检测鸡新城疫病毒和鸡传染性支气管炎病毒的基因芯片以及试剂盒的利记博彩app
【专利摘要】本发明公开了一种检测鸡新城疫病毒和/或鸡传染性支气管炎病毒的基因芯片和试剂盒。本发明基因芯片包括固相载体以及固定在固相载体上的探针；所述探针包括SEQ ID NO：1～2所示任意一个或者两个基因片段，和/或SEQ ID NO：3～4所示任意一个或者两个基因片段。本发明试剂盒包括前述基因芯片与鸡新城疫病毒和鸡传染性支气管炎病毒基因的试剂。本发明基因芯片和检测试剂盒可以准确、有效的检测鸡新城疫病毒和鸡传染性支气管炎病毒，且特异性强、灵敏度高、耗时短，检测快速，应用前景良好。
【专利说明】检测鸡新城疫病毒和鸡传染性支气管炎病毒的基因芯片以 及试剂盒
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种检测鸡新城疫病毒、鸡传染性支气管炎病毒的基因芯片以及试剂 盒。
【背景技术】
[0002] 随着我国养禽业集约化程度的不断提高，各类疾病的发生也呈逐年上升的趋势。 我国禽病防治的总体水平不高，禽病的发生和危害仍然十分严重，据不完全统计，目前危害 我国养禽业生产的疾病达80余种，其中传染病约占禽病总数的75%，危害严重。同时禽病 的发生也出现新的特点，如新的传染病不断出现；新发生禽病的种类增多；传染病发病的 非典型化和病原出现新的变化；混合感染和复合症使疾病更为复杂等。
[0003] 鸡新城疫、鸡传染性支气管炎这2种病在我国和许多国家地区广泛流行，受病毒 侵袭的鸡群会引起大批死亡，耐过的生长发育缓慢，淘汰率增高，并干扰其它疫苗的免疫 力，使鸡易继发感染其它疾病，而造成严重的经济损失。这3种病的共同特征都能引起呼 吸道症状，而且症状十分相似，在临床诊断中很难准确判断，也极易与其它呼吸道病如禽流 感、慢性呼吸道病等相混淆。现有的禽病检测或监测技术均存在不可克服的局限，如对疫病 的混合感染、隐性感染及疫苗毒和野毒的区分等，在检测时均存在一定的困难。同时对于多 种疫病的混合感染需要同一种方法或不同方法多次进行检测，因此有必要加强对动物疫病 检测或监测新型技术的研究。
[0004] 目前，对这2种病的诊断一般采用病原分离鉴定和常规的血清学方法，但这些方 法存在操作繁杂、费时费力、敏感性较差等不足。特别是当鸡群存在鸡新城疫、鸡传染性支 气管炎等多种病毒感染时，难以应用这些传统方法进行快速检测和鉴别诊断，在一定程度 上影响了对这些疫病的有效防制。最近国内外均建立了 PCR/RT-PCR检测方法，以及多重 PCR检测方法，但是还不能满足更加快速、准确的检测多种病原混合感染的要求。
[0005] 分子生物学理论和技术的发展，特别是基因芯片有高通量、多样性、微型化和自动 化的特点，这些特性使它上面的信息能快速准确地被读出，对样品的量要求很少，节约试剂 和成本，处理速度大大加快，在对各种病原体的检测中，病原体基因的检测和分析是最可信 的，而基因芯片技术能对各种病原体的RNA进行定性和定量的分析，从而帮助临床医生对 感染的种类和感染的程度进行分析。
[0006] 曹三杰，"鸡新城疫、鸡传染性支气管炎基因芯片的构建及其检测技术研究"，四川 农业大学2004年博士论文公开了一种同时检测鸡新城疫病毒、鸡传染性支气管炎病毒的 基因芯片，其对鸡新城疫病毒、鸡传染性支气管炎病毒的最低检测浓度分别为0. 44ng/μ L 和0.87ι^/μ?，灵敏度低。
【发明内容】
[0007] 为了解决上述问题，本发明提供了一种特异强、灵敏度高可检测检测鸡新城疫病 毒和/或鸡传染性支气管炎病毒的新的基因芯片和试剂盒。
[0008] 本发明检测鸡新城疫病毒和/或鸡传染性支气管炎病毒的基因芯片，它包括固相 载体以及固定在固相载体上的探针；所述探针包括SEQ ID NO :1?2所示任意一个或者两 个基因片段，和/或SEQ ID NO :3?4所示任意一个或者两个基因片段。
[0009] 基因芯片，又叫DNA微阵列，是指指通过不同方法将生物分子（寡核苷酸、cDNA、 genomic DNA、多肽、抗体、抗原等）固着于娃片、玻璃片（珠）、塑料片（珠）、凝胶、尼龙膜 等固相递质上形成的生物分子点阵，其突出的特点是微型化、集成化、平行化和高通量。
[0010] 优选地，它还包括定位探针，定位探针是SEQ ID NO: 13所示的基因片段。
[0011] 本发明检测鸡新城疫病毒和/或鸡传染性支气管炎病毒的试剂盒，它包括前述的 基因芯片与扩增鸡新城疫病毒和/或鸡传染性支气管炎病毒基因的试剂，其中，扩增鸡新 城疫病毒基因的试剂包括SEQ ID NO :5?6和/或SEQ ID NO :7?8所示引物对；扩增鸡 传染性支气管炎病毒基因的试剂包括SEQ ID NO :9?10和/或SEQ ID NO : 11?12所示 引物对。
[0012] 所述试剂盒还包括SEQ ID NO : 14?15所示引物对。
[0013] 所述引物对中，SEQ ID NO :5所示上游引物与SEQ ID NO :6所示下游引物的摩尔 比为1:10;SEQ ID N0:7、9、ll所示上游引物与SEQ ID N0:8、10、12所示下游引物的摩尔 比为1 :20。
[0014] 所述上游引物标记有荧光染料。
[0015] 所述试剂盒还包含有胶体金。
[0016] 胶体金是由氯金酸（HAuC14)在还原剂如白磷、抗坏血酸、枸橼酸钠、鞣酸等作用 下，可聚合成一定大小的金颗粒，并由于静电作用成为一种稳定的胶体状态，形成带负电的 疏水胶溶液，由于静电作用而成为稳定的胶体状态，故称胶体金。
[0017] 本发明胶体金按照下述方法制备：取200mL灭菌超纯水和2mLl % HAuC14混于 500ml大烧杯中，而后量取20mL分装于编号1-10的10个50mL小烧杯中，使用加热磁力 搅拌器将分装的胶体金溶液依次加热5min，快速加入1 %柠檬酸三钠溶液，加入量分别为 0. ImT,, 0. 2mL, 0. 24mL, 0. 28mL, 0. 32mL, 0. 36mL, 0. 4mL, 0. 6mL, I. OmT,, I. 2mL。颜色由浅黄迅 速变为黑色再变为红色时，再持续搅拌IOmin停止，等溶液冷却至室温，用硝酸纤维薄膜过 滤，即可得到所需胶体金。
[0018] 本发明还提供SEQ ID NO :1或2所示任意一个或者两个基因片段，和/或SEQ ID NO :3或4所示任意一个或者两个基因片段在制备检测鸡新城疫病毒和/或鸡传染性支气 管炎病毒的基因芯片中的用途。
[0019] 优选地，所述基因芯片还包括定位探针，定位探针是SEQ ID NO: 13所示的基因片 段。
[0020] 本发明还提供了 SEQ ID NO :5?6和/或SEQ ID NO :7?8所示引物对，与SEQ ID NO :9?10和/或SEQ ID NO :11?12所示引物对在制备同时扩增鸡传染性支气管炎 病毒和鸡新城疫病毒的试剂中的用途。
[0021] 本发明还提供了 SEQ ID NO :1?2所示任意一个或者两个基因片段以及SEQ ID NO :5?6和/或SEQ ID NO :7?8所示引物对，和/或SEQ ID NO :3?4所示任意一个或 者两个基因片段以及SEQ ID NO :9?10和/或SEQ ID NO :11?12所示引物对在制备检 测鸡新城疫病毒和/或鸡传染性支气管炎病毒的试剂盒中的用途；其中，引物对为扩增试 齐[J ;SEQ ID NO :1?4为检测探针。
[0022] 所述引物对中，SEQ ID NO :5所示上游引物与SEQ ID NO :6所示下游引物的摩尔 比为1:10;SEQ ID N0:7、9、ll所示上游引物与SEQ ID N0:8、10、12所示下游引物的摩尔 比为1 :20。
[0023] 本发明基因芯片可以有效检测鸡新城疫病毒和鸡传染性支气管炎病毒，特异性 强，灵敏度高，两种病毒样品的最低检测浓度为I. 8X IO4拷贝/ μ L(0. 2pg/μ L)，耗时短，检 测快速，具有良好的应用前景。
[0024] 以下通过实施例形式的【具体实施方式】，对本发明的上述内容作进一步的详细说 明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例。凡基于本发明权利要 求书记载的内容所实现的技术均属于本发明的范围。
【专利附图】
【附图说明】
[0025] 图1基因芯片的矩阵排列情况；
[0026] 图2胶体金的影响结果；
[0027] 图3特异性实验结果；
[0028] 图4灵敏度实验结果；
[0029] 图5稳定性实验结果。
【具体实施方式】
[0030] 一、实验材料和仪器
[0031] 菌株：NDV LaSota株、IBV Η120株均购自中国兽药监察所，由本实验室保存。
[0032] 主要试剂与培养基：〇mega质粒提取试剂盒，购于Omega生物技术公司；2XTaq PCR Master Mix、反转录试剂盒、总RNA提取试剂盒、天根DNA提取试剂盒和IOObp DNA Ladder ;Amp :取IgAmp溶解于IOmL灭菌超纯水中浓度为lOOmg/mL ;液体LB培养基：胰 蛋白胨2. 0g，氯化钠2. 0g，酵母浸出物l.Og，完全溶于180. OmL超纯水后，用NaOH调节 pH = 7. 2,定容到 200mL，高压灭菌 30min，冷至 55°C 左右，IOOmLLB 加 IOOul 的 Amp，4°C 保存；固体LB培养基：向IOOmL的LB加 I. 5g的琼脂粉，高压灭菌后冷至55°C左右，加入 IOOuL 的 lOOmg/mL Amp，倒入平板中，4°C保存备用；50 XTAE :0. 5mol/L EDTA50. OmL，冰醋 酸28. 55mL，Tris 121. 0g，用氢氧化钠调节pH = 8. 0,定容到500mL。氨基基片：Biiicvu氨 基载玻片，点样缓冲液：Baio?点样缓冲液，均购自上海百傲生物工程有限公司。Cy3-dCTP 购于美国Amersham公司；IOOXDenhardt :牛血清白蛋白0. 2g，聚乙烯峨咯烧酮0. 2g，聚鹿 糖0. 2g，加到CldH2O IOmL中完全溶解；20 XSSC :柠檬酸钠8. 82g，氯化钠17. 53g，超纯水 80.011^，恥0!1调？!1 = 7.0，定容到100.011^，41：保存；洗液1:2\550/0.1%505，洗液2 : 0· 2X SSC/0. 1 % SDS，洗液 3 :0· 16X SSC/0. 1 % SDS，洗液 4 :ddH20
[0033] 主要仪器设备：超净工作台，SW-CJ-2FD，苏州安泰空气技术有限公司；电子天平， Sartorius BP 310S;恒温摇床，Thermo Forma，美国产；梯度 PCR 仪，PX2，Thermo hybaid， 美国产；超纯水仪，Milli Qplus，法国产；电泳仪，POWER Pac300，Bi〇-RAD，意大利产；凝胶 电泳成像系统，Bio-RAD，意大利产；高速冷冻离心机3K18型，Sigma，德国产；核酸蛋白检测 仪，SmartSpaee TM 3010, Bio-RAD，意大利产；分子杂交仪，Thermo hybaid，美国产；晶芯? SmartArrayer 16基因芯片点样仪，Capitalbio Corporation,北京博奥生物公司；真空抽 干机，SinBo,香港产；基因芯片杂交盒，北京博奥生物公司；晶芯? LuxScan IOK基因芯片 扫描仪，Capitalbio Corporation,北京博奥生物公司。
[0034] 实施例1本发明基因芯片的制备
[0035] 1、菌株
[0036] NDV LaSota 株、IBV Hl20 株。
[0037] 2、实验方法
[0038] 2. IPCR引物、检测探针的制备
[0039] (1)设计病原特异性探针：通过对GenBnak中收录的鸡新城疫病毒、鸡传染性支气 管炎病毒的核酸序列的比对分析，选定保守区域序列：NDV-F/HN、IBV-IBM/IBN。针对保守序 列设计检测多对探针，从中挑选出特异性强的探针序列。
[0040] (2)设计探针序列的特异性引物：针对上述保守探针序列，利用生物信息学软件 DNAman、Primer5. 0等设计特异性引物。特异性引物由上海生物工程公司合成。
[0041] (3)探针制备：用小量病毒/液体样品DNA/RNA抽提试剂盒提取鸡新城疫病毒、鸡 传染性支气管炎病毒，利用上述特异性引物对两种病原核酸进行PCR扩增，纯化浓度测定。
[0042] 反转录体系及条件（参照PrimeScript RT reagent Kit的方法）
[0043]
【权利要求】
1. 一种检测鸡新城疫病毒和/或鸡传染性支气管炎病毒的基因芯片，其特征在于：它 包括固相载体以及固定在固相载体上的探针；所述探针包括SEQ ID NO :1?2所示任意一 个或者两个基因片段，和/或SEQ ID NO :3?4所示任意一个或者两个基因片段。
2. 根据权利要求1所述的基因芯片，其特征在于：它还包括定位探针，定位探针是SEQ ID NO :13所示的基因片段。
3. -种检测鸡新城疫病毒和/或鸡传染性支气管炎病毒的试剂盒，其特征在于：它包 括权利要求1或2所述的基因芯片与鸡新城疫病毒和鸡传染性支气管炎病毒基因的试剂， 其中，扩增鸡新城疫病毒基因的试剂包括SEQ ID NO :5?6和/或SEQ ID NO :7?8所示 引物对；扩增鸡传染性支气管炎病毒基因的试剂包括SEQ ID NO :9?10和/或SEQ ID NO: 11?12所示引物对。
4. 根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于：它还包括SEQ ID NO : 14?15所示引 物对。
5. 根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于：它还包括胶体金。
6. 根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于：所述引物对中，SEQ ID NO :5所示上游 引物与SEQ ID NO :6所示下游引物的摩尔比为1 :10 ;SEQ ID NO :7、9、11所示上游引物与 SEQ ID NO :8、10、12所示下游引物的摩尔比为1 :20。 7. SEQ ID N0:1或2所示任意一个或者两个基因片段，和/或SEQ ID N0:3或4所示 任意一个或者两个基因片段在制备检测鸡新城疫病毒和/或鸡传染性支气管炎病毒的基 因芯片中的用途。
8. 根据权利要求7所述的用途，其特征在于：所述基因芯片还包括定位探针，定位探针 是SEQ ID N0:13所示的基因片段。 9. SEQ ID NO :5?6和/或SEQ ID NO :7?8所示引物对，与SEQ ID NO :9?10和/ 或SEQ ID NO :11?12所示引物对在制备同时扩增鸡新城疫病毒和鸡传染性支气管炎病毒 的试剂中的用途。 10. SEQ ID NO :1?2所示任意一个或者两个基因片段以及SEQ ID NO :5?6和/或 SEQ ID NO :7?8所示引物对，和/或SEQ ID NO :3?4所示任意一个或者两个基因片段以 及SEQ ID NO :9?10和/或SEQ ID NO : 11?12所示引物对在制备检测鸡新城疫病毒和 /或鸡传染性支气管炎病毒的试剂盒中的用途；其中，引物对为扩增试剂；SEQ ID NO :1?4 为检测探针。
【文档编号】C40B40/06GK104293982SQ201410515912
【公开日】2015年1月21日 申请日期:2014年9月29日 优先权日:2014年9月29日
【发明者】文心田, 曹三杰, 黄小波, 赵松, 文翼平, 伍锐, 邓静, 尹人杰, 张仙, 常晓霞 申请人:四川农业大学