专利名称：重组人甲状旁腺素基因的合成及表达的利记博彩app
技术领域：
本发明是要利用DNA重组技术生产重组人甲状旁腺素(简称rhPTH)，主要是按照人甲状旁腺素的自然氨基酸序列，合成该多肽类激素基因，进而将该基因整入不同的表达载体，转化不同的宿主细胞，筛选出能够表达重组人甲状旁腺素的工程菌。
hPTH是人的甲状旁腺细胞分泌的一种由84个氨基酸残基组成的多肽类激素，其最重要的功能是调节人体内的钙离子代谢。在临床上的主要作用是治疗各种骨骼类疾病，如低甲状旁腺素血症、骨质疏松症等。研究表明hPTH分子的不同肽段有不同的作用，已知hPTH的N-端34个氨基酸残基组成的肽段能使其结合肾细胞膜上的激素受体，进而激活腺苷酸环化酶(Adv.Prot.Chem.，32323-393，1982)；hPTH的28-48肽段可能通过蛋白激酶C起促有丝分裂作用。因此，hPTH分子将人体内的合成及分解代谢功能有机的统一起来了。正是基于此，人们可以人工合成hPTH的不同肽段或hPTH的类似物来研究其在调节钙离子代谢中的作用。虽然PTH属于小分子多肽，分子量仅9,500道尔顿，可采用化学法人工合成，但这种方法的技术要求高、难度大。采用基因工程的方法是比较理想的一种选择。如，由Allelix(加拿大)、Astra(瑞典)和Chiron(荷兰)三家制药公司联合研究的重组人甲状旁腺素ALX1-11已于1997年9月进入III期临床。
hPTH的基因序列最早是由Hendy，GN等确定的(Hendy，GN etalProc.Natl.Acad.Sci.USA，787365-7369，1981)。此后，许多研究小组都试图利用DNA重组技术使其在酵母菌中表达，但均未获得成功。研究者在E.coli中进行了一系列的表达工作，如有人表达出N-端增加Met-Gly的hPTH，但是Met-Gly残基的存在，使所得到的表达产物没有生物活性(Hogset，A etalBiochem.Biophys.Res.Commun.16650-60，1990)，Wingender等将hPTH同半乳糖苷酶进行融合表达成功，但是在切去半乳糖苷酶部分后，hPTH的N-端又多出一个脯氨酸(Pro)(Wingender，E etal J.Biol.Chem.2464367-4373，1989)，这又同天然的PTH不同。Hogset等成功地将hPTH的基因拼接到蛋白A启动子和一种信号肽的下游，在E.coli中实现了分泌型表达完整的PTH分子，不过表达量只有1mg/L，根本没有生产意义(Hogset，A etal J.Biol.Chem.2657338-7344，1990)。
随着DNA合成技术的发展，针对一些小分子蛋白，可很方便地采用人工合成的方法得到其相应的基因，并将其中的密码子改变成最终表达宿主所偏好密码子，实现高效表达。例如，本公司采用了酵母喜好的遗传密码子人工合成的水蛭素基因，在Pichia酵母中以分泌型表达，产量不低于2.0g/L(中国专利号00129747.3)。但是，针对hPTH基因，Sung和Rabban等(Sung，WL etalBiochem.Cell.Biol.64133-138，1986；Rabban，SA etal J.Biol.Chem.2631307-1313，1988)选用酵母喜好的密码子合成hPTH基因，在酵母中表达并不成功，而在E.coli中表达，其最终产量也只有200ug/L，这一表达量也没有实际意义。考虑到天然的各种hPTH在不同表达系统中，或是由于表达量太低，不适合工业化生产；或是对其一级结构有所改变，使之活性丧失。唯有选择融合表达并利用特定的蛋白酶出除去融合蛋白的另一部分，方能够获得很高的表达，我们构建的工程菌表达GST-hPTH融合蛋白占菌体总蛋白的量不低于15％。
最终我们对Pharmacia公司的表达载体pGEX4T-1进行了改造，将谷胱甘肽转移酶(GST)基因同hPTH基因相连形成融合蛋白，在两个基因中间插入了肠激酶识别的氨基酸序列DDDDK所对应得DNA序列(图4)。肠激酶的高度特异性剪切可以确保在不破坏hPTH的情况下除去GST部分；采用蛋白酶缺陷型BL21宿主菌构建工程菌使目的蛋白水解的可能性降到最低限度，且该套表达系统较之pTrx或pTrxFus系统更易于规模化生产。最终在E.coli中获得了同天然hPTH氨基酸序列完全一样并有生物活性的重组hPTH(rhPTH)。将我们合成的hPTH基因在甲醇酵母Pichia pastoris中表达，在摇瓶中的表达量不低于0.2g/L。
图1、合成的hPTH基因的碱基序列及氨基酸序列图2、拼接hPTH基因所合成的六段引物序列图3、引物拼接过程的示意图及PCR产物的凝胶电泳图片图4、表达载体pGEX4T-1-hPTH构建示意5、表达载体pGEX4T-1-hPTH的酶切电泳6、pGEX4T-1-hPTH表达质粒的测序结果图7、BL-21-hPTH工程菌表达产物的SDS聚丙烯凝胶电泳图片本发明的主要内容1.hPTH基因的合成在合成基因时，首先要考虑的是确保基因的两端有可插入不同表达载体的限制性内切酶酶切位点。合成的人甲状旁腺素基因可插入由Lac或Tac或AOX1启动子控制的不同表达载体中，如pGEX、pTrx、pPIC9、pHIL-S1等；我们首选pGEX4T-1表达载体。通过计算机辅助软件设计六段引物(合成编号为W881、W882、W883、W884、W885、W886)，利用W882~W886号引物，通过PCR法(图1、2)拼接出含有hPTH基因及其两端含有BamHI、EcoRI和PstI限制性内切酶识位点的DNA片段，将PCR产物经BamHI-EcoRI双切可插入pGE4T-1载体中，而经BamHI-PstI双切可插入pTrx系列的载体中等等。2.hPTH基因的测序将构建的pGEX4T-1-hPTH表达载体在上海基康(Genecore)公司的ABI377测序仪(配套用BigDye Terminator试剂盒)上进行测序，确定序列无误后，再利用合成的hPTH5`-端引物(合成编号W881)和W883号引物，以pGEX4T-1-hPTH为模板，扩增出可整合入pPIC9、pHIL-S1等表达载体的hPTH基因，构建其他表达载体。由于PCR拼接时易于出现差错，所以可能需要测定多个阳性克隆菌体中的质粒，最终才能获得正确的hPTH基因。3.hPTH基因的表达根据目的基因插入的表达载体不同，选用不同的培养基和培养温度，利用不同的诱导物(如IPTG、甲醇)诱导目的蛋白的表达。对于融合表达的情况，则根据融合蛋白的分子量，在15％SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析菌体蛋白，对比未诱导和诱导后电泳条带的差异，并在酶切后进行Tricin电泳，Western Blot确定酶切释放出的片段是否为hPTH。非融合胞内型表达判定方法类似融合表达，而分泌型表达采用临床常用的PTH检测试剂盒(解放军301医院东亚研究所制)测定表达情况。hPTH在原核中的表达量约占总蛋白的15~25％；在甲醇酵母发酵液中的含量不低于0.2g/L(诱导50小时)。
实施例一hPTH基因的合成所用得六段引物均在上海生物工程(Sangon)公司合成，经PAGE电泳回收，分装成10D/管，合成编号W881~886，自编号HP1-HP6，2000.4.23合成)。其中W881是为将hPTH基因整合入不同表达载体而设计的，具体拼接过程如图3。先以HP5为模板，HP6、HP3为引物，拼接出hPTH基因的后半段，电泳胶回收后作为下一轮PCR的模板，加入引物HP2、HP3、HP4，最终得到含hPTH基因的DNA片段。整个PCR拼接过程经历两次PCR反应，PCR过程及条件如下第一次PCR反应(PCR-A)50ul反应体系0.4ul-------HP5(模板)1.3ul-------HP3(hPTH基因3`-端引物)1.3ul-------HP6(上链引物)1.0ul------Mix-dNTP(每种dNTP含5mmol/L)5.0ul------10x Taq-Plus缓冲溶液2.0ul------Taq-Plus酶(用1xTaq-Plus缓冲溶液稀释酶原装液至1u/ul)加超纯水39ul至总体积为50ul。反应参数为94℃，60s/58℃，50s/72℃，70s，循环30轮，用1.5％的低熔点琼脂糖进行凝胶电泳，回收最亮的条带，溶于30ul 10mM TE缓冲溶液PH8.0，作为下一轮PCR的模板。第二次PCR反应(PCR-B)100ul反应体系0.6ul------PCR-A胶回收片段(hPTH基因5`-端片段，模板)0.4ul------HP4(hPTH基因5`-端片段，引物兼模板)2.5ul------HP3(hPTH基因3`-端引物)2.5ul------HP2(上链引物)2.0ul------Mix-dNTP(每种dNTP含5mmol/L)10ul ------10x Taq-Plus缓冲溶液4.0ul------Taq-Plus酶(用1xTaq-Plus缓冲溶液稀释酶原装液至1U/ul)加超纯水79ul至总体积为100ul反应参数为94℃，60s/54℃，50s/72℃，70s循环30轮，用1.5％的低熔点琼脂糖进行凝胶电泳，回收最亮的条带，用限制酶BamHI-EcoRI双切，作连接用。PCR拼接过程见图3。实施例二hPTH基因的表达载体pGEX4T-1-hPTH的构建用BamHI-EcoRI双切表达载体pGEX4T-1(Pharmacia)，胶回收酶切后的载体大片段，将其同双切后PCR-B产物(hPTH基因)建立如下连接反应体系；7.0ul------双切后PCR-B产物(hPTH基因)1.0ul------回收后的pGEX4T-1载体1.0ul------10x T4 DNA联接酶0.5ul------T4 DNA联接酶(约3U)0.5ul------dH2O------------------------------------------------------10ul ------总反应体积连接反应的条件22℃、60mins、65℃、10mins，用连接反应液转化经氯化钙法制备的E.coli BL21感受态细胞，方法参见J.Sambrook etal，MolecularCloning a laboratory Mannual，2nded，1989。取转化后的菌液100ul铺在f 80cm的LB+Amp+1.5％Agar平板上，从中挑出出6-10个阳性克隆，接种到LB+Amp(100ug/ml)液体培养液中，37℃，200rpm过夜培养，采用试剂盒提取质粒，BamHI-EcoRI双酶切法进行筛选，能酶切出约280bp片段的克隆就是含有hPTH基因的菌(图5)，特称为pGEX4T-1-hPTH-BL21准工程菌。实施例三pGEX4T-PTH-BL21准工程菌的筛选及诱导表达1).准工程菌的增殖及诱导挑选含有能切出280bp片段的质粒的阳性克隆菌，分别接种于10ml LB+Amp(100ug/ml)的培养液中，37℃，200rpm条件下培养过夜；然后以用LB培养液按1∶10的比例稀释培养至OD600为0.5(约需1小时)，自每份诱导培养液取700ul盛于有编号的1.5mlEP管中，10,000rpm，2mins冻存菌体，待用。然后加入0.1M IPTG至培养液中的浓度为0.1mM，诱导GST-hPTH融合蛋白表达，诱导时间约2.5~3.5小时。2).准工程菌表达的电泳检测诱导约3小时，自每份诱导培养液取600ul盛于有编号的1.5mlEP管中(注意编号同前面未诱导时各管编号的对应，便于电泳对比)，10,000rpm，2mins弃上清，保留菌体沉淀，在每个EP管中加100ul的蒸馏水，充分悬浮体沉淀，再加入等体积的2xSDS凝胶电泳上样缓冲液，混均，盖紧。另取出冻存的未诱导时的菌体，也依此方法处理。将上述各管置热水浴中，置微波炉中加热5mins。每管中取15ul在15％的SDS-聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳分析(注意未诱导菌同诱导后菌样品在点样孔位置上要相邻)。根据分子量估算rhPTH融合蛋白的MW约35,500道尔顿。因此，未诱导菌及诱导后菌体蛋白电泳条带对比即可以获悉那一个阳克隆中的目的基因已表达了。我们从30个抗氨苄青霉素的阳性克隆菌中筛选出15个含有280bp片段的准目标克隆，进而将这15个克隆诱导表达，得到6个表达出35,00条带的克隆，5个表达出或长或短的蛋白条带的克隆，4个未表达克隆(图7)。由于在PCR拼接过程中，会出现各种差错，使得目的基因发生移码或缺失突变，产生或长或短的融合蛋白，或根本就不能表达。我们将这6个克隆定为准工程菌，因为它们虽然表达出大小符合要求的融合蛋白，但是，这并不能排除中间出现了同原设计不相符的碱基置换或少数密码子的增减，从而使hPTH的一级结构发生改变的情况。实施例四pGEX4T-PTH-BL21工程菌的确定及诱导表达从上述六个工程菌中随机取三个克隆，接种于5ml LB+Amp培养液中过夜，提取质粒，用pGEX4T-1载体的配套引物，由上海基康(Genecore)公司在ABI377测序仪上(配套用BigDye Terminator试剂盒)进行测序，其中有二个克隆的碱基序列同原设计完全相同(图6)。这两株准工程菌即为我们需要得工程菌。其诱导表达的条件同实施例三。实施例五GS115-hPTH Pichia酵母工程菌的构建1).pPIC9-hPTH表达载体的构建以上述测序正确的表达载体pGEX4T-1-hPTH为底物，利用W881和W883号引物，扩增出5`-端含XhoI，3`-端含EcoRI的内有hPTH基因的DNA片段，用XhoI-EcoRI双切PCR出的长约270bp的DNA片段，使与同样用XhoI-EcoRI双切pPIC9联接，转化感受态Top10F`宿主菌，按照同实施例二中的方法酶切筛选含270bp的克隆，即可获得含hPTH-pPIC9表达载体克隆宿主菌，以此来制备用于转化酵母的质粒DNA。2).Pichia酵母的转化用线性化的hPTH-pPIC9表达载体DNA转化感受态Pichia酵母GS115 His--Mut+宿主菌(感受态采用Invitrogen公司的Pichia Easy CompTransformation Kit制备)，按Pichia Expression Kit-Protein Expression，Catalog NoK1710-01)中所述步骤进行转化并筛选。因宿主GS115是His-(组氨酸缺陷型)，不能MD板上生长(1.34％YNB、4×10-5％Biotin、2％Dextrose、1.5％Agar)，只有转化成功的转化子才能生长。3).Pichia酵母工程菌hPTH-GS115的构建从MD板上挑出单菌落，接种到含10mlYPD培养基(1％Yeast extract、2％Peptone、2％Dextose)中，30℃培养30小时，在无菌操作的条件下，收集菌体转到含10ml MM诱导培养液的容积为50ml摇瓶中，在不低子300转/分钟下培养，并每隔10小时，取一次样，用的PTH检测试剂盒(解放军301医院东亚研究所制)测定表达情况。每次取样后加无水甲醇到终浓度为0.5-1.0％。诱导培养约60-70小时。最高表达量(hPTH活性最高时)约在50-60小时之间出现。为保证培养液体积相对恒定，每次取出多少样，就添加相应体积的MM培养液，另加约0.5ml无菌水补充蒸发掉的水。最终获取能表达hPTH的Pichia酵母工程菌，命名为hPTH-GS115。
权利要求
1.合成如下一段含人甲状旁腺素(简称hPTH)基因的DNA序列5`-GCTGGATCCGATGACGATGACAAGTCAGTTTCTGAAATTCAACTTATGCATAATCTTGGTAAGCATCTTAATTCTATGGAACGTGTTGAATGGCTTCGTAAGAAGCTTCAAGATGTCCATAATTTTGTTGCTCTTGGTGCTCCTCTTGCTCCTCGTGATGCTGGTTCTCAACGTCCTCGTAAGAAGGAAGATAATGTTCTTGTTGAGTCTCATGAAAAGTCTCTTGGTGAAGCTGATAAGGCTGATGTCAATGTTCTTACAAAGGCTAAGTCTCAATAGAATTCTGCAGTGA-3`
2.根据权利要求1，该段DNA序列的特征是其5`-端含有限制酶BamHI的识别序列，3`-端含有限制酶EcoRI、PstI的识别序列，尤其在其5`-端含有编码肠激酶识别的氨基酸序列(DDDDK)对应得DNA序列；
3.根据权利要求1，可以将合成的人甲状旁腺素基因插入由Lac或Tac或AOX1启动子控制的不同表达载体中。如pGEX、pTrx、pPIC9、pHIL-S1等；
4.根据权利要求1、2所述hPTH基因的5`-端DDDDK对应的DNA序列也可以替换成重组TEV蛋白酶识别的氨基酸序列(ENLYFQG/S)所对应得DNA序列，从而产生同天然hPTH完全一样或仅N-端第一位氨基酸改变成甘氨酸(Gly)的hPTH衍生物；
5.根据权利要求4，hPTH多肽的N-端第一位可以替换成甘氨酸(Gly)；
6.根据权利要求1、2、3、4，含有该基因的原核或真核表达宿主细胞。
全文摘要
本发明是以人甲状旁腺素(简称hPTH)氨基酸序列资料为基础,合成含有如下一段hPTH基因的DNA序列:5`-TCAGTTTCTGAAATTCAACTTATGCATAATCTTGGTAAGCATCTTAATTCTATGGAACGTGTTGAATGGCTTCGTAAGAAGCTTCAAGATGTCCATAATTTTGTTGCTCTTGGTGCTCCTCTTGCTCCTCGTGATGCTGGTTCTCAACGTCCTCGTAAGAAGGAAGATAATGTTCTTGTTGAGTCTCATGAAAAGTCTCTTGGTGAAGCTGATAAGGCTGATGTCAATGTTCTTACAAAGGCTAACTCTCAA-3`,并提供了PCR法拼接人工合成的寡聚脱氧核苷酸链的方法,以及将该基因整合入由Lac或Tac或AOX1启动子控制的不同表达载体中,转化E.coli或Pichia酵母宿主菌,最终得到融合或非融合表达的重组蛋白hPTH的工程菌。
文档编号C07K14/435GK1353115SQ0013357
公开日2002年6月12日 申请日期2000年11月13日 优先权日2000年11月13日
发明者黄秀东, 游自立, 李树刚, 王立兵 申请人:梅伯皋