人同源盒基因LHX4全长cDNA序列的利记博彩app

专利名称：人同源盒基因LHX4全长cDNA序列的利记博彩app
技术领域：
本发明涉及一种人同源盒基因序列，具体涉及人同源盒基因LHX4的全长cDNA序列。
同源盒基因(homeobox gene)是1983年在瑞士Gehring实验室发现的一类基因，它们因在其基因外显子3′端共同具有一段长180个碱基对、高度保守的同源盒序列而得名，同源盒基因的表达产物是一类重要的转录因子，是发育的主控基因。由这段序列所翻译出的蛋白质更具保守性，并富含碱性氨基酸，因此称为同源盒区(homeodomain)。LIM同源盒基因(LIM homeoboxgene)属于同源盒基因家族，它不仅具有同源盒结构，而且含有两个富含半胱氨酸和组氨酸的LIM结构域。LIM结构域的名称是由LIM家族中三个基因Lin-11(线虫)、Isl-1(鼠)和Mec-3(线虫)名称的首字母缩写而成。LIM同源盒转录因子(LIM homeodomain transcription factor，LIM-HD)是指LIM同源盒基因的蛋白质表达产物，大多表达在神经系统，具有早期特征的的形成及后期调控组织特异性基因的表达等功能，因而这些基因决定脊柱和非脊柱动物发育中组织和细胞特异性分化。
LHX4基因(LIM homeobox gene 4)属于LIM同源盒基因家族。1994年，美国Hung Li等人依据同源盒区最保守的氨基酸序列“KIWFQNRR”设计了一个含有编码同源盒序列羧基端14个氨基酸序列的基因克隆，然后用这段基因序列去筛选小鼠胚胎cDNA文库后得到一个1196bp的cDNA阳性克隆。这个克隆含有一段编码170个氨基酸的翻译区，它的位置从3′poly-A一直延伸到homeobox的5′端，因而它与LHX3有较高的同源性而命名为LHX4(Li Hung，Witte DP，Branford WW et al.Gsh-4 encodes a LIM-typehomeodomain is expressed in the developing central nervous system and isrequired for early postnatal survival.The EMBO J，1994，132876-2885)。但由于LHX4基因在机体内的表达量很低，此后国内外一直没有获得小鼠或其他物种LHX4基因的cDNA全长序列。
本发明的目的是提供一种可以在成人中枢神经系统组织中得到表达的人LHX4基因的cDNA全长序列。
本发明的发明人以LHX4 pBluescript质粒(Li H，Witte DP，Branford WWet al.Gsh-4 encodes a LIM-type homeodomain is expressed in the developingcentral nervous system and is required for early postnatal survival.The EMBO J，1994，132876-2885对该质粒有详细描述)中小鼠LHX4基因cDNA 3′端部分序列为探针，应用放射性原位杂交技术筛选人脊髓cDNA文库，在数百个阳性克隆中意外地得到一个含有完整的开放性阅读框架(opening reading frame，ORF)、3′端有明显的Poly A结构的阳性克隆。它编码一个含399个氨基酸的蛋白质，与已知小鼠LHX4蛋白质仅有3个不同的氨基酸。该克隆的核酸序列与小鼠LHX4(AF135415)cDNA序列有92％的相似性，具体表示为GACGTCGCATGCTCCCGGCCGCCATGGCGGCCGCGGGAATTCGATTGGTGGCGACGACTCCTGGAGCCCGTCAGTATCGGCGGAATTCGCGGCCGCGTCGACCGGAGAGCGAGATCAAAGGGATTGGAAACAGACTGGGGACTGGCGGGGGGAGGGGGCCGGCCAGCCTGTGGAGTCCTCCCTGAGAAGCGGAGGGCCCGGCTTCCACCGTGACTCCAGCGGCCTGCTTGGGGTTTTAATTATTATTTTGAAATTTCTGAATCGAGCTAGAGCGAGAGAGCGAGAGATCTCCGTAGACTGCGACTCGCTGGCTTTCGCTCCGAGATGATGCAGAGTGCGACTGTCCCCGCGGAAGGGGCTGTCAAGGGGCTCCCGGAGATGCTAGGTGTGCCGATGCAACAGATTCCCCAGTGCGCTGGCTGCAACCAGCACATCCTGGACAAGTTCATCCTGAAGGTCCTGGACAGACACTGGCACAGCTCCTGCCTCAAGTGTGCAGACTGCCAGATGCAGCTGGCGGACAGGTGCTTCTCCAGGGCTGGGAGCGTCTACTGCAAGGAGGACTTCTTCAAGCGCTTCGGCACAAAATGCACGGCCTGCCAGCAGGGTATCCCCCCAACCCAGGTGGTCCGCAAGGCCCAGGACTTTGTCTACCACCTGCACTGCTTTGCTTGCATCATCTGCAACCGGCAGCTGGCCACGGGGGACGAATTCTACCTCATGGAGGACGGGCGGCTGGTGTGCAAGGAAGACTACGAGACAGCCAAGCAGAACGATGACTCAGAGGCTGGAGCTAAGCGGCCCCGGACCACCATCACAGCCAAGCAGCTGGAGACATTAAAGAATGCATACAAGAACTCCCCCAAGCCTGCCCGGCACGTGAGGGAGCAGCTGTCCTCAGAGACAGGCCTGGACATGAGGGTCGTACAGGTTTGGTTTCAGAACAGAAGGGCCAAAGAGAAACGCCTGAAGAAGGATGCAGGGCGGCACCGCTGGGGGCAGTTCTATAAGAGCGTCAAGAGGAGCCGGGGCAGCAGCAAGCAGGAGAAGGAGAGCTCTGCAGAGGACTGTGGGGTTAGTGACAGTGAGCTGAGCTTCCGAGAGGATCAAATTCTCTCAGAACTTGGCCACACCAATAGGATTTATGGCAACGTGGGGGACGTTACAGGCGGACAGTTAATGAATGGGAGCTTCTCCATGGACGGGACAGGACAATCCTATCAGGACTTGAGGGATGGGAGCCCCTATGGAATCCCCCAGTCTCCATCCTCCATATCGTCCCTGCCATCCCACGCTCCTTTGCTCAATGGGCTGGATTACACGGTGGACAGTAATTTGGGCATCATTGCGCATGCAGGGCAGGGAGTAAGCCAGACGCTGAGAGCCATGGCTGGGGGACCCACCTCTGACATCTCCACAGGAAGCAGTGTAGGCTATCCCGACTTTCCAACTAGCCCAGGCTCTTGGCTCGATGAAATGGATCATCCTCCTTTTTAAACTTCTCTCCTCCCCACCCTACCTGCCCCCCTGGCTTGAGAGAATATCTTCAAGGATCAAAAGAGACTTGCCTTTTAAGGATCGAAAGTACGCCAATGTGAATTTCCATTATTTTCAATGGAAGTCCTCCGCTGATTCCTAGAAGGCTGTGAGACCACACTAGGGCATTGTTTCCCTGGGGAAGCAGTGGGAGAGCAGACTCATCTCAGAACACAGCACAGGGGGTAATGGCCTAGAGCTCTAGGGACACTGGCTTGTTGGGTCTCTCCCCTGCTGTTCTGCTTAGGGGCTTGGCTGCTCAGTGCTTTGGTAGCACAAGGTGACTGTGATAGGCCCCCTTGGCCTTTGGGAACTTTGCTCCAACTGGTGTGTCTCACACAATGCCTCGTCGACGCGGCCGCGAATTCCAGCTGAGCGCCGGTCGCTACCATTACCAGTTGGTCTGGTGTCAAAATCACTAGTGAATTCGCGGCCGCCTGCAGGTCGACCATATGGGAGAGCTCCCAACGCGTTGGATGCArAGC通过RHGB4(Radiation Hybridization GeneBridge4)法和基因组数据库检索两种方法对上述人LHX4基因的外显子区域进行了划分，结果发现人LHX4基因包含6个外显子。外显子序列为
ATGGATCATCCTCCTTTT其中同源盒区(homeodomain)由外显子2和3共同表达构成；LIM结构域1(LIM domain 1)由外显子5表达，LIM结构域2(LIM domain 2)由外显子4表达。
接着，本发明的发明人利用已得到的人LHX4基因cDNA序列为探针，在成人多组织表达Array膜(multiple tissue expression array，MTE array)上通过放射性杂交的方法，研究了LHX4基因在成人不同组织中的表达情况，结果显示全脑、大脑皮层、脊髓和胎脑有杂交信号出现。其中以胎脑信号最强。其余由强到弱依次为脊髓、全脑和大脑皮层，而人体其他组织中则没有杂交信号出现。
他人和本发明的发明人都用实验证明，LHX4是躯体运动神经元发育和分化过程中发挥重要作用，是调节运动神经元发育分化和轴突投射模式形成的一类重要转录因子(Sharma K，Sheng HZ，Lettier K et al.LIM homeoboxfactors Lhx3and LHX4 assign subtype identities for motor neurons.Cell，1998，95817-828；Thor S and Thomas JB.The Drosophila islet gene governs axonpathfinding and neurotransmitter identity.Neuron，1997，18397-407)。
本发明中使用的英文缩写及其中文意义为英文缩写 其中文意义Amp 氨苄青霉素BSA 牛血清白蛋白dCTP 2′-脱氧胞苷三磷酸ddH2O双蒸水DEPC 焦碳酸二乙酯IPTG 异丙基硫代-β-D-半乳糖苷NC 硝酸纤维素NTP 三磷酸核苷PEG 聚乙二醇SDS 十二烷基硫酸钠SSC 标准柠檬酸盐氯化钠溶液Tris 三羟甲基氨基甲烷X-gal5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷下面用实施例结合附图对本发明作进一步详细说明。


图1为LHX4-pBluescript II SK(+/-)质粒图谱。
图2为LHX4 pBluescript II SK(+/-)质粒中所插入的小鼠LHX4翻译区序列，图中黑色下划线的区域即为探针的序列。
图3为探针的PCR扩增和玻璃奶纯化结果(L200bp Ladder，A探针的PCR扩增，B探针的玻璃奶纯化)。
图4为放射性原位杂交筛库示意图(A第一轮杂交，B第二轮杂交，C第三轮杂交)。
图5为第一轮杂交的克隆进行PCR鉴定(L200bp Ladder，C-阴性对照，C+阳性对照，1-7依次为阳性克隆SC1，SC4，SC6，SC7，SC8，SC11，SC14)。
图6为第二轮杂交Lhx4特异性引物PCR鉴定结果(L200bp Ladder，C-阴性对照，C+阳性对照，1-13依次为阳性克隆SC11，SC12，SC13，SC14，SC61，SC62，SC63，SC64，SC71，SC111，SC112，SC141，SC143)。
图7为第二轮杂交λgt11引物PCR鉴定结果(L200bp Ladder，C-阴性对照，1-13依次为阳性克隆SC11，SC12，SC13，SC14，SC61，SC62，SC63，SC64，SC71，SC111，SC112，SC141，SC143)。
图8为第三轮杂交Lhx4特异性引物PCR鉴定结果(L200bp Ladder，C-阴性对照，1-5依次为阳性克隆SC112，SC613，SC1111，SC1411，SC712)。
图9为第三轮杂交λgt11引物鉴定结果(L200bp Ladder，C-阴性对照，C+阳性对照，1-5依次为阳性克隆SC112，SC613，SC1111，SC1411，SC712)。
图10为阳性克隆插入片段的玻璃奶纯化(1-5依次为阳性克隆SC112，SC613，SC1111，SC1411，SC712)。
图11为LHX4基因全长cDNA序列图12为Promega柱纯化法回收纯化探针(L200bp Ladder，A纯化的LHX4探针)。
图13为MTE Array膜与人LHX4 cDNA探针杂交结果。
图14为LHX4基因所含6个外显子序列实施例1.人同源盒基因LHX4全长cDNA序列的筛选和克隆一.材料主要化学试剂IPTG、X-gal(Promega公司)，DEPC、明胶、溴化乙锭(Sigma公司)，Tris碱、Agar、Agarose(GIBCO-BRL公司)，SDS(Promega公司)、麦芽糖(Merck公司)，其它各种试剂均为进口或国产分析纯试剂。
主要仪器Mili-Q超纯水系统(Milipore公司)，紫外分光光度计(Beckman)，紫外交联仪(Bio-Rad GS Gene LinkerTM)，PCR仪(PE公司480型)，数码相机和扫描仪(Kodak公司)，冷冻高速离心机、冷冻台式离心机、台式离心机、温箱、电泳仪、紫外检测仪(均为国产)。
质粒LHX4-pBluescript质粒(美国NIH Hui Z和Heiner Westphal实验室馈赠)cDNA文库人脊髓cDNA文库(Clontech公司)探针标记Ex Taq PCR系统(TaKaRa公司)，Primer-a-Gene labelingSystem(Promega公司)，玻璃奶DNA纯化回收试剂盒(北京原平公司)，杂交Hybond杂交膜(Amersham公司)，Express杂交液(Clontech公司)，杂交炉(Heraeus公司)，[α-32P]dCTP(北京亚辉公司)，X光片(Fuji公司)克隆菌种E.Coil.DH5α，Y1090(本室存货，可从一般商业专业公司购买)；载体T-EASY Vector(Promega公司)；引物λgt11的上下游引物(Sangon公司)；PCREX Taq PCR体系和Pyrobest Taq PCR体系(TaKaRa公司)。
序列分析测序仪PE公司377型测序仪(大连TaKaRa公司)；序列分析美国国家生物技术信息中心(NCBI)网站BLAST程序DNASIS 4.0软件(Hitachi软件公司)。
二.方法1.小鼠LHX4-pBluescript质粒的获得和测序由于我们得到了国外实验室馈赠的插入小鼠LHX4部分cDNA片段的LHX4-pBluescript质粒，为了保证插入序列的准确，我们对其进行了扩增和测序。
1.1.小鼠LHX4-pBluescript质粒的扩增和纯化(1).以2μl连接产物转化200μl E.coli DH5α感受态细菌。转化后的DH5-α10μl涂布于LB/Agar/Amp+/IPTG+/X-Gal+的平板上37℃培养18～20小时。
(2).重组克隆的筛选和鉴定。挑选白色透明菌落，接种到50ml LB/Amp+(100μg Amp/ml LB)，220rpm，37℃摇菌12小时。以碱裂解法小提质粒。质粒溶于20μl。以Hind III、BamH I双酶切鉴定重组质粒。2.0μl 10x MultBuffer、1.0μl Hind III(20U/μl)、1.0μl BamH I(10U/μl)、0.8μl RNase A(10mg/ml，Promega)、0.2μl BSA、10μl Plasmid preparation、共20μl混匀，37℃保温2小时，以1.5％琼脂糖凝胶电泳鉴定酶切产物。用200bp PCRLadder(华美公司)作DNA大小的参照物。
(3).质粒测序模板的提取a.挑取阳性克隆接菌到6ml LB/Amp+液体培养基中，37℃、220rpm摇菌12～16小时。
b.室温离心收集细菌，以200μl GTE(50mM glucose，25mM Tris.HClpH8.0，10mMEDTA)悬浮细菌。
c.加300μl新鲜配置的裂解液(0.2M NaOH，1％SDS)，温和颠倒离心管10次以混匀内容物，置冰上5分钟。
d.加300μl中和液(3M KAC，5M HAC，pH4.8)，温和颠倒离心管12～14次以混匀内容物。置冰上5分钟。
e.室温12,000rpm离心10分钟。
f.转移上清至新离心管，加4μl RNase A(10mg/ml)，37℃温育30分钟。
g.以500μl等体积氯仿酚抽提两次，再以500μl氯仿抽提一次，留取上清。
h.加等体积异丙醇，混匀，室温10,000rpm离心10分钟。
i.弃上清，以75％乙醇洗涤沉淀，吸尽残液。
j.以33.6μl ddH2O悬浮沉淀，加6.4μl 5M NaCl，40μl 13％PEG8000，混匀，冰浴20分钟。
k. 4℃ 12,000rpm离心12分钟，小心吸尽上清。
l.以10μlddH2O溶解质粒沉淀。以0.8％琼脂糖凝胶电泳鉴定质粒并测定质粒浓度。只有无RNA污染，且超螺旋成分含量大于90％的质粒才能用于测序。
1.2.测序将上述纯化后的质粒20μl送大连TaKaRa公司，使用377型测序仪(PE公司)测序。
2.小鼠LHX4 cDNA探针的制备2.1. PCR扩增特异的部分LHX4 cDNA片段(1).合成上下游引物引物浓度为100μmol上游引物(primer 1)5′gccatcgctggggccagttc3′下游引物(primer 2)5′ctaaaaaggaggatggtcc3′(2).PCR扩增PCR buffer 2μl、DNTP 2μl、primer 1 1μl、primer 2 1μl、Ex Taq 0.5μl、模板0.5μl和ddH2O 13μl，共20μl于94℃变性3-5分钟。94℃ 40秒，60℃ 1分钟，72℃ 1分钟，30个循环。72℃延伸10分钟。结束反应后1.5％Agarose凝胶电泳鉴定。
2.2. PCR扩增产物的纯化玻璃奶(Glass milk)法回收DNA片段DNA样品经1×TAE缓冲液配制的琼脂糖凝胶电泳，EB染色后，长波紫外灯下切下欲回收DNA片段，在Eppendorf管中捣碎，加入3倍体积的溶胶液，60℃水浴5分钟(其间轻摇Eppendorf管数次使胶完全溶化)，加入10μl玻璃奶，用加样器混匀，室温静置5分钟，离心8000rpm数秒，去上清，加125μl漂洗液，用加样器吸漂洗液将玻璃奶冲散均匀，8000rpm离心去上清(重复3次)，再加20μl TE或灭菌蒸馏水，混匀，60℃水浴5分钟，离心15000rpm数秒，回收上清备用。
2.3.小鼠LHX4 cDNA探针的同位素标记采用随机引物标记试剂盒标记(Prime-a-Gene Labeling System，Promega)，操作步骤同Promega公司操作手册。用于标记的DNA来源于PCR扩增的片段。(1).25ng的DNA，用水补足30μl，98℃变性4分钟，快速放到冰上。(2).依次向管中加入以下试剂成分 体积 终浓度5×标记缓冲液 10μldNTP混合物(无dCTP) 2μl 每种20μM10mg/ml BSA 2μl 400μg/ml(3).将1，2两管混匀，然后加入成分 体积 终浓度〔α-32P〕dCTP 5μl 50μ Ci，3,000/mmolKlenow酶(5U/μl)1μl 100U/ml室温标记1小时，取1μl按下述方法测定标记效率，剩余的探针98℃变性5分钟后加入杂交液中。将1μl标记产物稀释500倍，取5μl按三氯乙酸沉淀法测定标记效率。探针的比活度一般约为1×108～1×109cpm/μg.。
3.人脊髓cDNA文库的筛选3.1.cDNA文库滴度的测定(1).宿主菌Y1090的活化从琼脂平板上挑取单克隆Y1090菌落于LB培养液中含10mM MgSO4，0.2％麦芽糖)，37℃摇过夜。离心后用10mM MgSO4再次悬浮，置于4℃。
(2).将原装的人脊髓cDNA文库分装后，进行如下稀释
5μl原液取5μl 取5μl 取5μl+→ +→ →+ +500μl SM 500μl SM500μl SM500μl SM1∶1021∶1041∶1051∶1061 234(3).将1，2，3，4号稀释液2μl，加入200μl活化好的Y1090宿主菌中，混匀后置于37℃水浴中吸附15-20分钟。
(4).化顶层胶(0.7％Agrose+LB+1.5％Agar+10mM MgSO4)，以3ml/管分装，置于50℃水浴中。
(5).将(3)中2，3，4号混合液加入(4)中分好的顶层胶中，迅速到入铺好底层的90mm平板中(LB+1.5％Agar+10mM MgSO4)，摇匀，吹干。倒置于37℃温箱中培养7-8小时，观察，记生长克隆数。
3.2.噬菌斑原位杂交筛选cDNA文库(1).准备30块130mm平板，铺底层胶(LB+1.5％Agar+10mM MgSO4)，风干30分钟后置37℃ 1小时。
(2).配顶层胶(0.7％Agrose+LB+1.5％Agar+10mM MgSO4)，按7ml/管分装，50℃保温。
(3).按1∶100稀释噬菌体液(5μl/500μl SM)，取稀释液3μl置于300μl Y1090菌中混匀后，37℃吸附20分钟。
(4).将(3)中每份混合物加入(2)的每一管中，并迅速铺顶层，吹干后倒置37℃培养7-8小时。
(5).待到嗜菌斑生长的透亮，均匀，直径接近1.5mm左右时停止培养，将平皿置4℃保存，以加固培养基硬度。这时每个平板上约有3万个克隆，总共铺100万个克隆。
(6).将NC膜(132mm，0.45μ)30张编号，平板依NC膜顺序编号。
(7).将NC膜置于平板顶层胶面上1-2分钟，转移噬菌体DNA至硝酸纤维素膜上，并对NC膜进行标记。
(8).将NC膜印迹面朝上置于3M滤纸上晾干。并依次通过变性液(0.5NNaOH，1.5M NaCl)5分钟×2次，中和液(0.5M Tris-HCl，pH7.4，1.5M NaCl)5分钟，漂洗液(2×SSC)短暂漂洗。晾干，置80℃烘烤2小时固定DNA。
(9).杂交液100ml(6×SSC，0.5％SDS，5×Denhardt)预热至68℃。
(10).鲑精DNA(10mg/ml)1ml，98℃变性5分钟，加入预热的杂交液中，与NC膜预杂交1-2小时。
(11).更换杂交液并加入变性探针，68℃杂交18小时。杂交期间保持均匀震荡和恒温。
(12).杂交后以I液(0.1％SDS+2×SSC)洗膜三次，15分钟/次。II液(0.1％SDS+1×SSC)洗膜两次，并监测信号强度。
(13).将洗好的膜置3M滤纸上晾干后压X光片，-70℃曝光24-72小时。
3.3.阳性克隆的鉴定和纯化(1).对照X光片，从培养皿上相应部位挑取阳性克隆噬菌斑，并将其悬浮于200μl SM(含20-30μl氯仿)溶液中，4℃过夜，使噬菌体从胶中释放出来。
(2).用PCR鉴定阳性噬菌斑，PCR条件同前。PCR重复一次，确保结果的准确性。
(3).根据第一次挑出的阳性噬斑含有10个单克隆噬斑估计。第二次铺板使每个平板的克隆数达到100-200个/板。
(4).再次进行噬菌斑原位杂交(方法同前)。使每板阳性克隆数达占克隆总数的60％。
(5).挑取单克隆阳性噬斑，PCR鉴定后，用λgt11载体引物扩增插入序列。
LHX4特异性引物PCR鉴定上游引物(primer 1)5′gccatcgctggggccagttc3′下游引物(primer 2)5′ctaaaaaggaggatggtcc3′λgt11载体引物
Forward Primer5′GGTGGCGACGACTCCTGGAGCCCG3′Reverse Primer5′TTGACACCAGACCAACTGGTAATG3′PCR反应体系EX PCR buffer 2μl、DNTP 2μl、Forward primer 0.4μl、Reverse primer 0.4μl、Ex Taq 0.2μl、模板1μl和ddH2O 14μl共20μl于94℃变性3-5分钟；94℃ 40秒，55℃ 1分钟，72℃ 1分钟，30个循环；72℃延伸10分钟；结束反应后1.5％Agarose凝胶电泳鉴定。
(6).对扩增到(大于1.2Kb)的阳性克隆准备进行克隆测序。
3.4.克隆和测序(1).对阳性克隆进行高保真PCR扩增使用TaKaRa公司Pyrobest Taq酶(ProofReading)系统Pyrobest buffer 5μl、dNTP 4μl、forward primer 1μl、reverse primer 1μl、Pyrobest Taq 0.5μl、模板2.5μl和ddH2O 36μl，共50μl于94℃变性3-5分钟；94℃ 40秒，55℃ 1分钟，72℃ 2分钟，30个循环；72℃延伸10分钟；结束反应后1.5％Agarose凝胶电泳鉴定。
(2).PCR产物的纯化玻璃奶纯化(方法同前)。
(3).回收片段与PGEM-T EASY载体的连接连接体系为2×Rapidligation buffer 5μl、PCR回收片段(30ng)3μl、PGEM-T EASY载体1μl、T4 DNA ligase(3 Weiss Unit/ul)1μl，共10μl于4℃连接12小时。
(4).重组子转化E.coil.DH5a菌株a.感受态的制备来自单菌落的DH5a经过夜活化后，1∶100接种于50mlLB培养基中，37℃振荡培养2-3小时至OD600＝0.4-0.6。冰浴10分钟，立即于4℃，4000rpm离心10分钟，弃上清，菌体重悬于10ml冰预冷的0.1mol/LCaCl2，冰浴20分钟后4℃4000rpm离心10分钟，收集菌体重悬于1-2ml预冷的0.1mol/L CaCl2中，放置4℃过夜备用。
b.转化取200μl感受态细胞于无菌离心管中，加入连接产物4-6μl并混匀，冰浴中放置30分钟，然后置42℃热休克90秒，迅速转入冰浴，2分钟后加800μl LB培养基，37℃缓慢振动培养1小时以恢复抗生素抗性。取100μl转化菌液涂布于琼脂平板(100μg/ml Amp+，X-gal+，IPTG+)，室温放置30分钟后37℃孵箱倒置培养12-16小时待克隆形成。
(5).蓝白斑筛选和质粒的小量提取用接种环挑取平板中白色单菌落，接种于3-5ml Amp+的LB液体培养基中，37℃恒温摇床中振荡过夜，使细菌生长至对数晚期，然后将菌液转入1.5mlEppendorf管，高速离心1分钟，去上清。向沉淀中加入100μl冰预冷的溶液I[50mmol/L葡萄糖、25mmol/L Tris-HCl(pH8.0)、10mmol/L EDTA(pH8.0)]悬浮细胞，置冰浴中，再加入200μl现配的溶液II(0.2mol/L NaOH、1％SDS)，上下颠倒Eppendorf管数次至液体变得清澈，加入150μl溶液III(5mol/L乙酸钾60ml、冰乙酸11.5ml、水28.5ml)，倒置Eppendorf管振荡，使溶液充分混匀后，将Eppendorf管置冰浴中3-5分钟，4℃ 12000rpm离心5分钟，收集上清，加等体积平衡酚振荡混合，12000rpm离心3分钟，收集上层水相，再用酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)抽提，加两倍体积乙醇，混匀后室温下放置15分钟，4℃ 12000rpm离心5分钟，去上清，用1ml 70％乙醇洗涤沉淀，去上清，空气中干燥，然后将沉淀溶于20μl含RNA酶(20μg/ml)的水中，37℃保温1小时，-20℃冻存待用。
(6).酶切鉴定根据不同限制性内切酶的具体要求进行。
以ApaI、PstI双酶切鉴定重组质粒。2.0μl 10x Multbuffer，1.0μlApaI(10U/μl)，1.0μl PstI(10U/μl)，0.8μl RNase A(10mg/ml，Promega)，0.2μl BSA，10μl Plasmid preparation共20μl混匀，37℃保温2小时，以1.5％Agrose凝胶电泳鉴定酶切产物。用200bp PCR Ladder(华美公司)作DNA大小的参照物。
(7).PEG法纯化质粒溶解在30μl中的质粒(5-8μg)，加10μl(30％PEG8000、1.5mol/LNaCl)，冰上放置60分钟。4℃ 12000rpm离心10分钟，去上清，70％乙醇、100％乙醇各洗涤一次，空气中干燥，再溶于20μl H2O中，作为测序反应模板。
(8).测序将(7).中纯化好的测序反应模板20μl送大连TaKaRa公司测序。
3.5阳性克隆的序列分析cDNA序列的翻译使用的是DNASIS 4.0版本(Hitachi软件公司)。DNA及蛋白质的同源性比较用BLAST软件[20]与NCBI GenBank数据库进行比较。
三、结果1.小鼠LHX4-pBluescript II SK(+/-)质粒的插入序列和探针制备1.1.探针序列的选择根据对小鼠LHX4-pBluescript II SK(+/-)质粒(见图1)的插入片段的测序结果，选择小鼠LHX4 3′端特异的cDNA序列为探针不包含LIM结构域和homeobox结构域(序列见图2)。
1.2.探针的纯化用PCR的方法，以质粒为模板，扩增所需的cDNA片段，并用玻璃奶纯化(结果见图3)。
2.放射性原位杂交法筛选人脊髓cDNA文库2.1.放射性原位杂交在第一轮杂交中，人脊髓cDNA文库共铺100万个克隆，杂交后挑选25个克隆，经PCR鉴定7个阳性克隆为SC1，SC4，SC6，SC7，SC8，SC11，SC14。将第一轮杂交阳性克隆再次铺板，第二轮杂交后共挑选21个克隆经LHX4特异性引物和λgt11载体特异性引物PCR鉴定后，去除插入片段＜1.2Kb的克隆，得到13个阳性克隆，分别为SC11，SC12，SC13，SC14，SC61，SC62，SC63，SC64，SC71，SC111，SC112，SC141，SC143。第三轮杂交后共挑选70个单克隆，经LHX4特异性引物和λgt11载体特异性引物PCR鉴定后，挑选5个阳性克隆为SC112，SC613，SC1111，SC1411，SC712.(结果见图4～图9)。
3.阳性克隆的鉴定及序列分析3.1.将阳性克隆的插入片段克隆入T-Easy载体并进行序列分析将λgt11引物扩增的PCR产物玻璃奶纯化后与T-Easy载体相连，酶切鉴定阳性克隆并进行测序(结果见图10)。
3.2.SC712序列分析我们将6个样品的质粒纯化后送大连TaKaRa公司测序，测序由PE公司的377型测序仪进行。序列回报后我们应用NCBIBlast2.0程序和ORF Finder程序，我们发现SC712克隆的序列有完整的ORF(opening reading frame，开放性阅读框架)，3′端有明显的Poly A结构。其核酸序列与小鼠LHX4(AF135415)cDNA序列有92％的相似性。编码一个含399个氨基酸的蛋白质，与已知小鼠LHX4蛋白质仅有3个不同的氨基酸。因此，我们可以确认克隆到了一个人的LHX4基因全长cDNA序列(序列见图3)。
实施例2.人同源盒基因LHX4在成人不同组织中的表达一.材料主要仪器HEAR hybrid杂交炉(Heraeus公司)，扫描仪(Kodak公司)。
主要试剂Huamn Ubiquitin Control cDNA Probes(Clontech公司，5ng/μl)，ExpressHyb杂交液(Clontech公司)，鲑精DNA(10mg/ml，ssDNA，GIBCO-BRL公司)，C0t-1 DNA(1mg/ml，Gibrco公司)，20×SSC(pH7.0)，20％SDS(Sigma公司)，洗膜液12×SSC，1％SDS，洗膜液20.1×SSC，0.5％SDS，玻璃奶纯化试剂盒(原平公司)，PCR产物纯化试剂盒(Promega公司)，EX Taq PCR系统(TaKaRa公司)。
杂交膜MTE Arrary膜(Multiple Tissue Expression Arrary，Clontech公司)放射自显影α-32P dCTP(北京亚辉公司)，X光片(Kodak公司)，X光片压片盒(汕头医学实验仪器厂)，D-72显影液，定影液(浙江嘉兴市南湖摄影仪器厂)。
二.方法1.探针的制备和纯化1.1.PCR法扩增探针(1).设计引物Forward Primer5′atgatgcagagtgcgactgtc 3′Reverse Primer5′gtttaaaaaggaggatgatc 3′(2).PCR扩增体系为TaKaRa公司Ex Taq PCR系统PCR buffer 2μl，DNTP 2μl，primer 1 1μl，primer 2 1μl，Ex Taq 0.5μl，模板0.5μl，ddH2O13μl，共20μl。扩增条件
温度 时间(分钟)94℃ 30094℃ 03060℃ 03030个循环72℃ 03072℃ 10.004℃保存1.2.探针的纯化对PCR扩增后的产物用Promega柱纯化的方法进行纯化(1).50μl PCR扩增产物中加入100μl纯化缓冲液(direct purificationbuffer)，充分混匀。
(2).再加入1ml PCR纯化树脂(wizard PCR preps DNA purificationresin)，混匀。
(3).将上述液体全部加入5ml注射器中，并装好小柱子(Wizard PCRpurification Spin Column)。将注射器缓慢推下使所有液体通过小柱子。
(4).卸下注射器，加入2ml 80％的异丙醇，装好小柱子并将注射器缓慢推下使所有液体通过小柱子。
(5).将小柱子装入1.5ml Eppendorf管中，8000rpm离心1分钟，使异丙醇彻底从小柱子上去除。
(6).将小柱子换入到干净的Eppendorf管中，并从顶部加入30μl的dd H2O，静置1分钟，然后12000rpm离心20秒，回收液体。
(7).将所回收的液体取2μl进行琼脂糖电泳，以检测回收的效果。
1.3.探针的标记采用随机引物标记试剂盒标记(Prime-a-Gene Labeling System，Promega)，操作步骤同Promega公司操作手册。用于标记的DNA来源于PCR扩增的片段。
(1).25ng的DNA，用水补足30μl，98℃变性4分钟，快速放到冰上。
(2).依次向管中加入以下试剂成分 体积终浓度5×标记缓冲液 10μldNTP混合物(无dCTP) 2μl每种20μM10mg/ml BSA2μl400μg/ml(3).将1，2两管混匀，然后加入成分 体积终浓度〔α-32P〕dCTP5μl50μ Ci，3,000/mmolKlenow酶(5U/μl) 1μl100U/ml室温标记1小时，取1μl按下述方法测定标记效率，剩余的探针98℃变性5分钟后加入杂交液中。将1μl标记产物稀释500倍，取5μl按三氯乙酸沉淀法测定标记效率。探针的比活度一般约为1×108～1×109cpm/μg.。
1.4. MTE Array膜与特异性探针的杂交(1).准备ExpressHyb杂交液和鲑精DNA50-60℃预热15ml ExpressHyb杂交液；98℃变性1.5mg鲑精DNA 5分钟，并迅速置于冰浴中；将上述预热好的ExpressHyb杂交液与变性后的鲑精DNA混匀。
(2).将MTE Array膜放入杂交管中并加入10ml步骤(1)中准备好的杂交液。
(3).保持65℃，连续震荡中持续预杂60分钟。
(4).将标记好的探针中加入30μg C0t-1 DNA，150μg鲑精DNA和50μl20×SSC，使总体积达到200μl。
(5).将上述步骤(4)中准备好的探针98℃变性5分钟，然后68℃ 30分钟(6).将步骤(5)中准备好的探针混合液加入剩下的5ml杂交液中，并确保两种溶液能够充分混合。
(7).从进行MTE Array预杂的杂交管中弃去预杂液，加入步骤(6)中准备好的杂交液，并尽量去除气泡并使杂交液全面覆盖膜。
(8).65℃持续震荡杂交过夜(6-12小时)。
(9).杂交完毕后，到掉杂交液。
(10).加入200ml洗膜液1，65℃持续震荡洗膜20分钟。重复这一过程4次。
(11).然后加入200ml 55℃预热的洗膜液2，55℃持续震荡洗膜20分钟。重复这一过程2-3次，洗膜的程度可用mintor来检测。
(12).洗膜完毕后，将膜置于3M的滤纸上，去掉多余的水分，但不要使膜干。并将膜包入塑料薄膜中。
(13).将步骤1中处理好的膜与X光片一同置入压片盒中，-70℃压片7天。
(14).x光片显影，分析结果。
三、结果1.探针的制备和纯化以人LHX4基因的质粒为模板，经过PCR扩增和纯化后，得到人LHX4 cDNA表达序列全长，以其做为MTE Array膜杂交的探针(结果见图12)。
2.杂交及结果分析经过多次反复杂交后，我们得到较为稳定的杂交结果，并将杂交信号的位置与MTE Array膜上不同组织RNA的位置相比较，发现有杂交信号出现的位置依次是全脑，大脑皮层，脊髓，胎脑。其中尤以胎脑信号最强，其次信号由强到弱依次为脊髓，全脑，大脑皮层(结果见图13)。
上述结果表明，我们所克隆到的人LHX4 cDNA全长序列在神经组织具有特异性表达，而且这种表达主要局限在成人的神经系统，但在成人神经系统各组织的表达程度均明显低于胎脑中的表达。由此我们可以推测人LHX4基因的表达并不止局限在胚胎组织中，在成人的神经组织中也有特异性的表达。
权利要求
1.人同源盒基因LHX4全长cDNA序列，包含如下序列的6个外显子，AGCGAGAGATCTCCGTAGACTGCGACTCGCTGGCTTTCGCTCCGAGATGATGCAGAGTGCGACTGTCCCCGCGGAAGGGGCTGTCAAGGGGCTCCCGGAGATGCTAGGTGTGCCGATGCAACAGATTCCCCAGTGCGCTGGCTGCAACCAGCACATCCTGGACAAGTTCATCCTGAAGGTCCTGGACAGACACTGGCACAGCTCCTGCCTCAAGTGTGCAGACTGCCAGATGCAGCTGGCGGACAGGTGCTTCTCCAGGGCTGGGAGCGTCTACTGCAAGGAGGACTTCTTCAAGCGCTTCGGCACAAAATGCACGGCCTGCCAGCAGGGTATCCCCCCAACCCAGGTGGTCCGCAAGGCCCAGGACTTTGTCTACCACCTGCACTGCTTTGCTTGCATCATCTGCAACCGGAGCTGGCCACGGGGGACGAATTCTACCTCATGGAGGACGGGCGGCTGGTGTGCAAGGAAGACTACGAGACAGCCAAGCAGAACGATGACTCAGAGGCTGGAGCTAAGCGGCCCCGGACCACCATCACAGCCAAGCAGCTGGAGACATTAAAGAATGCATACAAGAACTCCCCCAAGCCTGCCGGCACGTGAGGGAGCAGCTGTCCTCAGAGACAGGCCTGGACATGAGGGTCGTACAGGTTTGGTTTCAGAACAGAAGGGCCAAAGAGAAACGCCTGAAGAAGGATGCAGGGCGGCACCGCTGGGGGCAGTTCTATAAGAGCGTCAAGAGGAGCCGGGGCAGCAGCAAGCAGGAGAAGGAGAGCTCTGCAGAGGACTGTGGGGTTAGTGACAGTGAGCTGAGCTTCCGAGAGGATCAAATTCTCTCAGAACTTGGCCACACCAATAGGATTTATGGCAACGTGGGGGACGTTACAGGCGGACAGTTAATGAATGGGAGCTTCTCCATGGACGGGACAGGACAATCCTATCAGGACTTGAGGGATGGGAGCCCCTATGGAATCCCCCAGTCTCCATCCTCCATATCGTCCCTGCATCCCACGCTCCTTTGCTCAATGGGCTGGATTACACGGTGGACAGTAATTTGGGCATCATTGCGCATGCAGGGCAGGGAGTAAGCCAGACGCTGAGAGCCATGGCTGGGGGACCCACCTCTGACATCTCCACAGGAAGCAGTGTAGGCTATCCCGACTTTCCAACTAGCCCAGGCTCTTGGCTCGATGAAATGGATCATCCTCCTTTT
2.按照权利要求1的人同源盒基因LHX4全长cDNA，其特征在于其序列为GACGTCGCATGCTCCCGGCCGCCATGGCGGCCGCGGGAATTCGATTGGTGGCGACGACTCCTGGAGCCCGTCAGTATCGGCGGAATTCGCGGCCGCGTCGACCGGAGAGCGAGATCAAAGGGATTGGAAACAGACTGGGGACTGGCGGGGGGAGGGGGCCGGCCAGCCTGTGGAGTCCTCCCTGAGAAGCGGAGGGCCCGGCTTCCACCGTGACTCCAGCGGCCTGCTTGGGGTTTTAATTATTATTTTGAAATTTCTGAATCGAGCTAGAGCGAGAGAGCGAGAGATCTCCGTAGACTGCGACTCGCTGGCTTTCGCTCCGAGATGATGCAGAGTGCGACTGTCCCCGCGGAAGGGGCTGTCAAGGGGCTCCCGGAGATGCTAGGTGTGCCGATGCAACAGATTCCCCAGTGCGCTGGCTGCAACCAGCACATCCTGGACAAGTTCATCCTGAAGGTCCTGGACAGACACTGGCACAGCTCCTGCCTCAAGTGTGCAGACTGCCAGATGCAGCTGGCGGACAGGTGCTTCTCCAGGGCTGGGAGCGTCTACTGCAAGGAGGACTTCTTCAAGCGCTTCGGCACAAAATGCACGGCTGCCAGCAGGGTATCCCCCCAACCCAGGTGGTCCGCAAGGCCCAGGACTTTGTCTACCACCTGCACTGCTTTGCTTGCATCATCTGCAACCGGCAGCTGGCCACGGGGGACGAATTCTACCTCATGGAGGACGGGCGGCTGGTGTGCAAGGAAGACTACGAGACAGCCAAGCAGAACGATGACTCAGAGGCTGGAGCTAAGCGGCCCCGGACCACCATCACAGCCAAGCAGCTGGAGACATTAAAGAATGCATACAAGAACTCCCCCAAGCCTGCCCGGCACGTGAGGGAGCAGCTGTCCTCAGAGACAGGCCTGGACATGAGGGTCGTACAGGTTTGGTTTCAGAACAGAAGGGCCAAAGAGAAACGCCTGAAGAAGGATGCAGGGCGGCACCGCTGGGGGCAGTTCTATAAGAGCGTCAAGAGGAGCCGGGGCAGCAGCAAGCAGGAGAAGGAGAGCTCTGCAGAGGACTGTGGGGTTAGTGACAGTGAGCTGAGCTTCCGAGAGGATCAAATTCTCTCAGAACTTGGCCACACCAATAGGATTTATGGCAACGTGGGGGACGTTACAGGCGGACAGTTAATGAATGGGAGCTTCTCCATGGACGGGACAGGACAATCCTATCAGGACTTGAGGGATGGGAGCCCCTATGGAATCCCCCAGTCTCCATCCTCCATATCGTCCCTGCCATCCCACGCTCCTTTGCTCAATGGGCTGGATTACACGGTGGACAGTAATTTGGGCATCATTGCGCATGCAGGGCAGGGAGTAAGCCAGACGCTGAGAGCCATGGCTGGGGGACCCACCTCTGACATCTCCACAGGAAGCAGTGTAGGCTATCCCGACTTTCCAACTAGCCCAGGCTCTTGGCTCGATGAAATGGATCATCCTCCTTTTTAAACTTCTCTCCTCCCCACCCTACCTGCCCCCCTGGCTTGAGAGAATATCTTCAAGGATCAAAAGAGACTTGCCTTTTAAGGATCGAAAGTACGCCAATGTGAATTTCCATTATTTTCAATGGAAGTCCTCCGCTGATTCCTAGAAGGCTGTGAGACCACACTAGGGCATTGTTTCCCTGGGGAAGCAGTGGGAGAGCAGACTCATCTCAGAACACAGCACAGGGGGTAATGGCCTAGAGCTCTAGGGACACTGGCTTGTTGGGTCTCTCCCCTGCTGTTCTGCTTAGGGGCTTGGCTGCTCAGTGCTTTGGTAGCACAAGGTGACTGTGATAGGCCCCCTTGGCCTTTGGGAACTTTGCTCCAACTGGTGTGTCTCACACAATGCCTCGTCGACGCGGCCGCGAATTCCAGCTGAGCGCCGGTCGCTACCATTACCAGTTGGTCTGGTGTCAAAATCACTAGTGAATTCGCGGCCGCCTGCAGGTCGACCATATGGGAGAGCTCCCAACGCGTTGGATGCATAGC
全文摘要
本发明涉及人同源盒基因LHX4的全长cDNA序列。该序列包含6个外显子。其表达产物在躯体运动神经元发育和分化过程中发挥重要作用,是调节运动神经元发育分化和轴突投射模式形成的一类重要转录因子。
文档编号C07H21/00GK1353186SQ00133460
公开日2002年6月12日 申请日期2000年11月7日 优先权日2000年11月7日
发明者刘耀波, 范明, 于顺, 周严, 袁建刚, 强伯勤 申请人:中国人民解放军军事医学科学院基础医学研究所