专利名称：乙型肝炎病毒耐多药基因突变检测试剂盒的利记博彩app
技术领域：
本实用新型涉及ー种疾病病原体基因检测技术，尤其涉及ー种こ型肝炎病毒耐多药基因突变检测试剂盒。
背景技术：
目前国内外对于慢性こ型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)感染患者 的主流治疗方案是抗病毒长期治疗。HBV是ー种突变率极高的病毒，自然突变率101°-11点突变/天，在长期药物治疗特别是核苷类似物药物如拉米夫定等选择压カ下，HBV耐药突变发生频率高，临床耐药突变成为影响慢性こ肝治疗效果的主要因素。拉米夫定是治疗慢性こ肝最常用的核苷类似物药物，但研究发现随着用药时间的延长患者发生病毒耐药变异的比例增高，第1、2、3、4年分别为14%、38%、49%和66%，从而限制其长期应用。部分病例在发生病毒耐药变异后会出现病情加重，少数甚至发生肝功能失代偿。因此用拉米夫定治疗慢性HBV感染患者，要用多长疗程，何时发生耐药、需要停换药物，这是临床医生考虑的难点。替比夫定和拉米夫定的耐药位点相同，95%以上对拉米夫定和替比夫定的耐药突变都发生在rtL180M和rtM204V/I位点，一小部分病人的耐药突变发生在rtA181T/V位点，rtA181T/V位点与阿德福韦有交叉耐药。阿德福韦酯是治疗慢性こ肝最常见的核酸类似物药物，其治疗こ型肝炎病毒e抗原(HbeAg)阳性患者的第1、2、3年耐药发生率分别为0%、1. 6%和3. 1% ;治疗HBeAg阴性患者的第1、2、3年耐药发生率分别为0%、3. 0%和5. 99Tll%。虽然总的耐药发生率较拉米夫定降低不少，但其耐药发生后造成的危害同样非常严重。目前已证实阿德福韦耐药相关的变异主要包括rtA181V/T和rtN236T。拉米夫定耐药患者如加用阿德福韦治疗，可降低对阿德福韦的耐药率。因此，对拉米夫定耐药患者，目前倾向于采用拉米夫定和阿德福韦联合治疗。值得注意的是，拉米夫定和阿德福韦联合治疗有可能选择出对拉米夫定和阿德福韦同时耐药的HBV毒株。拉米夫定耐药(rtM2041)的患者换用阿德福韦治疗，在出现阿德福韦耐药(rtN236T)后加用拉米夫定，虽然出现了 HBV DNA的下降，但是同时出现了拉米夫定和阿德福韦联合耐药株(rtL180M+rtM204V+rtA181V)o1989年由Saiki等提出了反向斑点杂交(reverse dot blot, RDB)技术,该技术是在PCR技术的基础上进行了一个实用性的改进。Saiki及其同事在检测HLA时提出了ー个有效的改迸，该方法是将靶基因在PCR过程用放射性元素标记，然后与尼龙膜杂交，从而检测靶基因的突变情況。这一方法可将多个靶基因在同一条件下进行检测从而大大提高了检测的效率。随后，其它科学家证实了该方法可以区分单个碱基的突变，利用共价键的探针固定方法代替紫外交联以及使用非放射性的生物素标记引物的方法，RDB技术的稳定性有了明显的提高。目前Inogenetics的LiPA系列产品(通过CE认证)均是基于上述的原理。从技术原理来说，RDB在本质上也是DNA芯片(一般是中密度芯片)的ー种，但它不同于一般所说的玻璃DNA芯片，其信号特异性強，简便易行，技术要求低，仪器设备投入小，检测结果用肉眼就可直接判断，而无需购买昂贵的激光扫描仪，更符合中国目前的国情也更利于在基层医院推广。然而，目前RDB技术整个杂交过程的操作步骤比较多，操作时间也相对较长，成为大規模推广应用的阻力。基于此需求，虽然已经有相应的自动化杂交仪出现，但自动化杂交仪的价格昂贵，并非普通的基层医院可接受。而且，繁多的操作步骤，也对自动化仪器运行的稳定性提出了挑战。在生物学领域中所涉及的基因芯片技术，是ー种同时将大量探针分子固定到固相支持物上，借助核酸分子杂交配对的特性对DNA样品的效率信息进行高效的解读和分析的方法。这类技术在对基因表达谱的分析 、突变检测、多态性分析、基因测序和基因组文库作图等方面有相关应用。
实用新型内容本实用新型的目的是提供一种用于こ型肝炎病毒耐多药基因突变检测的试剂盒。本实用新型的技术方案为提供一种こ型肝炎病毒耐多药基因突变检测试剂盒，由こ型肝炎病毒耐多药基因检测芯片和配套试剂盒组成，こ型肝炎病毒耐多药基因检测芯片由带有正电荷的固相载体和检测こ型肝炎病毒耐多药基因的探针组成，探针以共价键方式偶联在固相载体上。优选的，上述配套试剂盒包括分开放置的DNA提取液，DNA浓缩液，A液、B液、C液、D液、E液、F液。优选的，上述固相载体为玻片、硅片、尼龙膜或硝酸纤维素膜。优选的，上述固相载体为经I- (3- ニ甲氨基丙基)-3-こ基碳ニ亚胺盐酸盐预处理的尼龙膜。优选的，上述尼龙膜宽长为36. 75-37. 25毫米，宽为9. 75-10. 25毫米。优选的，上述检测こ型肝炎病毒耐多药基因的探针为与こ型肝炎病毒耐多药基因相同或互补的核酸序列。本实用新型的有益效果为利用CR-RDB方法，在具备了 PCR高灵敏度高特异性等优点的基础上，本实用新型可同时检测多个基因探针，实现对HBV基因型的高通量多通道分祈，有助于临床病情评估，治疗药物的选择和预后判断。
图I :为膜条探针排列顺序图；图2 :膜条杂交结果显色示意图；图3 :膜条杂交结果显色示意图；图4 :膜条杂交结果显色示意图；图5 :膜条杂交结果显色示意图；I、膜条；2、探针设置位置。
具体实施方式
为详细说明本实用新型的技术内容、构造特征、所实现目的及效果，以下结合实施方式并配合附图详予说明。[0024]本实用新型是将高灵敏度的聚合酶链反应(PCR)技术和反向点杂交技术相结合的基因及基因突变检测技木。是将特异的探针分别固定到硝酸纤维素膜或尼龙膜上，再将经PCR特异性扩增的产物(在PCR引物5’端预先进行生物素标记，使扩增产物相应标记有生物素)与之杂交，这样待检样本就会与具有同源序列的探针结合，经洗涤去除未结合的DNA样本，由于待测的DNA样本具有生物素类的标记物，结合了待测DNA的探针点上就带有生物素类的标记物，再经相应的显色反应就能显出杂交信号。生物素(Biotin):本实用新型生物素标记，优选地高辛标记。以尼龙膜为载体的DNA芯片技术，采用的是微量点样DNA微阵列技木。其主要的基本原理如下DNA探针为含有特定DNA序列的寡核苷酸片段，其末端带有氨基标记。经活 化处理的尼龙膜带有负电荷基团，可以与氨基形成共价结合。利用这种方法可将DNA探针按一定的排列规律永久的固定在尼龙膜的表面。其主要优点是简便易行，技术要求低，并且探针不受探针分子大小种类的限制，能根据使用者的要求简便地制出符合目的的芯片。在此基础上结合PCR技术对微量待测样品进行大量快速扩增，扩增后含有相应标记物的待测样品与芯片上的探针进行特异性杂交，此后对杂交信号強弱和有无进行分析，即可判断样品中靶分子的数量和性质。探针根据こ型肝炎病毒各耐药位点序列，设计合成各位点探针180LU80M、204M、204V、204I、181A、181V、181T、236N、236T、CC (显色反应控制)。实施例I本实用新型试剂盒的组成一、膜条生产エ艺将尼龙膜经EDC. HC1( I-(3-ニ甲氨基丙基)-3-こ基碳ニ亚胺盐酸盐)预处理30分钟后激活表面羧基；同时，将5’端带有氨基标记的探针用缓冲液稀释到适当的浓度，按阵列顺序点加于尼龙膜相应位置上，氨基与活化的羧基发生反应生成稳定的“一 CO — NH — ”共价键，从而将探针固定在尼龙膜表面，最后用0. IN的NaOH处理尼龙膜，封闭未结合探针的表面羧基，膜条制作完成，具体流程如下I、将膜条裁成适当大小，用激光打印机打上2X6的格子，每格大小为4. 5 X 5. Omm ;2、配探针稀释液(0. 5mol/L NaHC03, pH8. 4)；3、将所有12条探针分别用探针稀释液稀释至5 u mol/L ；4、配32%的EDC溶液等比例混合EDC和探针稀释液；5、用八通道连续移液器取0. 6 y L稀释好的探针点于尼龙膜相应的格子上膜条自然晾干30min ；6、配制 0. lmol/L NaOH, 二次泡膜 5 分钟；7、纯水洗膜3次；8、膜条烘干 30min ；9、二次裁剪备用。ニ、请參阅图1，膜条I上设有各个探针排列的探针位置2，每格大小为4. 5 X 5. Omm0三、原料试剂配制20 X SSC 配制[0043]取2L溶液瓶，称取350. 4g氯化钠、176. 4g柠檬酸钠.2水、溶解于1600mL去离子水中，加入数滴lOmol/L氢氧化钠溶液调节pH值至7. 0，加去离子水定容至2し高压灭菌。10%SDS 配制称取IOgSDS慢慢转移到约含90mL的水的烧杯中，用磁力搅拌器搅拌直至完全溶解。用水定容至100mL。IM柠檬酸钠配制称取294. Ig柠檬酸钠，溶解至800ml水中，用IM柠檬酸调节PH值至PH5. 0，加水定容到1L，高压灭菌。杂交液配制·[0049]A液配制在IL的20 X SSC溶液瓶中，加入IOg SDS，混匀，配成IL A液；B液配制取IL溶液瓶，加20XSSC 250mL, 10%SDS lOOmL，加水至1L，混匀，配成ILB液；C 液配制取 500mL 溶液瓶，加 Sti^ptavidin POD 2500U，600mL 水，溶解，混匀，配成 600mL C 液；D液配制取IL溶液瓶，加IL IM柠檬酸钠溶液，配成IL D液；E液配制取500mL溶液瓶，称取lgTMB，加无水こ醇至500ml，溶解，混匀，配成5 OOmL E 液;F液配制取500mL溶液瓶，取30%H20217. 5ul，加水至350ml溶解，混匀，配成350mLF液；实施例2本实用新型试剂盒的使用I、标本处理提取及杂交试剂的配置HBV DNA 浓缩液10% (w/v) PEG6000、0. 3M NaCl 水溶液；HBV DNA 提取液5% (w/v) chelex IOOUOmM Tris HCl、25mM Na0H、l% (v/v)Triton-100、1% (v/v) NP-40,0. ImM EDTA ；杂交缓冲液2XSSC/0.1%SDS ；洗膜缓冲液0.5 X SSC/0. 1%SDS ；POD :按罗氏公司POD说明书指导，在购买的每瓶500U POD粉末中直接加入120mL纯水，溶解混匀；显色缓冲液0. lmol/L柠檬酸钠，pH5. 0 ；TMB(3,3/ ,5,5/ -四甲基联苯胺)市售粉末，按原料说明书要求1:50 (w/v)溶于无水こ醇中，充分溶解；H2O2 市售的30%过氧化氢用纯净水稀释10倍；将血清或血浆IOOii I转移到I. 5ml离心管中，加IOOii I DNA浓缩液混匀，12000rpm离心10分钟，弃上清(用枪头吸尽上清)。加入30 u I DNA提取液，振荡数秒充分溶解沉淀。4000rpm离心30秒。100°C保温10分钟(误差不超过I分钟)。12000rpm离心5分钟，备用。2、PCR 扩增取PCR反应管若干，然后分别加入处理后样品、阳阴性质控品5iU，加入PCR反应管中，GOOOrpm瞬时(3秒)离心，将各反应管放入市售PCR仪，按下列条件扩增
权利要求1.一种乙型肝炎病毒耐多药基因突变检测试剂盒，其特征在于，由乙型肝炎病毒耐多药基因检测芯片和配套试剂盒组成，乙型肝炎病毒耐多药基因检测芯片由带有正电荷的固相载体和检测乙型肝炎病毒耐多药基因的探针组成。
2.根据权利要求I所述的乙型肝炎病毒耐多药基因突变检测芯片，其特征在于，所述配套试剂盒包括分开放置的DNA提取液，DNA浓缩液，杂交液A液、杂交液B液、杂交液C液、杂交液D液、杂交液E液、杂交液F液。
3.根据权利要求I所述的乙型肝炎病毒耐多药基因突变检测芯片，其特征在于，所述固相载体为玻片、硅片、尼龙膜或硝酸纤维素膜。
4.根据权利要求3所述的乙型肝炎病毒耐多药基因突变检测芯片，其特征在于，所述固相载体为经1-(3- 二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐预处理的尼龙膜。
5.根据权利要求4所述的乙型肝炎病毒耐多药基因突变检测芯片，其特征在于，所述尼龙膜宽长为36. 75-37. 25毫米，宽为9. 75-10. 25毫米。·
6.根据权利要求I所述的乙型肝炎病毒耐多药基因突变检测芯片，其特征在于，所述检测乙型肝炎病毒耐多药基因的探针为与乙型肝炎病毒耐多药基因相同或互补的核酸序列。
专利摘要本实用新型的目的是提供一种乙型肝炎病毒耐多药基因突变检测的试剂盒。本实用新型的技术方案为提供一种乙型肝炎病毒耐多药基因突变检测试剂盒，由乙型肝炎病毒耐多药基因检测芯片和配套试剂盒组成，乙型肝炎病毒耐多药基因检测芯片由带有正电荷的固相载体和检测乙型肝炎病毒耐多药基因的探针组成，探针以共价键方式偶联在固相载体上。本实用新型的有益效果为利用CR-RDB方法，在具备了PCR高灵敏度高特异性等优点的基础上，本实用新型可同时检测多个基因探针，实现对HBV基因型的高通量多通道分析，有助于临床病情评估，治疗药物的选择和预后判断。
文档编号C40B40/06GK202754998SQ20122024864
公开日2013年2月27日 申请日期2012年5月30日 优先权日2012年5月30日
发明者林希瑾, 秦伟, 胡守旺, 姚铭锋, 谢佐福, 周晓强 申请人:泰普生物科学(中国)有限公司