治疗免疫性疾病的药用组合物的利记博彩app

专利名称：治疗免疫性疾病的药用组合物的利记博彩app
技术领域：
本发明涉及一种药用组合物，其包含一种具有调节AILIM(诱导活化的淋巴细胞免疫调节分子；又称为“JTT-1抗原”，“JTT-2抗原”，“ICOS诱导的协同刺激因子”或“8F4”)生物活性的活性的物质，尤其可调节经AILIM介导的信号传导的物质。
具体地，本发明涉及一种药用组合物，其包含一种具有调节(例如抑制)AILIM表达细胞增殖或调节(例如抑制)AILIM表达细胞产生细胞因子(例如干扰素γ或白细胞介素4)的生物活性的物质。
更具体地，本发明涉及(1)一种药用组合物，其用于阻止、治疗或预防关节病(例如类风湿性关节炎RA，骨关节炎OA)，(2)一种药用组合物，其用于阻止、治疗或预防炎症(例如肝炎)，(3)一种药用组合物，其用于阻止、治疗或预防移植物抗宿主反应(GVH反应)，移植物抗宿主疾病(GVHD)，或与组织或器官移植相伴的免疫排斥，(4)一种药用组合物，其用于阻止或预防外来抗原或自身抗原引起的免疫应答(例如针对该抗原的抗体的产生，细胞增殖，细胞因子的产生)。
背景技术：
哺乳动物具有排斥侵入机体的病原微生物(病毒，细菌，寄生虫等)或外来物体(下文中将二者称为“抗原”)的免疫应答系统。其中之一称为天然免疫应答系统，另一个称为获得性免疫应答系统。前者的排斥机制包括吞噬细胞(多形核白细胞，单核细胞，巨噬细胞等)的吞噬作用，自然杀伤(NK)细胞的攻击，和补体参与的非特异识别如抗原的调理作用。后者，获得性免疫应答系统，通过已获得对抗原的特异性的淋巴细胞(主要是T细胞和B细胞)(称为活化的淋巴细胞)进行的排斥机制。获得了抗原特异性的B细胞通过该抗原特异性抗体的产生来攻击存在于细胞外的抗原。获得了抗原特异性的T细胞(称为活化的T细胞)分为辅助T细胞和细胞毒T细胞(细胞毒淋巴细胞，CTL)。辅助T细胞调节B细胞的分化和抗体产生，与吞噬细胞协作破坏抗原。后者，CTL自己攻击病毒感染的细胞等(实验医学增刊，“生物医学术语库，免疫”，Yodosha，14-17页(1995))。
T细胞(即活化的T细胞)抗原特异性的获得始于T细胞对抗原提呈细胞(APC)如巨噬细胞，B细胞或树突状细胞所提呈的抗原的识别。抗原提呈细胞对其捕获的抗原进行加工，并将这些加工后的抗原与主要组织相容性复合物(MHC)结合来进行提呈。T细胞通过其细胞膜表面由T细胞受体(TcR)和CD3抗原组成的复合物来识别由抗原提呈细胞提呈的经过加工的抗原，从而接受第一信号使细胞活化(或获得特异性)。
然而，TcR/CD3复合物介导的第一信号单独还不足以活化T细胞，结果导致不应答或克隆无反应性，使细胞对随后接受的任何刺激不能应答。T细胞的活化，分化成抗原特异性T细胞克隆，及增殖均必须白细胞介素2(IL-2)的自分泌。克隆无反应性时，由于没有IL-2的产生，T细胞不能活化，并因此无细胞分裂。即，伴有细胞因子如IL-2的产生的T细胞活化需要在TcR/CD3复合物传递了第一信号之后接受第二信号。该第二信号称为协同刺激信号。
T细胞接受该第二信号，通过其表面除TcR/CD3复合物以外的其它分子与除了抗原提呈细胞上的MHC分子以外的其它分子进行分子间相互作用(细胞粘附)向细胞传递。该第二信号避免了细胞无反应性(克隆无反应性)，从而活化细胞。
尽管对抗原提呈细胞和淋巴细胞如T细胞间第二信号传递的部分机制仍未详细阐明，但迄今的研究揭示，第二信号传递的一个重要因素是CD28(也称为Tp44，T44，或9.3抗原，其主要表达于T细胞和胸腺细胞的表面)与CD80(也称为B7-1，B7，BB1，或B7/BB1，其主要表达于抗原提呈细胞如巨噬细胞，单核细胞，树突状细胞等的表面)的相互作用，及与CD86(也称为B7-2或B70，它也是抗原提呈细胞的表面分子)的相互作用(即通过这些分子的结合而发生的细胞粘附)。而且实验证明，溶细胞T淋巴细胞相关抗原4(CTLA-4)(其表达因有第二信号而增强)与CD80(B7-1)和CD86(B7-2)的相互作用(即通过这些分子的结合而发生的细胞粘附)在通过第二信号调节T细胞活化中也发挥重要作用。即，通过第二信号的传递导致的T细胞活化的调节至少涉及CD28与CD80/CD86的相互作用，和被认为依赖于这种相互作用的CTLA-4表达的增强，以及CTLA-4与CD80/CD86的相互作用。
已知CD28是传递活化T细胞，避免无反应性所必须的第二信号(协同刺激信号)的协同刺激分子。第二信号通过该分子与抗原提呈细胞上的CD80(B7-1)和CD86(B7-2)的结合(通过这些分子间的结合而发生的细胞粘附)进行传递，稳定Th1型细胞因子的mRNA，因此促进T细胞产生大量Th1型细胞因子，如IL-2，IFNγ和TNFα。CTLA-4经TcR/CD3传递的第一信号诱导表达，这一表达被CD28和CD80结合所传递的第二信号增强。已显示CTLA-4接受这些信号后发挥其抑制T细胞功能的作用，这与经CD28传递的第二信号对T细胞的活化相反。
人CD28和CTLA-4是I型糖蛋白，其分子量分别是44kD和41-43kD。它们均有免疫球蛋白样结构域，均属于免疫球蛋白超家族，均具有细胞粘附分子和信号传递分子的功能。
人CD28经二硫键形成同型二聚体，而CTLA-4以单体存在。CD28和CTLA-4基因均位于人染色体“2q33”和小鼠染色体“IC”，它们均由4个外显子构成。人CD28和CTLA-4分别由220和223个氨基酸构成，包括前导序列，二者间氨基酸同源性是20-30％。
在人和小鼠中，CD28和CTLA-4的配体是CD80(B7-1)和CD86(B7-2)。CTLA-4与这两种配体的亲和力为CD28的约20倍。研究阐明在不同动物物种间保守的氨基酸序列“MYPPPY”(Met-Tyr-Pro-Pro-Pro-Tyr)对于CD28和CTLA-4与CD80(B7-1)的结合是重要的。又有报道，当CD28被刺激时，PI3激酶(磷酸肌醇3激酶，PI3K)与CD28的部分序列“YMNM”(Tyr-Met-Asn-Met)中磷酸化的酪氨酸残基有关，而CD28在通过该“YxxM”结构进行的细胞内信号传递中发挥重要作用。进一步有报道，在CTLA-4的胞浆区也有“YxxM”序列，为“YVKM(Tyr-Val-Lys-Met)”，被刺激后，SYP与这一序列相关。
CD28在淋巴细胞和外周血T细胞中特异性表达，而CTLA-4在活化的T细胞中特异性表达(细胞工程增刊，“粘附分子手册”，Shujunsha，93-102页(1994)；同上，120-136页；实验医学增刊，“生物科学术语库，免疫”，Yodosha，94-98页(1995)；实验医学增刊，“生物医学术语库，细胞内信号传递”，Yodosha，58-59页(1997)；Nihon Rinsho，55卷，第6期，215-220页(1997))。
现已认识到，T细胞功能(活化和抑制T细胞的功能)的调节中，多种分子如协同刺激分子(CD28，CD80(B7-1)，CD86(B7-2)等)间的相互作用，以及与CTLA-4的协同作用(即通过这些分子的结合而发生的细胞粘附)的重要性，这引起人们这些分子与疾病间关系的关注，和通过调节这些分子的功能对疾病进行治疗的关注。
如上所述，虽然基团可针对外来抗原活化其获得性免疫应答系统，它也具有免疫耐受，使其对其自身成分(自体抗原)不发生免疫应答。假如因某些原因破坏了免疫耐受，自身抗原反应性T细胞将以上述相同的机制被活化，导致免疫异常，并引起各种自身免疫病。
换而言之，由于正常组织中未受刺激的抗原提呈细胞(APC)在基团免疫系统正常时不表达协同刺激分子，T细胞均处于非应答状态，以便在有与自身抗原反应的自身抗原反应性T细胞存在时也能维持免疫耐受。已有人提出，在异常免疫状态下，更多的自身抗原反应性T细胞由于异常表达而活化，并不断表达协同刺激分子，从而引起自身免疫病。
最近基于这类观点，人们试图通过调节协同刺激信号的传递例如上述的CD28/CTLA-4和CD80/CD86的信号传递，达到治疗各种自身免疫病的目的。。
这些尝试仍未阐明通过协同刺激分子与相关分子间相互作用(即通过这些分子间结合进行细胞粘附)而活化T细胞的详细机制。也许该机制涉及其它未知分子。
最近，本发明者成功地从哺乳动物(人，小鼠和大鼠)中鉴定并分离了一种新的细胞膜表面分子，认为该分子能传递淋巴细胞，如T细胞活化所需的第二信号(协同刺激信号)，并通过信号传递以与上述“CD28”和“CTLA-4”相同的方式调控活化淋巴细胞，例如活化T细胞的功能，将该分子命名为“JTT-1抗原”或“JTT-2”(日本专利申请1999年29599号；WO98/38216，国际免疫学，卷12，期1，页51-55，2000)。后来本发明者改称这些分子为AILIM(可诱导活化的淋巴细胞免疫调节分子)。
经本发明者研究，获得这一新分子AILIM的如下知识(1)“CD28”可通过细胞间粘附作用传递淋巴细胞，如T细胞活化所需的重要协同刺激信号；“CTLA-4”可通过与上述信号协同控制活化的淋巴细胞，如活化的T细胞的功能。它们均是淋巴细胞，如T细胞表面的分子。AILIM与这两种分子有以下相似性。
1. 20个或更多氨基酸残基，包括半胱氨酸残基是高度保守的。
2.作为配体结合区必需的脯氨酸重复序列“Pro-Pro-Pro(PPP)”在胞外区为保守的。
3.作为信号传递区所必需的序列“Tyr-Xaa-Xaa-Met(YxxM)(Xaa和X代表任何氨基酸)在胞浆区为保守的。
4.编码“小鼠AILIM(小鼠JTT-1抗原)”的基因位于小鼠染色体“IC3”，小鼠“CD28”和“CTLA-4”的基因也如此。
(2)在以与“CD28”和“CTLA-4”相同的方式发挥介导细胞间粘附之功能方面，“AILIM(JTT-1抗原)”具有调节胸腺细胞和淋巴母细胞、以及受有丝分裂原(如ConA)刺激的淋巴瘤细胞之间细胞粘附的能力。
(3)AILIM至少在胸腺细胞、受有丝分裂原如ConA刺激的淋巴母细胞(活化的T淋巴母细胞和活化的B淋巴母细胞)、外周血淋巴细胞、以及胸腺瘤细胞中强烈表达。
(4)抗AILIM(JTT-1抗原)的抗体可显著刺激人的外周血淋巴细胞增殖，抗CD3的单克隆抗体的共同存在可诱导更强的增殖，所述CD3由TCR/CD3复合物构成，它接受活化T细胞所必需的来自抗原提呈细胞的第一信号。
(5)通过给予抗AILIM(JTT-1抗原)的抗体可缓解实验型变应性脑脊髓膜炎(EAE)的病情。
(6)通过给予抗AILIM(JTT-1抗原)的抗体可缓解肾小球基底膜(GMB)肾炎模型大鼠的病情。
在本发明人报道了对AILIM的鉴定和特点分析后，Kroczek等人的工作小组报道了对一个名为ICOS(可诱导的协同刺激分子)或8F4的分子的鉴定，它是与AILIM等同的来自人的分子，将它命名为8F4(自然，卷397，第263-266页，1999；WO99/15553)。
另一方面，最近鉴定了称为B7h，B7RP-1，GL50或LICOS的新分子，认为它是与协同刺激分子AILIM相互作用的配体(自然，卷402，期6763，页827-832，1999；自然医学，卷5，期12，页1365-1369，1999；免疫学杂志，卷164，页1653-1657，2000；现代生物学，卷10，期6，页333-336，2000)。
对AILIM(ICOS)和B7RP-1(B7h，GL50，LICOS)这两种新分子作为上述淋巴细胞如T细胞的活化，以及调控活化细胞的功能所必需的协同刺激信号传导途径的鉴定，揭示在AILIM(ICOS)和B7RP-1(B7h，GL50，LICOS)之间，除已知的第一和第二信号途径，即由CD28和CD80(B7-1)/CD86(B7-2)，CTLA4和CD80(B7-1)/CD86(B7-2)介导的信号传递途径外，存在第三条途径。
对这些新分子的生物功能，通过这些分子间第三协同刺激信号的传递而对淋巴细胞如T细胞进行的功能调控，以及这种新的信号传递途径与疾病之间的关系均仍在研究中。
发明公开本发明旨在揭示一种新分子AILIM的生物功能，它象“CD28”和“CTLA-4”一样，是传导淋巴细胞，如T细胞活化所必需的第二信号(协同刺激信号)，并通过与该信号作用调控活化的淋巴细胞，如活化的T细胞的分子的功能的分子；揭示AILIM表达与疾病的关系；提供一种方法和一种药物，它们可用于抑制依赖于AILIM表达模式的多种疾病的进展，或通过医学和药学方法(药物如小分子化合物和抗体)调控AILIM的生物功能来治疗这些疾病。
本发明者研究了哺乳动物AILIM的生物功能，AILIM在多种细胞中的表达模式，AILIM表达与疾病的关系，结果发现了除上述现有知识以外的如下知识，完善本发明。
(I)在正常小鼠淋巴组织胸腺的T细胞中，以相同的方式在强表达CD3的细胞中发现了AILIM的强表达，证实这两种表达相关。相反，另一种协同刺激分子CD28的表达随CD3表达的增高而降低。在小鼠正常胸腺来源的T细胞中，AILIM和CD28的表达动态相反。CD4-CD8-T细胞中，AILIM和CD28均不表达。正常小鼠胸腺的T细胞中，CD28的表达在CD4+CD8+T细胞中最强，在(经历了以下细胞分化的)CD4-CD8+T细胞或CD4+CD8-T细胞中表达降低。相反，在正常小鼠胸腺细胞中，AILIM的表达在CD4+CD8+T细胞中仅检出微量，但在(经历了以下细胞分化的)CD4-CD8+T细胞或CD4+CD8-T细胞中强表达。正常小鼠胸腺T细胞中，AILIM的表达区别于CD28表达之处，不仅在于与CD3表达的关系，也在于与CD4和CD8的表达的关系。
(II)在正常小鼠淋巴组织脾脏和淋巴节的T细胞中，AILIM的表达相对于小鼠胸腺T细胞中的很少，CD4+T细胞中仅有极少数表达AILIM(大约占CD4+T细胞的1～3％)。
(III)在疮疱丙酸杆菌(Propionibacterium acnes)和LPS(脂多糖)诱导的小鼠肝炎模型中，肝组织来源的T细胞(单核细胞)中的AILIM表达显著。这种表达远高于正常小鼠脾脏或淋巴节T细胞来源的CD4+细胞的表达。
(IV)在健康人外周血细胞中，AILIM阳性细胞大多数是CD4+CD8-细胞，而且AILIM阳性细胞大多数是T细胞。健康人外周血B细胞仅微量表达AILIM。
(V)在类风湿性关节炎(RA)患者关节滑液中浸润的T细胞(CD4+T细胞，和CD4-细胞)中，AILIM的表达较同一患者的外周血T细胞及健康人外周血T细胞中的明显增高。
(VI)骨关节炎(OA)患者关节滑液的CD4+T细胞中，AILIM阳性细胞比率明显增高。进行性系统性硬化症(PSS)患者的CD4+T细胞中，AILIM阳性细胞比率也明显增加。
(VII)用离子导体与抗CD3抗体，伴刀豆球蛋白A(ConA)，或PMA(十四烷酰佛波醇乙酸酯联合刺激小鼠淋巴组织来源的T细胞3到6小时后，AILIM的表达增加，并证实刺激约12小时后AILIM表达最高。刺激后24小时或更长时间AILIM高表达，甚至刺激后48小时仍维持这一水平。
(VIII)用PMA和离子导体活化人外周血T细胞(CD4阳性细胞和CD8阳性T细胞)，刺激后约8小时AILIM高表达，用抗CD3抗体联合抗AILIM抗体，或抗CD3抗体联合抗CD28抗体，也可诱导人外周血细胞中的AILIM高表达。
(IX)在产生Th2型细胞因子的T细胞系(例如，DC10，MS202，CD28KO，EL-4)中有AILIM的组成型表达。在这些细胞系中AILIM的表达与CD28的表达同样高，或比CD28更高。
(X)当在包被了本发明抗AILIM抗体和抗CD3抗体的培养板中保温正常小鼠或大鼠脾或胸腺来源的T细胞，或正常健康人外周血T细胞时，可诱导T细胞产生细胞因子(IFNγ，IL-4，TNFα，IL-2，IL-10)及诱导T细胞增殖。
(XI)当用ConA或PMA刺激外周血T细胞，并在包被本发明抗AILIM抗体和抗CD3抗体的培养板中保温时，可诱导T细胞产生细胞因子及细胞增殖。这与经ConA或PMA刺激的外周血T细胞，在包被抗CD28抗体和抗CD3抗体的培养板上保温后的水平相同。
(XII)分离自正常脾和正常胸腺的胸腺细胞和脾细胞(分别去除贴壁细胞)通过在包被抗CD3抗体的培养板中保温而引发T细胞应答，此时加入本发明的抗AILIM抗体，则可抑制T细胞产生细胞因子(例如干扰素γ(IFNγ)，白细胞介素4(IL-4))并抑制T细胞增殖。而且，用抗AILIM抗体抑制T细胞应答(例如上述细胞因子的产生，细胞增殖)时，依赖于该抗体浓度。相反，用抗CD28抗体替代抗AILIM抗体时，T细胞应答增强，这与使用抗AILIM抗体的结果不同。
(XIII)受疮疱丙酸酐菌和LPS(脂多糖)诱导的肝炎模型动物接受了本发明的抗AILIM抗体后，血中IFN-γ的增加受到显著抑制，并依赖于抗体浓度，GOP/GPT的增加也受到明显抑制。
(XIV)由死结核杆菌诱导的关节炎模型动物接受本发明的抗AILIM抗体后，脚掌肿胀受到明显抑制，并依赖于抗体浓度，关节炎中各种参数的增加也受到显著抑制。
(XV)给予移植物抗宿主病(GVHD)模型动物以本发明的抗AILIM抗体，移植物抗宿主反应(GVH反应)产物IgG和IgE的产生受到明显抑制，抗-dsDNS抗体，一种自身抗体效价指标的增加也明显抑制。
(XVI)模型动物用致敏绵羊红细胞(SRBC)作为外来抗原(致敏后即刻或几天后)诱导产生针对过量外来抗原的抗体，对该动物施予本发明的抗AILIM抗体后，抗外来抗原SRBC的抗体的增加受到明显抑制。该抑制效应明显强于施予CTLA4-Ig后的作用。
(XVII)模型动物用致敏NP-KLH作为外来抗原诱导(致敏即刻或几天后)产生针对过量外来抗原的抗体，对动物施予本发明的抗AILIM抗体后，抗NP-KLH抗体的产生受到明显抑制。
(XVIII)来源于不同正常供体的外周血单核细胞(PBMC)和T细胞进行同种异体混合淋巴细胞反应(MLR)时，抗AILIM抗体可明显抑制T细胞增殖。
本发明的药用组合物可作为调节体内各种反应的有效药物，所述反应中涉及AILIM介导的向AILIM表达细胞中转导协同刺激信号(例如，AILIM表达细胞的增殖，其产生细胞因子，其免疫细胞溶解或凋亡，及诱导针对AILIM表达细胞的抗体依赖性细胞毒作用)，和/或本发明的药用组合物可作为药物阻止各种涉及AILIM介导之信号转导的疾病的突发和/或进展，及治疗或预防这些疾病。
具体地，本发明的药用组合物能调节(抑制或促进)AILIM表达细胞的增殖，或调节(抑制或促进)AILIM表达细胞产生细胞因子(例如，干扰素γ，或白细胞介素4)，并能阻止与AILIM介导的信号转导有关的各种生理现象所触发的各种疾病状况，还可以治疗或阻止所述各种疾病。
使用本发明药用组合物可抑制，阻止和/或治疗多种疾病，例如关节炎(例如类风湿性关节炎；RA，骨关节炎OA)，炎症(例如，肝炎)，移植物抗宿主反应(GVH)，移植物抗宿主疾病(GVHD)，伴随组织或器官移植的免疫排斥反应，外源抗原或自身抗原触发的免疫应答(例如，产生针对抗原的抗体，细胞增殖，产生细胞因子)。
此外，本发明药用组合物可用于治疗或预防采用各种类固醇抗炎的反复发作的炎症。
而且，本发明药用组合物可用于治疗或阻止炎性疾病，如伴有各种关节炎的炎症(例如类风湿性关节炎，骨关节炎)，肺炎，肝炎(包括病毒性肝炎)，伴有传染病的炎症，炎性肠疾病，肠炎，肾炎(肾小球肾炎，肾纤维变性的伴随炎症)，胃炎，血管炎，胰腺炎，腹膜炎，支气管炎，心肌炎，脑炎，心肌缺血后再灌注损伤性炎症(心肌缺血再灌注损伤)，组织和器官移植后免疫排斥性炎症，烧伤，各种皮肤炎症(牛皮癣，过敏性接触型皮炎，苔癣等慢性皮肤炎症疾病)，多器官衰竭性炎症，PTCA或PTCR术后炎症，动脉硬化伴随炎症，和自身免疫性甲状腺炎。
具体地，对本发明作如下描述(1)到(32)(1)一种阻止，治疗或预防关节炎的药用组合物，其包含一种可调节AILIM介导的信号转导的物质，和一种可药用的载体。
(2)上述(1)中的药用组合物，所述物质具有抑制AILIM表达细胞增殖或产生细胞因子的活性。
(3)上述(1)或(2)中的药用组合物，所述细胞因子是由Th1型T细胞产生的干扰素γ，或由Th2型T细胞产生的白细胞介素4。
(4)上述(1)到(3)之一中的药用组合物，所述关节炎是类风湿性关节炎。
(5)上述(1)到(3)之一中的药用组合物，所述关节炎是骨关节炎。
(6)上述(1)到(5)之一中的药用组合物，所述物质是一种蛋白。
(7)上述(6)中的药用组合物，所述蛋白选自a)一种抗体，其与AILIM或其一部分结合；b)一种多肽，其包含AILIM的完整胞外区或其一部分；c)一种融合多肽，其包含AILIM的完整胞外区或其一部分以及免疫球蛋白重链的完整恒定区或其一部分；
d)一种多肽，其与AILIM结合。
(8)上述(1)到(5)之一的药用组合物，所述物质是非蛋白物质。
(9)上述(8)中的药用组合物，所述非蛋白物质是DNA，RNA，或化学合成的化合物。
(10)一种阻止，治疗或预防炎症的药用组合物，其包含一种具有调节AILIM介导的信号转导的活性的物质，及一种可药用的载体。
(11)上述(10)中药用组合物，所述物质具有抑制AILIM表达细胞增殖或产生细胞因子的活性。
(12)上述(11)中药用组合物，所述细胞因子是由Th1型T细胞产生的干扰素γ，或由Th2型T细胞产生的白细胞介素4。
(13)上述(10)到(12)之一中的药用组合物，所述炎症是肝炎。
(14)上述(10)到(12)之一中的药用组合物，所述物质是蛋白。
(15)上述(14)中的药用组合物，其中所述蛋白物质选自a)一种抗体，其与AILIM或其一部分结合；b)一种多肽，其包含AILIM的完整胞外区或其一部分；c)一种融合多肽，其包含AILIM的完整胞外区或其一部分以及免疫球蛋白重链的完整恒定区或其一部分；d)一种多肽，其与AILIM结合。
(16)上述(10)到(13)之一中的药用组合物，所述物质是非蛋白物质。
(17)上述(16)中的药用组合物，所述非蛋白物质是DNA，RNA或一种化学合成的化合物。
(18)一种药用组合物，其用于阻止，治疗或预防防移植物抗宿主反应以及移植物抗宿主反应或组织或器官移植后伴有的免疫排斥，其包含一种具有调节AILIM介导的信号转导的活性的物质，和一种可药用的载体。
(19)上述(18)中的药用组合物，所述物质具有抑制AILIM表达细胞增殖或产生细胞因子的活性。
(20)上述(19)中的药用组合物，所述细胞因子是由Th1型T细胞产生的干扰素γ或由Th2型T细胞产生的白细胞介素4。
(21)上述(18)到(20)之一的药用组合物，所述物质是蛋白质。
(22)上述(21)中的药用组合物，所述蛋白物质选自a)一种抗体，其与AILIM或其一部分结合；
b)一种多肽，其包含AILIM的完整胞外区或其一部分；c)一种融合多肽，其包含AILIM的完整胞外区或其一部分以及免疫球蛋白重链的完整恒定区或其一部分；d)一种多肽，其与AILIM结合。
(23)上述(18)到(20)之一的药用组合物，所述物质是非蛋白物质。
(24)上述(23)中的药用组合物，所述非蛋白物质是DNA，RNA或一种化学合成的化合物。
(25)一种阻止由外来抗原或自身抗原触发的免疫应答的药用组合物，其包含一种具有调节AILIM介导之信号转导的活性的物质，和一种可药用的载体。
(26)上述(25)中的药用组合物，所述免疫应答是产生针对所述抗原的抗体，细胞增殖，或产生细胞因子。
(27)上述(25)或(26)中的药用组合物，所述物质具有抑制AILIM表达细胞增殖或产生细胞因子的活性。
(28)上述(27)中的药用组合物，所述细胞因子是由Th1型T细胞产生的干扰素γ，或由Th2型T细胞产生的白细胞介素4。
(29)上述(25)到(28)之一中的药用组合物，所述物质是蛋白质。
(30)上述(29)中的药用组合物，所述蛋白选自a)一种抗体，其与AILIM或其一部分结合；b)一种多肽，其包含AILIM的完整胞外区或其一部分；c)一种融合多肽，其包含AILIM的完整胞外区或其一部分以及免疫球蛋白重链的完整恒定区或其一部分；d)一种多肽，其与AILIM结合。
(31)上述(25)到(28)之一的药用组合物，所述物质是非蛋白物质。
(32)上述(31)中的药用组合物，所述非蛋白物质是DNA，RNA，或一种化学合成的化合物。
通过定义产生抗体的常规方法及本发明的术语来详述本发明。
此处，“哺乳动物”是指人，牛，山羊，兔，小鼠，大鼠，仓鼠，豚鼠；优选人，兔，大鼠，小鼠，或仓鼠，尤其优选人。
此处“AILIM”代表“可诱导活化的淋巴细胞免疫调节分子”。该AILIM是一种新的哺乳动物细胞膜表面分子，是最近被JP-A Hei 11-29599(日本专利申请1998年62217)鉴定、分离并报道的，该专利申请对应于WO 98/38216(PCT/JP98/00837)，这种分子本发明者称为“JTT-1抗原”或“JTT-2抗原”。
具体在上述专利申请中，本发明的“AILIM”指包含SEQ ID NO1的氨基酸序列的人AILIM(人JTT-1抗原)，包含SEQ ID NO4或6的氨基酸序列的大鼠AILIM(大鼠JTT-1抗原)，包含SEQ ID NO5的氨基酸序列的小鼠AILIM(小鼠JTT-1抗原)。
在上述两个由本发明者公开的专利申请之后，Kroczek等在两篇发表文献中报道与人AILIM完全一致的一种人源分子。他们将该人源分子命名为ICOS(可诱导的协同刺激因子)或8F4(WO 99/15553；自然卷397，页263-266，1999)。被称为ICOS或8F4的人源分子也引入本文作为与人AILIM一致的分子。
而且，本文中“AILIM”也包括具有基本相同于上述每种哺乳动物之AILIM的氨基酸序列的多肽，尤其优选人的AILIM(是对应于WO 98/38216的JP-A Hei 11-29599中SEQ ID NO2的氨基酸序列)。
这里所谓“具有基本相同氨基酸序列”是指多肽的序列中有多个氨基酸，优选1-10个，更优选1-5个被替代、缺失、和/或修饰；以及指多肽的序列中多个氨基酸，优选1-10个，更优选1-5个被加至所示序列中，只要该多肽与具有文献所示氨基酸序列的多肽具有相同的生物学特点。
这些氨基酸的替代、缺失或插入可根据通常的方法实现(实验医学增刊，“遗传工程手册”(1992)；等)。
例如合成性寡核苷酸定点诱变(缺口型二倍体法)，用亚硝酸盐或亚硫酸盐处理后随机引入的点突变，用Bal31酶等产生缺失突变的方法，盒式诱变，接头扫描法，错误掺入法，错配引物法，DNA片段合成法等。
合成性寡核苷酸定点诱变(缺口型二倍体法)可如下实施。将待诱变区克隆至含有琥珀突变的M13噬菌体载体，产生单链噬菌体DNA。不含琥珀突变的M13载体的RF I DNA经限制性内切酶处理而线性化，将DNA与上述单链噬菌体DNA混合，变性，退火，形成“缺口型二倍体DNA”。已引入突变的合成性寡核苷酸与该缺口型二倍体DNA杂交，用DNA多聚酶和DNA连接酶制备闭环双链DNA。用该DNA转化E.coli(大肠杆菌)mutS细胞(为错配修复活性缺陷型)。用已生成的噬菌体感染不具备抑制物活性的E.coli细胞，仅筛出无琥珀突变的噬菌体。
经诸如亚硝酸盐处理而引入点突变的方法如下。如果用亚硝酸盐处理DNA，碱基将脱氨基，使腺嘌呤变成次黄嘌呤，胞嘧啶变成尿嘧啶，鸟嘌呤变成黄嘌呤。如果将脱氨基的DNA引入细胞，“AT”和“GC”分别被“ GC”和“AT”替换，因为在DNA复制时次黄嘌呤，尿嘧啶和黄嘌呤分别与胞嘧啶，腺嘌呤和胸腺嘧啶形成碱基对。实际上，亚硝酸盐处理的单链DNA片段与“缺口型二倍体DNA”杂交，然后用与合成性寡核苷酸定点诱变(缺口型二倍体法)相同的方法分离突变株。
本文中“有丝分裂原”也称为有丝分裂因子，是一种诱导细胞分裂的物质。免疫学上，它是指诱导淋巴细胞多克隆母细胞化及诱导细胞分裂的物质。其实例有植物血凝素例如PHA和PWM，刀豆球蛋白A(ConA)，脂多糖，链球菌溶血素S，和抗淋巴细胞抗体。已知ConA和PHA仅作用于T淋巴细胞，脂多糖仅作用于B淋巴细胞，PWM作用于这两种淋巴细胞。
本文中术语“淋巴母细胞”也称为大淋巴细胞，淋巴母细胞或免疫母细胞，是指存在于淋巴组织(淋巴节，脾，胸腺，骨髓，淋巴管，扁桃腺等)和血中的大淋巴细胞。
本文中术语“活化的淋巴细胞”可指下述的淋巴细胞，但又不局限于此。例如经某些刺激活化的淋巴细胞。淋巴细胞分为T细胞，B细胞和自然杀伤细胞。T细胞分为CD4阳性细胞和CD8阳性细胞。本发明中“活化的淋巴细胞”主要包括活化的T细胞，活化的B细胞，和活化的自然杀伤细胞，而活化的T细胞包括活化的CD4阳性细胞和活化的CD8阳性细胞。
CD4阳性T细胞通过与抗原提呈细胞提呈的抗原反应，可分泌多种细胞因子(IFNγ，IL-4，等)，表达这些细胞因子的受体，扩大自身大小，开始细胞分裂，增殖，并被活化。活化的CD4阳性T细胞包括处于上述状态的细胞。
当CD8阳性细胞与抗原反应时表达IL-2R，当IL-2作用于IL-2R，细胞分化成具有细胞毒作用的CTL。当CTL识别带有相同抗原肽/MHCI类复合物的靶细胞时，破坏并杀伤该细胞。当CD8阳性T细胞分化成CTL时，胞浆中颗粒增多。这些颗粒包括各种高分子量蛋白，其代表是穿孔素。穿孔素类似于由补体第五到第九成分构成的MAC，可在靶细胞膜上打孔。所述颗粒还包括丝氨酸蛋白酶，LT和蛋白聚糖。CD8阳性细胞受到抗原刺激并分化成CTL后，将分泌淋巴细胞因子，如IFNγ，LT，TNF或IL-2。活化的CD8阳性T细胞包括处于上述状态的细胞。
当T细胞与血凝素(植物血凝素，PHA)或刀豆球蛋白A(ConA)反应时，显示爆发成形现象。活化的T细胞包括处于上述状态的细胞。
B细胞表达BT分子，经刺激辅助T细胞表面的CD28和TCR使之活化，从而表达CD40L，或产生淋巴因子。当这些细胞受到刺激时，细胞体积增大或增殖。活化的B细胞包括这些状态。本发明中，活化的B细胞包括这些分泌抗体的细胞(抗体分泌细胞和浆细胞)。
活化的自然杀伤细胞是指对上述肿瘤细胞或感染病毒的细胞有细胞毒作用的细胞。本发明中活化的淋巴细胞包括受ConA刺激的胸腺细胞。
此处“活化的淋巴母细胞”包括上述淋巴母细胞用上述“有丝分裂原”如ConA刺激后产生的活化“淋巴母细胞”。
这里术语“静息态淋巴细胞”有时指未活化的淋巴细胞，其未接受刺激变成活化细胞，与上述活化淋巴细胞相反。
本发明“AILIM表达细胞产生的细胞因子”中的“细胞因子”指由AILIM表达细胞(尤其是T细胞)生成的任意细胞因子。
T细胞有Th1型和Th2型T细胞，本发明的细胞因子尤其是指由Th1型生成的细胞因子和/或由Th2型生成的任意细胞因子。
Th1型T细胞生成的细胞因子如IFN-γ，IL-2，TNF，IL-3，由Th2型T细胞生成的细胞因子如IL-3，IL-4，IL-5，IL-10，TNF(细胞，卷30，期9，页343-346，1998)。
本发明的“物质”，尤其“具有调节经AILIM介导的信号转导的活性的物质”，更尤其“拥有抑制AILIM表达细胞增殖或产生细胞因子的活性的物质”，是指自然界中存在的天然物质，或人工制备的物质。
这里“经AILIM介导的信号转导”是指通过AILIM介导的信号转导，其导致上述或如下的AILIM表达细胞表型的改变(细胞增殖，活化，失活，凋亡，和/或产生细胞因子的能力的改变)。
“物质”主要分为“蛋白物质”和“非蛋白物质”。“蛋白物质”如下述的多肽，抗体(多克隆抗体，单免隆抗体，或单抗的一部分)。
当所述物质是抗体时，优选单克隆抗体。当所述物质是单抗时，其不仅包括非人哺乳动物来源的单抗，而且包括如下的重组嵌合单抗，重组人源化单抗和人型单克隆抗体。
当所述物质是多肽时，其包括所述多肽，所述多肽的片段(寡肽)，其融合多肽，及其化学修饰物。寡肽包含5-30个氨基酸，优选5-20个氨基酸的肽。化学修饰可基于不同目的，例如增加体内给药后血中半衰期，或增加对降解的耐受，或增加口服给药后胃肠道的吸收。
多肽实例如下(1)包含AILIM胞外区全部或一部分的多肽。
(2)包含AILIM胞外区全部或一部分与免疫球蛋白重链恒定区的融合多肽。
(3)与AILIM结合的多肽。
“非蛋白”是指DNA，RNA，和化学合成的化合物。
这里“DNA”是指“含所述DNA的部分核苷酸序列的DNA或其化学修饰DNA”，其根据上述AILIM(优选人AILIM)的编码DNA的核苷酸序列(包括cDNA和基因组DNA)来设计，可用作反义DNA药物。该反义DNA可经与编码AILIM的DNA或RNA杂交特异性抑制编码AILIM的DNA转录成mRNA，或抑制mRNA翻译成蛋白。
“部分核苷酸序列”是指含有任意区域中任意个核苷酸的部分核苷酸序列。所述部分核苷酸序列包含5-100个连续核苷酸，优选5-70，更优选5-50，最优选5-30。
将所述DNA用作反义DNA药物时，该DNA序列可通过化学修饰，延长给药后血药浓度的半衰期(稳定性)，增加胞浆内膜对该DNA的通透性，增加降解抗性或增加口服该DNA在胃肠道的吸收。化学修饰包括对磷酸键，核糖，核苷酸碱基，糖部分，寡核苷酸结构中3′端和/或5′端的修饰。
对磷酸键的修饰包括使一或多个磷酸二酯键(D-oligo)，硫代磷酸酯键，二硫代磷酸酯键(S-oligo)，甲基膦酸酯(MP-oligo)，氨基磷酸盐键，非磷酸酯键，甲基硫代磷酸酯键，或它们的组合发生转化。核糖的修饰包括向2′-氟核糖或2′-邻-甲基核糖转变。核苷酸碱基修饰包括向5-丙炔尿嘧啶或2-氨基腺嘌呤转变。
这里“RNA”是指“含所述RNA的部分核苷酸序列的RNA或其化学修饰的RNA”，其根据上述AILIM(优选人AILIM)的编码RNA的核苷酸序列来设计，可用作反义DNA药物。该反义RNA可通过与编码AILIM的DNA或RNA杂交，抑制编码AILIM的DNA转录成mRNA，或抑制该mRNA翻译成蛋白。
“部分核苷酸序列”是指含有任意区域中任意个核苷酸的部分核苷酸序列。所述部分核苷酸序列包含5-100个连续核苷酸，优选5-70，更优选5-50，最优选5-30。
反义RNA序列中一部分可通过化学修饰，而延长给药后血药浓度半衰期(稳定性)，增加胞浆内膜对该RNA的通透性，增加降解抗性及促进口服RNA的胃肠道吸收。化学修饰的例子如对上述反义DNA应用的化学修饰。
“化学合成的化合物”是指除上述DNA，RNA和蛋白以外，分子量为约100-1000，优选100-800，更优选100-600的化合物。
上述“物质”的定义中包括的“多肽”是指AILIM(优选人AILIM)多肽链的一部分(片段)，优选AILIM胞外区的全部或一部分(可在该区域的N端和/或C端加入1到5个氨基酸)。
本发明中AILIM是穿透细胞膜的跨膜分子，其包含1或2条多肽链。
这里“跨膜蛋白”是指通过一次或多次穿透脂质双层的疏水肽区与膜相连的蛋白，其结构由三个主要区域构成，即胞外区，跨膜区，和胞浆区，在许多受体或细胞表面分子可见。这种跨膜蛋白以单体，与具有相同或不同氨基酸序列的另一链形成同型二聚体，异型二聚体或寡聚体的形式构成各种受体或细胞表面分子。
这里“胞外区”是指上述跨膜蛋白膜外区的全部或一部分。即指跨膜蛋白上，除了插入细胞膜的区域(跨膜区)以及紧接跨膜区而位于细胞浆中的区域(胞浆区)以外，剩余的区域的全部或一部分。
上述“蛋白物质”包括的“融合多肽”指一种融合多肽，其包含AILIM(尤其人AILIM)多肽胞外区的全部或一部分，以及“免疫球蛋白(Ig，尤其人的Ig)重链恒定区的全部或一部分”。优选该融合多肽是含有AILIM胞外区和人IgG重链恒定区的一部分的融合多肽，更优选该融合多肽包含AILIM胞外区以及人Ig重链(Fc)区，该区包括绞链区、CH2结构域和CH3结构域。IgG优选IgG1，AILIM优选来自人，小鼠或大鼠(尤其来自人)。
“人免疫球蛋白(Ig)重链恒定区的全部或一部分”在本文中指人源免疫球蛋白重链(H链)恒定区或Fc区，或其一部分。免疫球蛋白可以是任何类型和任何亚类。例如免疫球蛋白是IgG(IgG1，IgG2，IgG3和IgG4)，IgM，IgA(IgA1和IgA2)，IgD和IgE。优选免疫球蛋白是IgG(IgG1，IgG2，IgG3或IgG4)，或IgM。本发明特别优选的免疫球蛋白是人源的IgG(IgG1，IgG2，IgG3，或IgG4)。
免疫球蛋白有一个Y型结构单位，其中两条同源轻链(L链)和两条同源重链(H链)经二硫键(S-S键)组成四条链结构。轻链是由轻链可变区(VL)和轻链恒定区(CL)构成。重链是由重链可变区(VH)和重链恒定区(CH)构成。
重链恒定区中有些结构域的氨基酸序列是每一类(IgG，IgM，IgA，IgD和IgE)和每一亚类(IgG1，IgG2，IgG3，和IgG4，IgA1和IgA2)所固有的。
IgG(IgG1，IgG2，IgG3和IgG4)重链从N端开始依次由VH，CH1结构域，铰链区，CH2结构域，和CH3结构域构成。
类似地，IgG1重链从N端开始依次由VH，Cγ11结构域，绞链区，Cγ12结构域，和Cγ3结构域构成。IgG2重链从N端开始依次由VH，Cγ21结构域，绞链区，Cγ22结构域，和Cγ3结构域构成。IgG3重链从N端开始依次由VH，Cγ31结构域，绞链区，Cγ32结构域，和Cγ33结构域构成。IgG4重链从N端开始依次由VH，Cγ41结构域，绞链区，Cγ42结构域，和Cr43结构域构成。
IgA重链从N端开始依次由VH，Cα1结构域，绞链区，Cα2结构域，和Cα3结构域构成。
类似地，IgA1重链从N端开始依次由VH，Cα11结构域，绞链区，Cα12结构域，和Cα13结构域构成。IgA2重链从N端开始依次由VH，Cα2l结构域，绞链区，Cα22结构域，和Cα23结构域构成。
IgD重链从N端开始依次由N端VH，Cδ1结构域，绞链区，Cδ2结构域，和Cδ3结构域构成。
IgM重链从N端开始依次由VH，Cμ1结构域，Cμ2结构域，Cμ3结构域，和Cμ4结构域构成，无而IgG，IgA和IgD中具有的绞链区。
IgE重链从N端开始依次由VH，Cε1结构域，Cε2结构域，Cε3结构域和Cε4结构域构成，而无IgG，IgA和IgD所具有的绞链区。
IgG通过木瓜蛋白酶处理后，在绞链区二硫键的略偏N末端侧断裂，这些二硫键在此处连接两条重链，从而生成两个同源Fab和一个Fc，在Fab中由重链的VH加CH1片段与轻链通过一个二硫键连接，在Fc中由两个同源重链的绞链区，CH2结构域和CH3结构域组成的片段通过二硫键连接(参见“免疫学图谱”，原书第二版，南江堂出版，65-75页(1992)；和“最新医学科学的焦点免疫系统的识别机制”，南江堂，4-7页(1991)；等)。
即，上述“免疫球蛋白重链恒定区的一部分”是指免疫球蛋白重链恒定区中具有上述结构特征的部分，优选不含C1结构域的恒定区，或Fc区。具体如包含IgG，IgA和IgD的绞链区，C2结构域和C3结构域的区域，以及包含IgM和IgE的C2结构域，C3结构域，和C4结构域的区域。引起优选人源IgG1的Fc区。
上述的融合多肽的优点是，其可通过亲和层析利用蛋白A特异性结合免疫球蛋白片段的特点很方便地进行纯化，因为本发明的融合多肽以上述免疫球蛋白如IgG的恒定区的一部分(如Fc区)作为融合配对物。此外，由于可得到针对各种免疫球蛋白的Fc的各种抗体，因此可很容易地用抗该Fc的抗体对该融合多肽进行免疫分析。
“与AILIM结合的多肽”属于上述“物质”定义中的“多肽”。
“与AILIM结合的多肽”有已知B7h，B7RP-1，GL50或称为LICOS的分子(其为与AILIM相互作用的配体)的整个多肽或其一部分(自然，卷402，6763期，827-832页，1999；自然医学，卷5，12期，1365-1369页，1999；免疫学杂志，卷164，1653-1657页，2000；现代生物学，卷10，6期，333-336页，2000)。
优选所述多肽是含有上述配体(B7h，B7RP-1，GL50，LICOS)胞外区的全部或一部分的多肽，或含有该多肽的融合多肽，和免疫球蛋白(优选人的免疫球蛋白)重链恒定区的全部和一部分。这里的“胞外区”和“免疫球蛋白重链恒定区”概念与上述相同。
上述多肽、多肽的一部分(片段)和融合多肽，不仅可以用下面提到的重组DNA技术制备，而且可以用本领域已知的化学合成法和细胞培养法，或它们的改良法来制备。
本发明的“抗体”可以是抗哺乳动物AILIM(尤其是人AILIM)的多克隆抗体(抗血清)，或是单抗，优选单抗。
具体而言，所述抗体可以是能抑制AILIM表达细胞通过结合AILIM而增殖的抗体，或是能抑制AILIM表达细胞通过结合AILIM而产生干扰素γ或白细胞介素4的抗体。
本发明的抗体可以是用抗原免疫哺乳动物而获得的天然抗体，所述动物如小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠和兔子，所述抗原如表达本发明AILIM细胞(天然细胞，细胞系，肿瘤细胞等)、用重组DNA技术制备的可在其表面过量表达AILIM的转化体、构成AILIM的多肽、或包含AILIM多肽或AILIM胞外区的上述融合多肽。本发明的抗体也包括可用重组DNA技术制备的嵌合抗体和人源化抗体(CDR移植抗体)，以及可通过产生人源抗体的转基因动物制备的人源化抗体。
单抗包括具有IgG，IgM，IgA，IgD或IgE的任何一种同种型的抗体。最好是IgG或IgM。
可用已知方法制备多抗(抗血清)或单抗。如用上述抗原免疫哺乳动物，优选小鼠，大鼠，仓鼠，豚鼠，兔，猫，狗，猪，山羊，马，或牛，更优选小鼠，大鼠，仓鼠，豚鼠或免，必要时可使用弗氏佐剂。
从如此免疫的动物血清获取多抗。此外，单抗可如下制备。从如上述免疫的动物获得产生抗体的细胞，用于与不能产生自身抗体的骨髓瘤细胞一起制备杂交瘤。对杂交瘤进行克隆，筛选能产生针对免疫该哺乳动物所用抗原具有特异性亲和力的单克隆抗体的克隆。
具体地，用如下方法可产生单抗。以上述抗原作免疫原，一次或多次经皮下、肌肉、静脉、通过足垫或腹腔内途径注射或植入非人哺乳动物，具体为小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠、或兔子，优选小鼠、大鼠或仓鼠(包括可产生其它动物来源的抗体的转基因动物，如下述产生人的抗体的转基因小鼠)，必要时可加用弗氏佐剂。通常第一次免疫后每1到14天免疫一次共1到4次。末次免疫后1到5天获取该哺乳动物的抗体产生细胞。免疫频率和间隔期可根据如所用免疫原的特点作适当安排。可用Kohler和Milstein的方法(自然，卷256，页495-497(1975))和其修饰方法制备分泌单抗的杂交瘤。即，将用上述方法免疫后的非人哺乳动物脾脏，淋巴节，骨髓，或扁桃体(优选脾)中所含有的抗体产生细胞，与优选来源于哺乳动物，如小鼠，大鼠，豚鼠，仓鼠，兔或人，更优选小鼠，大鼠或人的不能产生自身抗体的骨髓瘤细胞融合，从而制备杂交瘤。
例如小鼠来源的骨髓瘤P3/X63-AG8.653(653)，P3/NSI/1-Ag4-1(NS-1)，P3/X63-Ag8.U1(P3U1)，SP2/0-Ag14(Sp2/0，SP2)，PAI，F0，或BW5147，大鼠来源的骨髓瘤210RCY3-Ag.2.3.，或人源骨髓瘤V-266AR1，GM1500-6TG-A1-2，UC729-6，CEM-AGR，DIR11，或CEM-T15可作为细胞融合用的骨髓瘤。
通过在微量滴定板中培养杂交瘤，用RIA和EILSA等酶免疫分析法测定有杂交瘤生长的孔中培养上清对上述免疫所用免疫原的活性，可筛选产生单抗的杂交瘤克隆。
可通过杂交瘤的体外或体内培养，如在小鼠，大鼠，豚鼠，仓鼠或兔子(优选小鼠或大鼠，更优选小鼠)的腹水中培养，从所得培养上清或哺乳动物腹水中分离抗体，即获得单克隆抗体。
可根据诸如培养细胞的特点、受试主体、及培养方法的各种条件，用已知营养培基，或从已知能培养、维持和贮存产单克隆抗体之杂交瘤的基本营养培基衍生的任何营养培养基体外培养杂交瘤。
基本培基有低钙浓度的培养基和高钙浓度的培基，前者如Ham′s F12培养基，MCDB 153培基，或低钙浓度MEM培基，后者如MCDB 104培基，MEM培基，D-MEM培基，RPMI 1640培基，ASF 104培基，或RD培基。基本培基根据不同目的可含有血清，激素，细胞因子，和/或各种无机或有机物质。
可用饱和硫酸铵沉淀法，优球蛋白沉淀法，己酸法，辛酸法，离子交换层析(DEAE或DE52)，利用抗免疫球蛋白柱或蛋白A柱的亲和层析法从培养上清或腹水中分离纯化单抗。
“重组嵌合单抗”是用基因工程制备的单抗，尤其指嵌合抗体如小鼠/人嵌合单克隆抗体，其中可变区源于非人哺乳动物(小鼠，大鼠，仓鼠等)免疫球蛋白，而恒定区源自人免疫球蛋白。
源自人免疫球蛋白的恒定区有每种同种型，如IgG(IgG1，IgG2，IgG3，IgG4)，IgM，IgA，IgD，和IgE固有的氨基酸序列。重组嵌合单抗的恒定区可能是人免疫球蛋白的任何同种型。最好是人IgG的恒定区。
嵌合单抗可用如下方法产生。当然，产生方法不限于此。
可根据实验医学增刊，卷1.6，10期(1988)；和已审查并公开的日本专利申请(JP-B)1991年73280的方法制备小鼠/人嵌合单抗。即，将CH基因(编码H链恒定区的C基因)与CL基因(编码L链恒定区的C基因)插入同一或不同的表达载体，用该表达载体转化宿主细胞，然后培养转化体，其中CH基因获自产小鼠单抗之杂交瘤中编码小鼠单抗的DNA上活化VH基因(编码H链可变区的重排VDJ基因)下游编码人免疫球蛋白的DNA，CL基因获自产小鼠单抗之杂交瘤中编码小鼠单抗DNA上活化VL基因(编码L链可变区的重排VJ基因)下游编码人免疫球蛋白的DNA。
具体地，用常规方法提取产小鼠单抗之杂交瘤的DNA，用适当限制性内切酶(例如EcoRI和HindIII)消化，电泳(例如用0.7％琼脂糖凝胶)，经Southern杂交分析。电泳胶经溴化乙锭染色，照相，胶用分子量标志定位，用水洗胶两次，在0.25M HCl中浸15分钟。然后将胶浸入0.4N NaOH溶液10分钟，轻轻摇动。用常规方法将DNA转膜4小时。回收膜，用2×SSC洗两次。膜充分干燥后，在75℃烘3小时。烘烤后，将膜用0.1×SSC/0.1％SDS 65℃处理30分钟。然后浸入3×SSC/0.1％SDS。所得膜在塑料袋中用预杂交液65℃处理3到4小时。
接下来，32P标记的探针DNA和杂交液均加入袋中，65℃反应约12小时。杂交后，在适当盐浓度，反应温度和时间下洗膜(例如2×SSC-0.1％SDS，室温，10分钟)。将膜放入装有少量2×SSC的塑料袋中，密封袋后放射自显影。
用上述Southern杂交确定编码小鼠单抗H链和L链的重排VDJ基因和VJ基因。经蔗糖密度梯度离心分离含有已鉴定的DNA片段的区域，将其插入噬菌体载体(例如Charon 4A，Charon28，λEMBL3，λEMBL4等)，并用此噬菌体载体转染E.coli(例如LE392，NM539等)产生基因组文库。基因组文库用菌斑杂交法，如Benton-Davis法(科学，卷196，180-182页(1977))，用适当探针(H链J基因，L链(κ)J基等)筛选，从而获取含重排VDJ基因或VJ基因的阳性克隆。通过限制性内切酶作图，并确定所获得克隆的核苷酸序列，证实获得的基因含有所需的重排VH(VDJ)基因或VL(VJ)基因。
分别分离用作抗体嵌合的人CH基因和人CL基因。例如，用人IgG1生成嵌合抗体时，分离到Cγ1基因作为CH基因，Cκ基因作为CL基因。可用分别对应于人Cγ1基因和人Cκ基因的小鼠Cγ1基因和Cκ基因作为探针，利用小鼠免疫球蛋白基因和人免疫球蛋白基因核苷酸序列间的高度同源性，从人基因组文库中分离这些基因。
具体是，从人λCharon 4A HaeIII-AluI基因组丈库中分离出含有人Cκ基因和一个增强子区的DNA片段(细胞，卷15，1157-1174页(1978))，所用探针可以是Ig146克隆的3Kb Hind III-BamHI片段(美国国家科学院院刊，卷75，4709-4713页(1978))和MEP 10克隆的6.8Kb EcoRI片段(美国国家科学院院刊，卷78，474-478页(1981))。此外，可用HindIII消化人胎肝细胞DNA，经琼脂糖电泳分离，将5.9kb片段插入λ788，然后用上述探针分离人Cγ1基因。
使用如此获得的小鼠VH基因和VL基因，人CH基因和CL基因，并考虑启动子区和增强子区，可用适当的限制性内切酶和DNA连接酶，按常规方法，在表达载体如pSV2gpt或pSV2neo中，将人CH基因插入小鼠VH基因下游，人CL基因插入小鼠VL基因下游。本实验中，可将小鼠VH基因/人CH基因的嵌合基因以及小鼠VL基因/人CL基因的嵌合基因分别插入同一表达载体或不同表达载体。
将已插入了嵌合基因的表达载体经原生质体融合法，DEAE-葡聚糖法，磷酸钙法，或电穿孔法导入不产生抗体的骨髓瘤例如P3X63·Ag8·653细胞或SP 210细胞。选取含有与已插入该表达载体之抗药基因对应的药物的培养基，通过在该培养基中培养而筛选转化体，获取产生所需嵌合单抗的细胞。
从筛选的抗体产生细胞培养上清中获取所需嵌合单抗。
本发明中的“人源单抗(CDR-移植抗体)是用基因工程方法制备的单抗，尤其指人源单抗，其中超变区的互补决定区全部或一部分来自非人哺乳动物(小鼠，大鼠，仓鼠等)单抗超变区的互补决定区，可变区的框架区来自于人免疫球蛋白可变区的框架区，恒定区来自于人免疫球蛋白的恒定区。
超变区的互补决定区存在于抗体可变区的超变区，是指三个与抗原直接互补结合的区域(互补决定区残基，CDR1，CDR2和CDR3)。可变区的框架区是指位于上述三个互朴决定区上游，下游或之间的4个相对保守的区域(框架区，FR1，FR2，FR3和FR4)。
换而言之，人源单抗是指非人哺乳动物单抗中除了超变区的互补决定区的全部或一部分，其余均被人免疫球蛋白的相应区域替代的单抗。
人免疫球蛋白恒定区具有每一同种型如IgG(IgG1，IgG2，IgG3和IgG4)，IgM，IgA，IgD和IgE的氨基酸序列。本发明中人源单抗恒定区可以是人免疫球蛋白的任何同种型。优选人IgG的恒定区。对源自人免疫球蛋白恒定区的框架区无特别限制。
人源单抗可如下产生。当然，产生的方法不仅限于此。
可参照已公开的国际申请(JP-WA)1992年506458和1987年296890(日文译本)，经基因工程制备由小鼠单抗衍生的重组人源化单抗。即，从产生小鼠单抗的杂交瘤中分离出至少一个小鼠H链CDR基因，和至少一个与该小鼠H链CDR基因对应的小鼠L链CDR基因，从人免疫球蛋白基因中分离编码整个人H链的基因(但不包括对应于上述小鼠H链CDR的人H链CDR)，以及编码整个人L链的基因(但不包括对应于上述小鼠L链CDR的人L链CDR)。
将所分离的小鼠H链CDR基因和人H链基因插入适当表达载体。类似地，将小鼠L链CDR基因和人L链基因插入适当表达载体。或者，小鼠H链CDR基因/人H链基因，和小鼠L链CDR基因/人L链基因插入同一表达载体进行表达。用所述表达载体转化宿主细胞，制备产生人源单抗的转化体。培养所述转化体，从培养上清中获取所需的人源单抗。
“人源单抗”是指包含免疫球蛋白H链可变区和恒定区，及L链可变区和恒定区的完整区来自编码人免疫球蛋白的基因。
人的抗体(优选人的单抗)可用上述产生多克隆抗体或单克隆抗体的相同方法产生，即用抗原免疫转基因动物，其中至少已用常规方法将人的免疫球蛋白基因整合至非人哺乳动物，如小鼠的基因座上。
可如自然遗传学，卷7，13-21页(1994)；自然遗传学，卷15，146-156页(1997)；JP-WA Hei 4-504365；JP-WA Hei 7-509137；NikkeiScience，6期，40-50页(1995)；WO 94/25585；Nature，卷368，856-859页(1994)和JP-WA Hei 6-500233所述用转基因小鼠产生人抗体。
也可应用最近开发的从转基因牛或猪的乳汁中产生人源蛋白的技术(Nikkei Science，78-84页(1997年4月))。
本发明中“抗体的一部分”是指上述单抗的一部分，具体指F(ab′)2，Fab′，Fab，Fv(抗体可变区片段)，sFv，dsFv(二硫键稳定的Fv)，或dAb(单结构域抗体)(Exp.Opin.Ther.Patents，卷6，5期，441-456页(1996))。
“F(ab′)2”和“Fab′”用蛋白酶，如胃蛋白酶和木瓜蛋白酶处理免疫球蛋白(单抗)可产生，它们是消化免疫球蛋白绞链区两H链间二硫键的附近位置产生的抗体片段。例如木瓜蛋白酶可裂解IgG绞链区两个H链间二硫键的上游，产生两个同源抗体片段，其中L链包括VL(L链可变区)和CL(L链恒定区)，H链片段包括VH(H链可变区)和CHγ1(H链恒定区中的γ1区)，将所述H链和L链的C末端区通过二硫键连接。这两个同源抗体片段均称为Fab′。胃蛋白酶还可裂解IgG绞链区中两个H链间二硫键的下游，产生一个略大于上述片段的抗体片段，其中上述两个Fab′在绞链区相连。这个抗体片段称为F(ab′)2。
本发明的“药用组合物”含有上述定义的“物质”，具体为“能调节由AILIM介导的信号传递的物质”，更具体为“具有抑制AILIM表达细胞增殖或产生细胞因子活性的物质”，还含有可药用的载体。具体地，本发明的药用组合物含有上述定义的“蛋白物质”或“非蛋白物质”以及可药用的载体。更具体地说，本发明的药用组合物含有上述的任何一种多肽，多肽部分(片段)，融合多肽，多克隆抗体，单抗，或单抗的一部分，以及可药用的载体。
“可药用的载体”包括赋形剂，稀释剂、增溶剂，分解剂，稳定剂，防腐剂，缓冲剂，乳化剂，芳香剂，着色剂，甜味剂，粘性增强剂，调味剂，促溶剂，或其它添加剂。使用一种或更多的这种载体，可将药用组合物制成片剂，丸剂，粉剂，颗粒剂，注射剂，溶液，胶囊，锭剂，酏剂，悬浮剂，乳剂，或糖浆。本药用组合物可经口服或非胃肠道途径给药。非胃肠道给药的其它形式包括常规的外用溶液，直肠栓剂，阴道栓剂，均包含一或多种成分。
药物剂量因患者的年龄、性别、体重、症状，治疗效果，给药途径，疗程，或药用组合物中所含活性成分的种类(上述多肽或抗体)不同而不同。通常该药用组合物可给予每个成人每次10μg到1000mg(或10μg到500mg)。在某些病例中，使用少于上述的剂量可有效，在另一些病例中，使用多于上述的剂量有效，依条件不同而不同。
具体地，可将抗体溶解或悬浮在无毒性可药用的载体，如生理盐水，或市售蒸馏水中，制成注射剂，调节其浓度至0.1μg抗体/ml载体到10mg抗体/ml载体。这些注射剂给予有需要的人类患者的治疗剂量是1μg到100mg/kg体重，优选50μg到50mg/kg体重，每天一次或多次给药。给药途径是医疗常用的给药途径，例如静脉注射，皮下注射，皮内注射，肌肉注射，或腹内注射，优选静脉注射。
在非水性稀释剂(例如丙二醇，聚乙二醇，植物油如橄榄油，和醇类如乙醇)，悬浮剂或乳化剂内制备注射制剂。
注射制剂经除菌滤膜过滤，与杀菌剂混合，或经辐射灭菌。可将注射制剂制成备用形式。即，将其冷冻干燥成无菌固体组合物，使用前用无菌蒸馏水或其它溶剂溶解以便注射。
本发明的药用组合物可有效治疗或预防因淋巴细胞，如T细胞活化和活化的淋巴细胞调节异常所致各种自身免疫病，过敏性疾病，或炎性疾病。
所述疾病有关节病(例如类风湿性关节炎，骨关节炎)，炎症(例如脑炎，支气管炎，脉管炎，肺炎，肝炎，心肌炎，胰腺炎，肠炎，胃炎，腹膜炎，肾炎(例如肾小球肾炎)，关节炎(例如类风湿性关节炎)，缺血后再灌注损伤中的炎症(心肌缺血再灌注损伤)，免疫排斥引起的炎症，炎性肠内疾病，烧伤，多器官衰竭中的炎症，PTCA或PTCR术后炎症，动脉硬化的伴随炎症，细菌或病毒感染引起的各种疾病(如炎症)，移植物抗宿主反应，移植物抗宿主反应及组织和器官移植所伴有的免疫排斥，与针对外来抗原的抗体产生过量有关的各种疾病，因外来抗原免疫引起的各种疾病，多发性硬化症，自身免疫性甲状腺炎，各种皮肤炎症(过敏性接触性皮炎，皮肤慢性炎症如苔癣，牛皮癣，硬皮病)，系统性红斑狼疮。
急性和慢性炎症均包括在本发明的“炎症”中。通常急性炎症是指炎性反应的表现相对迅速，进展也快，其终止是明显的。另一方面，慢性炎症是指炎症反应的表现相对缓慢，或渐进，甚或表现太弱不能明确检出，表现从数周延至数年，终止不明显。
在任意组织中引起的炎症均包括在本发明的炎症中。具体地说是脑，眼，支气管，血管，肺，肝，心，胰腺，胃，肠，肠系膜，肾，皮肤，鼻粘膜，或关节等组织中的炎症。
本发明药用组合物对多种疾病症状的治疗效应可通过给已知疾病模型动物给药经通常方法检测出。
附图简述

图1显示正常小鼠胸腺T细胞中CD3，CD28和AILIM(又称为ThA)的表达模式。
分图(a)显示CD3和AILIM(又称为ThA)的表达模式。分图(b)显示CD3和CD28的表达模式。
图2显示正常小鼠胸腺T细胞在每一分化阶段的CD28和AILIM的表达模式，用CD4和CD8的表达作为分化阶段分级的指标。
R2到R8显示如下R2CD4阴性CD8阴性T细胞的AILIM和CD28表达模式。
R3CD4弱阳性CD8弱阳性T细胞的AILIM和CD28表达模式。
R4CD4阳性CD8阳性细胞的AILIM和CD28表达模式。
R5CD4阳性CD8弱阳性T细胞的AILIM和CD28表达模式。
R6CD4阳性CD8阴性细胞的AILIM和CD28表达模式。
R7CD4弱阳性CD8阳性T细胞的AILIM和CD28表达模式。
R8CD4阴性CD8阳性T细胞的AILIM和CD28表达模式。
图3显示正常小鼠脾组织包含的CD4阳性T细胞的AILIM表达模式。
图4显示肝炎患者肝组织浸润型CD4阳性T细胞的AILIM表达模式。
图5显示类风湿性关节炎患者外周血T细胞和关节滑液浸润型T细胞中CD4阳性T细胞和CD4阴性T细胞各自的CD28和AILIM表达模式。
图6显示用不同刺激因素刺激后活化的正常小鼠淋巴节T细胞在时间进程中的AILIM表达模式。
图7图表显示不同T细胞株和源自小鼠杂交瘤的T细胞中AILIM的表达模式和各种特点。
图8显示通过用包被抗CD3抗体和抗AILIM抗体的平板实现CD3与AILIM的交联，而对小鼠脾脏来源T细胞的活化(诱导IFNγ产生)。
图9显示通过用包被抗CD3抗体和抗AILIM抗体的平板实现CD3与AILIM的交联，而对大鼠脾脏来源T细胞的活化(诱导IFNγ产生)。
图10显示通过用包被抗CD3抗体和抗AILIM抗体的平板实现CD3与AILIM的交联，而对人外周血来源的T细胞的活化(诱导IFNγ产生)。
图11显示在用抗CD3抗体刺激活化的人外周血T细胞中，抗AILIM抗体对增强的IFNγ产生作用(T细胞应答反应之一)的抑制效应。
图12显示在用抗CD3抗体刺激活化的人外周血T细胞中，抗AILIM抗体对增强的IL-4产生作用(T细胞应答反应之一)的抑制效应。
图13显示在用抗CD3抗体刺激活化的小鼠胸腺T细胞中，抗AILIM抗体对增强的IL-4产生作用(T细胞应答反应之一)的抑制效应。
图14显示在用抗CD3抗体刺激活化的小鼠脾T细胞中，抗AILIM抗体对增强的IL-4产生作用(T细胞应答反应之一)的抑制效应。
图15显示对患关节炎的宿主数次给予抗AILIM抗体，对足部肿胀(关节炎的一个参数)的治疗效应。
图16显示抗AILIM抗体对患有肝炎的宿主体内增强的IFNγ产生作用(病情恶化的一个参数)的治疗效应。
图17显示抗AILIM抗体对患有肝炎的宿主体内增强的GPT和GOT产生作用(病情恶化的一个参数)的抑制效应。
图18显示抗AILIM抗体对移植物抗宿主病(GVHD)中增加的IgG产生作用(移植物抗宿主反应(GVH反应)之一)的抑制效应。
图19显示抗AILIM抗体对移植物抗宿主病(GVHD)中增加的IgE产生作用(移植物抗宿主反应(GVH反应)之一)的抑制效应。
图20显示抗AILIM抗体对移植物抗宿主病(GVHD)中增加的抗dsDNA抗体滴度(移植物抗宿主反应(GVH反应)之一)的抑制效应。
图21显示抗AILIM抗体在用外来抗原SRBC免疫的宿主体内，对所述外来抗原之抗体的产生作用(抗原致敏后立即给药)的抑制效应。
图22显示抗AILIM抗体在用外来抗原SRBC免疫的宿主体内，对所述外来抗原之抗体的产生作用(抗原致敏的7天后给药)的抑制效应。
图23图示在正常组织(胸腺，淋巴节和外周血)和损伤部位中AILIM和CD28的表达模式。
图24分别显示正常健康人外周血T细胞以及从这些T细胞中分离的AILIM阳性细胞中，AILIM，CD28，CD4，CD8，CD19，和CTLA-4的表达模式。
分图(a)显示不同外周血来源T细胞的分布。
分图(b)显示从外周血来源T细胞分离的AILIM阳性细胞的分布。
分图(c)显示外周血来源T细胞中CD4和CD8表达模式。
分图(d)显示从外周血来源T细胞分离的AILIM阳性细胞中CD4和CD8表达模式。
分图(e)显示外周血来源T细胞中AILIM和CD4表达模式。
分图(f)显示从外周血来源T细胞分离的AILIM阳性细胞中AILIM和CD4表达模式。
分图(g)显示外周血来源T细胞中AILIM和CD28表达模式。
分图(h)显示从外周血来源T细胞分离的AILIM阳性细胞中AILIM和CD28表达模式。
分图(i)显示外周血来源T细胞中AILIM和CTLA-4表达模式。
分图(j)显示从外周血来源T细胞分离的AILIM阳性细胞中AILIM和CTLA-4表达模式。
分图(k)显示外周血来源T细胞中AILIM和CD19表达模式。
分图(l)显示从外周血来源T细胞分离的AILIM阳性细胞中AILIM和CD19表达模式。
图25显示正常健康个体外周血来源T细胞，CD4阳性T细胞，CD8阳性T细胞，和从上述每种T细胞分离的每种AILIM细胞中AILIM表达强度。
分图(a)分别显示外周血T细胞和从该T细胞分离的AILIM阳性细胞的AILIM表达强度。
分图(b)分别显示外周血CD4阳性T细胞和从这些T细胞分离的CD4阳性AILIM阳性T细胞的AILIM表达强度。
分图(c)显示外周血CD8阳性T细胞和从这些T细胞分离的CD4阳性AILIM阳性T细胞的AILIM表达强度。
图26显示慢性类风湿性关节炎(RA)，骨关节炎(OA)患者外周血T细胞和关节滑液T细胞，以及进行性系统性硬化症(硬皮病；PSS)和系统性红斑狼疮(SLE)患者外周血T细胞各自的AILIM表达模式。
图27显示佐剂诱导型关节炎模型大鼠的胸腺，脾，淋巴节和外周血T细胞(CD4阳性T细胞，CD8阳性T细胞)的AILIM表达模式。
图28显示经各种刺激活化的正常健康人外周血来源T细胞中AILIM和CTLA-4各自的表达模式。
分图(a)显示用PMA和离子导体刺激活化的T细胞的AILIM表达强度。
分图(b)显示用PMA和离子导体刺激活化的T细胞的CTLA-4表达强度。
分图(c)显示用PMA和离子导体刺激活化的CD4阳性T细胞的AILIM表达强度。
分图(d)显示用PMA和离子导体刺激活化的CD4阳性T细胞的CTLA-4表达强度。
分图(e)显示用抗CD3抗体和抗AILIM抗体，或者抗CD3抗体和抗CD28抗体刺激活化的T细胞AILIM的表达强度。
分图(f)显示用抗CD3抗体和抗AILIM抗体，或者抗CD3抗体和抗CD28抗体刺激活化的T细胞CTLA-4的表达强度。
图29显示用不同抗体刺激每种人源外周血T细胞对各种细胞因子产生的诱导。
图30显示用不同抗体以各种浓度刺激每种人源外周血T细胞对细胞增殖的诱导。
图31显示用不同抗体刺激每种人源外周血T细胞，在一定时间内对细胞增殖的诱导。
图32显示于包被抗CD3抗体和抗AILIM抗体的微滴板上培养的小鼠脾细胞和小鼠脾脏来源T细胞各自的增殖水平。
分图(a)显示小鼠脾脏细胞增殖水平。
分图(b)显示小鼠脾脏来源的T细胞的增殖水平。
图33显示用包被抗CD3抗体(恒定浓度)和抗AILIM抗体(不同浓度)的微珠(恒定浓度)培养的各种小鼠脾细胞的增殖水平。
图34显示用包被抗CD3抗体(恒定浓度)和抗AILIM抗体(恒定浓度)的微珠(不同浓度)培养的各种小鼠脾细胞的增殖水平。
图35显示用包被抗CD3抗体(恒定浓度)和抗AILIM抗体(恒定浓度)的微珠(不同浓度)培养的各种小鼠脾脏来源T细胞的增殖水平。
图36显示用不同抗体以各种浓度刺激每种大鼠淋巴节来源的T细胞对细胞增殖的诱导。
图37显示单一给予抗AILIM抗体(恒定浓度)在患有关节炎的宿主中对足部肿胀(关节炎的一个参数)的治疗效应。
图38显示单一给予抗AILIM抗体(不同浓度)在患有关节炎的宿主中对足部肿胀(关节炎的一个参数)的治疗效应。
图39显示抗AILIM抗体对移植物抗宿主病(GVHD)中增加的IgG产生作用(移植物抗宿主反应(GVH反应)之一)的抑制效应。
图40显示抗AILIM抗体对移植物抗宿主病(GVHD)中增加的IgE产生作用(移植物抗宿主反应(GVH反应)之一)的抑制效应。
图41显示抗AILIM抗体对移植物抗宿主病(GVHD)中增加的抗dsDNA抗体滴度(移植物抗宿主反应(GVH反应)之一)的抑制效应。
图42显示抗AILIM抗体在用外来抗原NP-KLH免疫的宿主体内，对所述外来抗原之IgG1抗体的产生作用的抑制效应。
图43显示抗AILIM抗体在用外来抗原NP-KLH免疫的宿主体内，对所述外来抗原之IgM抗体的产生作用的抑制效应。
图44显示抗AILIM抗体在用外来抗原NP-KLH免疫的宿主体内，对所述外来抗原之IgG1抗体的产生作用的抑制效应。
图45显示抗AILIM抗体在用外来抗原NP-KLH免疫的宿主体内，对所述外来抗原之IgG2b抗体的产生作用的抑制效应。
图46显示抗AILIM抗体在用外来抗原NP-KLH免疫的宿主体内，对所述外来抗原之IgG2a抗体的产生作用的抑制效应。
图47显示，对来自正常健康个体“供体A”的T细胞和来自正常健康个体“供体D”的PBMC通过混合淋巴细胞反应(MLR)进行T细胞增殖检测，测得各种待检样品中对T细胞增殖的抑制效应。
纵坐标表示[3H]胸苷的掺入量，其可指示细胞增殖水平，横坐标表示待测样品的浓度。
图中每种描述表示以下内容。
“CD80+86”抗CD80抗体和抗CD86抗体的混合物“mIgG1”抗人CD34/IgG1的小鼠单抗“CTLA4-Ig”人CTLA4-IgFc嵌合分子“SA12”抗人AILIM的小鼠单抗图48显示，对来自正常健康个体“供体D”的T细胞和来自正常健康个体“供体B”的PBMC通过混合淋巴细胞反应(MLR)进行T细胞增殖检测，测得各种待检样品中对T细胞增殖的抑制效应。
纵坐标表示[3H]胸苷的掺入量，其可指示细胞增殖水平，横坐标表示待测样品的浓度。
图中每种描述表示以下内容。
“CD80+86”抗CD80抗体和抗CD86抗体混合物。
“mIgG1”抗人CD34/IgG1小鼠单抗。
“CTLA4-Ig”人CTLA4-IgFc嵌合分子。
“SA12”抗人AILIM小鼠单抗。
图49显示，对来自正常健康个体“供体C”的T细胞和来自正常健康个体“供体A”的PBMC通过混合淋巴细胞反应(MLR)进行T细胞增殖检测，测得各种待检样品中对T细胞增殖的抑制效应。
纵坐标表示[3H]胸苷的掺入量，其可指示细胞增殖水平，横坐标表示待测样品的浓度。
图中每种描述表示以下内容。
“CD80+86”抗CD80抗体和抗CD86抗体的混合物“mIgG1”抗人CD34/IgG1的小鼠单抗“CTLA4-Ig”人CTLA4-IgFc嵌合分子“SA12”抗人AILIM的小鼠单抗图50显示，对来自正常健康个体“供体E”的T细胞和来自正常健康个体“供体G”的PBMC通过混合淋巴细胞反应(MLR)进行T细胞增殖检测，测得各种待检样品中对T细胞增殖的抑制效应。
纵坐标表示[3H]胸苷的掺入量，其可指示细胞增殖水平，横坐标表示待测样品的浓度。
图中每种描述表示以下内容。
“mIgG对照”抗人CD34/IgG1的小鼠单抗“CD80+86”抗CD80抗体和抗CD86抗体的混合物“SA12”抗人AILIM的小鼠单抗“CTLA4-Ig”人CTLA4-IgFc嵌合分子图51显示，对来自正常健康个体“供体F”的T细胞和来自正常健康个体“供体E”的PBMC通过混合淋巴细胞反应(MLR)进行T细胞增殖检测，测得各种待检样品中对T细胞增殖的抑制效应。
纵坐标表示[3H]胸苷的掺入量，其可指示细胞增殖水平，横坐标表示待测样品的浓度。
图中每种描述表示以下内容。
“mIgG对照”抗人CD34/IgG1的小鼠单抗“CD80+86”抗CD80抗体和抗CD86抗体的混合物“SA12”抗人AILIM的小鼠单抗“CTLA4-Ig”人CTLA4-IgFc嵌合分子图52显示，对来自正常健康个体“供体G”的T细胞和来自正常健康个体“供体F”的PBMC通过混合淋巴细胞反应(MLR)进行T细胞增殖检测，测得各种待检样品中对T细胞增殖的抑制效应。
纵坐标表示[3H]胸苷的掺入量，其可指示细胞增殖水平，横坐标表示待测样品的浓度。
图中每种描述表示以下内容。
“mIgG对照”抗人CD34/IgG1的小鼠单抗
“CD80+86”抗CD80抗体和抗CD86抗体的混合物“SA12”抗人AILIM的小鼠单抗“CTLA4-Ig”人CTLA4-IgFc嵌合分子发明的优选实施方案本发明用以下实施例作更详细的举例说明，但应理解为并不仅限于此。
实施例1 实验材料制备除非有其它说明，否则按如下描述制备试验材料(动物，抗体，细胞)。
<1-1>动物C57BL/6小鼠(雄性，5到8周龄)和BALB/C小鼠(雄性，5到8周龄)，购自JAPAN SLC。Wistar大鼠(雄性，5到6周龄)购自Charles River JapanInc.
<1-2>制备抗大鼠AILIM单克隆抗体称作“JTT-1”和“JTT-2”的杂交瘤能产生小鼠抗大鼠AILIM单克隆抗体(小鼠抗大鼠JTT-1抗原的单抗)，是由本发明者制成，并在先前做了报道。本发明人已将其作了国际保藏(1996年10月11日，已将这两种杂交瘤保藏在日本通产省工业技术院生命工学工业技术研究所(日本茨城市东1丁目1-3号，邮编305-8566))，它是遵循布达佩斯条约的国际保藏单位)。从“JTT-1”(国际保藏号FERM BP 5707)和“JTT-2”(国际保藏号FERMBP-5708)的培养上清经体外或体内纯化的单抗或腹水，可用于下述试验(JP-A 11-29599(实施例1和2)，和WO 98/38216(实施例1和2))。
此后，这些小鼠抗大鼠AILIM单抗分别称为“JTT-1抗体”和“JTT-2抗体”(IgG1)。在一些实施例中，“JTT-1抗体”和“JTT-2抗体”也被分别称为“JMab49”和“JMab50”。
除非特别说明，否则在下述检测中使用的抗大鼠AILIM抗体是“JTT-2抗体”(也称作JMab50；IgG1)。
<1-3>制备抗人AILIM单克隆抗体称作“SA12”和“SG430”的产生小鼠抗人AILIM单抗(小鼠抗人JTT-1抗原的单抗)的杂交瘤，由本发明者制成，并在以前做过报道，将它们经腹膜内注射(每种杂交瘤为106到107细胞/0.5ml/小鼠)至ICR裸鼠(雌性，7到8周龄)。注射10到20天后，根据常用方法在麻醉状况下对每种小鼠行剖腹术收集腹水。就这样大规模制备每种小鼠抗人AILIM单抗(JP-A 11-29599(实施例12))，和WO 98/38216(实施例12))。
此后，这两型的小鼠抗人AILIM单抗称作“SA12抗体”(IgG1)和“SG430抗体”(IgG1)。这两型在下述的检测中使用。
<1-4>制备抗小鼠AILIM单克隆抗体。
用如下方法制备抗体根据常用基因重组技术，用编码小鼠AILIM(小鼠JTT-1抗原)全长氨基酸序列的cDNA(已由本发明人克隆出)(JP-A 11-29599(SEQ ID NO5)，和WO98/38216(SEQ ID NO5))制备能表达小鼠AILIM的转化细胞。
对转化细胞匀浆，然后进行超速离心(100,000xg)。收集含有细胞膜部分的沉淀，然后悬浮在PBS中。将获得的细胞膜部分与弗氏完全佐剂经足垫注入Wistar大鼠作为初次免疫(0天)。在初次免疫后7天，14天和28天给大鼠经足垫注入细胞膜抗原。末次免疫后2天，收集大鼠淋巴节细胞。
按5∶1比例将淋巴节细胞与小鼠骨髓瘤PAT细胞(JCR期B0113；Res.Disclosure，卷217，页155，1982)混合。用聚乙二醇4000(BoehringerMannheim)作为融合剂使细胞相互融合制成可产生单抗的杂交瘤。在包含HAT，10％胎牛血清和氨基喋呤的ASF 104培养基(Ajinomoto)上培养融合细胞，从而筛选杂交瘤。
杂交瘤培养上清中每种单抗抗小鼠AILIM(小鼠JTT-1抗原)的反应性如下检测使每种培养上清与表达上述重组小鼠AILIM的转化细胞反应；然后进一步将这种细胞与FITC标记的抗大鼠IgG(Cappel)反应；用EPICS-ELITE流式细胞仅检测染色细胞的荧光强度。筛选出能产生与小鼠AILIM(小鼠JTT-1抗原)反应的单抗的多个杂交瘤。
从中筛选的两种不同的杂交瘤称为“B10.5”和“B9B6”。经腹膜内给ICR裸鼠(雌性，7到8周龄)注射每种杂交瘤(每种均为106到107细胞/0.5ml/小鼠)。注射后10到20天，根据常用方法在麻醉状态下行剖腹术，收集每种小鼠的腹水。就这样大规模制备大鼠抗小鼠AILIM单抗。此后，由“B10.5”和“B9B6”杂交瘤产生的两种大鼠抗小鼠AILIM单抗称为“B10.5抗体”(IgG2a)和“B9B6抗体”(IgG2a)。在下述的检测中使用这两种抗体。
<1-5>制备淋巴细胞断头处死小鼠。根据常用方法取出胸腺和外周淋巴组织(脾和淋巴节)。在不锈钢网眼上将组织切成小块。将组织块悬浮在含有10％胎牛血清(FCS)的RPMI 1640培养液中制成细胞悬液。细胞悬液(每种为1×107到3×107细胞/ml)铺在平板中，在CO2培养箱中培养2小时。培养完成后，从平板中小心回收非贴壁细胞，并用RPMI 1640培养液洗涤。这样从各种组织获得小鼠细胞。
用上述同样的方法从胸腺和外周淋巴组织(脾和淋巴节)制备不同组织的大鼠细胞。
根据常用方法制备人外周血T细胞(来自健康正常个体和患者)。具体地说，从健康正常人或患者收集肝素抗凝血样，用lymphoprep(Nycomed)进行分离以制备外周血单核细胞。以后，用Pan T细胞分离试剂盒(Miltenyi)回收T细胞。
<1-6>制备已有的T细胞系下述检测用不同的小鼠T细胞系(D10，MS202，CD28KO，EL-4，2L2和BC3C13)以及各种小鼠T细胞来源的杂交瘤(KV24，D0.11.10，8-4-31，3H10-11，61-21-25，1-2-66和6-13-64)进行，所述杂交瘤源自小鼠T细胞来源的杂交瘤BW5147，全部由本发明者建系。
实施例2 分析来自多种组织和多种细胞系的细胞AILIM的表达用常规程序，进行细胞染色实验并经流式细胞仪检测，分析动物(小鼠，大鼠或人)的正常和患病组织细胞AILIM表达模式的不同，分析未受刺激的T细胞和受刺激的T细胞(活化的T细胞)间AILIM表达模式的不同，以及各种T细胞系中的表达模式不同。
基于下述获得的检测结果，对比组织和细胞中AILIM和CD28的表达模式。图23显示比较情况。然而，应该指出图例说明仅仅是一个例证；事实上，这种举例说明不应理解为对下述试验中获得的数据的唯一解释。
<2-1>细胞染色和流式细胞术除非特别说明，否则用如下方法进行细胞染色，并做流式细胞仪检测。
经上述方法从各种组织制备的细胞和未刺激或经各种刺激物质(抗CD3抗体，ConA，或PMA和离子导体等)刺激的T细胞或各种T细胞系重悬在包含0.5％小牛血清白蛋白(BSA)和5mM EDTA的磷酸缓中液(无Ca2+，Mg2+的PBS；PBS-)中。以后，将选自下述(A)或(B)的第一抗体加入所述细胞悬浮液，使所述混合物在4℃培养30分钟(A)用FITC或藻红蛋白(PE)标记的针对上述各种AILIM抗体的抗体(抗小鼠AILIM抗体，抗大鼠AILIM抗体，抗人AILIM抗体)，(B)未标记的针对上述各种AILIM抗体的抗体(抗小鼠AILIM抗体，抗大鼠AILIM抗体，抗人AILIM抗体)。
随后，用上述磷酸缓冲液洗细胞3次，然后用相同缓冲液重悬。
当使用的第一抗体是未标记的抗AILIM抗体(即上述(B)抗体之一)时，进一步将FITC，PE或生物素标记的抗小鼠Ig抗体或抗大鼠Ig抗体作为二抗加入所述细胞悬液。用上述相同方法保温这些悬浮液。
当二抗是生物素标记的抗体时，进一步将PE标记的链亲合素(Pharmingen)加入细胞悬液，并以上述同样方法保温。然后将细胞重悬在上述磷酸缓冲液中。
用上述方法染色的细胞的大小和其荧光强度用FACSort(BectonDekinson)检测。用Lysis II软件分析AILIM表达的分布。
<2-2>分析小鼠胸腺来源的T细胞中AILIM的表达从小鼠胸腺(正常淋巴组织)分离的T细胞中AILIM的表达根据上述<2-1>中的同样方法分析。同时，进行类似的测量来分析AILIM表达模式和其它分子(向T细胞传递第一信号时发挥功能的CD3分子，在第二刺激信号传递中发挥功能的CD28分子，作为T细胞表面标志的CD4和CD8)的表达间的关系。
图1和2显示此结果。基于这一结果揭示的新发现显示如下。
第一，CD3分子和AILIM分子表达间的关系是，AILIM表达水平高的细胞中CD3表达水平也高，因此这两种分子的表达水平彼此相关(图1(a))。与前面分子相反，CD3表达水平较高的细胞中协同刺激分子CD28表达水平较低(图1(b))。这些结果显示至少在正常胸腺T细胞中AILIM和CD28的表达模式与CD3的逆相关。
已知胸腺T细胞的分化和成熟是通过下述主要步骤完成。
(1)CD4阴性CD8阴性细胞(图2中R2)分化成CD4弱阳性CD8弱阳性细胞(在图3中R3)，其中每种分子的表达是可识别的，但较弱。
(2)CD4弱阳性CD8弱阳性细胞(在图2中R3)分化成CD4阳性CD8阳性细胞(在图2中R4)，其中两种分子强表达。
(3)通过阳性选择降低CD4或CD8分子的表达(在图2中R5或R7)；每种类型的细胞最终分化成CD4阳性CD8阴性(在图2R6)或CD4阴性CD8阳性(在图2中R8)细胞，这样完成成熟过程。
CD4阴性CD8阴性细胞中AILIM和CD28的表达均无法识别，但在CD4弱阳性CD8弱阳性细胞中观察到它们的较低水平表达。CD28的表达在CD4阳性CD8阳性细胞中最高，然后随这些细胞进一步分化至成熟而减少。
另一方面，甚至在CD4阳性CD8阳性细胞中也仅见低水平AILIM表达。然而在随后的细胞分化过程中AILIM表达水平升高；即当CD4或CD8表达水平下降时，AILIM表达水平升高，然后在淋巴细胞完成阳性选择的最终分化阶段表达水平最高，成熟淋巴细胞被称作SP细胞(CD4阳性CD8阴性细胞或CD4阴性CD8阳性细胞)。
实验结果显示，就与CD4和CD8及CD3表达的关系而论，AILIM表达模式与CD28的不同。
<2-3>分析源自小鼠正常淋巴组织的T细胞中AILIM的表达。
小鼠正常淋巴组织，脾和淋巴节的T细胞中AILIM的表达经上述方法分析。
图3显示结果。
脾来源的T细胞中AILIM阳性T细胞群较胸腺来源的少；大约为1％到3％。AILIM阳性细胞大多是CD4阳性和CD8阳性。
淋巴节来源的T细胞中AILIM的表达模式和细胞群百分比与上述脾来源的T细胞中的相当。
<2-4>从肝炎模型小鼠的感染组织获取的T细胞中AILIM表达的分析肝炎模型小鼠制备如下将疮疱丙酸杆菌细胞(5mg/ml)悬浮在磷酸缓冲液(PBS-；0.2ml)中，静脉注入C57BL/6小鼠尾部。一周后，将LPS(脂多糖；1.5μg/ml)的磷酸缓冲液(PBS-；0.2ml)静脉注入该小鼠以诱发肝炎。此小鼠作为肝炎模型动物。
给予LPS后6.5小时，从小鼠切除肝脏；用上述方法制备T细胞，分析AILIM表达。
图4显示结果。
源自肝炎动物模型肝组织的T细胞(单个核细胞)中AILIM表达水平非常高；大多数T细胞以显著高的水平表达AILIM。源自肝炎模型肝脏的T细胞中AILIM表达水平远远高于正常小鼠脾脏来源的T细胞(CD4阳性细胞)中和淋巴节来源中T细胞的表达水平。
<2-5>健康正常人外周血来源的T细胞中AILMI表达的分析用流式细胞仪进行分析，从而评估源自健康正常人外周血T细胞和健康正常人外周血样所分离的人单核细胞中AILIM的表达水平，以及这些细胞上多种细胞表面标志的表达。健康正常人外周血T细胞按上述方法制备。
另一方面，从如下所述获取AILIM表达型T细胞(AILIM阳性细胞)从健康正常人外周血分离单核细胞部分，将其悬浮在包含0.5％BSA和5mMEDTA的PBS-中，并加入抗AILIM抗体(SG430；50μg)。该混合物在4℃保持30分钟。之后，用相同缓冲液洗细胞3次，加入固定有山羊抗小鼠IgG(100到500μl；Miltenyi)的微珠。混合物用同样方式保持，然后用相同缓中液洗涤。下一步，根据分离AILIM阳性细胞常用的方法，用磁性分离柱处理细胞(2次)。用各种标记抗体和抗AILIM抗体对分离的AILIM阳性细胞进行染色；染色细胞经流式细胞仪分析。
图24显示结果。
外周血T细胞主要分为CD4阳性CD8阴性细胞和CD4阴性CD8阳性细胞。用FITC-标记的抗AILIM抗体(SA12)和抗CD4抗体进行双染色试验，AILIM的表达主要见于CD4阳性细胞。用抗AILIM抗体和抗CD28抗体进行双染色揭示，绝大多数外周血来源的AILIM阳性细胞表达CD28。在外周血T细胞中AILIM阳性细胞群的百分比大约是0.5％到5％。
另一方面，基于从人外周血单核细胞直接分离的AILIM阳性细胞其表面标志的分析结果获得如下发现；(1)大多数AILIM阳性细胞是CD4阳性CD8阴性细胞；(2)AILIM阳性细胞中，CD4阴性CD8阳性细胞和CD4阴性CD8阴性细胞数可检测，但很少；(3)用抗AILIM抗体和抗CD28抗体进行的双染色揭示，大多数AILIM阳性细胞表达CD28，因此大多数的AILIM阳性细胞属于T细胞类。
(4)一些AILIM阳性细胞可被B细胞表面标志CD19的相应抗体染色。这表明B细胞也弱表达AILIM；(5)协同刺激分子CTLA4的表达可见于许多AILIM阳性细胞。
此外，通过分析评价外周血T细胞和AILIM阳性细胞中AILIM的表达水平。
图25显示结果。
将AILIM阳性细胞的表达与外周血T细胞的相比，在不同位置移动的峰值表明AILIM阳性细胞中AILIM表达水平较高。
进一步，对CD4阳性细胞和CD8阳性细胞进行类似比较分析。观察发现两部分的AILIM表达水平相似。AILIM阳性细胞中CD8阳性细胞群小，但CD8阳性细胞的AILIM表达水平与其它细胞的相似。
<2-6>各种关节炎性皮疹或自身免疫病患者T细胞中AILIM表达的分析。
根据上述方法分析关节炎(类风湿性关节炎(RA)和骨关节炎(OA))或自身免疫病(进行性系统性硬化症(PSS)和系统性红斑狼疮(SLE))患者T细胞中AILIM的表达和AILIM表达细胞的比例。
从每位关节炎患者的关节滑液和外周血分离T细胞；从自身免疫病患者外周血边分离T细胞。此外，用健康正常人外周血T细胞作为对照。
图5和26显示结果。
RA患者外周血T细胞的AILIM表达与健康正常人外周血T细胞的比较。患者和正常人之间，在CD4阳性T细胞和CD4阴性T细胞(即CD4阴性CD8阳性T细胞)中表达水平无明显差异。
然而，在RA患者关节滑液T细胞中，CD4阳性T细胞和CD4阴性T细胞中AILIM表达细胞的数量明显增加。特别是，AILIM表达细胞的平均比例增加至总CD4阳性T细胞的约20％。此外，发现在RA患者关节滑液的CD4阳性T细胞和CD4阴性T细胞中AILIM表达水平较健康正常人外周血来源的CD4阳性T细胞和CD4阴性T细胞中明显升高。RA患者CD4阳性T细胞中CD28表达水平无改变。
另一方面，一例OA患者的关节滑液CD4阳性细胞中AILIM阳性细胞数明显增加。
自身免疫病患者外周血CD4阴性T细胞中AILIM阳性细胞数量与健康正常人的细胞数相当。然而，PSS患者比健康正常人CD4阳性T细胞中AILIM阳性细胞数显著增多。
<2-7>佐剂诱导的关节炎模型大鼠中AILIM表达的分析液体石蜡中死的结核杆菌(结核分枝杆菌H37Ra；Difco)10mg/ml(Wakopure chemical)用作佐剂。该佐剂以1mg/0.1ml/个体的浓度经尾尖区域皮内注入Wistar大鼠(雄性，5周龄，Charles River)以诱导关节炎。用体积测量器测量两后腿体积。用所测体积作为关节炎发作的一个指标。
给予佐剂后(0天)一定时间内收集胸腺，脾，淋巴节和外周血。根据上述方法制备T细胞悬浮液。经上述方法分别用抗CD4抗体，抗CD8抗体和抗AILIM抗体染色T细胞，然后用流式细胞仪分析CD4，CD8和AILIM的表达。
以正常大鼠来源的胸腺，脾，淋巴节和外周血T细胞作为对照。
图27显示结果。
与对照细胞比较，来自胸腺，脾和外周血的CD4阳性T细胞及CD8阳性T细胞中AILIM的表达无可识别的明显差异。
另一方面，与对照细胞比较，淋巴节来源的CD4阳性T细胞和CD8阳性T细胞中AILIM阳性细胞数明显增加。尤其是，给予佐剂后第5天，CD4阳性T细胞中AILIM表达水平达峰值。
<2-8>分析与小鼠T细胞活化相关的AILIM表达水平的变化不同状态下活化小鼠淋巴组织来源的T细胞。分析与T细胞活化有关的不同AILIM表达水平。
T细胞悬浮在含10％FCS的RPMI1640培养基中，加入抗CD3抗体(终浓度1到10μg/ml)，刀豆蛋白A(ConA；终浓度1到5μg/ml)或PMA(十四烷酰佛波醇乙酸酯；终浓度20ng/ml)和Ca离子导体(终浓度200ng/ml)以刺激T细胞活化。加入上述活化剂后一定时间(0，6，12，24和28小时后)分析AILIM表达。
图6显示结果。
上述任何活化条件下刺激后约3到6小时AILIM表达开始上调，刺激后12小时达最大。刺激后约24小时AILIM表达水平仍是高的，此高水平维持至刺激后48小时。
<2-9>分析与人T细胞活化相关的AILIM表达的诱导用上述同样方法获取的健康正常人外周血来源T细胞，经下述(A)或(B)的方法活化。分析AILIM和协同刺激分子CTLA-4与T细胞活化相关的表达。
(A)用PMA和Ca离子导体活化T细胞。
PMA(终浓度20ng/ml)和Ca离子导体(终浓度200ng/ml)作为活化剂加入悬浮在含有10％FCS的RPMI1640培养液中的T细胞悬浮液中进行刺激。加入上述活化剂后8小时，用流式细胞仪分析AILIM和CTLA-4的表达。
(B)用抗CD3抗体/抗AILIM抗体或抗CD3抗体/抗CD28抗体活化T细胞取(1)抗CD3抗体(克隆OKT3；200ng/孔)和抗AILIM抗体(克隆SA12；1μg/孔)或(2)抗体CD3抗体(克隆OKT3；200ng/孔)和抗CD28抗体(克隆CD28.2；1μg/孔)的等份溶液，用D-PBS稀释，加入96孔微滴板的各孔中，在室温保温3小时，从而用各种抗体包被反应板。
悬浮在含10％FCS的RPMI1640培养液中的外周血来源人T细胞加入每个反应板(1×105细胞/ml，0.1ml/孔)。培养2到3天后收获细胞。根据上述方法用流式细胞仪分析AILIM和CTLA-4的表达。
图28显示结果。
用PMA和离子导体刺激T细胞的活化后8小时，诱导了相对高水平的AILIM表达，其表达水平较经受同样刺激诱导的CTLA-4表达水平高。进一步，在绝大多数T细胞中均诱导了AILIM表达。此外，对CD4和AILIM或CD28和AILIM的双染色试验显示，CD4阳性T细胞和CD8阳性T细胞的活化均诱导显著的AILIM表达水平。
另一方面，用抗CD3抗体/抗AILIM抗体或抗CD3抗体/抗CD28抗体包被的微滴板检测活性，得到如下结果(1)抗CD3抗体/抗AILIM抗体活化的T细胞和抗CD3抗体/抗CD28抗体活化的T细胞中均诱导了AILIM的较高水平表达。抗CD3抗体/抗CD28抗体活化的T细胞较抗CD3抗体/抗AILIM抗体活化的T细胞中诱导的表达水平高。
(2)抗CD3抗体/抗AILIM抗体活化的T细胞和抗CD3抗体/抗CD28抗体活化的T细胞中均诱导了CTLA-4的表达。然而，用抗CD3抗体/抗AILIM抗体活化的T细胞和用抗CD3抗体/抗CD28抗体活化的细胞间，被诱导的表达水平无明显差异。
<2-10>各种T细胞系AILIM表达分析已知T细胞系主要是经自然永生化产生，或用化学试剂使T细胞系永生化而产生，或使骨髓瘤细胞与T细胞融合形成T细胞杂交瘤。基于产生细胞因子的特点，T细胞系分为两类，即Th1型T细胞系和Th2型T细胞系。
上述<1-6>中各种已知小鼠T细胞系中AILIM和CD28表达的分析，用流式细胞仪，用上述同样的方法进行。
图7显示结果。
根据细胞因子的产生显示Th2型T细胞系特点的T细胞系(D10，MS202，CD28K0，EL-4等)中AILIM为组成型表达。在这些细胞系中AILIM表达水平相较于CD28的表达略高或相当。
另一方面，在除了6-13-64外的Th1型T细胞系中CD28表达水平较高，但没有可识别的AILIM表达。
实施例3 抗AILIM抗体的T细胞应答调节活性分析分析本发明的抗AILIM抗体是否有调节(增强和/或抑制)T细胞应答(产生细胞因子如IFN-γ和IL-4，细胞增殖等)的活性，即该抗体是否能调节AILIM介导的协同刺激信号向细胞内转导。用细胞的细胞因子(IFN-γ和IL-4)产量和细胞增殖程度作指标进行分析。
<3-1>检测方法依赖于每种检测目的，选择如上制备的1或2种抗体(单用抗CD3抗体，单用抗CD28抗体，抗CD3抗体和抗AILIM抗体，或抗CD3抗体和抗CD28抗体)，将其加入96孔微滴板中。该板在37℃保温1小时或更长时间以便将1或2种抗体包被在板上。然后用PBS充分洗涤该板。然后，将用上述方法制备的胸腺细胞(5×105细胞/孔)，脾细胞(2×105细胞/孔)或纯化的T细胞(1×105到3×105细胞/孔)加入板中。
在事先未用抗AILIM抗体或抗CD28抗体包被，只是简单的将这两种抗体加入板中的试验中，在板中种入细胞后加入抗体。此外，在检测中用CTLA4-Ig(CTLA4可溶区和IgFc的融合蛋白)替代抗AILIM抗体作为对照。根据同样方法进行检测。
该板在CO2培养箱中保温2到4天。用通常的ELISA方法确定培养上清中细胞因子(IFN-γ或IL-4)浓度。此外，用常用的氚标记胸腺嘧啶(3H-TdR)掺入方法评价细胞增殖程度。
<3-2>分析用抗CD3抗体和抗AILIM抗体介导协同刺激信号进入T细胞后对细胞因子产生的诱导已知T细胞应答T细胞受体介导的第一信号和协同刺激分子如CD28和CTLA-4介导的第二信号，导致产生特异性细胞因子。
根据上述<3-1>的检测方法，用分别从小鼠、大鼠和人分离的外周血T细胞，胸腺细胞或脾细胞分析各种抗体刺激后诱导的各种细胞因子的产生。
<3-2-1>小鼠脾来源的T细胞中IFN-γ的诱导将小鼠脾来源的T细胞加入(1)用抗CD3抗体(克隆145-2Cll；Pharmingen0到3μg/ml)和抗CD28抗体(克隆CD28.2；1μg/孔)包被的微滴板；(2)用抗CD3抗体和抗小鼠AILIM抗体(克隆B10.5；1μg/孔)包被的微滴板；和(3)单用抗CD3抗体包被的微滴板。培养种入细胞的孔板，然而用ELISA法确定培养上清中IFNγ的量。
图8显示结果。
单用抗CD3抗体刺激不能诱导IFNγ产生。用抗CD3抗体/抗AILIM抗体或抗CD3抗体/抗CD28抗体刺激可明显诱导IFNγ产生。诱导强度依赖于抗CD3抗体浓度。
<3-2-2>对大鼠脾的T细胞中IFNγ产生的诱导源自大鼠脾脏的T细胞被加入(1)用抗CD3抗体(克隆G4.18；50ng/孔)和抗CD28抗体(克隆JJ316；1μg/孔)包被的微滴板；(2)用抗CD3抗体和抗大鼠AILIM抗体(克隆JTT1；1μg/孔)包被的微滴板；(3)单用抗CD3抗体包被的微滴板；(4)单用抗AILIM抗体包被的微滴板；和(5)单用抗CD28抗体包被的微滴板。培养种入细胞的微滴板，然后用ELISA法确定培养上清中IFNγ的量。
图9显示结果。
单用抗CD3抗体，抗AILIM抗体或抗CD28抗体刺激不能明显诱导IFNγ产生。然而，用抗CD3抗体/抗AILIM抗体或抗CD3抗体/抗CD28抗体刺激可显著诱导IFNγ产生。诱导的产生水平随时间升高。
<3-2-3>对人外周血T细胞中IFNγ产生的诱导人外周血T细胞被加入(1)用抗CD3抗体(克隆OKT3；恒定浓度)和抗AILIM抗体(克隆SA12；各种浓度)包被的微滴板；和(2)单用抗CD3抗体包被的微滴板。培养种植细胞的微滴板，然后用ELISA法确定培养上清中IFNγ的数量。在(2)的检测中，加入细胞后加入可溶性抗AILIM抗体。
图10显示结果。
既使抗AILIM抗体浓度升至20μg/ml，在加入细胞后再加可溶性抗AILIM抗体的实验组，T细胞加入包被恒定浓度抗CD3抗体的微滴板中未检测到可识别的对IFNγ产生的诱导。
另一方面，当抗AILIM抗体浓度是5μg/ml或更高时，在包被抗CD3抗体和抗AILIM抗体的微滴板中培养的人T细胞中以较高水平诱导了IFNγ产生。
还发现，用ConA或PMA刺激的外周血T细胞种入用上述同样方法包被抗AILIM抗体和抗CD3抗体的孔板中，细胞因子的生成和细胞增殖均增强。此结果与用ConA或PMA刺激的外周血T细胞在抗CD28抗体和抗CD3抗体包被的孔板中培养的结果基本一致。
<3-2-4>诱导人外周血T细胞产生TNFα，IFNγ，IL-2，IL-4和IL-10。
来自两个不相关的健康正常供体的外周血T细胞被加入(1)单用抗CD3抗体(克隆OKT3；200ng/孔)包被的微滴板；(2)单用抗CD28抗体(克隆CD28.2；1μg/孔)包被的微滴板；(3)用抗人AILIM抗体(克隆SA12；1μg/孔)包被的微滴板；(4)用抗CD3抗体和抗CD28抗体包被的微滴板；(5)用抗CD3抗体和抗AILIM抗体包被的微滴板；(6)用抗CD3抗体，抗AILIM抗体和抗CD28抗体包被的微滴板。培养种入细胞的孔板，用ELISA法测定一定时间(18，40和64小时)时培养上清中TNFα(肿瘤环死因子α)，IFNγ(干扰素γ)，IL-2(白细胞介素2)，IL-4(白细胞介素4)和IL-10(白细胞介素10)的量。
必需注意，TNFα，IFNγ和IL-2是Th1型T细胞产生的细胞因子；IL-4和IL-10是由Th2型T细胞生成的细胞因子。
图29显示结果。结果包括如下(1)两个供体间对TNFα，IFNγ和IL-2产生的诱导水平无差异。
(2)既使单用抗CD3抗体刺激也可诱导TNFα和IFNγ生成。
(3)用抗CD3抗体和抗CD28抗体或用抗CD3抗体和抗AILIM抗体刺激比单用抗CD3抗体刺激对生成TNFα和IFNγ的诱导水平呈相加性增长。
(4)用抗CD3抗体和抗CD28抗体，抗CD3抗体和抗AILIM抗体，或用抗CD3抗体，抗CD28抗体和抗AILIM抗体刺激均可诱导生成IL-2。用抗CD3抗体，抗CD28抗体和抗AILIM抗体刺激所诱导的IL-2生成水平最高。
(5)关于IL-4和IL-10这两种Th2细胞因子，两个供体之间诱导水平不同。这种不同可能反应不同个体中T细胞群的不同。
(6)关于IL-4，用抗CD3抗体和抗CD28抗体，抗CD3抗体和抗AILIM抗体，或用抗CD3抗体，抗CD28抗体和抗AILIM抗体刺激均诱导生成。用抗CD3抗体，抗CD28抗体和抗AILIM抗体刺激所诱导的IL-4生成水平最高。
(7)关于IL-10，用抗CD3抗体和抗CD28抗体，用抗CD3抗体和抗AILIM抗体，或用抗CD3抗体，抗CD28抗体和抗AILIM抗体可诱导生成。用抗CD28抗体和抗AILIM抗体刺激导致IL-10以相对高水平产生。用抗CD3抗体，抗CD28抗体和抗AILIM抗体三种抗体刺激所诱导的IL-10生成水平最高。
上述检测显示，固定在孔板上的抗CD3抗体起抗原提呈细胞上MHC的作用，固定在孔板上的抗AILIM抗体起AILIM配体的作用，它们将第一信号和第二刺激信号(协同刺激信号)转导入加入的T细胞中，从而活化T细胞。
<3-3>当T细胞经CD3介导的信号传递刺激而产生细胞因子时，用抗AILIM抗体抑制这种诱导作用在包被有抗CD3抗体的微滴板中培养T细胞，检测抗AILIM抗体和抗CD28抗体分别能否抑制对T细胞应答生成IFNγ和IL-4的诱导。
外周血T细胞，胸腺T细胞或脾脏T细胞加入单用抗CD3抗体包被的微滴板，然后加入抗AILIM抗体(各种浓度)，抗CD28抗体(各种浓度)或CTLA4-IgFc(对照)中任何一种。根据上述<3-1>中方法确定培养上清中IFNγ或IL-4的量。
图11到14显示结果。
加入抗AILIM抗体能明显抑制经抗CD3抗体刺激的外周血T细胞生成IFNγ和IL-4(图11和12)。加入抗AILIM抗体也抑制这种细胞增殖。另一方面，加入抗CD28抗体既不能抑制细胞因子生成，也不能抑制细胞增殖。
加入抗AILIM抗体能明显抑制抗CD3抗体诱导的胸腺来源T细胞IL-4的生成(图13)。加入抗AILIM抗体也抑制这种细胞增殖。另一方面，加入CTLA4-IgFc作为对照既不能显著抑制IL-4产生，也不能明显抑制细胞增殖。
加入抗AILIM抗体明显抑制抗CD3抗体诱导的脾脏T细胞IL-4的生成(图14)。加入抗AILIM抗体也抑制这种细胞增殖。另一方面，加入CTLA4-IgFc作为对照既不能明显抑制IL-4生成，也不能明显抑制细胞增殖。
<3-4>分析经抗CD3抗体和抗AILIM抗体介导的协同刺激信号导入T细胞诱导的T细胞增殖。
对T细胞受体介导的第一信号和协同刺激分子如CD28和CTLA-4介导的第二信号应答的T细胞发生增殖。
用上述<3-1>检测方法分析健康正常人外周血T细胞，小鼠脾细胞，小鼠脾脏T细胞和大鼠淋巴节T细胞，经各种抗体刺激诱导的细胞增殖。
<3-4-1>对人外周血T细胞增殖的诱导将人外周血T细胞加入(1)单用抗CD3抗体(克隆OKT3；200ng/孔；Ortho诊断系统)包被的微滴板；(2)用抗CD3抗体和抗CD28抗体(克隆CD28.2；不同浓度；Pharmingen)包被的微滴板；(3)用抗CD3抗体(200ng/孔)和抗AILIM抗体(克隆SA12；各种浓度)包被的微滴板；和(4)用抗CD3抗体(200ng/孔)，抗人AILIM抗体(各种浓度)和抗CD28抗体(1μg/孔)包被的微滴板。将所述平板保温以培养所述细胞，通过用常规方法检测一定时间内氚标记的胸苷(3H-TdR)的掺入来评价细胞增殖程度。
结果见图30并如下(i)经上述(2)到(4)中任何一种刺激可明显增强人外周血T细胞的增殖。该增殖依赖于固定在所述微滴板上的抗AILIM抗体或抗CD28抗体浓度。
(ii)经上述(2)到(4)中抗体包被板的刺激可最大程度地诱导彼此相当的T细胞增殖。
随后，用上述同样方法，在下述(5)，(6)和(7)所示微滴板中评价T细胞增殖程度，以便研究经上述各种抗体刺激诱导的人外周血T细胞增殖过程。
(5)抗CD3抗体(200ng/孔)和抗体CD28抗(1μg/孔)包被板；(6)抗CD3抗体(200ng/孔)和抗AILIM抗(1μg/孔)包被板；和(7)抗CD3体抗体(200ng/孔)，抗人AILIM抗体(1μg/孔)和抗CD28体抗(1μg/孔)包被板。
图31显示结果。
任何抗体组合刺激后18小时有可识别的T细胞增殖。用抗CD3抗体和抗CD28抗体的组合(上述(5))进行刺激，可在刺激后40小时诱导最高水平的T细胞增殖，但在此之前该组合的刺激已使对T细胞增殖的诱导活性达到平衡。
另一方面，用抗CD3抗体和抗AILIM抗体(上述(6))或用三种抗体(上述(7))进行刺激，可在刺激后60小时达峰值。在这两种组合中，用抗体刺激后60小时所诱导的T细胞增殖明显高于抗CD3抗体和抗CD28抗体组合的诱导。
<3-4-2>对小鼠脾细胞和小鼠脾T细胞增殖的诱导
<3-4-2-1>在有固定抗体的微滴板中诱导细胞增殖用抗CD3抗体(克隆145-2C11；Pharmingen；50ng/孔)包被96孔板。然后，进一步用各种浓度抗小鼠AILIM抗体(克隆B10.5)包被这些板，或用抗NP-KLH抗体作为对照抗体包被这些板。小鼠脾细胞或小鼠脾来源T细胞被加入各种抗体包被的孔。将所述平板保温以培养所述细胞，通过用常规方法检测一定时间内氚标记的胸苷(3H-TdR)的掺入来评价细胞增殖程度。
用KLH(匙孔血蓝蛋白；PIERCE)与NP(硝基苯酚)这种半抗原连接而成的NP-KLH作为抗原制备抗NP-KLH抗体，作为对照抗体。
图32结果显示。
用抗NP-KLH抗体作为对照抗体既不能刺激小鼠脾细胞增殖，也不能刺激小鼠脾T细胞增殖。另一方面，用抗AILIM抗体刺激的所有细胞均有明显的增殖，其依赖于抗AILIM抗体的浓度。
<3-4-2-2>用固定了抗体的微珠诱导细胞增殖(第一部分)用乳胶微珠替代微滴板作为载体固定抗体。用这种珠以上述同样方法进行细胞增殖试验。
在D-PBS中，1×107微珠作如下处理(1)1μg/ml抗CD3抗体(克隆145-2C11；Pharmingen)和各种浓度的抗AILIM抗体(克隆B10.5)，或(2)1μg/ml抗CD3抗体和各种浓度的抗NP-KLH抗体。包含珠子的混合物培养1小时或更长时间，然后用D-PBS洗珠子。就这样将抗体固定在珠子上。
C57BL/6小鼠脾细胞(1×105/孔)悬浮在含10％FCS的RPMI1640培养液中，将其加入96孔板各孔，再加入珠子(1×105颗/孔)。混合物培养56小时。用常规方法实施氚标记的胸苷(3H-TdR)的掺入以确定反应后细胞增殖程度。
图33显示结果。
用抗CD3抗体和抗AILIM抗体刺激，或用抗CD3抗体和抗CD28抗体刺激均诱导C57BL/6小鼠脾细胞增殖。细胞增殖程度的增加依赖于固定在珠子上的抗AILIM抗体或抗CD28抗体浓度的增加(抗AILIM抗体或抗CD28抗体与抗CD3抗体的浓度比增加)。此外，抗CD3抗体与抗AILIM抗体及抗CD3抗体与抗CD28抗体的浓度比均是1∶9。
<3-4-2-3>用固定抗体的微珠诱导细胞增殖(第二部分)基于上述<3-4-2-2>的结果，在抗CD3抗体与抗AILIM抗体及抗CD3抗体与抗CD28抗体的浓度比均为1∶9条件下，用抗体包被的乳胶微粒以上述同样方法分析小鼠细胞的增殖。
将抗体包被的微珠以各种浓度加入小鼠脾细胞悬液(1×105细胞/孔)进行本实验。
此外，本试验所用小鼠细胞为BALB/C小鼠的脾细胞和其脾衍生的T细胞。
在检测中，单用抗CD3抗体固定的微珠以相似方法进行实验作为对照。
图34和35显示结果。
在(1)单用抗CD3抗体刺激；(2)用抗CD3抗体和抗AILIM抗体刺激；或(3)用抗CD3抗体和抗CD28抗体刺激后，均可诱导BALB/C小鼠脾细胞和BALB/C小鼠脾脏T细胞增殖。
细胞增殖程度随着加入该细胞培养中的微珠浓度(即抗体浓度)的增加而增加。
BALB/C小鼠脾细胞和BALB/C小鼠脾脏T细胞的增殖，均是在加入细胞培养的微珠浓度为30,000颗/孔时最大。用包被抗CD3抗体和抗AILIM抗体的珠子及包被了抗CD3抗体和抗CD28抗体的微珠均获得同样结果。
<3-4-3>诱导大鼠淋巴节T细胞增殖大鼠淋巴节T细胞(1×105细胞/孔)悬浮在含10％FCS的RPMI1640培养液中，将其加入(1)包被抗CD3抗体(克隆G4.18；50ng/孔)和抗CD28抗体(克隆JJ319；各种浓度；Pharmingen)的微滴板；(2)包被抗CD3抗体(50ng/孔)和抗AILIM抗体(各种浓度)的微滴板；和(3)用抗CD3抗体(50ng/孔)和阴性对照抗体MOPC21(各种浓度；Pharmingen)包被的微滴板。细胞在37℃培养44小时。培养结束前6小时，每孔以0.5μCi/孔的浓度加入氚标记的胸苷(3H-TdR)。培养结束后，收获细胞，然后用TOPCOUNT(PACKARD)测定掺入细胞中的氚标记的胸苷(3H-TdR)量。以掺入量作指标分析细胞增殖程度。
图36显示结果。如下是本实验结果。
尽管单用抗CD3抗体不能诱导大鼠淋巴节T细胞增殖，但用抗CD3抗体和抗AILIM抗体，或用抗CD3抗体和抗CD28抗体刺激，均可明显增强增殖。增殖依赖于固定在板上的抗AILIM抗体或抗CD28抗体的浓度。
实施例4抗AILIM抗体对关节炎的治疗效应<4-1>抗AILIM抗体多重给药的检测以10mg/ml死的结核杆菌(结核分枝杆菌H37Ra；Difco)的液体石蜡制剂作为佐剂。将该佐剂以0.1ml/个体(1mg/0.1ml/个体)经尾尖部皮内注射入Wistar大鼠(雄性，5周龄，Charles River Inc.)以诱导关节炎。给佐剂(0天)后7天，用体积测量器测量两后腿的体积。以两后腿体积作指标将大鼠分群(每群8个个体)。
给佐剂(0天)7天后，给其中一群的大鼠静脉注射抗大鼠AILIM抗体(JTT-2抗体，也称作JMab50；20mg/kg)。初次给药后，从开始到第20天的期间内，每周给两次抗体。在初次给佐剂后一定时间，用体积测量器测两后腿体积。
对照实验中，以一群既不给佐剂，也不给抗体的正常大鼠(4只)作对照，以小鼠抗人CETP抗体(克隆JHCl；也称作JMab109；JP-A 9-20800)代替抗大鼠AILIM抗体给予一群阴性对照大鼠。用体积测量器以同样方式测量两后腿体积。
图15显示结果。
令人惊奇地是，抗AILIM抗体给予组的足部肿胀被完全抑制；观察结果与未诱导关节炎的正常大鼠组的观察结果基本一致。
<4-2>单给抗AILIM抗体的检测(第一部分)基于上述结果，用上述同样方法观察单用抗AILIM抗体对关节炎的治疗效应。
本检测中，在给予佐剂(0天)后第3天，第5天或第7天静脉注射抗AILIM抗体或阴性对照抗体；使用的抗AILIM抗体和阴性对照抗体分别是抗大鼠AILIM抗体(JTT-2抗体；也称作JMab50；20mg/kg)和抗大鼠CETP抗体(JHCl；20mg/kg)。
图37显示结果。
抗AILIM抗体给药甚至只进行一次，但这一次给药无论是发生在给予佐剂后第3天，第5天或第7天，均明显抑制足部肿胀。具体是，给予佐剂后第7天给予抗AILIM抗体的实验组，足部肿胀几乎完全被抑制。抑制程度实质上与未诱导关节炎的正常大鼠组的相同。
<4-3>单用抗AILIM抗体的检测(第二部分)基于上述<4-2>的结果，在关节炎治疗中抗AILIM抗体的有效剂量，可用上述同样方法在关节炎模型中测出。
本检测中，仅在给予佐剂后第7天给予一次抗大鼠AILIM抗体(JTT-2抗体；也称作JMab50)，为静脉注射1，3，10或20mg/kg。
除JTT-2外，另一种抗大鼠AILIM抗体(JTT-1；也称作JMab-49；20mg/kg)以同样的方式仅给予一次，用于对比。
抗大鼠CETP抗体(JHCl；20mg/kg)作为阳性对照静脉注射一次。
既使以1，3，10或20mg/kg的剂量给予抗AILIM抗体一次时，足部肿胀也几乎完全抑制。抑制足部肿胀的程度实质上与未诱导关节炎的正常大鼠组水平相同。令人惊奇地，抗体既使在剂量低至1mg/kg也有抑制效应。
实施例5抗AILIM抗体对肝炎的治疗效应给C57BL/6小鼠静脉注射溶解在磷酸盐缓冲液(PBS)中的疮疱丙酸杆菌。给予P.acnes(0天)一周后，给该小鼠静脉注射溶于PBS中的LPS(脂多糖)以诱导肝炎。给予LPS后6.5小时，从眼底采血，用ELISA法测定血浆IFN-γ浓度。此外，用生化分析仪(Fara)测血浆GOT(谷草转氨酶)和GPT(谷丙转氨酶)浓度。
给予P.acnes(0天)后1，2和3天，给该小鼠腹膜内注射抗小鼠AILIM单抗(B10.5抗体；5,50或500μg/个体)，然后评价抗AILIM抗体对肝炎的缓解作用。
对照组不给予抗小鼠AILIM抗体。
图16和17显示结果。
抗AILIM抗体的给予以抗体浓度依赖方式显著抑制血中IFN-γ水平的升高。给予抗AILIM抗体(50μg/个体)也明显抑制GOT和GPT水平。
实施例6抗AILIM抗体对移植物抗宿主病(GVHD)的治疗效应<6-1>检测1为诱导GVHD，将BALB/C小鼠脾细胞(8×107细胞/个体)静脉输入F1小鼠(8到10周龄，3个)，其通过BALB/C小鼠和C57BL/6小鼠的杂交(bleeding)获得。给予脾细胞(0小时)后即刻和第12小时，给所述小鼠静脉注射抗小鼠AILIM单抗(B10.5抗体；400μg/个体)。给予脾细胞后24，48和72小时，给所述小鼠腹膜内注射B10.5抗体(200μg/个体)。
给予脾细胞(0天)后即刻，1，2，3和6周后，从所述小鼠采血。用常规方法测定血清中IgG1，IgE和抗dsDNA抗体的滴度。以自发性自身免疫病小鼠血清中抗dsDNA抗体滴度作标准，将抗dsDNA抗体滴度值标准化。
用hCTLA4-Ig(人CTLA4可溶区与免疫球蛋白恒定区的融合蛋白)替代抗AILIM抗体，以同样方式给予阳性对照组小鼠。此外，用PBS替代抗AILIM抗体，以同样方式给予阴性对照组。
图18到20显示结果。
作为GVH反应(移植物抗宿主反应)指标的血清IgG，IgE和抗dsDNA抗体滴度的增加，在给予抗AILIM抗体组，相对于阴性对照可被明显抑制。此外，该抑制效应与给予hCTLA4-Ig的阳性对照组的结果相当。
<6-2>检测2为诱导GVHD，将BALB/C小鼠脾细胞(1×108细胞/个体)静脉输入F1小鼠(8到10周龄，3只)，其通过BALB/C小鼠和C57BL/6小鼠杂交获得。给予脾细胞(0小时)后即刻和第12小时，给所述小鼠静脉注射抗小鼠AILIM单抗(B10.5抗体；200μg/个体)。给予脾细胞后24，48和72小时，给所述小鼠腹膜内注入B10.5抗体(100μg/个体)。
给予脾细胞(0天)后即刻，1，2，3，6，9和12周后，从所述小鼠采血。根据常规方法检测血清中IgG1，IgE和抗dsDNA抗体滴度。以自发性自身免疫病小鼠血清中抗dsDNA抗体滴度作标准，使抗dsDNA抗体滴度值标准化。
用hCTLA4-Ig(人CTLA4可溶区和免疫球蛋白恒定区的融合蛋白)替代抗AILIM抗体，用同样方式给予阳性对照组小鼠。此外，用PBS替代抗AILIM抗体，以同样方式给予阴性对照组。
图39到41显示结果。
作为GVH反应(移植物抗宿主反应)指标的血清IgG，IgE和抗dsDNA抗体滴度的增加，相对于阳性对照，在给予抗AILIM抗体组可被明显抑制。此外，该抑制效应与给予hCTLA4-Ig的阳性对照组的结果相当。
实施例7抗AILIM抗体对产生抗外来抗原抗体的抑制效应<7-1>抗AILIM抗体对绵羊红细胞(SRBC)致敏小鼠产生抗SRBC抗体的抑制效应给BALB/C小鼠(雌性，5周龄)静脉给予绵羊红细胞(SRBC；1×108细胞/个体)。给予SRBC(0天)后即刻或第7天，给所述小鼠静脉注射抗小鼠AILIM单抗(B10.5抗体；50或500μg/个体)。给予SRBC后一定时间采血。用常用的ELISA法评价血清中抗SRBC抗体的生成。
用hCTLA-4(人CTLA4可溶区和免疫球蛋白恒定区的融合蛋白)替换抗AILIM抗体，以同样方式给予阳性对照组小鼠。此外，用PBS替代抗AILIM抗体，以同样方式给阴性对照组。
图21和22显示结果。
给予抗AILIM抗体组，不管是SRBC致敏后即刻或致敏后第7天给予抗体，其针对外来抗原SRBC的IgG抗体的产生比阴性对照组均受到明显抑制。该抑制效应比给予hCTLA4-Ig的阳性对照组强。
另一方面，给予hCTLA4-Ig组在SRBC致敏后即刻给予hCTLA4-Ig，抗SRBC抗体的产生比阴性对照组也明显受到抑制。然而，SRBC致敏后第7天给予组未发现明显抑制。
<7-2>抗AILIM抗体对NP-KLH致敏小鼠产生抗NP-KLH抗体的抑制效应CFA(弗氏完全佐剂)和NP-KLH(KLH(匙孔血蓝蛋白)经化学方法连接到半抗原NP(硝基苯酚)；100μg/鼠)给C57BL/6小鼠腹膜内注射。给予抗原(0小时)后即刻和第12小时，经尾静脉给予抗小鼠AILIM抗体(克隆B10.5或B9.B6，200μg/鼠)。给予抗原后24和48小时，经腹膜内给予所述小鼠上述两种抗AILIM抗体之一。
给予NP-KLH后一定时间采血。用常规ELISA法对血清中产生的每种NP-KLH特异性抗体(IgG1，IgG2a，IgG2b或IgM)定量。在这个ELSIA实验中，NP偶联的小牛血清白蛋白(BSA)用作捕获抗原。
本实验中，分别用磷酸盐缓冲液和hCTLA4-Ig(人CTLA4可溶区和免疫球蛋白恒定区的融合蛋白)用上述相同的处理方法作阴性和阳性对照。
图42到46显示结果。
给予阴性对照抗体组在一定时间内生成的抗NP-KLH抗体量增加。因此该阴性对照抗体不能抑制抗NP-KLH抗体的生成。
另一方面，给予抗AILIM抗体组可明显抑制抗NP-KLH抗体生成。抑制程度与给予CTLA4-Ig的阳性对照组抑制NP-KLH抗体生成的效应相当。
在给予抗AILIM抗体组，生成的属于抗体类型IgG1，IgG2a，Ig2b或IgM的任何抗NP-KLH抗体均被明显抑制。
实施例8 分析抗AILIM抗体调节混合淋巴细胞反应(MLR)的活性分析了抗AILIM抗体是否具有调节(增强和/或抑制)T细胞应答(产生细胞因子如IFN-γ和IL-4，细胞增殖等)的活性，即该抗体是否具有调节AILIM介导的协同刺激信号转导入细胞的能力。以有无T细胞应答同种异体混合淋巴细胞反应(同种异体MLR)时的细胞增殖(即细胞中DNA合成)的调节活性作指标进行分析。
<8-1>制备人PBMC和T细胞从健康正常个体(7位，称作供体A，B，C，D，E，F和G)采集外周血样(200ml)，加在离心管(50ml；Falcon)的Lymphoprep层(15ml；Nycomed)之上。之后离心(1600rpm，10分钟)，然后回收中间层。回收的细胞用磷酸盐缓冲液稀释2倍或更多倍，然后离心(1800rpm，10分钟)制备PBMC(外周血单核细胞；2×108到5×108细胞)。用血细胞计数器计数细胞。取一等份细胞(1.08×108细胞，9个微滴板)以备MLR试验，存在冰上。剩余细胞用下述方法分离T细胞用PamT分离试剂盒(Miltenyi Biotech)从PBMC中分离T细胞。根据试剂盒的说明书，加入上述的剩余PBMC并使之在试剂盒包含的溶液中反应。之后，细胞用含5mM EDTA和0.5％BSA的PBS洗涤，再重悬于PBS。然后将细胞悬液加入用PBS溶胀的阳性选择柱VS+(Milteroyi Biotech)，回收未吸附部分。用PBS洗柱子。回收洗液。再次洗柱。将回收的溶液汇总以产生T细胞级分。将T细胞级分离心，然而将这些细胞重悬在PBS中。用血细胞计数器对所得T细胞计数。将这些细胞用于如下试验。
<8-2>混合淋巴细胞反应(MLR)如前所述，已知CD28和CD80(B7-1)/CD86(B7-2)间以及CTLA4和CD80(B7-1)/CD86(B7-2)间的两个信号传递途径是活化淋巴细胞，如T细胞等所需的协同刺激信号传递途径。
即T细胞应答混合淋巴细胞反应(MLR)而发生的增殖也可通过这两个已知途径中任何一个的信号传导而诱导。
这样，用下面显示的物质，本实验可分析(1)通过阻断CTLA4介导的信号传递途径对MLR的抑制；(2)通过阻断CD80(B7-1)/CD86(B7-2)介导的信号传递途径对MLR的抑制；和(3)通过阻断与AILIM相关的第三信号传递途径对MLR的抑制。
使用下述检测物质。
(1)小鼠抗人AILIM单抗SA12(与上述实施例相同)。
(2)小鼠IgG抗体(抗人CD34抗体；阴性对照；Immunotech)。
(3)抗人CD80单抗(Phamingen)和抗人CD86单抗(Phamingen)的混合物。
(4)人CTLA4-IgFc嵌合分子(Ancell)。
在下述6种组合中进行混合淋巴细胞反应，使用从上述<8-1>的供体制备的PBMC和T细胞。
(i)T细胞(供体A)/PBMC(供体D)(ii)T细胞(供体D)/PBMC(供体B)(iii)T细胞(供体C)/PBMC(供体A)(iv)T细胞(供体E)/PBMC(供体G)(v)T细胞(供体F)/PBMC(供体E)(vi)T细胞(供体G)/PBMC(供体F)用下述方法调节试验中所用的PBMC和T细胞的浓度。
将PBMC悬浮在PBS中，然后转入培养皿(60mm)。细胞用放射仪(HitachiMEDICO)进行X线照射(50Gy)。回收细胞，离心，然后加入含10％FCS的RPMI1640培养液中。调节细胞数至2×105细胞/50μl。
将所得每个供体的T细胞也加入含10％FCS的RPMIL1640培养液，调节细胞数至1×105细胞/50μl。
<8-2-1>抗AILIM抗体对MLR的抑制将含10％FCS的PRMI1640培养液加入U型96孔板的各孔。将小鼠抗人AILIM单抗SA12溶液用含10％FCS的RPMI1640培养液稀释，制成各种浓度的抗体溶液。将稀释的抗体溶液加入各孔(终浓度0，0.31，1.25，5和20μg/ml)。之后，将T细胞(50μl)加入这些孔中。在CO2培养箱(NAPCO)中37℃保温1小时。反应结束后，将源自不同供体的PBMC(50μl)加入这些孔中开始MLR。
当用除抗人AILIM抗体以外的另一种物质作检测物质进行MLR时，可使PBMC与该检测物质一起保温，然后使源自不同供体的T细胞与PBMC反应。
培养第5天，用含10％FCS的RPMI1640培养液稀释的氚标记胸苷(3H-胸苷；20μl；1μCi/孔)被加入各孔。继续培养1天。培养结束后，用细胞收获仪(Packard)收集细胞。用β计数器(TOP COUNT；Packard)检测掺入的3H的放射活性，以分析培养后T细胞的增殖率。
图47到52显示结果。
结果总结如下(1)CTLA4-IgFc阻断CTLA-4介导的信号传导，因此抑制同种异体MLR诱导的T细胞增殖。
(2)抗CD80抗体和抗CD86抗体抑制由CD80/CD86(CTLA4和CD28的配体)介导的信号传导，因此抑制同种异体MLR诱导的T细胞增殖。
(3)抗人AILIM抗体，类似于CTLA4-IgFc，抗CD80抗体和抗CD86抗体，可以以抗AILIM抗体浓度依赖方式明显抑制同种异体MLR诱导的通过AILIM介导的信号传导途径的T细胞增殖。
(4)抗AILIM抗体对MLR的明显抑制均可以由源自这些供体的PBMC或T细胞的任何组合获得。
换而言之，这些结果显示T细胞活化所需的协同刺激信号包括第三途径，其中信号传递除了通过已知的CTLA4/CD80/CD86介导和CD28/CD80/CD86介导，还可经AILIM及其配体介导，这些结果还显示AILIM介导的信号途径可被抗AILIM抗体抑制。
而且，这些结果更延续AILIM介导途径对信号传导的贡献很可能与CTLA4/CD80/CD86介导途径和CD28/CD80/CD86介导途径的相当。
工业用途本发明药用组合物可有效治疗或预防由淋巴细胞如T细胞活化及活化淋巴细胞的功能调节异常引发的下述各种自身免疫病，过敏性疾病或炎性疾病。
疾病实例有关节炎(例如类风湿性关节炎，骨关节炎)，炎症(例如脑炎，支气管炎，脉管炎，肺炎，肝炎，心肌炎，胰腺炎，肠炎，胃炎，腹膜炎，肾炎(例如肾小球肾炎)，关节炎(例如类风湿性关节炎)，缺血后再灌损伤中的炎症(心肌缺血再灌注损伤)，免疫排斥引起的炎症，炎性肠内疾病，烧伤，多器官衰竭性炎症，PTCA或PTCR术后炎症，动脉硬化伴有炎症，细菌或病毒感染引发的炎症(例如发炎)，移植物抗宿主反应，移植物抗宿主反应及组织和器官移植伴有的免疫排斥，外来抗原免疫所致针对外来抗原的抗体过量产生所伴有的各种疾病，多发性硬化症，自身免疫性甲状腺炎，各种皮肤炎症(过敏性接触型皮炎，苔藓等慢性皮肤炎症，牛皮癣，硬皮症)和系统性红斑狼疮。
本发明包含人抗AILIM抗体的药用组合物，作为药物是非常有用的，因为它完全没有副作用，例如，鼠源抗体给予人时的过敏。
权利要求
1.一种可阻止、治疗或预防关节炎的药用组合物，其包含具有对AILIM介导的信号传导进行调节的活性的物质及可药用的载体。
2.权利要求1的药用组合物，其中所述物质具有抑制AILIM表达细胞增殖或抑制AILIM表达细胞生成细胞因子的活性。
3.权利要求1或2的药用组合物，其中所述细胞因子是由Th1型T细胞生成的干扰素γ，或由Th2型T细胞生成的白细胞介素4。
4.权利要求1到3中任一项的药用组合物，其中所述关节病是类风湿性关节炎。
5.权利要求1到3中任一项的药用组合物，其中所述关节病是骨关节炎。
6.权利要求1到5中任一项的药用组合物，其中所述物质是蛋白物质。
7.权利要求6中的药用组合物，其中所述蛋白物质选自a)一种抗体，其与AILIM或其一部分结合；b)一种多肽，其包含AILIM的完整胞外区或其一部分；c)一种融合多肽，其包含AILIM的完整胞外区或其一部分以及免疫球蛋白重链的完整恒定区或其一部分；d)一种多肽，其与AILIM结合。
8.权利要求1到5中任一项的药用组合物，其中所述物质是非蛋白物质。
9.权利要求8中的药用组合物，其中所述非蛋白物质是DNA，RNA，或化学合成的化合物。
10.一种可阻止，治疗，或预防炎症的药用组合物，其包含一种具有对AILIM介导的信号转导进行调节的活性的物质，及一种可药用的载体。
11.权利要求10的药用组合物，其中所述物质具有抑制AILIM表达细胞增殖或抑制AILIM表达细胞产生细胞因子的活性。
12.权利要求11的药用组合物，其中所述细胞因子是由Th1型T细胞产生的干扰素γ，或由Th2型T细胞产生的白细胞介素4。
13.权利要求10到12中任一项的药用组合物，其中所述炎症是肝炎。
14.权利要求10到13中任一项的药用组合物，其中所述物质是蛋白。
15.权利要求14中的药用组合物，其中所述蛋白选自a)一种抗体，其与AILIM或其一部分结合；b)一种多肽，其包含AILIM的完整胞外区或其一部分；c)一种融合多肽，其包含AILIM的完整胞外区或其一部分以及免疫球蛋白重链的完整恒定区或其一部分；d)一种多肽，其与AILIM结合。
16.权利要求10到13中任一项的药用组合物，其中所述物质是非蛋白的物质。
17.权利要求16中的药用组合物，其中所述非蛋白物质是DNA，RNA或化学合成的化合物。
18.一种药用组合物，其可阻止、治疗或预防移植物抗宿主反应以及与移植物抗宿主反应或者组织或器官的移植相伴的免疫排斥，其中该药用组合物包含一种具有调节AILIM介导的信号转导的活性的物质，和一种可药用的载体。
19.权利要求18中的药用组合物，其中所述物质具有抑制AILIM表达细胞增殖或抑制AILIM表达细胞产生细胞因子的活性。
20.权利要求19中的药用组合物，其中所述细胞因子是由Th1型T细胞产生的干扰素γ，或由Th2型T细胞产生的白细胞介素4。
21.权利要求18到20中任一项的药用组合物，其中所述物质是蛋白。
22.权利要求21中的药用组合物，其中所述蛋白选自a)一种抗体，其与AILIM或其一部分结合；b)一种多肽，其包含AILIM的完整胞外区或其一部分；c)一种融合多肽，其包含AILIM的完整胞外区或其一部分以及免疫球蛋白重链的完整恒定区或其一部分；d)一种多肽，其与AILIM结合。
23.权利要求18到20中任一项的药用组合物，其中所述物质是非蛋白的物质。
24.权利要求23的药用组合物，其中所述非蛋白物质是DNA，RNA或化学合成的化合物。
25.一种阻止由外来抗原或自身抗原触发的免疫应答的药用组合物，其包含一种具有调节AILIM介导之信号转导的活性的物质，和一种可药用的载体。
26.权利要求25的药用组合物，其中所述免疫应答是产生针对该抗原的抗体，细胞增殖，或产生细胞因子。
27.权利要求25或26的药用组合物，其中所述物质具有抑制AILIM表达细胞增殖或抑制AILIM表达细胞产生细胞因子的活性。
28.权利要求27的药用组合物，其中所述细胞因子是由Th1型T细胞产生的干扰素γ，或由Th2型T细胞产生的白细胞介素4。
29.权利要求25到28中任一项的药用组合物，其中所述物质是蛋白。
30.权利要求29的药用组合物，其中所述蛋白选自a)一种抗体，其与AILIM或其一部分结合；b)一种多肽，其包含AILIM的完整胞外区或其一部分；c)一种融合多肽，其包含AILIM的完整胞外区或其一部分以及免疫球蛋白重链的完整恒定区或其一部分；d)一种多肽，其与AILIM结合。
31.权利要求25到28中任一项的药用组合物，其中所述物质是非蛋白的物质。
32.权利要求31的药用组合物，其中所述非蛋白物质是DNA，RNA，或化学合成的化合物。
全文摘要
发现抗AILIM(又称作JTT－1抗原,JTT－2抗原,ICOS和8F
文档编号C07K16/28GK1359302SQ00802420
公开日2002年7月17日 申请日期2000年8月30日 优先权日1999年8月30日
发明者手塚克成, 渡部良広, 安部良 申请人:日本烟草产业株式会社