专利名称：一种筛选酸性浸矿体系中新基因的宏基因组芯片及其筛选方法
技术领域：
本发明涉及从酸性浸矿微生物群落中快速筛选新颖基因的宏基因组芯片及筛选方法。
背景技术：
酸性浸矿体系中，浸矿微生物群落通过氧化分解矿物使金属离子进入溶液。了解浸矿微生物群落的代谢调控与浸出过程的关系，发掘关键代谢途径相关的新颖基因有助于提高微生物冶金的效率。利用传统方法研究微生物的代谢调控或者功能基因，必须先分离纯化微生物，然后通过形态观察或生理生化检测分析其代谢调控方式。新基因的研究，则要通过体外表达和酶学测定确定其功能特性。然而，极端酸性浸矿体系中的大部分微生物难以分离纯化培养，利用传统的方法难以开展代谢调控和基因功能的研究。
发明内容
本发明的目的在于通过构建酸性浸矿微生物群落宏基因组大片段文库，提供一种宏基因组基因芯片，以及利用该芯片快速筛选宏基因组文库中的新颖目标基因的方法，从而获得不能分离纯化培养的微生物的遗传基因信息，解决传统方法无法分析未分离纯化培养微生物遗传和代谢调控特性的难题。一种筛选酸性浸矿体系中新基因的宏基因组芯片，是由以下方式构建的:利用德兴酸性矿坑废水中微生物群落的总DNA构建大片段的宏基因组文库，以宏基因组文库中提取的7776个fosmid质粒为探针，将探针通过基因芯片点样仪打印在玻片表面，打印后的宏基因组芯片在室温下干燥过夜，最后使用紫外交联仪照射下进行交联即可。具体包括以下步骤:采用0.2 iim的尼龙膜过滤酸性浸矿体系中的酸性浸出液，得到生物质富集物，液氮研磨法提取微生物群落总DNA，然后利用200 ill的小枪头进行切割，将总DNA修剪成40-50Kb的随机的大片段；通过DNA的末端修饰使其末端成为两条链平齐的钝末端，利用DNA快速连接酶将DNA大片段与CopyControl pCClFOS Vector质粒(Epicentre)连接起来构建重组的fosmid质粒；然后将重组的fosmid质粒转化到EPI300_T1K Plating大肠杆菌感受态细胞(Epicentre);将转化后的大肠杆菌细胞液均匀地涂布在含有氯霉素的LB培养基上，过夜培养，挑取阳性克隆子构成含有7776个克隆子的宏基因组文库；每个克隆子中都含有一段40-50Kb的插入DNA片段，利用诱导剂诱导宏 基因组文库中的克隆子，使重组fosmid质粒在细胞中的拷贝数达到至少50个，然后提取宏基因组文库中每个克隆子的fosmid质粒，用紫外吸收法测定质粒的浓度，调节浓度为50ng/ u I储存；将10 ill的fosmid DNA与40%的二甲基亚砜按体积1:1的比例混合，用芯片点样仪，在相对湿度为50-55%的条件下将fosmid DNA样品打印在硅化玻片表面；样品点之间的距离为250 ym，打印好的芯片室温干燥过夜后紫外照射使核酸分子与玻片交联固定。将探针在芯片上排列成18行36列的亚矩阵，共排列26个亚矩阵，每个探针在芯片上有2个阵列重复。所述的酸性浸矿体系为江西德兴铜矿的酸性浸矿体系。利用上述的宏基因组芯片筛选浸矿体系微生物群落中的新基因的方法，包括以下步骤:PCR扩增待筛选目标基因并进行荧光标记:将经标记后的PCR产物与宏基因组芯片杂交，获取阳性杂交信号数据，通过PCR验证，然后通过测序对应宏基因组文库中的克隆子得到目标基因的完整序列信息。与传统方法相比，本发明芯片及方法能够快速的筛选目标基因，提高了基因文库的利用效率，避免了重复建库筛选文库利用率低的弊端。同时，这种方法不要求微生物必须是纯培养物，所以可以有效地筛选到未分离纯化微生物的新颖基因。
图1为16sRNA基因宏基因组杂交结果；图2为宏基因组芯片质粒浓度与信号关系；图3为SAOR基因PCR扩增电泳图；图4为SAOR不同基因型在群落中所占比例；图5为SAOR基因宏 基因组芯片扫描图；图6为德兴铜矿浸矿水中的细菌微生物SAOR基因的系统发育树。
具体实施例方式以下结合实施例旨在进一步说明本发明，而非限制本发明。实施例1宏基因组文库的制备尼龙膜(0.2 Pm)过滤江西德兴铜矿酸性浸矿体系中的酸性浸出液，得到生物质富集物，液氮研磨法提取微生物群落总DNA，然后利用200 u I的小枪头进行切割，将总DNA修剪成40-50Kb的随机的大片段。通过DNA的末端修饰使其末端成为两条链平齐的钝末端，利用DNA连接酶将DNA大片段与CopyControl pCClFOS Vector质粒连接起来。然后将重组的fosmid质粒转化到EPI300-T1k Plating大肠杆菌感受态细胞。将转化后的大肠杆菌细胞液均匀地涂布在含有氯霉素的LB培养基上，过夜培养，挑取阳性克隆子构成含有7776个克隆子的宏基因组文库。每个克隆子中都含有一段40Kb左右的插入DNA片段，所以宏基因组文库中所有序列信息可以达到240Mb。这样的一个数据量可以对酸性浸矿体系微生物群落中各种丰度的微生物达到一个比较好的覆盖，有利于新颖基因的筛选。宏基因组芯片的制备利用诱导剂诱导宏基因组文库中的克隆子，使重组fosmid质粒在细胞中的拷贝数达到较高水平(至少50个以上)，然后提取宏基因组文库中每个克隆子的fosmid质粒，用紫外吸收法测定质粒的浓度，调节浓度为50ng/iil储存。将IOiU的fosmid DNA与40%的二甲基亚砜按1:1的比例混合，用芯片点样仪，在相对湿度为50-55%的条件下将fosmidDNA样品打印在硅化玻片表面。样品点之间的距离为250 iim，所有7776个样品在芯片上排布成26个18行36列的亚阵列，每个样品点在芯片上两个重复，其余为空白对照样。打印好的芯片室温干燥过夜后紫外照射使核酸分子与玻片交联固定。芯片杂交以前，先将其浸A 95°C热水2分钟中对DNA变性处理，在95%的酒精中浸洗5次，室温下空气干燥，贮存在室温及黑暗条件下备用。PCR扩增目标基因与荧光标记通过生物信息学分析感兴趣的目标基因序列的保守区域，设计通用引物，采用下列反应体系进行 PCR 扩增:1 倍 Taq 酶缓冲液(IOmM Tris-Cl [pH=9.9] ；1.5mM MgCl2 ；50mMKCl 以及 0.l%TritonX-100)；20mM dNTPs ；IOOpmol 引物，Ing 提取的微生物群落总 DNA。PCR反应程序为:94°C变性4分种；接着是在下列条件下进行32循环的放大:94°C变性45秒，55°C退火45秒，72°C延伸I分钟；最后，在72°C延伸10分钟，4°C恒温保存。用琼脂糖凝胶电泳和溴化乙啶染色检测PCR产物的大小及专一性。将PCR产物提纯。当对PCR产物进行荧光标记时，500ng的DNA与1.5 y g六聚体碱基随机引物混合(25iiL)，在95°C下变性2min，迅速在冰上冷却。变性的DNA溶液与15 y L标记反应液混合，标记反应液的成分如下:5mmol/L dATP, dTTP, dGTP 和 2.5mmol/L dCTP;lmmol/LCy3-dCTP (荧光绿，激发波长520nm ;发射波长55(T600nm)或者Cy5_dCTP (荧光红，激发波长647nm ;发射波长660 705鹽)；2.5mmol/L 二硫苏糖醇(DIT) ；10U Klenow大片断DNA聚合酶I (Invitrogen, Calsbad, CA)。反应混合物(40 y L)在37°C下孵化2h，在100°C加热板上变性3min，置于冰上迅速冷却。随后将标记的DNA用QIAquick PCR纯化柱进行纯化，纯化液于40°C下浓缩lh，用适量的dH20将浓缩的标记DNA重新溶解。宏基因组芯片杂交与 图像和数据处理标记好的DNA中加入芯片杂交溶液，成分如下:20ii I标记DNA，65ii 150%的甲酰胺，19.5iU20XSSC，3.9iU10%的十二烷基磺酸钠，9.1iil的未标记的青鱼精子DNA，
1.1 ill的DTT。配制好的杂交液98°C温浴3分钟，然后置于65°C备用。利用HS4800Pro杂交工作站进行芯片杂交，杂交温度48°C。杂交后的宏基因组芯片在分辨率5 下对基因芯片进行扫描。激发光源为绿色HeNe或红色HeNe (分别确定于所使用的荧光素Cy3或Cy5)，荧光素所发射的荧光由光电倍增管(PMT)在 570nm(Cy3)或 670nm(Cy5)进行探测。对扫描获得的图像中的每一个杂交点的光素密度(或强度)进行定量分析。将一个用来定义阵列中每一个DNA杂交点的圆圈叠加在图像上，用以确定每一个被定量分析的荧光点。将每一荧光点所获得的平均荧光强度作为其信号强度值，局部背景信号被自动地从每一单独的荧光点杂交信号中减去；同时，从每一个杂交信号值中减去所有人类基因(阴性对照)荧光强度的平均值，作为杂交强度最后的定量值。软件识别并标记质量不好的荧光点。根据下列公式计算信号干扰率(Signal-to-Noise Ratio, SNR):SNR=(信号强度值-背景信号值)/背景标准偏差，通常将SNR=3定为信号强度最小阈值，并将小于最小阈值的杂交点从数据集中去掉。对于SNR值大于3的杂交点认定为阳性杂交点，利用PCR检验后，进行DNA测序，从而得到目标基因完整的序列信息。通过生物信息学分析，在40Kb的DNA大片段上定位目标基因序列和与其相邻的基因序列，并注释生物学信息，推断目标基因可能的系统发育学位置。实施例2宏基因组芯片杂交特异性和灵敏度探索设计16s RNA 通用引物(正向引物 27F5' -AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3';反向引物1492R5' -GGYTACCTTGTTACGACTT-3')，以德兴样品总DNA为模板PCR扩增，扩增产物分别用Cy3或Cy5荧光染料标记，与宏基因组芯片在杂交仪中杂交。杂交之前，芯片放入95°C去离子水中煮2分钟，然后迅速拿出并放入无水乙醇中反复拿出5次，晾干，备用。杂交温度为48°C，探针浓度50ng时，杂交点饱满圆润，信噪比及特异性效果良好，结果见图1。探针浓度为50ng — 250ng/iil时，信噪比与探针浓度成正相关。结果如图2所示。实施例3宏基因组芯片筛选新功能基因的应用利用宏基因组芯片来获取一些感兴趣且未培养细菌的基因。挑选亚硫酸盐受体氧化还原酶(SAOR)基因的YedY亚基，从数据库中下载同源序列，比对后设计通用引物(正向引物 5' -CTACAACAACTTCTACGAATTC-3';反向引物 5' -CACGTTGGAATAGAAGCC-3')，然后将德兴铜矿中获得的总DNA进行扩增，产物片段约为500bp (图3)。为验证样品中细菌含有的SAOR基因类型，构建其克隆文库并进行RFLP分析，发现8种不同的基因型，各基因型的比例各不相同，以Acidiphilium-1ike为最多高达59%，其次是 Azotobacter-1ike 和 chromobacterium-like,分别占 13% 和 10% (图 4)。将SAOR基因的PC R产物纯化后荧光标记，与芯片杂交，获得阳性信号点(图5)。挑选圆润光滑、信号清晰，信噪比5以上的6个杂交点:2295，2478，5046，5378，7040和2800分析。取出相应的保存质粒，扩增后测序得知其中的四种为Acidiphilium菌属,而2800则为一未知菌属。将其序列做系统发育树分析(图6)，发现其基因大致分为三个组，第一组在总样品中含量较少，只占21%比例，他们与Deinococcus菌属相近，但其相似度也只有75%左右，而第二组则与Acidiphilium相近，且相似度极高，达95%以上，可初步断定就是为Acidiphilium。而且其所占比例也高达59%。第三组出现的比例为20%，且与其他菌属的相似度不高，不到70%。通过454焦磷酸测序，获得未知菌属2800克隆子fosmid的完整序列，其中SAOR基因的完整氨基酸序列如下:MTTRIPRIAPSEITPPETYFNRRAFLSAALAAGAGAAVVPAAAGAPLQYRYDAADSVAALVHAPDQDETPNTffEQ I THYNNFYEFGTGKGDPARYAGELQTRPWNLTVAGEAEVTGSFPLEKFLNPYALEERIYRFRCVEAWSMVIPWVGFPLAALLKQFKPTSRAKYVTFETLYRPSQMPGQRVPILKWPYLEGLRIDEAMNPLAFMVVGLYGRVLPNQNGAPLRLIVPWKYGFKSIKSIVRIAFTEQQPETTWSLAAPNEYGFYANVNPQVPHPRWSQASERRIGASLFHERQATLMFNGYAHEVAYLYKGMNLHKYF
权利要求
1.一种筛选酸性浸矿体系中新基因的宏基因组芯片，其特征在于，是由以下方式构建的: 利用德兴酸性矿坑废水中微生物群落的总DNA构建大片段的宏基因组文库，以宏基因组文库中提取的7776个fosmid质粒为探针，将探针通过基因芯片点样仪打印在玻片表面，打印后的宏基因组芯片在室温下干燥过夜，最后使用紫外交联仪照射下进行交联即可。
2.如权利要求1所述的宏基因组芯片，其特征在于:构建具体包括以下步骤: 采用0.2pm的尼龙膜过滤酸性浸矿体系中的酸性浸出液，得到生物质富集物，液氮研磨法提取微生物群落总DNA，然后利用200 u I的小枪头进行切割，将总DNA修剪成40_50Kb的随机的大片段；通过DNA的末端修饰使其末端成为两条链平齐的钝末端，利用DNA快速连接酶将DNA大片段与CopyControl pCClFOS Vector质粒连接起来构建重组的fosmid质粒；然后将重组的fosmid质粒转化到 EPI300-T1k Plating大肠杆菌感受态细胞；将转化后的大肠杆菌细胞液均匀地涂布在含有氯霉素的LB培养基上，过夜培养，挑取阳性克隆子构成含有7776个克隆子的宏基因组文库；每个克隆子中都含有一段40-50Kb的插入DNA片段； 利用诱导剂诱导宏基因组文库中的克隆子，使重组fosmid质粒在细胞中的拷贝数达到至少50个，然后提取宏基因组文库中每个克隆子的fosmid质粒，测定质粒的浓度，调节其浓度为50ng/ u I储存；将10 ill的fosmid DNA与40%的二甲基亚砜按体积1:1的比例混合，用芯片点样仪，在相对湿度为50-55%的条件下将fosmid DNA样品打印在硅化玻片表面；样品点之间的距离为250 ym，打印好的芯片室温干燥过夜后紫外照射使核酸分子与玻片交联固定。
3.如权利要求2所述的宏基因组芯片，其特征在于:将探针在芯片上排列成18行36列的亚矩阵，共排列26个亚矩阵，每个探针在芯片上有2个阵列重复。
4.如权利要求1所述的宏基因组芯片，其特征在于:所述的酸性浸矿体系为江西德兴铜矿的酸性浸矿体系。
5.利用权利要求1-4任一项所述的宏基因组芯片筛选浸矿体系微生物群落中的新基因的方法，其特征在于，包括以下步骤=PCR扩增待筛选目标基因并进行荧光标记:将经标记后的PCR产物与宏基因组芯片杂交，获取阳性杂交信号数据，通过PCR验证，然后通过测序对应宏基因组文库中的克隆子得到目标基因的完整序列信息。
全文摘要
本发明公开了一种筛选酸性浸矿体系中新基因的宏基因组芯片及其筛选方法。该方法构建了由7776个含有浸矿体系微生物群落DNA大片段的fosmid质粒组成的基因芯片，通过芯片与待筛选目标基因PCR产物杂交，筛选到未分离纯化培养的微生物的功能基因。与基于功能表达筛选基因的传统方法相比，本发明极大地提高了克隆文库的利用效率。同时，这一新方法也为研究利用未分离纯化培养的微生物遗传和代谢提供了一条可行的途径。
文档编号C40B50/14GK103103272SQ201310028300
公开日2013年5月15日 申请日期2013年1月25日 优先权日2013年1月25日
发明者刘学端, 邱冠周, 覃文庆, 梁伊丽, 尹华群, 郭雪, 申丽, 刘新星 申请人:中南大学