(1987)]和酵母细胞[Phah等，《生物化学杂志》2688665-8668(1993)；Kimata等，《生物化学生物物理学研究通报》(Biochem.Biophys.Res.Commun.)1911145-1151(1993)]已有描述。
本发明的质粒能通过熟知的方法例如大肠杆菌的氯化钙转化法和哺乳动物细胞的磷酸钙处理或电穿孔转移到选择的宿主细胞中。被质粒转化的细胞可通过对抗生素的抗性被选择出来，这种对抗生素的抗性是由包含在质粒中的基因如amp、gpt、neo、hyg基因赋予的。
显然，在不降低生物学功能的情况下，可以修饰单链Fv区和包含单链Fv区的的融合蛋白。可以进行一些修饰便于克隆、表达或将单链Fv区纳入融合蛋白中。这些修饰对本领域的技术人员是熟知的，它们包括把甲硫氨酸加在氨基末端提供起始位点，或把氨基酸附加在任何一个末端制造位置方便的限制位点或终止密码子。例如，在实施例1中所使用的引物引入了为在大肠杆菌中表达的一个编码起始甲硫氨酸的序列和便于克隆的BamHI、XbaI、SalI、NcoI和BstXI限制位点。
一经表达，可根据本领域标准的方法将重组蛋白纯化，这些方法包括硫酸胺沉淀法、亲和柱法、柱层析法、凝胶电泳法等。优选基本纯化的至少大约90％-95％均一的组合物，并且对于药用，最优选有98％-99％或大于99％均一性的组合物。一经纯化，部分或完全达到期望的均一程度的多肽用作药物用途应该基本无内毒素，并且可以用于治疗。
本领域的技术人员将了解，在化学合成、生物表达、或纯化后，单链Fv区或包含单链Fv区的融合蛋白可能具有与天然蛋白基本不同的构象。在这种情况下，有必要将此蛋白变性和还原，然后使它重新折叠成优选的构象。
表达单链抗体和/或变性蛋白和诱导重新折叠到适当折叠形式的方法，包括来自细菌如大肠杆菌的单链抗体已有描述，并且是人们熟知的，这些方法也适用于本发明的多肽[Buchner等，《分析，生物化学》(Analytical Biochemistry)205263-270(1992)]。
具体地，来自大肠杆菌或其它细菌的功能蛋白通常从包含体产生并且需要用强变性剂对蛋白进行溶解，然后，重新折叠。在溶解这个步骤中，本领域熟知需要有还原剂存在把二硫键打开。一种有还原剂的缓冲液的实例是0.1M tris，pH8，6M胍，2mM EDTA，0.3M DTE(二硫赤藓糖醇)。蛋白二硫键的重新氧化可以在低分子量还原和氧化形式的巯基试剂存在下得到有效催化，Buchner等(同上)对此有描述。典型的复性过程可以通过将变性和还原的蛋白于重新折叠缓冲液中进行稀释(例如，100倍)来完成。已发现，在8mM GSSG存在下进行复性可提供可重复的、高度稳定的产物。为达到此目的的一种缓冲液实例是0.1M tris，pH8.0，0.5M L-精氨酸，8mM氧化型谷胱甘肽(GSSG)和2mM EDTA。
5. 重组抗-CD3免疫毒素的治疗应用为治疗或预防T细胞介导的免疫系统疾病或异常状态，本文描述的免疫毒素多肽可用来实现削减至少部分T细胞。为系统降低患者体内的T细胞群体，免疫毒素可以在体内方法中应用。为从已处理过的细胞群中削减T细胞，免疫毒素也可以离体应用。
体内应用为在患者体内系统杀伤T细胞，向患者体内施用免疫毒素对T细胞介导的疾病或异常状态提供预防和治疗，和在骨髓或干细胞移植或来自人(同种异体)或非人源(异种)的实体器官移植时作为制剂或调节方案或诱导耐受治疗的一部分，都包括在本发明的范围之内。
B和T淋巴细胞都起源于骨髓，来源于共同的淋巴样先祖细胞，多能干细胞，但仅B淋巴细胞在骨髓中成熟。T细胞转移到胸腺经历成熟，然后进入血流，从血流中移向外周淋巴组织。淋巴组织包括产生淋巴细胞的中枢淋巴器官，和引发适应性免疫应答的次级或外周淋巴器官。中枢淋巴器官是骨髓和胸腺。外周淋巴器官包括淋巴结、脾脏、肠道相关淋巴组织、气管相关淋巴组织和粘膜相关淋巴组织(Janeway和Travers，同上，§1-2)。
本发明包括治疗和预防患者体内T细胞介导的疾病的方法，包括给有此需要的患者施用T细胞削减有效量的本发明免疫毒素。在患者的骨髓，外周血和/或淋巴组织中T细胞水平的削减的能改善患者的T细胞介导的对抗原的塑料应答，并且辅助诱导免疫耐受。例如，为在患者体内实现削减T细胞并由此预防或降低患者体内T细胞介导的对移植的同种异体(或异种)细胞、组织和器官的急性或慢性移植排斥，或促使对这些细胞、组织或器官的免疫耐受的产生，可将本发明免疫毒素有用地施用给接受了或即将接受同种异体移植(或异种移植)的患者。
优选地，当体内施用药物预防或治疗器官移植排斥时，期望将本发明免疫毒素以若干剂的方式在一段时间内施用给患者。通常，优选至少第一剂在移植手术前施用(优选尽可能提前)，随后的一剂或多剂在手术的同时或手术后迅速施用。
免疫毒素能在体内单独或与其它有效治疗急性或慢性移植排斥的药物制剂联合施用，这些制剂包括环孢素A、环孢素G、雷帕霉素、40-O-(2-羟基)乙基雷帕霉素(RAD)、FK-506、霉酚酸、霉酚酸莫非替克(mycophenolate mofetil，MMF)、环磷酰胺、硫唑嘌呤(azathioprene)、来氟米特、咪唑立宾、一种脱氧精胍菌素(deoxyspergualine)化合物或其衍生物或类似物，2-氨基-2-[2-(4-辛基苯基)乙基]丙烷-1，3-二醇(优选作为盐酸盐(FTY720))、皮质类固醇(例如，氨甲蝶呤、强的松龙、甲泼尼龙、地塞米松)或其它的免疫调节化合物(例如，CTLA4-Ig)；抗-LFA-1或抗-ICAM抗体或其它防止T细胞共刺激的抗体，例如，针对白细胞受体或它们的配体的抗体(例如，针对MHC、CD2、CD3、CD4、CD7、CD25、CD28、B7、CD40、CD45、CD58、CD152(CTLA-4)、CD154(CD40配体)的抗体)。
具体地，移植物接受时间延长和甚至明显的免疫耐受能通过本发明的抗CD3免疫毒素和精胍菌素衍生物如脱氧精胍菌素化合物或者精胍菌素类似物联合施用而获得。并且，本发明的一个优选实施方案包含在耐受诱导方案中抗CD3免疫毒素和脱氧精胍菌素化合物的联合施用，参见例如，Eckhoff等1997年5月15日提交给美国移植外科协会的摘要，和Contreras等，《移植》651159(1998)，两者都纳入作参考。术语“脱氧精胍菌素化合物”包括15-脱氧精胍菌素(称为“DSG”，也称作胍立莫司)，即N-[4-(3-氨基-丙基)氨基丁基]-2-(7-N-胍基庚酰胺基)-2-羟基乙酰胺，和它的药用盐，公开于US4518532，纳入作参考；(-)-15-脱氧精胍菌素和它的药用盐，公开于US4,525,299，纳入作参考。有旋光活性的(S)-(-)或(R)-(+)-15-脱氧精胍菌素同型异构体和它们的盐在US5,869,734和EP 765,866中公开，二者都纳入作参考；和DSG的三盐酸盐形式，在美国5,162,581中公开，纳入作参考。
在免疫耐受的诱导方案中和抗CD3免疫毒素一起应用的其它精胍菌素衍生物包括在US4,658,058，US4,956,504，US4,983,328，US4,529,549和EP213,526，EP212,606，中公开的化合物，这些文献都被纳入作参考。
本发明在进一步优选的实施方案中包含根据本发明的抗-CD3免疫毒素和其它精胍菌素类似物如在US5,476,870和EP600,762(都纳入作参考)中公开的化合物联合施用，例如， 化合物(a)即2-[[[4-[[3-(氨基)丙基]氨基]丁基]氨基]羰氧基]-N-[6-[(氨基亚氨基甲基)-氨基]己基]乙酰胺(″tresperimus″)和它的与无机或有机酸形成的可药用加成盐；在美国5,637,613和EP669,316(都纳入作参考)中公开的化合物， 化合物(b)即2-[[[4-[[3(R)(氨基)丁基]氨基]丁基]氨基羰氧基]-N-[6-[(氨基亚氨基甲基)-氨基]己基]乙酰胺基三(三氟乙酸酯)和它们的其它可药用盐。上述化合物的可药用盐包括与无机和有机酸形成的盐，这些无机和有机酸包括(无机酸)盐酸、溴酸、硫酸和磷酸以及(有机酸)延胡索酸、顺丁烯二酸、甲磺酸、草酸、和柠檬酸；在US5,733,928和EP743,300中公开的化合物，这些文献都纳入作参考；在US5,883,132和EP755,380中公开的化合物，这些文献都纳入作参考；和在US5,505,715中公开的(例如，co1.4，I.44-co1.5，I.45)化合物，该文献纳入作参考。
“联合施用”是指用本发明的抗CD3免疫毒素和精胍菌素衍生物或类似物二者治疗器官移植接受者。
免疫毒素和精胍菌素衍生物或类似物的施用不必同时进行，可以在时间上分开施用。然而，典型的情况是，免疫毒素和精胍菌素相关化合物的施用时程将至少有一定程度的重叠。
抗CD3免疫毒素的总剂量优选通过2-3次注射给予，第一剂在移植之前尽可能最早时间施用，随后各剂间隔施用，例如，间隔约24小时施用。
优选将免疫毒素在移植之前和在移植的同时和/或移植之后施用。在同种异体移植过程中，抗-CD3免疫毒素优选在移植手术前大约2-6小时施用，然而，对异种移植或生命相关的同种异体移植，第一次抗-CD3注射可以在移植之前一周进行，参见例如，Knechtle等[《移植》631(1997)]。在免疫耐受诱导方案中，免疫毒素治疗优选缩短至不晚于移植后14天，优选约在第七天，或在第五天，甚至在第三天。
精胍菌素衍生物或类似物的施用可以在移植前，移植的当时，和/或移植后。在移植前或移植后治疗时间的长短可以变化。
在免疫耐受诱导方案中，用精胍菌素衍生物或类似化合物治疗优选在移植后不晚于大约120天停药，并且，更优选在移植后60天，更优选移植后大约30天，甚至更优选不晚于14天，或甚至10天停药。
所以，术语“联合施用”的范围包括这样的治疗方案内，例如，一剂或多剂免疫毒素在移植之前施用，然后一剂或多剂靠近移植时的前后开始施用；并伴随在移植前和/或在移植的当时施用精胍菌素衍生物或类似物，并且，典型的情况是在移植后继续施用。
皮质类固醇激素例如甲泼尼龙可以被纳入联合施用方案中。例如，类固醇可以在移植之前开始施用，并且在此之后可以继续施用一剂或多剂。
本发明的抗CD3免疫毒素优选以足以降低T细胞数量2-3个log值的剂量提供给患者。根据本发明，降低患者T细胞数量2-3个log值的全部有效剂量可以在约50μg/kg和大约10mg/kg实验对象的体重之间，和更优选在约0.1mg/kg和1mg/kg之间。
用精胍菌素衍生物或类似物诱导治疗的剂量方案可以在10mg/kg/天，治疗0-30天，最佳是例如大约2.5mg/kg/天，治疗15天。
附加的类固醇可以在抗CD3免疫毒素注射的同时施用，例如，甲泼尼龙以剂量逐渐降低的方式施用，例如，在移植手术的当天7mg/kg，在+24小时3.5mg/kg和在+48小时0.35mg/kg。类固醇剂量也可以一直保持恒定，例如，在免疫毒素注射同时用40mg/kg泼尼松治疗。可以理解，与标准的临床实践一致，类固醇确切的剂量和选择可以更改。
在本发明的联合治疗的优选实施方案中，联合治疗的免疫毒素是scFv(UCHT-1)-PE38，尤其是有SEQ ID N01序列的免疫毒素。该scFv(UCHT-1)-PE38优选和15-脱氧精胍菌素尤其是(-)-15-脱氧精胍菌素共同施用。在另一方面，该scFv(UCHT-1)-PE38和上述化合物(a)共同施用。在再另一个实施方案中，该scFv(UCHT-1)-PE38和上述化合物(b)共同施用。
在上述联合治疗的实践和本发明的其它的方法中，在并种移植的情况下，尤其移植物接受者是人时，供体细胞、组织或器官优选是猪的，并且最优选来自转基因猪，例如，表达人DAF的猪。
在本发明的方法的另一实施方案中，可以将免疫毒素施用到骨髓接受者体内，通过杀伤宿主(即骨髓移植的接受者)的T细胞预防和治疗宿主抗移植物疾病。骨髓移植在某些疾病的治疗中变得必不可少，如白血病、再生障碍性贫血、或某些遗传性疾病，在这些情况下，患者自身的骨髓严重损伤或经放疗和化疗后患者的造血系统已经破坏。如果骨髓移植没有能使造血系统重建，患者将呈现严重免疫抑制和易受感染。
供体同种异体骨髓的稳定移植大部分取决于供体和受体之间的MHC的匹配。一般情况下，在骨髓移植中仅仅一个或二个抗原不匹配对因为接受者的T细胞对不同的骨髓移植物所造成的排斥是可以耐受的(也可以出现移植物抗宿主疾病，这在以下讨论，当存在较大差异时，这种疾病会非常严重)。另外，甚至极小程度的不吻合常规也需要对接受者进行致死或亚致死剂量的全身射线照射或整个淋巴系统放射处理以消减接受者的T细胞。进行骨髓移植的患者需要进行射线照射使他们完全或几乎完全无免疫能力，这对临床应用骨髓移植治疗许多疾病如实体器官或细胞移植、镰状细胞贫血、地中海贫血和再生障碍性贫血等带来了明显的限制，尽管骨髓移植对这些疾病的治疗可能是有用的。
本发明在不进行射线照射的情况下通过提供一种定向杀伤接受者T细胞的方法解决这个问题。
所以，本发明在另一方面提供一种在患者接受供体的骨髓和/或干细胞富集的外周血细胞移植之前调节骨髓移植患者的方法，该方法包括向患者施用T细胞削减有效量的免疫毒素。免疫毒素使患者体内T细胞群减少，因而可预防宿主(即患者)对供体骨髓移植物的排斥。获得含丰富造血干细胞的供体组合物的方法在US5,814,440、US5,681,559、US5,677,136和US5,061,620中公开，所有文献一并纳入作参考。
特别地，移植物抗宿主疾病(GVHD)有时是致命的，通常引起同种异体骨髓移植的身体衰弱并发症，这主要(如果不是全部的话)由T淋巴细胞介导。GVHD是由骨髓移植接受者从移植物中获得的供体T细胞引起，该供体T细胞产生抗宿主的免疫反应。GVHD典型地由供体和接受者人白细胞抗原(HLA)的不完全免疫学匹配引起。
因此，本发明也涉及一种预防和治疗骨髓移植患者中GVHD的方法，该方法包含在移植后早期阶段或在GVHD的症状变得明显时以足以降低宿主(即患者)体内供体和宿主两者的T细胞水平的剂量施用本发明的免疫毒素。供体和宿主T细胞的早期削减也促使同种异体嵌合状态的产生；即，在宿主T细胞被免疫毒素削减之后再次成熟的T细胞呈现对供体和宿主抗原的耐受并且不参与移植物抗宿主排斥反应。“移植后的早期阶段”是指骨髓移植后一天或几天至不超过大约二周的时间。
在进一步的实施方案中，能将本发明的抗CD3免疫毒素施用给有此需要的患者以治疗其它的T细胞介导的疾病，例如，T细胞白血病和淋巴瘤。如前所述，临床治疗T细胞白血病和淋巴瘤典型地依赖整个身体的射线照射以不加区别地杀伤患者体内的淋巴细胞，在此之后进行骨髓替换。将本发明的免疫毒素施用给患白血病/淋巴瘤的患者可用一种选择清除T细胞方法替换整个身体的射线照射。
在本发明的另一个方面，也可以将本发明的免疫毒素体内施用给患者，通过削减患者T细胞群治疗T细胞介导的自身免疫病，如系统性红斑狼疮(SLE)、I型糖尿病，类风湿性关节炎(RA)、重症肌无力和多发性硬化症。也能将免疫毒素施用给患免疫系统感染疾病如获得性免疫缺陷综合症(AIDS)的患者，施用量足以削减患者感染的T细胞从而抑制患者体内的HIV-1的复制。另外，也可以将抗CD3免疫毒素施用给患者以治疗那些不能接受慢性免疫抑制治疗的异常情况或疾病，例如，对患有糖尿病或代谢性疾病的患者分别通过有利于胰岛或肝细胞的移植来进行治疗。用肝移植可以纠正的疾病或易感状态包括血友病、α1-抗胰蛋白酶缺乏症和高胆红素血症。
在本发明的上述方法中，患者优选是人，并且，供体可以是同种异体(即人)或异种(例如，猪)。移植物可以是未经修饰的或修饰过的器官、组织或细胞移植物，例如，心脏、肺脏、联合心肺、气管、肝脏、肾脏胰腺、胰导细胞、肠管例如小肠、皮肤、肌肉或肢体、骨髓、食管、角膜或神经组织移植物。
对于体内应用，免疫毒素可以以有效杀伤至少一部分携带CD3的细胞(即T细胞)靶群的剂量施用给患者。
一般情况下，有效量的免疫毒素可以削减T细胞靶群，即在淋巴系统和/或外周血中，消减1或多个log值，更优选削减至少约2个log值，甚至更优选削减至少2-3个log值的T细胞靶群。最有效的施用方式和剂量方案依赖于疾病的病程和严重程度，施用对象的健康状况和对治疗的反应程度以及治疗医生的判断。所以，免疫毒素分子的剂量应该根据每个对象调整。
优选地，在治疗和预防伴随骨髓移植发生的GVHD时，将免疫毒素在骨髓移植后迅速施用给骨髓移植接受者，施用的剂量为足以降低存在于患者血和淋巴结中的全部T细胞群(即供体加受体T细胞)至少约50％，更优选至少约80％，甚至更优选至少约95％(例如，99％)，即至少2个log值(如2-3个log值)。
治疗或预防骨髓移植接受者的宿主抗移植物疾病和/或GVHD的适当投药方案可能包含在骨髓移植前即刻和/或骨髓移植后即刻施用免疫毒素，在移植后6天的时程中隔天一次施用，全部剂量约10-500μg/kg，优选200-300μg/kg。
在对白血病/淋巴瘤治疗时，免疫毒素施用的剂量足以降低施用当时的T细胞群的至少约50％，更优选至少约80％，甚至更优选至少约95％(例如99％)，即至少2个log值(如至少2-3个log值)。
在患者的骨髓、血或淋巴组织中携带CD3的细胞的水平，尤其是T细胞的水平，可以通过FACS分析检测。
在削减外周血和淋巴器官的T细胞的过程中免疫毒素治疗的有效性能通过比较免疫毒素治疗前后实验对象的血样品和浸软的淋巴组织中T细胞的数量来确定。T细胞的削减可以通过流式细胞仪跟综测定，见Neyille等的描述[《免疫治疗杂志》(J.Immunother.)1985-92(1996)]。
已显示，包含抗恒河猴CD3单克隆抗体和删除了细胞结合区的白喉毒素的化学连接免疫毒素造成的2个log值的T细胞削减与恒河猴体内同种异体肾脏移植的耐受相关[Thomsa等，《移植》64124-135(1997)；Knechtle等，《移植》631-6(1997)]。
通常，根据本发明，降低患者体内T细胞2-3个log值的总有效剂量最好是在约50μg/kg-约10mg/kg实验对象体重之间(例如，在约50μg/kg-5mg/kg之间)，更优选在约1mg/kg-0.1mg/kg之间。
患者可以每天进行一次或多次给药治疗。免疫毒素组合物也可以每月施用(或适合以周为间隔)，按一次或多次给药。
可以想象，在疾病状态期间，给药的剂量和时间可以更改。在治疗所述疾病时，开始施用组合物时可以在上述范围内以较高剂量施用，并且施用次数比以后频繁。
例如，实施例1中的scFv(UCHT-1)-PE38多肽，可以施用给肾移植患者，就在移植前开始施用，移植后继续，每天或隔天投药，平均(70kg)体重的患者每周约0.3-10mg，历时一周。移植后的第一周后，治疗方案可减少到隔周投药，平均体重的患者每周施用0.1mg-1mg多肽。然而，预计免疫毒素的治疗将在移植后第5周终止，更典型的在第3周，甚至在移植后第一周终止。
离体应用应用免疫毒素从取自机体的分离的细胞群中离体削减T细胞也在本本发明包括治疗和预防T细胞介导的免疫系统疾病或异常状态的方法，包括在移植或导入患者体内前用本发明的免疫毒素接触细胞、组织或器官。
在一方面，免疫毒素能应用在预防器官移植排斥的方法中，其中，该方法包含为清除器官内隐蔽的供体T细胞在移植进入接受者体内之前用包含T细胞削减有效剂量的免疫毒素灌注供体器官(例如，心脏、肺、肾脏、肝脏)。
在本发明的另一个实施方案中，通过用免疫毒素清除患者的癌细胞群(例如，骨髓)或者感染的T细胞，然后重新把T细胞削减后的细胞群输注到患者体内，免疫毒素可以以自身治疗的方式离体用于T细胞白血病/淋巴瘤或其它T细胞介导的疾病或异常状态的治疗。
具体地，这种治疗方法包含(a)收集来自患者的包含携带CD3的细胞的细胞群(例如，骨髓)。
(b)用有效削减T细胞的剂量的免疫毒素处理该细胞群；和(c)将处理过的细胞群输注到患者体内(例如，进入血液)。
这种自身治疗的进一步应用包含治疗感染HIV的实验对象的方法，该方法包含以下步骤(a)从患者分离包含感染HIV的T细胞；(b)用有效削减T细胞的剂量的免疫毒素处理分离的细胞群；和(c)将处理过的细胞群重新导入患者体内。
根据本发明的另一个实施方案，免疫毒素能离体用于削减来源于供体细胞群中的T细胞以预防骨髓移植患者的移植物抗宿主疾病，同时，诱导耐受。该方法包含以下步骤(a)提供包含适当供体(即有适当的MHC、HLA匹配的同种异体供体)分离骨髓和/或干细胞富集的外周血细胞的细胞组合物；(b)用有效量免疫毒素处理细胞组合物形成携带CD3的活细胞(即T细胞)至少部分削减的接种物；和(c)将处理过的接种物导入患者体内。
因为从供体接种物中削减了T细胞，使得移植之后成熟的供体T细胞对宿主免疫耐受并且不再引发移植物抗宿主排斥。
该方法的优点是，为上述离体治疗的目的，可以以远超过体内能达到或可耐受水平的治疗浓度施用免疫毒素。例如，为杀伤培养物中的CD3携带细胞，可以将免疫毒素以约0.5-50,000ng/ml的浓度与CD3表达细胞共同孵育在培养液中。
已发现人细胞因子活化的外周血白细胞(CMPBL，5×106/ml)与0.005-50μg/ml在实施例1中制备的免疫毒素在培养基中25℃孵育1小时，可导致存在的CD3+细胞削减约2.5个logs值，同时也可以将PHA诱导的增殖降低到基础水平，这可通过3H-胸苷的摄取检测。
在另一方面，上述离体治疗方法能与体内免疫毒素的施用联合使用，以提供治疗或预防骨髓移植患者排斥和获得免疫耐受的改进的方法。例如，为预防和/或治疗待进行骨髓移植的患者的宿主抗移植物疾病和/或移植物抗宿主疾病，可以应用包含体内和离体都施用本发明免疫毒素的方法，该方法包含以下步骤(a)降低患者体内(即来自患者外周血或淋巴系统)活的CD3携带细胞(即T细胞)水平；(b)提供包含适当供体的用T细胞削减有效量的免疫毒素处理的造血细胞(即骨髓和/或干细胞富集的外周血细胞)的接种物；和(c)将接种物导入患者体内，之后任选地向患者体内施用免疫毒素进一步削减供体和患者的T细胞。
步骤(a)，即患者T细胞的削减，可以通过向患者体内施用免疫毒素和/或通过包括用免疫毒素离体处理分离的患者骨髓或外周血的自身治疗按以上的描述来进行。
本发明的上述体内和离体方法适用于治疗可通过骨髓移植治愈或治疗的疾病，这些疾病包括白血病，如急性成淋巴细胞白血病(ALL)、急性非成淋巴细胞白血病(ANLL)、急性粒细胞白血病(AML)和慢性粒细胞白血病(CML)、皮肤T细胞淋巴瘤、重度联合免疫缺陷综合症(SCID)、骨质疏松、再生障碍性贫血、Gaucher’s病、地中海贫血、蕈样肉芽肿病(MF)、Sezany综合症(SS)和其它的先天性或遗传决定的血细胞生成异常。
具体地，利用免疫毒素作为药剂诱导与同种异体或异种细胞治疗或组织或器官移植相联系的供体特异和抗原特异性的耐受也在本发明的范围内。所以，可以将免疫毒素作为调节方案的一部分给药以在患者体内诱导针对供体细胞、组织或器官，例如心脏、肺、联合心肺、气管、肝脏、肾、胰腺、胰岛细胞、肠管(例如小肠)、皮肤、肌肉或肢体、骨髓、食管、角膜或神经组织的免疫耐受。
供体特异的系统性移植耐受已在MHC不匹配的动物模型和人体内通过嵌合状态短暂获得，这是用供体细胞进行骨髓移植之前对接受者整个淋巴系统射线照射的结果。重新构建的动物在它们的外周血中呈现稳定的混合的多谱系嵌合状态，这包含所有的淋巴造血细胞系的供体和接受体细胞，包括T细胞、B细胞、自然杀伤细胞、巨噬细胞、红细胞和血小板。而且，混合的同种异体嵌合体对供体型皮肤移植物显示供体特异的耐受，同时，它们迅速排斥第三者的移植物。供体特异的耐受也可以通过体外实验证实，在此实验中，从嵌合体获得的淋巴细胞显示针对同种异体的供体细胞的增殖活性和细胞毒活性下降，但保持正常的对第三者的细胞的免疫反应。
所以，本发明进一步涉及一种调节待移植供体细胞、组织或器官的患者的方法。此方法包括以下步骤(a’)降低患者体内(即患者外周血或淋巴系统)活的CD3携带细胞(即T细胞)的水平；(b’)提供包含用T细胞削减有效量的免疫毒素处理过的供体造血细胞(即骨髓和/或干细胞富集的外周血细胞)的接种物；(c’)将接种物导入患者体内；之后，(d’)将供体细胞、组织或器官移植到患者体内；或者，(a)削减患者体内的携带CD3的细胞群；(b)提供包含用T细胞削减有效量的免疫毒素处理过的分离的供体骨髓和/或干细胞富集的外周血细胞的接种物；(c)将接种物导入患者体内。
上述方法优选在没有进行全身射线照射或全部淋巴照射的情况下进行，并且最优选在没有任何射线照射情况下进行。
6. 包含免疫毒素的组合物可将本发明的重组免疫毒素多肽作为一种在可药用载体中的未修饰的多肽或它的可药用盐施用。
此处所用术语“可药用盐”是指由如下方式制备的盐从可药用的非毒性酸形成所述多肽链氨基基团的酸加成盐，或从可药用的非毒性碱形成所述多肽羧基基团的碱式盐。这些盐可以作为内部的盐和/或作为本发明多肽的氨基或羧基末端的盐形成。适合的可药用的酸加成盐是那些可药用的非毒性的有机酸、多聚酸或无机酸形成的酸加成盐。适合的有机酸的实例包含醋酸、抗坏血酸、苯甲酸、苯磺酸、柠檬酸、乙磺酸、延胡索酸、葡萄糖酸、谷氨酸、氢溴酸、盐酸、羟乙磺酸、乳酸、顺丁烯二酸、苹果酸、杏仁酸、甲磺酸、粘酸、硝酸、草酸、pamoic acid、泛酸、磷酸、水杨酸、琥珀酸、硫酸、酒石酸、对-甲苯磺酸等，和多聚酸如鞣酸或羧甲基纤维素。适合的无机酸包括无机酸如盐酸、氢溴酸、硫酸、磷酸、硝酸等。形成羧基盐的适合的无机碱实例包括碱金属盐如钠、钾和锂盐；碱土盐如钙、钡和镁盐；和氨、铜、亚铁、高铁、锌、亚锰、铝、锰盐等。优选氨、钙、镁、钾、钠盐。适合形成羧基盐的有机碱包括有机胺，如三甲基胺、三乙基胺、三(正丙基)胺、二环己基胺、β-(二甲胺)-乙醇、三(羟甲基)氨基甲烷、三乙醇胺、β-(二乙胺)-乙醇、精氨酸、赖氨酸、组氨酸、N-乙基哌啶、hydrabamine、胆碱、甜菜碱、1，2-乙二胺、葡糖胺、methylglucamine、可可碱、嘌呤、哌嗪、哌啶、咖啡碱、普鲁卡因等。
多肽的酸加成盐可用常规的方法通过用一或多个当量的所需无机酸或有机酸，例如盐酸，与多肽接触制备。肽的羧基盐可以用一或多个当量的所需碱例如，金属氢氧化物碱例如氢氧化钠；金属的碳酸盐或碳酸氢盐碱，例如碳酸钠或碳酸氢钠；或胺碱例如三乙基胺、三乙醇胺等，与多肽接触常规制备。
对于体内或者离体应用，本发明的药物组合物包含载体，该载体优选无菌的、无致热源的、肠胃外可接受的液体。水、生理盐水、葡萄糖水溶液、和乙二醇是优选的液体载体，尤其(等渗时)对注射溶液，或离体使用时如此。
可以将包含免疫毒素或其盐的组合物系统施用，即通过非肠胃的途径(例如，肌肉内的、静脉内的、皮下的、或皮内的途径)或通过腹膜施用。
尤其用于非肠胃施用如静脉施用或投入体腔或器官的腔隙中的组合物通常包含溶解在可药用载体中的融合蛋白溶液，所述载体优选含水载体如缓冲盐水等。这些组合物是无菌的并且通常不含不需要的物质。这些组合物可以通过常规的熟知的灭菌技术灭菌。此组合物也可包含可药用的接近生理条件所需的辅助物质，如pH值调节和缓冲剂、毒性调节剂等，例如，醋酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、乳酸钠等。在这些制剂中免疫毒素蛋白的浓度可以在很宽范围内变动，并且主要基于液体体积、粘稠度、体重等，并根据选择的特定施用方式和患者的需要进行选择。实际制备非肠胃施用的组合物的方法对本领域的技术人员来说是已知的或很明显的，并且在出版物如Remington’s药物科学，第15版Mack出版公司，Easton，Pa.(1980)等中有详细描述。
包含免疫毒素或它们的盐的药物组合物可以用于口服、局部或体表施用，例如通过气雾剂或经皮肤施用。
适合口服给药的单位剂量形式包括粉剂、片剂、丸剂、胶囊、和锭剂。可以理解，当口服施用时多肽必须防止被消化，如把所述蛋白和组合物混合使其抗酸水解和酶水解，或者把蛋白包裹在有适当抗性的载体例如脂质体中。保护蛋白免受消化的各种方法在本领域是已知的。
体表制剂形式的实例包括喷雾剂、眼药水、滴鼻剂和软膏。例如，喷雾剂可以通过将蛋白溶解在适当的溶剂中并且把它放入喷雾器中作为气雾剂用于常用的吸入治疗。眼药水和滴鼻剂可以这样制备，即把活性的肽成分溶解在蒸馏水中，然后加任何需要的辅助药剂，如缓冲液、等渗剂、增稠剂、防腐剂、稳定剂、表面活性剂、抗菌剂等，把此化合物调到pH4-9。也可以制备软膏，例如，首先从多聚物溶液例如2％羧基乙烯基多聚物的水溶液，和碱例如2％氢氧化钠，制备一种组合物，然后将该组合物和碱混合获得胶体，然后再将这种胶体与一定量的纯化融合多肽混合。
本发明组合物可以通过本领域熟知的方法制备的冻干物。
在本发明的体内法的实践中，将有效治疗量的重组免疫多肽，它的可药用盐或包含免疫毒素或其可药用盐的药物组合物施用给有此需要的患者。
给出以下实施例用来说明本发明和为普通技术人员实施和应用本发明提供帮助，并不打算限制发明的范围。
实施例1 scFv(UCHT-1)-PE38的制备(a)从杂交瘤细胞中克隆UCHT-1抗体的可变区通过RT-PCR从UCHT-1杂交瘤的RNA扩增编码鼠抗人CD3 Fv区的基因(Beverley和Callard，1981)，所用寡聚核苷酸引物是基于已公布的UCHT-1 scFv的序列(Shalaby等，同上)和为克隆抗体可变区而描述的共有引物[Orlandi等，PNAS863833-3387(1989)]，参见SEQ ID NO11到SEQ ID NO22。
寡聚物IM34A和IM34B用来扩增VL区，IM-61和IM-34C用来扩增VH片段。然后将这两个扩增片段亚克隆到大肠杆菌质粒载体中(TA载体，Invitrogen)，并且测定它们的DNA序列。
确定此克隆DNA序列后，通过在适当的限制位点切割pUC18和亚克隆的PCR片段然后用T4 DNA连接酶将它们在连接一起，从而将二个分子合并到单个基于pUC18的质粒中。该质粒包含VL，接着是多接头，其后是VH，将该质粒用XbaI和SalI切割。由二个退火后的寡聚物，IM-24A和IM-24B，组成的接头被设计成包含这两个位点的互补末端，将该接头插入到XbaI和SalI位点之间。产生的克隆，‘克隆B’，编码与SEQ ID NO2不同的带有接头的单链免疫毒素。用在scFv(UCHT-1)-PE38中使用的(GGGS)4(SEQ ID NO5)接头替代此接头将在下文中描述。然而，首先必需研究在可变区序列中发现与Shalaby等(同上)报道的克隆Fv片段序列有关的二个变更(1)在重链序列(VH)中核苷酸第208位上A变为C。这可能反映了Shalaby等(同上)的一个错误，因为报道在此位置编码的氨基酸(亮氨酸)与文中的核苷酸序列无关联，但确实与现在获得的克隆序列相关联；和(2)在第98位氨基酸残基苯丙氨酸变为丝氨酸。这显然是PCR导致的错误，VL链中的这个点突变用标准的4步PCR反应改正，在该PCR反应中，所需的核苷酸变更用互补寡聚物VL2和VL3引入。两侧的寡聚物，5’端的VL1和3’端的VH4，稳定了该变更，这在以下进行描述。
al.VL中点突变的修正用pUC18/UCHT-1‘克隆B’作为模板和寡聚物对VL1和VL2或者VL3和VH4设置PCR反应。用凝胶电泳分离这两个不同的PCR产物，然后将它们的互补末端退火，并用前述退火后的产物作为模板进行第二个PCR反应，其中用VL1和VH4连接上述二个片段。
a2.替代‘克隆B’的接头通过二个顺序的PCR反应，以修正了点突变后的质粒作为模板将分开VL和VH的接头变为包含序列(Gly3Ser)4(SEQ ID NO5)的接头。二个顺序反应的5’末端引物都与载体序列(M13R；New England Biolabs)互补。第一个PCR反应的3’引物是VL6，第二个PCR反应的3’引物是VL8。VL6和VL8与编码链互补；在VL8中BstXI位点朝向UCHT-1的VH片段的N端。来自第二个PCR反应的PCR产物编码VL的COOH末端、该新接头、和VH的N末端(正好在BSTXI位点以外)。来自第二个PCR反应的PCR产物在第三个PCR反应中进一步延伸以添加VL的N末端区。这个反应是用第二个PCR产物作为3’引物，用载体中的M13R(New England Biolabs)作为5’引物。第三个PCR反应的模板是puc18/UCHT-1‘克隆B’质粒。用第二个接头替代第一个接头并且把PCR产物连接到VH的剩余部分，第三个反应的PCR产物用BamHI(发生在VL和载体的连接部位)和BstXI(发生在VH中)切割。也用BamHI和BstXI切割puc18/UCHT-1‘克隆B’质粒；相应区域用此新产物替代。
在实施例1中使用的引物和寡聚物是核苷酸序列SEQ ID NO11，SEQID NO12，SEQ ID NO14(编码寡聚物用于克隆)，SEQ ID NO15(接头的编码寡聚物)，SEQ ID NO16(接头的相应非编码寡聚物)，SEQ ID NO17(VL的5’末端第102-124位核苷酸)，SEQ ID NO18(在nt#293具有正确T的3’引物)，SEQ ID NO19(在nt#293具有正确T的5’引物)，SEQ ID NO20(非编码引物)，SEQ ID NO21和SEQ ID NO22的那些引物和寡聚物。
(b)PE38的克隆PE38的克隆描述于Benhar等[Bioconjugate Chem.5No.4(1994)]和US5,981,726及US5,990,296描述，它们纳入本文作为参考。
(c)免疫毒素融合物的制备将新的sc Fv克隆到pET15b大肠杆菌表达载体中(Novagen)。首先用PCR将一些位点加到scFv上使此片段与pET15b克隆载体和来自包含假单胞菌外毒素的质粒pRB391(I.Psatan惠赠)的HindIII位点相匹配。(或者，编码PE38片段的DNA序列可以用标准的PCR方法和适当的寡聚物引物从以ATCC 67208保藏在ATCC的pJH8质粒中重建。在这种方法中，pJH8质粒需要通过PCR诱变以添加HindIII位点和存在质粒pRB391中的连接序列，Benhar等1994(同上)对此有描述。另外，将Ib域内部的16个氨基酸(天然PE的第365-380位)移动到PE40片段可以通过PCR完成，产生与pRB391的PE38片段功能相同的质粒。通过DNA序列分析可以确定产生的质粒是在相同的翻译框中。)添加NcoI限制位点编码的氨基末端甲硫氨酸和丙氨酸残基，以促进从该质粒的表达。
产物的氨基酸序列(包含N端的Met-ALa)在SEQ ID NO2中给出，相应的核苷酸序列在SEQ ID NO1给出。
在SEQ ID NO2中，VL包含第3-111位残基，肽接头占据第112-127位残基，VH包含第128-249位残基，连接物位于第250-254位残基，而截短的PE包含第255-601位残基。氨基末端残基甲硫氨酸和丙氨酸由NcoI限制位点(DNA序列是从第1个核苷酸到第6个核苷酸)编码，添加后促进从大肠杆菌质粒pET 15b的表达。在EcoRI位点(DNA序列是从第1901-1906位核苷酸)和BfIII/BamHI位点(DNA序列是从第1939-1944位核苷酸)之间3’非编码DNA是从中间物的克隆载体(pLitmus 38，NewEngland Biolabs)的多接头遗留的序列。在DNA序列中从核苷酸751到核苷酸756有一个HindIII限制位点。
已发现scFv(UCHT-1)-PE38在大肠杆菌株BLR(DE3)中的表达产生高均质的产物(即95％的纯度或更高)，该产物包含丙氨酸引导的多肽并且有8EQ ID NO2的第2-601位残基。
(a)scFv(UCHT-1)-PE38的发酵、重新折叠和纯化重组scFv(UCHT-1)-PE38的制备方法是在50L的规模上建立的。用PET15b转化至大肠杆菌BLR(DE3)(Novagen，Inc.)中。利用采取自我调节、pH固定的甘油补料策略的补料分批系统。补料在起始量的碳源消耗后开始，甘油自动限量加入，由pH控制。此方法避免了甘油过多和碳源完全消耗的不利影响。
最佳培养基包含6g/1/KH2PO4，0.6g/1KCl，0.2g/1MgSO4·7H2O，24.0g/1 N-Z-胺A，72g/l酵母提取物，100mg/l柠檬酸Fe(III)-铵，12mg/lMnSO4·H2O和10g/l甘油。为达到最佳的表达水平，需要在500D550条件下进行乳糖脉冲诱导。用此方法，24小时后可从在如下条件下进行的发酵实验中收获包含1kg包含体的4.3kg湿重细胞块体积50L；混合200-250rpm；通气/压力1vvm/1bar；pO2控制手动调节；pH控制6.7＜x＜7.1；碱2N NaOH；温度37℃；接种物在LB中生长到OD550＝1.8的预培养物1.0L；诱导50g/lD-乳糖，OD550＝52；收获在诱导后11小时。
用过量的D-乳糖在50的OD550诱导后表达水平达到总细胞蛋白的25％，这可用SDS-PAGE凝胶的光密度测定法检测。用这种方法，每升发酵肉汤可检测到86g湿细胞块(wcp)和20g包含体(IBs)的产量。通过SDS-PAGE和scFv(UCHT-1)-PE38的光密度定量法测定到1.4g/l的产物浓度。
然后提取scFv(UCHT-1)-PE38融合蛋白并且根据Buchner等(同上)的一般方法重新折叠，作如下改动(1)将含有以包含体形式存在的诱导scFv(UCHT-1)-PE38的冷冻细菌块(65g)在室温融化，继而转移到250ml的瓶中。将180ml TES(50mMTris-HCl，pH7.4，20mM EDTA和100mM NaCl的水溶液)加入瓶中，用Polytron组织粉碎机将细菌块彻底悬浮。把悬浮细胞分成几部分(30ml)，分别分装到清洁的250ml瓶中，每瓶用TES稀释到180ml。每瓶加入8ml溶菌酶溶液(在TES中，8mg/ml)，将细菌块重新悬浮，悬浮物在室温下孵育1小时。
(2)将20ml 25％的Triton-X100加到每个瓶中，然后将此混合物充分摇匀。此混合物在室温下孵育30分钟。然后，再将细胞裂解物用GSA转子13,000rpm离心50分钟。
(3)将细菌块重新悬浮在180ml TE中(50mM Tris-HCl，pH7.4，和20mM EDTA)。用Polytron组织粉碎机匀浆2分钟。加入20ml 25％Triton-X100到每个瓶中，然后将此混合物充分摇匀。然后把混合物以13,000rpm离心10分钟。
(4)将在步骤(b)中描述的去污剂(Triton-x100)洗涤步骤重复3次，以产生相对纯净的包含体。将包含体重新悬浮在180ml的TE中，然后以13,000rpm离心10分钟。
(5)将在步骤(3)中描述的漂洗步骤重复3次。将包含体合并，在-70℃冰冻成块。
(6)将42ml含6M盐酸胍(MW＝95.53)、0.1M Tris-Cl，pH8.0和2mM EDTA的溶解缓冲液加入到合并的包含体中。用移液器将包含体悬浮。然后将此悬浮物转移到两个50ml离心管中。该内容物室温孵育过夜，再离心。
(7)将多批100mg变性的包含体蛋白进行还原和复性。加入DTE至0.3M，并将混合物在室温孵育2小时，之后将此样品(100mg变性的包含体蛋白)迅速加至100体积的重折叠缓冲液中。重折叠缓冲液按如下制备配制0.1M Tris，pH8.0，0.5M L-精氨酸-HCl(FW 210.7g)，和2mMEDTA，用10N NaOH将pH调整到9.5，并且平衡到8-10℃，之后加入氧化的谷胱甘肽(GSSG，MW612.6g)到8mM。使此样品在无搅动的情况下10℃重新折叠30-40个小时。将样品biocentrator上浓缩，并透析至20mMTris-HCl，pH7.4，1mM EDTA和100mM尿素。
(8)将重新折叠后的免疫毒素通过相继的2次阴离子交换层析纯化，第一次用Fast-Flow Q(Pharmacia)进行，采用盐分级梯度洗脱，第二次用Q5柱(BioRad)进行，之后是盐梯度洗脱。以下缓冲液在柱层析中用于分级和线性梯度洗脱。
平衡20mM Tris-HCl，pH7.4，1mM EDTA冲洗20mM Tris-HCl，pH7.4，1mM EDTA，0.08M NaCl洗脱20mM Tris-HCl，pH7.4，1mM EDTA，0.28M NaCl
然后将洗脱峰用平衡缓冲液稀释5倍，将其在随后的纯化步骤中加样到Q5柱中。
从第二个阴离子交换柱回收单个峰。通过SDS-PAGE后预期位置上的迁移(64.5kD)和在Western印迹上可与兔抗PE38多克隆抗体进行交叉反应证明此峰与scFv(UCHT-1)-PE38相关(纯度大于95％)。
采用上面提到的DTE和GSSG浓度，用上述方法收获的正确折叠的scFv(UCHT-1)-PE38的产量可达到50mg/ml。
16批物质都进行重新折叠，所生成的物质用MTS检测后发现IC50值非常类似。
前11批产生的蛋白质在UCHT-1的轻链可变区第三个构架区的第63位残基从丝氨酸变成了精氨酸。基于体外实验的结果，发现此突变对其体外的特异性细胞毒影响极小或无影响。
重新折叠的5批蛋白(即第12，13，14，15，16批)中，点突变被修正了。
由于在MTS实验中的高重复性，将第12和13批，第14、15和16批分别合并在一起。用MTS实验检测合并批次的效力，然后再将合并批次本身合并在一起形成“合并的第12-16批”，用于在本发明中报告的大多数体外和体内研究。合并的第10A-12A批也包含已修正的物质，同样将其收集并检测。
通过非变性PAGE的分析发现，纯化的scFv(UCHT-1)-PE38在溶液中以单体形式存在。另外，用大小排阻柱层析(Sephacryl S200)或动态光散射(dynamic light scattering)实验未发现聚集的物质。基本上所有蛋白都在牛血清白蛋白(66kD)附近迁移。
根据例如以下描述的方法以及临床中的方法，可说明本发明的重组免疫毒素多肽在上文描述的如下方面的用途治疗和预防器官移植排斥和移植物抗宿主疾病，诱导免疫耐受，以及治疗和预防自身免疫病，AIDS和其它T细胞介导的免疫疾病，和T细胞白血病或淋巴瘤。
免疫毒素的生物学活性(1)scFv(UCHT-1)-PE38的MTS检测将免疫毒素加入到细胞后第3天用MTS检测，显示针对表达CD3+的人Jurkat T细胞系的特异毒性作用。
在MTS检测中，细胞的活性通过加入MTS，即(3(4，5-二甲基噻唑-2-基)-5-(3-羧甲基苯基)-2H-四唑翁，内盐)进行检测，MTS在电子偶联剂吩嗪硫酸二甲酯存在的情况下被活细胞代谢转变成水溶性的甲替衍生物。该甲替衍生物的490nm吸光度与活细胞的数量成正比。将加入检测化合物时的活细胞数与加入化合物后72小时的活细胞数相比较。非特异性毒性的阴性对照是人CD3-Ramos B细胞系。scFv(UCHT-1)-PE38免疫毒素是非常有效的(≈10pM)，这是由MTS检测中CD3+细胞的杀伤作用测定。在高浓度的情况下，所述蛋白可以把活细胞数降到开始时的细胞数以下，所以是作为细胞毒性制剂起作用的。
(2)scFv的热稳定性scFv(UCHT-1)-PE38的热稳定性是用MTS检测法测定的。样品在PBS中以100μg/ml的浓度在4℃、25℃、和37℃孵育。此物质在4℃和25℃时一个月是完全稳定的。在37℃，在第21或28天IC50有轻度的增加。
(3)scFv(UCHT-1)-PE38对蛋白合成抑制的实验将细胞在有或无免疫毒素存在时孵育过夜。第二天早晨，将细胞与3H-亮氨酸孵育3小时。培养皿冰冻在-80℃以裂解细胞，然后用细胞收集器和充分的洗涤将裂解物收集在玻璃滤器fibermat中。用Wallac Betaplate读数器测定掺入蛋白质中的量。典型地，在无免疫毒素存在的情况下，3H-亮氨酸的掺入是3,000-4,000cpm；细胞处理前即刻加入的标记本底是400-700cpm。在一个培养皿中，三个重复孔的标准差通常小于10％，每培养皿之间平均掺入的偏差小于10％。
Jurkat(CD3+)和Ramos(CD)细胞中蛋白合成的抑制在这个实验中scFv(UCHT-1)-PE38的IC50是6.7±1.9ng/ml或104±29pM。
甚至在最高的检测浓度时(100μg/ml)也存在杀伤的选择性。在较高的浓度时，细胞数量降低到起始细胞数量以下。对CD3+Jurkat细胞系的毒性的选择性在这些实验中，即使用高4或5个logs的浓度的scFv(UCHT-1)-PE38也未获得杀伤CD3-Ramos细胞的IC50。
(4)人血混合淋巴细胞反应(MLR)scFv(UCHT-1)-PE38免疫毒素阻止同种异体反应性人外周血单核细胞(PBMC)增殖的能力可用一种双向混合淋巴细胞反应(MLR)检测。MLR是同种异体刺激的量度。在MLR测定中干扰细胞增殖是对免疫抑制剂作用于完整人血细胞的效力的测定。
人MLR是根据标准方法进行的。在Ficoll上从淡黄色的覆盖物中分离来自不同供体(A、B、C)的携带未知HLA型的PBMC(Kantonspital/Basel/Blutspendezentrum)。将细胞以2×107细胞/ml的浓度(90％FCS，10％DMSO)放入冷冻管(Nunc)保存在液氮中待用。开始进行MLS时，将细胞融化，洗涤，计数。
在两个实验的每一个中(“A”和“B”)，通过以1∶1细胞数的比例混合来自2个不同供体的细胞建立3个双向反应(AB，AC，BC)。混合的细胞(共4×105细胞/0.2ml)在37℃，5％CO2条件下共培养6天，作三次重复。用环孢素A作阳性对照。在递增浓度的免疫毒素(合并的第12-16批)或对照存在时进行培养。在最后16小时的培养中通过3H-TdR的摄取(1mCi/0.2ml)测定增殖水平。
在上述二个实验的体外混合淋巴细胞反应(MLR)中，scFv(UCHT-1)-PE38在阻止人血PBMC增殖方面的效力测定为0.11±0.053ng/ml和0.53±0.002ng/ml，导致总体IC50为0.072±0.053ng/ml(1.12pM)。这个资料说明scFv(UCHT-1)-PE38在人MLR中能有效抑制同种异体特异性T细胞的活化。
(5)scFv(UCHT-1)-PE38对人CD3ε转基因小鼠脾细胞伴刀豆球蛋白A刺激的增殖作用的抑制。
人CD3ε转基因小鼠人CD3ε转基因小鼠株来自C.Terhorst(BethIsrael Deaconess医学中心)。表达高和低拷贝数人CD3ε的转基因小鼠脾细胞的表型由Wang等描述[PNAS919402(1994)]。表达高拷贝数人CD3ε的转基因小鼠甚至在杂合的情况下也没有T和NK细胞，所以该转基因小鼠具有敲除表型。据报道tgε600株存在约3个拷贝整合在染色体的未知位置上的人CD3ε转基因。纯合的低拷贝数的转基因小鼠如tgε600小鼠仅表达有限数量的T细胞。相反，当tgε600为杂合时，小鼠有接近正常数量的T细胞，这些T细胞中大部分既表达人CD3ε又表达小鼠CD3ε。
这些小鼠的遗传背景是混合的；由于转基因是通过CBA和C57BL/6杂交的F2胚胎的原核注射导入的，所以，其同胞在遗传上是不同的。将人CD3ε纯合的转基因小鼠和C57BL/6野生型小鼠交配产生杂合小鼠。将这些动物保持作为转基因的纯合子，在与C57BL/6回交后用作杂合子。tgε600插入片段杂合的动物用于检测体外对scFv(UCHT-1)-PE38的敏感性和静脉内或腹膜内施用scFv(UCHT-1)-PE38后引起的体内削减作用。合并的第12-16批scFv(UCHT-1)-PE38用于这些实验。对于体外实验，使用CBA×C57BL/6杂交的F1代作为对照动物。在体内实验中，未经处理的杂合tgε600小鼠作为对照组。
scFv(UCHT-1)-PE38对表达人CD3ε的转基因小鼠脾细胞体外增殖的抑制能力可以通过伴刀豆球蛋白A诱导的增殖和单向混合淋巴细胞反应来测定。
将脾脏粉碎，通过尼龙滤膜(0.45μm)滤过，然后用1ml注射器轻轻地吹打形成单细胞悬液。红细胞用ACK缓冲液(0.15氯化铵，1mM碳酸钾，0.1mM EDTA)裂解，然后将此悬液在补充有5％FBS的RPMI-1640溶液中洗涤3次。每孔加入5μg/ml伴刀豆球蛋白A。将培养皿在37℃，5％CO2条件下孵育3天。在第三天，每孔加入1μCi的3H-胸苷。24小时后将各孔收集至玻璃纤维滤器中，用Wallacβ培养皿读数器检测3H-胸苷的掺入量。
加入scFv(UCHT-1)-PE38可阻断Con A(5μg/ml)诱导的人CD3ε转基因(“HuCD3 εTg”)脾细胞的增殖，但不能阻断非转基因的B6CBAF1(“NonTg”)脾细胞的增殖。对转基因小鼠细胞的剂量依赖性的抑制作用可以从计算得出的0.6ng/ml的IC50观察到。这与抗Jurkat细胞的细胞毒性(0.63±0.15ng/ml)非常一致。在高浓度时，可以观察到＞100％的抑制作用(即增殖比无Con A存在时观察到的少)，提示所有的ConA-反应性的脾细胞对scFv(UCHT-1)-PE38是敏感的。
(6)在单向MLR中scFv(UCHT-1)-PE38对人CD3ε转基因小鼠脾细胞增殖的抑制作用。
scFv(UCHT-1)-PE38对人CD3ε脾细胞中的T细胞体外增殖的抑制能力可以通过单向混合淋巴细胞反应检测。在单向MLR中，增殖是由于同种异体反应性huCD3ε转基因小鼠脾细胞对同种异体MHC II的直接识别所引起的。不是所有的T细胞都是同种异体反应性的，结果只有较少百分比的反应性转基因脾细胞，这与检测中信号降低和实验之间的偏差增加相一致。
根据上述第5部分的方法制备huCD3ε转基因小鼠脾细胞(“CD3Tg细胞”)。非转基因B6CBAF1小鼠的脾细胞(“NonTg”)用作对照。
根据上述第5部分的方法制备Balb/C脾细胞的单细胞悬液，然后用丝裂霉素C(30μg/ml)在37℃处理20分钟，然后加入MLR培养基洗涤。
将丝裂霉素C处理的BALB/c刺激细胞以4×105细胞/ml加入平底Corning 96孔培养板中。将转基因小鼠脾细胞以2×105细胞/ml加入各孔中，然后将培养板在37℃，5％CO2中孵育3天。在第三天，加入1μCi/孔3H-胸苷。16小时后，将各孔收集在玻璃纤维滤器上，用Wallacβ培养皿读数器检测3H-胸苷的掺入量。
scFv(UCHT-1)-PE38免疫毒素抑制包含huCD3εTg脾细胞的培养物中的同种异体MLR反应，但不抑制非转基因对照脾细胞的MLR反应。观察到转基因小鼠细胞的剂量依赖性抑制，计算的IC50为0.6ng/ml。在高浓度时，可以观察到＞100％的抑制作用，提示所有同种异体反应性huCD3εT细胞都对scFv(UCHT-1)-PE38敏感。在非转基因B6CBAF1脾细胞和丝裂霉素C处理的Balb/C(APC)脾细胞之间的MLR反应没有被scFv(UCHT-1)-PE38抑制。
所以，发现免疫毒素可以以剂量依赖性方式抑制由完全同种异体的丝裂霉素C处理BALB/C脾细胞(APC)刺激产生的huCD3ε转基因脾细胞(T细胞)的MLR反应。在此实验中上述免疫毒素的有效性是～0.9ng/ml，即～14pM。
(7)Jurkat空纤维植入模型将8条空纤维植入单一裸鼠体内4条腹膜内放置，另4条放置在皮下。在每一植入位置的4条空纤维中2条包含CD3+Jurkat细胞；每一植入位置的4条空纤维中1条包含LS174T结肠癌细胞；1条包含MDA-MB-435S乳腺癌细胞。6只动物构成一组。
值得一提的是用于这些研究的材料都包含在Seq.ID NO2第195位核苷酸T变成了G的点突变，这一突变使得SEQ ID NO2第65位残基(即在可变的轻链的第三个构架区中)从丝氨酸(UCHT-1)变成了精氨酸(突变体)。该材料的效力在3天的MTS实验中等同于没有突变的scFv(UCHT-1)-PE38的效力。
随着第3-6天腹膜内以1μg/只小鼠、一天二次，或5μg/只小鼠、一天二次的剂量施用(每只小鼠施用存在于盐水载体中的150μl)scFv(UCHT-1)-PE38，监测植入到裸鼠腹膜腔中的空纤维中Jurkat细胞的生长。在第10天取回纤维。在腹膜内或静脉内施用免疫毒素后，显示出免疫毒素在杀伤植入裸鼠体内的人T细胞系方面有系统的体内效果，并且可观察到的生长抑制是CD3+T细胞特异的。
在此模型中也发现，用1μg/只小鼠的剂量腹膜内(一天二次，共4天)或用3μg/只小鼠的剂量静脉内(一天二次，共4天)给药，腹膜内植入的空纤维中Jurkat细胞的生长受到大约75％的抑制。
(8)在人CD3ε转基因小鼠中的T细胞削减用4μg/只小鼠的免疫毒素(合并的第12-16批)处理上述tgε600/C57BL6杂合小鼠，一天二次，共4天。在最后处理后第一天，将淋巴结(LN)和脾脏取出，从单个小鼠中制备单细胞悬液。
CD3阳性细胞的百分比可通过用FITC-抗huCD3ε抗体(以检测人CD3ε的表达)和与藻红蛋白(PE)连接的抗mCD3ε抗体(500A2-PE)(以检测小鼠CD3的表达)对单细胞悬液进行双色FACS分析来评价。每个器官中T细胞数量可通过从该器官获得的总细胞数乘以CD3阳性细胞的百分比确定。
由同型匹配的对照抗体所引起的非特异细胞染色是低的。在经处理的和未经处理的小鼠之间未见非特异染色不同。
在未经处理的转基因动物脾脏全部细胞中～20％是mCD3和huCD3双阳性的。一小部分细胞表达小鼠CD3，但不表达人CD3(3.5％)。
用scFv(UCHT-1)-PE38进行的系统治疗可将表达mCD3和huCD3两者的细胞百分比从约20％降低至约2％。
处理和未处理转基因小鼠的淋巴结(LN)FACS分析结果与转基因小鼠的脾细胞FACS分析结果相似。即，由同型匹配的对照抗体所引起的非特异细胞染色是低的。在未处理的转基因小鼠中，淋巴结总细胞中～53％是mCD3和huCD3双阳性的。一小部分细胞表达小鼠CD3但不表达人CD3(2.8％)。静脉内施用scFv(UCHT-1)-PE38(4μg/动物)，一天二次，共4天，之后，表达mCD3和huCD3两者的双阳性LN细胞的百分比从～53％降低到12％。
对于脾脏和淋巴结，不同给药方案对小鼠和人CD3双阳性细胞的百分比和数量的结果是相似的。当经静脉内或者腹膜内以一天二次的方式给药时，scFv(UCHT-1)-PE38可引起双阳性T细胞统计学上显著的削减。另外，在系统给药后在两种组织中都可观察到剂量依赖性的T细胞削减。
总结所产生的数据，4μg/只小鼠静脉内给药或5μg/只小鼠腹膜内给药，一天二次，持续4天，可导致所获得的脾huCD3 T细胞数量86％和95％的削减。当考虑huCD3阳性细胞百分比时，按3μg/只小鼠，静脉内，一天二次，持续4天和1μg/只小鼠静脉内，一天二次的方式给药，可观察到脾细胞数量统计学上显著的降低。所以，导致脾削减的最低有效剂量显示为1μg，一天二次，持续4天。
对于淋巴结，4μg/只小鼠静脉内给药或5μg/只小鼠腹膜内给药，一天二次，持续4天，可导致所获得的脾huCD3 T细胞数量97％和92％削减。当考虑淋巴结中huCD3阳性细胞百分比时，用3μg/只小鼠静脉内给药，一天二次，持续4天，和1μg/只小鼠静脉内给药，一天二次，持续4天的方式处理的小鼠，可观察到淋巴结细胞数量统计学上显著的降低。所以，导致淋巴结削减的最低有效剂量显示为1μg，一天二次，持续4天。
序列表<110>Novartis AG<120>抗CD3免疫毒素及其治疗用途<130>免疫毒素<140><141><160>22<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>1803<212>DNA<213>人工序列<220><221>CDS<222>(1)..(1803)<220><223>人工序列的描述scFv(UCHT-1)-PE28<400>1atg gcg gac atc cag atg acc cag acc acc tcc tcc ctg tct gcc tct 48Met Ala Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser1 5 10 15ctg gga gac aga gtc acc atc agt tgc agg gca agt cag gac att aga 96Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Arg20 25 30aat tat tta aac tgg tat caa cag aaa cca gat gga act gtt aaa ctc 144Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu35 40 45ctg atc tac tac aca tca aga tta cac tca gga gtc cca tca aag ttc 192Leu Ile Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Lys Phe50 55 60agt ggc agt ggg tct gga aca gat tat tct ctc acc att agc aac ctg 240Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu65 70 75 80gag caa gag gat att gcc act tac ttt tgc caa cag ggt aat acg ctt 288Glu Gln Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu85 90 95ccg tgg acg ttc gct gga ggc acc aag ctg gaa atc aaa cgg gct gga 336Pro Trp Thr Phe Ala Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala Gly100 105 110ggc ggt agt ggc ggt gga tcg ggt gga ggc agc ggt ggc gga tct gag 384Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Glu115 120 125gtg cag ctc cag cag tct gga cct gag ctg gtg aag cct gga gct tca 432Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser130 135 140atg aag ata tcc tgc aag gct tct ggt tac tca ttc act ggc tac acc 480Met Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr Thr145 150 155 160atg aac tgg gtg aag cag agt cat gga aag aac ctt gag tgg atg gga 528Met Asn Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Asn Leu Glu Trp Met Gly165 170 175ctt att aat cct tac aaa ggt gtt agt acc tac aac cag aag ttc aag 576Leu Ile Asn Pro Tyr Lys Gly Val Ser Thr Tyr Asn Gln Lys Phe Lys180 185 190gac aag gcc aca tta act gta gac aag tca tcc agc aca gcc tac atg 624Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met195 200 205gaa ctc ctc agt ctg aca tct gag gac tct gca gtc tat tac tgt gca 672Glu Leu Leu Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala210 215 220aga tcg ggg tac tac ggt gat agt gac tgg tac ttc gat gtc tgg ggc 720Arg Ser Gly Tyr Tyr Gly Asp Ser Asp Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly225 230 235 240gca ggg acc acg gtc acc gtc tcc tca aaa gct tcc gga ggt ccc gag 768Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Lys Ala Ser Gly Gly Pro Glu245 250 255ggc ggc agc ctg gcc gcg ctg acc gcg cac cag gct tgc cac ctg ccg 816Gly Gly Ser Leu Ala Ala Leu Thr Ala His Gln Ala Cys His Leu Pro260 265 270ctg gag act ttc acc cgt cat cgc cag ccg cgc ggc tgg gaa caa ctg 864Leu Glu Thr Phe Thr Arg His Arg Gln Pro Arg Gly Trp Glu Gln Leu275 280 285gag cag tgc ggc tat ccg gtg cag cgg ctg gtc gcc ctc tac ctg gcg 912Glu Gln Cys Gly Tyr Pro Val Gln Arg Leu Val Ala Leu Tyr Leu Ala290 295 300gcg cgg ctg tcg tgg aac cag gtc gac cag gtg atc cgc aac gcc ctg 960Ala Arg Leu Ser Trp Asn Gln Val ASp Gln Val Ile Arg Asn Ala Leu305 310 315 320gcc agc ccc ggc agc ggc ggc gac ctg ggc gaa gcg atc cgc gag cag 1008Ala Ser Pro Gly Ser Gly Gly Asp Leu Gly Glu Ala Ile Arg Glu Gln
325 330 335ccg gag cag gcc cgt ctg gcc ctg acc ctg gcc gcc gcc gag agc gag 1056Pro Glu Gln Ala Arg Leu Ala Leu Thr Leu Ala Ala Ala Glu Ser Glu340 345 350cgc ttc gtc cgg cag ggc acc ggc aac gac gag gcc ggc gcg gcc aac 1104Arg Phe Val Arg Gln Gly Thr Gly Asn Asp Glu Ala Gly Ala Ala Asn355 360 365ggc ccg gcg gac agc ggc gac gcc ctg ctg gag cgc aac tat ccc act 1152Gly Pro Ala Asp Ser Gly Asp Ala Leu Leu Glu Arg Asn Tyr Pro Thr370 375 380ggc gcg gag ttc ctc ggc gac ggc ggc gac gtc agc ttc agc acc cgc 1200Gly Ala Glu Phe Leu Gly Asp Gly Gly Asp Val Ser Phe Ser Thr Arg385 390 395 400ggc acg cag aac tgg acg gtg gag cgg ctg ctc cag gcg cac cgc caa 1248Gly Thr Gln Asn Trp Thr Val Glu Arg Leu Leu Gln Ala His Arg Gln405 410 415ctg gag gag cgc ggc tat gtg ttc gtc ggc tac cac ggc acc ttc ctc 1296Leu Glu Glu Arg Gly Tyr Val Phe Val Gly Tyr His Gly Thr Phe Leu420 425 430gaa gcg gcg caa agc atc gtc ttc ggc ggg gtg cgc gcg cgc agc cag 1344Glu Ala Ala Gln Ser Ile Val Phe Gly Gly Val Arg Ala Arg Ser 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Pro545 550 555 560acc gac ccg cgc aac gtc ggc ggc gac ctc gac ccg tcc agc atc ccc 1728Thr Asp Pro Arg Asn Val Gly Gly Asp Leu Asp Pro Ser Ser Ile Pro565 570 575gac aag gaa cag gcg atc agc gcc ctg ccg gac tac gcc agc cag ccc 1776Asp Lys Glu Gln Ala Ile Ser Ala Leu Pro Asp Tyr Ala Ser Gln Pro580 585 590ggc aaa ccg ccg cgc gag gac ctg aag 1803Gly Lys Pro Pro Arg Glu Asp Leu Lys595 600<210>2<211>601<212>PRT<213>人工序列<223>人工序列的描述scFv(UCHT-1)-PE28<400>2Met Ala Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser1 5 10 15Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Arg20 25 30Ash Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu35 40 45Leu Ile Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Lys Phe50 55 60Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu65 70 75 80Glu Gln Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu85 90 95Pro Trp Thr Phe Ala Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala Gly100 105 110Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Glu115 120 125Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser130 135 140Met Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr Thr145 150 155 160Met Asn Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Asn Leu Glu Trp Met Gly165 170 175Leu Ile Asn Pro Tyr Lys Gly Val Ser Thr Tyr Asn Gln Lys Phe Lys180 185 190Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met195 200 205Glu Leu Leu Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala210 215 220Arg Ser Gly Tyr Tyr Gly Asp Ser Asp Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly225 230 235 240Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Lys Ala Ser Gly Gly Pro Glu245 250 255Gly Gly Ser Leu Ala Ala Leu Thr Ala His Gln Ala Cys His Leu Pro260 265 270Leu Glu Thr Phe Thr Arg His Arg Gln Pro Arg Gly Trp Glu Gln Leu275 280 285Glu Gln Cys Gly Tyr Pro Val Gln Arg Leu Val Ala Leu Tyr Leu Ala290 295 300Ala Arg Leu Ser Trp Asn Gln Val Asp Gln Val Ile Arg Asn Ala Leu305 310 315 320Ala Ser Pro Gly Ser Gly Gly Asp Leu Gly Glu Ala Ile Arg Glu Gln325 330 335Pro Glu Gln Ala Arg Leu Ala Leu Thr Leu Ala Ala Ala Glu Ser Glu340 345 350Arg Phe Val Arg Gln Gly Thr Gly Asn Asp Glu Ala Gly Ala Ala Asn355 360 365Gly Pro Ala Asp Ser Gly Asp Ala Leu Leu Glu Arg Ash Tyr Pro Thr370 375 380Gly Ala Glu Phe Leu Gly Asp Gly Gly Asp Val Ser Phe Ser Thr Arg385 390 395 400Gly Thr Gln Asn Trp Thr Val Glu Arg Leu Leu Gln Ala His Arg Gln405 410 415Leu Glu Glu Arg Gly Tyr Val Phe Val Gly Tyr His Gly Thr Phe Leu420 425 430Glu Ala Ala Gln Ser Ile Val Phe Gly Gly Val Arg Ala Arg Ser Gln435 440 445Asp Leu Asp Ala Ile Trp Arg Gly Phe Tyr Ile Ala Gly Asp Pro Ala450 455 460Leu Ala Tyr Gly Tyr Ala Gln Asp Gln Glu Pro Asp Ala Arg Gly Arg465 470 475 480Ile Arg Asn Gly Ala Leu Leu Arg Val Tyr Val Pro Arg Ser Ser Leu485 490 495Pro Gly Phe Tyr Arg Thr Ser Leu Thr Leu Ala Ala Pro Glu Ala Ala500 505 510Gly Glu Val Glu Arg Leu Ile Gly His Pro Leu Pro Leu Arg Leu Asp515 520 525Ala Ile Thr Gly Pro Glu Glu Glu Gly Gly Arg Leu Glu Thr Ile Leu530 535 540Gly Trp Pro Leu Ala Glu Arg 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565 570 575Asp Lys Glu Gln Ala Ile Ser Ala Leu Pro Asp Tyr Ala Ser Gln Pro580 585 590Gly Lys Pro Pro Arg Glu Asp Leu Lys595 600<210>3<211>613<212>PRT<213>铜绿假单胞菌<400>3Ala Glu Glu Ala Phe Asp Leu Trp Asn Glu Cys Ala Lys Ala Cys Val1 5 10 15Leu Asp Leu Lys Asp Gly Val Arg Ser Ser Arg Met Ser Val Asp Pro20 25 30Ala Ile Ala Asp Thr Asn Gly Gln Gly Val Leu His Tyr Ser Met Val35 40 45Leu Glu Gly Gly Asn Asp Ala Leu Lys Leu Ala Ile Asp Asn Ala Leu50 55 60Ser Ile Thr Ser Asp Gly Leu Thr Ile Arg Leu Glu Gly Gly Val Glu65 70 75 80Pro Asn Lys Pro Val Arg Tyr Ser Tyr Thr Arg Gln Ala Arg Gly Ser85 90 95Trp Ser Leu Asn Trp Leu Val Pro Ile Gly His Glu Lys Pro Ser Asn100 105 110Ile Lys Val Phe Ile His Glu Leu Asn Ala Gly Asn Gln Leu Ser His115 120 125Met Ser Pro Ile Tyr Thr Ile Glu Met Gly Asp Glu Leu Leu Ala Lys130 135 140Leu Ala Arg Asp Ala Thr Phe Phe Val Arg Ala His Glu Ser Asn Glu145 150 155 160Met Gln Pro Thr Leu Ala Ile Ser His Ala Gly Val Ser Val Val Met165 170 175Ala Gln Thr Gln Pro Arg Arg Glu Lys Arg Trp Ser Glu Trp Ala Ser180 185 190Gly Lys Val Leu Cys Leu Leu Asp Pro Leu Asp Gly Val Tyr Asn Tyr195 200 205Leu Ala Gln Gln Arg Cys Asn Leu Asp Asp Thr Trp Glu Gly Lys Ile210 215 220Tyr Arg Val Leu Ala Gly Asn Pro Ala Lys His Asp Leu Asp Ile Lys225 230 235 240Pro Thr Val Ile Ser His Arg Leu His Phe Pro Glu Gly Gly Ser Leu245 250 255Ala Ala Leu Thr Ala His Gln Ala Cys His Leu Pro Leu Glu Thr Phe260 265 270Thr Arg His Arg Gln Pro Arg Gly Trp Glu Gln Leu Glu Gln Cys Gly275 280 285Tyr Pro Val Gln Arg Leu Val Ala Leu Tyr Leu Ala Ala Arg Leu Ser290 295 300Trp Asn Gln Val Asp Gln Val Ile Arg Asn Ala Leu Ala Ser Pro Gly305 310 315 320Ser Gly Gly Asp Leu Gly Glu Ala Ile Arg Glu Gln Pro Glu Gln Ala325 330 335Arg Leu Ala Leu Thr Leu Ala Ala Ala Glu Ser Glu Arg Phe Val Arg340 345 350Gln Gly Thr Gly Asn Asp Glu Ala Gly Ala Ala Asn Ala Asp Val Val355 360 365Ser Leu Thr Cys Pro Val Ala Ala Gly Glu Cys Ala Gly Pro Ala Asp370 375 380Ser Gly Asp Ala Leu Leu Glu Arg Asn Tyr Pro Thr Gly Ala Glu Phe385 390 395 400Leu Gly Asp Gly Gly Asp Val Ser Phe Ser Thr Arg Gly Thr Gln Asn405 410 415Trp Thr Val Glu Arg Leu Leu Gln Ala His Arg Gln Leu Glu Glu Arg420 425 430Gly Tyr Val Phe Val Gly Tyr His Gly Thr Phe Leu Glu Ala Ala Gln435 440 445Ser Ile Val Phe Gly Gly Val Arg Ala Arg Ser Gln Asp Leu Asp Ala450 455 460Ile Trp Arg Gly Phe Tyr Ile Ala Gly Asp Pro Ala Leu Ala Tyr Gly465 470 475 480Tyr Ala Gln Asp Gln Glu Pro Asp Ala Arg Gly Arg Ile Arg Asn Gly485 490 495Ala Leu Leu Arg Val Tyr Val Pro Arg Ser Ser Leu Pro Gly Phe Tyr500 505 510Arg Thr Ser Leu Thr Leu Ala Ala Pro Glu Ala Ala Gly Glu Val Glu515 520 525Arg Leu Ile Gly His Pro Leu Pro Leu Arg Leu Asp Ala Ile Thr Gly530 535 540Pro Glu Glu Glu Gly Gly Arg Leu Glu Thr Ile Leu Gly Trp Pro Leu545 550 555 560Ala Glu Arg Thr Val Val Ile Pro Ser Ala Ile Pro Thr Asp Pro Arg565 570 575Asn Val Gly Gly Asp Leu Asp Pro Ser Ser Ile Pro Asp Lys Glu Gln580 585 590Ala Ile Ser Ala Leu Pro ASp Tyr Ala Ser Gln Pro Gly Lys Pro Pro595 600 605Arg Glu Asp Leu Lys610<210>4<211>25<212>PRT<213>铜绿假单胞菌<400>4Met His Leu Ile Pro His Trp Ile Pro Leu Val Ala Ser Leu Gly Leu1 5 10 15Leu Ala Gly Gly Ser Ser Ala Ser Ala20 25<210>5<211>16<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列描述scFV(UCHT-1)-PE38的接头<400>5Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser1 5 10 15<210>6<211>5<212>PRT<213>铜绿假单胞菌<400>6Arg Glu Asp Leu Lys1 5<210>7<211>4<212>PRT<213>铜绿假单胞菌<400>7Arg Glu Asp Leu1<210>8<211>4<212>PRT<213>铜绿假单胞菌<400>8Lys Asp Glu Leu1<210>9<211>5<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列描述scFV(UCHT-1)-PE38的连接肽<400>9Lys Ala Ser Gly Gly1 5<210>10<211>5<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列描述双倍体接头<400>10Gly Gly Gly Gly Ser15<210>11<211>32<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述引物<400>11gcggatccga catccagatg acccagacca CC 32<210>12<211>32<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述引物<400>12cctctagaag cccgtttgat ttccagcttg gt 32<210>13<211>35<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述引物<400>13ccaagctttc atgaggagac ggtgaccgtg gtccc 35<210>14<211>29<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述引物<400>14ccgtcgacga ggtgcagctc cagcagtct 29<210>15<211>42<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述引物<400>15ctagaggagg tagtggaggc tcaggaggtt ctggaggtag tg 42<210>16<211>42<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述引物<400>16tcgacactac ctccagaacc tcctgagcct ccactacctc ct 42<210>17<211>23<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述引物<400>17ctggtatcaa cagaaaccag atc23<210>18<211>27<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述引物<400>18ggtgcctcca gcgaacgtcc acggaag27<210>19<211>27<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述引物<400>19cttccgtgga cgttcgctgg aggcacc27<210>20<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述引物<400>20ctctgcttca cccagttcat g 21<210>21<211>66<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述引物<400>21gccaccgctg cctccacctg atccaccgcc actaccgcct ccagcccgtt tgatttccag 60cttggt66<210>22<211>57<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述引物<400>22tcaggtccag actgctggag ctgcacctca gatccgccac cgctgcctcc acctgat 5权利要求
1.包含CD3结合域和假单胞菌外毒素A成分的分离的重组免疫毒素及其可药用盐。
2.根据权利要求1的免疫毒素及其可药用盐，其中CD3结合域是鼠抗人CD3单克隆抗体UCHT-1的单链(“sc”)Fv片段，且假单胞菌外毒素A成分是绿脓假单胞菌外毒素A的截短的片段。
3.具有SEQ ID NO2的第1-601位或第2-601位或第3-601位残基的重组免疫毒素多肽及其可药用盐和同系物。
4.多核苷酸或生理功能等同的多肽，其是制备根据权利要求1的免疫毒素的中间物。
5.预防或治疗T细胞介导的免疫系统疾病或病症的方法，包括给有此需要的患者施用T细胞削减有效量的根据权利要求1的免疫毒素或其可药用盐。
6.预防或治疗T细胞介导的免疫系统疾病或病症的方法，包括在细胞、组织、或器官移植或导入到患者体内之前用根据权利要求1的免疫毒素或其可药用盐接触细胞、组织、或器官。
7.调节将用供体的细胞、或组织或器官移植的患者的方法，此方法包括(a)削减患者体内携带CD3的细胞群；(b)提供如下接种物，该接种物包含供体的经T细胞削减有效量的根据权利要求1的免疫毒素或其可药用盐处理的分离的骨髓和/或干细胞富集的外周血细胞；和(c)将该接种物导入患者体内。
8.在待进行骨髓移植的患者中预防和/或治疗移植排斥、宿主抗移植物疾病和/或移植物抗宿主疾病的方法，包括(a)降低患者体内携带CD3的活细胞水平；(b)提供如下接种物，该接种物包含适当供体的经T细胞削减有效量的根据权利要求1的免疫毒素或其可药用盐处理的造血细胞；和(c)将该接种物导入患者体内，并且，此后任选给该患者施用根据权利要求1的免疫毒素或其可药用盐以进一步削减供体和患者的T细胞。
9.根据权利要求5或8的方法，该方法包括把有效治疗量的根据权利要求1的免疫毒素或其可药用盐和在治疗急性或慢性移植排斥方面有效的选自如下物质的药剂共同施用给患者环孢素A、雷帕霉素、40-0-(2-羟基)乙基雷帕霉素(RAD)、FK-506、霉酚酸、霉酚酸莫非替克(MMF)、环磷酰胺、硫唑嘌呤、来氟米特、咪唑立宾、脱氧精胍菌素化合物或其衍生物或类似物、2-氨基-2-[2-(4-辛基苯基)乙基]丙烷-1，3-二醇(FTY720)、皮质类固醇、其它免疫调节化合物；抗-LFA-1和抗-ICAM抗体，和其它阻止T细胞共刺激的抗体。
10.根据权利要求1的免疫毒素或其可药用盐在制备用于根据权利要求5-9之任一项的方法的药物的用途。
11.药用组合物，包含根据权利要求1的免疫毒素或其可药用盐和可药用的稀释剂或载体。
12.用于根据权利要求5-9之任一项的方法的药物组合物，包含根据权利要求1的免疫毒素或其可药用盐和一种或多种可药用的载体或稀释剂。
13.根据权利要求10或11的组合物，该组合物和可有效治疗急性或慢性移植排斥的药剂联合应用。
全文摘要
本发明描述了重组免疫毒素多肽,其包含CD3结合域和假单胞菌外毒素突变体,尤其包含作为CD3结合部分的单链(sc)Fv。本发明的优选种类包含scFv(UCHT－1)－PE38。本发明还公开了该免疫毒素的制备方法;作为本发明免疫毒素制备过程中的中间物的功能等同的免疫毒素,和多核苷酸和寡核苷酸中间物;用免疫毒素或其可药用盐预防和/或治疗移植排斥,和诱导耐受,以及治疗自身免疫病和其它免疫疾病的方法;和包含该免疫毒素或其可药用盐的药物组合物。
文档编号C07D498/18GK1341124SQ00804064
公开日2002年3月20日 申请日期2000年1月13日 优先权日1999年1月15日
发明者M·E·迪根, P·雷克, R·M·莱特 申请人:诺瓦提斯公司