专利名称：Bibac基因文库混合池的构建方法及其混合池和基因的快速筛选方法
技术领域：
本发明属于生物技术基因工程技术领域，具体涉及植物基因文库混合池的构建方法及其混合池，以及植物基因的快速筛选方法。
背景技术：
构建基因文库是获得特定基因的重要途径之一，为适宜人和高等动植物基因组及其复杂功能的研究，常通过人工染色体载体构建基因文库的方法获得特定基因，如用双元细菌人工染色体(binary BAC，BIBAC)构建BIBAC基因文库。所构建的BIBAC基因文库均是将供体基因组DNA的克隆贮存在一些文库保存板中，每一块文库保存板通常有M列，每列有16个孔，共有384孔，每个孔用以贮存供体基因组DNA的单克隆菌液，因此，该文库保存板也称为384孔板，一个BIBAC基因文库，根据供体材料的不同，常有几十，甚至上百个文库保存板，如云南省农业科学院生物技术与种质资源研究所构建的药用野生稻BIBAC基因文库，有140块文库保存板，包含53760个克隆。采用常规的BIBAC基因文库筛选特异基因， 需要将该基因文库包含的所有克隆一个一个或几十个一起进行PCR筛选，再去查找相应的特异基因位置，会造成工作量很大的缺陷和不足。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有BIBAC基因文库利用时存在工作量大的缺陷和不足，其发明目的提供一种BIBAC基因文库混合池的构建方法，本发明还提供用该方法所构建的基因文库混合池及其基因的快速筛选方法。为解决以上的技术问题，本发明的技术方案如下 一、BIBAC基因文库混合池的构建方法，包括如下步骤
(1)一级混合池的构建
待BIBAC基因文库的文库保存板中的单克隆菌液完全融化后，将每一块文库保存板中每一列中的16个孔内的单克隆菌液合并成一个一级混合池，将一级混合池标记为(X)-y， X为文库保存板的编号，X=l，2，3，……自然数，y为每一块文库保存板中列的编号，y=l， 2,3,……自然数，该一级混合池命名为(X) _y号一级混合池；
(2)二级混合池的构建
将每一块文库保存板所对应的一级混合池合并成一个二级混合池，将二级混合池标记为X，X=l，2，3，……自然数，该二级混合池命名为X号二级混合池；X与文库保存板的编号相同；
(3)三级混合池的构建
按二级混合池编号顺序从1号二级混合池开始，每10个二级混合池合并成为一个三级混合池，将三级混合池记为η，η =1，2，3，……自然数，该三级混合池命名为η号三级混合池。
二、一种BIBAC基因文库混合池，所述的BIBAC基因文库混合池是按上述技术方案 1所述的BIBAC基因文库混合池的构建方法构建获得。三、一种基因的快速筛选方法，包括以下步骤
(1)按上述技术方案1所述的BIBAC基因文库混合池的构建方法构建一级混合池、二级混合池和三级混合池；
(2)根据目的基因的特异序列或同源基因序列设计引物，并合成该引物；
(3)以步骤(1)所构建的三级混合池为第一步筛选的模板，用步骤(2)所获得的引物按常规PCR方法进行筛选，得到阳性克隆池；
(4)用步骤(3)所得到阳性克隆池所对应的二级混合池为第二步筛选的模板，按照步骤(3)相同的PCR体系进行筛选，得到阳性克隆池；
(5)用步骤(4)获得的阳性克隆池所对应的一级混合池作为第三步筛选的模板，按照步骤(3)相同的PCR体系进行筛选，得到阳性克隆池；
(6)对步骤(5)所述的阳性克隆池所对应的16个单克隆，按照步骤(3)相同的PCR体系进行筛选，得到阳性克隆；
(7)，采用目的基因的特异序所设计的引物进行PCR时，如果步骤(3)到步骤(6)各步骤所得到的阳性克隆的片段大小相同，即可认定步骤(6)获得的阳性克隆为目的基因；采用同源基因序列设计的引物进行PCR时，将步骤(6)得到阳性克隆回收纯化，测序、进行blast 比对，以比对结果确定目的基因。与现有技术相比，本发明的有益效果是
1、本发明所述的BIBAC基因文库混合池的构建方法，构建了一级混合池、二级混合池和三级混合池，能简明清楚地记录庞大的基因文库各级混合池及其克隆的详细位置，能准确地找到任何单拷贝序列并且可以将其相对应的克隆定位在基因文库的具体位置，能为利用植物优良基因提供可靠的材料，该方法易掌握。2、用本发明BIBAC基因文库混合池的构建方法所构建的基因文库混合池或用本发明的基因的快速筛选方法筛选基因，比用现有的BIBAC基因文库直接筛选基因可结省大量工作量和大量成本，如实施例中的云南药用野生稻BIBAC基因文库包含53760个克隆，1 台PCR机，按一次能扩增96个单克隆计算，需进行560次PCR，而用本发明BIBAC基因文库混合池的构建方法所构建的基因文库混合池或用本发明的基因的快速筛选方法筛选基因， 只需进行4次PCR，节省500次PCR的工作量，大大提高了基因克隆效率。3、所构建的基因文库混合池还可重复用于多个基因的筛选。
图1为双元细菌人工染色体BIBAC2质粒载体物理图。图2是一级混合池和二级混合池的构建示意图，图中(X) -1 (X) -24，表示第X 块文库保存板中的M个一级混合池，X表示M个一级混合池合并成的一个二级混合池。图3是三级混合池的构建示意图，图中1 10表示1号二级混合池至10号二级混合池共10个二级混合池合并构建1个三级混合池，1表示1号三级混合池。图4是本发明实施列3对14个三级混合池进行)Ca21基因筛选的琼脂糖电泳检测结果，图中M为DL2000 Marker,泳道1是1号三级混合池；泳道2是2号三级混合池；泳道3是3号三级混合池；泳道4是4号三级混合池；泳道5是5号三级混合池；泳道6是6 号三级混合池；泳道7是7号三级混合池；泳道8是8号三级混合池；泳道9是9号三级混合池；泳道10是10号三级混合池；泳道11是11号三级混合池；泳道12是12号三级混合池；泳道13是13号三级混合池；泳道14是14号三级混合池，其中14号三级混合池是阳性克隆池。图5是本发明实施列3对二级混合池进行)Ca21基因筛选的琼脂糖电泳检测结果， 图中M为DL2000 Marker,泳道1是1；34 二级混合池；泳道2是135 二级混合池；泳道3是 136 二级混合池；泳道4是137 二级混合池，其中134号二级混合池是阳性克隆池。图6是本发明实施列3对一级混合池进行)Ca21基因筛选的琼脂糖电泳检测结果， 图中M为DL2000 Marker，泳道1是(1；34)_1号一级混合池；泳道2是(1；34)_2号一级混合池；泳道3是(1；34)-3号一级混合池；泳道4是(1；34)-4号一级混合池，其中(1；34)_4号一级混合池是阳性克隆池。图7是本发明实施列3对(134) _4 —级混合池所对应的16个单克隆进行)Ca21基因筛选的琼脂糖电泳检测结果，图中M为DL2000 Marker,泳道1至16分别是第1个孔至第 16个孔中单克隆的电泳检测结果，其中泳道4，泳道8，泳道15是阳性克隆。
具体实施例方式
药用野生稻、Oryza officinalis Watt.)由于独立起源和进化，具有其它药用野生稻不具有的结实率高等重要的特意优良性状，这些优良性状都是水稻育种的宝贵资源，是本领域常用的材料，以下实施例以云南药用野生稻为供体材料对本发明做进一步描述，但不够成限制本发明。当然也可用其它供体植物材料按本发明方法构建基因文库文库混合池和用本发明基因的快速筛选方法对基因进行快速筛选。实施例1云南药用野生稻BIBAC基因文库的构建
云南药用野生稻BIBAC基因文库的构建是按照常规的BIBAC基因文库的构建方法构建的。还可参照“云南药用野生稻BIBAC文库的构建及分析”(作者侯思名等，湖南农业大学学报(自然科学版)第37卷第1期2011年2月，17-21)构建。用现有的常规方法构建的云南药用野生稻BIBAC基因文库的克隆载体是双元细菌人工染色体BIBAC2，大小为23. 5kb,具有单克隆酶切位点BamHI，如图1所示，对卡那霉素(Km)具有抗性，具有feci 基因，当载体有外源片段插入，可以在含5%的蔗糖和卡那霉素(50mg/L)的LB培养基中生长；该云南药用野生稻BIBAC基因文库包括53760个克隆， 平均插入片段76 kb,保存在140块文库保存板中，每块文库保存板有M列，每列有16个孔，即每块文库保存板有384个孔用以贮存克隆菌液，用X表示文库保存板的编号，X=l，2， 3，……140自然数；从第1块文库保存板开始，依次，命名为第1块文库保存板，第2块文库保存板，第3块文库保存板，第4块文库保存板，第5块文库保存板，……到第140块文库保存板，其基因文库库容相当于云南药用野生稻基因组的5. 86倍。实施例2 BIBAC基因文库混合池的构建方法及其混合池
将实施例1构建的云南药用野生稻BIBAC基因文库，按以下步骤构建BIBAC基因文库混合池
(1) 一级混合池的构建
①待云南药用野生稻BIBAC基因文库的文库保存板中的单克隆菌液完全融化后，将每一块文库保存板中，每一列中16个孔的单克隆菌液合并成一个一级混合池，每一块文库保存板有M列，共合并成M —个一级混合池，具体操作是用最大量程为10 μ 1的移液枪分别吸取文库保存板的1列中的16个孔中单克隆菌液10 μ 1，合加在一个已装有1.5ml培养基的离心管中，所述的培养基与构建的云南药用野生稻BIBAC基因文库所采用的培养基及培养条件均相同，具体是所述的培养基是1.0%胰蛋白胨，0.5%酵母膏，1.0% NaCl, 360mmol/LK2HP04, 132mmol/LKH2PO4, 17mmol/L, Na citrate 4mmol/L MgSO4 · 7H20，68 mmol /L (NH4)2S04，每次在吸取1个孔中的单克隆菌液之前先用移液枪将沉淀在板底的菌体重悬后再吸取菌液，每个单克隆菌液用一个无菌移液枪头；将所建成的一级混合池放入 37°C恒温摇床中培养6 他(培养条件)；所述的百分数为质量分数；
②将收集了的每一列的混合菌液离心管标记为(X)_y，X为文库保存板的编号，X=l， 2,3,……140自然数;y为每一块文库保存板中列的编号，y=l，2，3，4，5，6，7，8，9，10，ll， 12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24 ；即每一块文库保存板有24个一级混合池(如图2)，一级混合池命名为(X) -y号一级混合池；因云南药用野生稻BIBAC基因文库有140 块文库保存板，所以构成3360个一级混合池(140XM=3360)；
以下以第1块文库保存板，第2块文库保存板，第3块文库保存板，第140块文库保存板为例，更具体地说明该文库保存板中每一列16个孔的单克隆菌液合并在一个离心管中， 该离心管的标记即一级混合池的标记 第1块文库保存板
第1块文库保存板第1列中16个孔的单克隆菌液合并的离心管记为(1)_1，命名为
-1号一级混合池，以下类推；(1) -2第1块文库保存板第2列中16个孔的单克隆菌液合并的离心售;标记为(1)-2，第1块文库保存板第3列中16个孔的单克隆菌液合并的离心售;标记为(1)-3，第1块文库保存板第4列中16个孔的单克隆菌液合并的离心售;标记为(1)-4，第1块文库保存板第5列中16个孔的单克隆菌液合并的离心售;标记为(1)-5，第1块文库保存板第6列中16个孔的单克隆菌液合并的离心售;标记为(1)-6，第1块文库保存板第7列中16个孔的单克隆菌液合并的离心售;标记为(1)-7，第1块文库保存板第8列中16个孔的单克隆菌液合并的离心售;标记为(1)-8，第1块文库保存板第9列中16个孔的单克隆菌液合并的离心售;标记为(1)-9，第1块文库保存板第10列中16个孔的单克隆菌液合并的离心<蒙标记为(1)-10第1块文库保存板第11列中16个孔的单克隆菌液合并的离心<蒙标记为(1)-11第1块文库保存板第12列中16个孔的单克隆菌液合并的离心-蒙标记为(1)-12第1块文库保存板第13列中16个孔的单克隆菌液合并的离心-蒙标记为(1)-13第1块文库保存板第14列中16个孔的单克隆菌液合并的离心-蒙标记为(1)-14第1块文库保存板第15列中16个孔的单克隆菌液合并的离心-蒙标记为(1)-15第1块文库保存板第16列中16个孔的单克隆菌液合并的离心-蒙标记为(1)-16第1块文库保存板第17列中16个孔的单克隆菌液合并的离心-蒙标记为(1)-17第1块文库保存板第18列中16个孔的单克隆菌液合并的离心-蒙标记为(1)-18第1块文库保存板第19列中16个孔的单克隆菌液合并的离心-蒙标记为(1)-19第1块文库保存板第20列中16个孔的单克隆菌液合并的离心-蒙标记为(1)-20第1块文库保存板第21列中16个孔的单克隆菌液合并的离心管标记为(1)-21， 第1块文库保存板第22列中16个孔的单克隆菌液合并的离心管标记为(1)-22， 第1块文库保存板第23列中16个孔的单克隆菌液合并的离心管标记为(1)-23， 第1块文库保存板第M列中16个孔的单克隆菌液合并的离心管标记为(1) -24 ； 分别命名为(1) -1号一级混合池，(1)-2号一级混合池，(1)-3号一级混合池，(1)-4 号一级混合池，(1)-5号一级混合池，(1)-6号一级混合池，(1)-7号一级混合池，(1)-8号一级混合池，(1) -9号一级混合池，(1) -10号一级混合池，(1) -11号一级混合池，(1) -12 号一级混合池，(1) -13号一级混合池，(1) -14号一级混合池，(1) -15号一级混合池， (1)-6号一级混合池，(1) -17号一级混合池，(1) -18号一级混合池，(1) -19号一级混合池，(1) -20号一级混合池，(1)-21号一级混合池，(1)-22号一级混合池，(1) -23号一级混合池，(1)-24号一级混合池，以下类推； 第2块文库保存板
第2块文库保存板第1列中16个孔的单克隆菌液合并的离心管记为(2) -1， 第2块文库保存板第2列中16个孔的单克隆菌液合并的离心管标记为(2) -2， 第2块文库保存板第3列中16个孔的单克隆菌液合并的离心管标记为(2) -3， 第2块文库保存板第4列中16个孔的单克隆菌液合并的离心管标记为(2) -4， 第2块文库保存板第5列中16个孔的单克隆菌液合并的离心管标记为(2) -5， 第2块文库保存板第6列中16个孔的单克隆菌液合并的离心管标记为(2) -6， 第2块文库保存板第7列中16个孔的单克隆菌液合并的离心管标记为(2) -7， 第2块文库保存板第8列中16个孔的单克隆菌液合并的离心管标记为(2) -8， 第2块文库保存板第9列中16个孔的单克隆菌液合并的离心管标记为(2) -9，
第2块文库保存板第10列中16个孔的单克隆菌液合并的离f标记为(2)-10,第2块文库保存板第11列中16个孔的单克隆菌液合并的离f标记为(2)-11,第2块文库保存板第12列中16个孔的单克隆菌液合并的离f标记为(2)-12，第2块文库保存板第13列中16个孔的单克隆菌液合并的离f标记为(2)-13，第2块文库保存板第14列中16个孔的单克隆菌液合并的离f标记为(2)-14，第2块文库保存板第15列中16个孔的单克隆菌液合并的离f标记为(2)-15，第2块文库保存板第16列中16个孔的单克隆菌液合并的离f标记为(2)-16，第2块文库保存板第17列中16个孔的单克隆菌液合并的离f标记为(2)-17，第2块文库保存板第18列中16个孔的单克隆菌液合并的离f标记为(2)-18，第2块文库保存板第19列中16个孔的单克隆菌液合并的离f标记为(2)-19，第2块文库保存板第20列中16个孔的单克隆菌液合并的离f标记为(2)-20，第2块文库保存板第21列中16个孔的单克隆菌液合并的离f标记为(2)-21，第2块文库保存板第22列中16个孔的单克隆菌液合并的离f标记为(2)-22，第2块文库保存板第23列中16个孔的单克隆菌液合并的离f标记为(2)-23，第2块文库保存板第24列中16个孔的单克隆菌液合并的离f标记为(2)—24
第3块文库保存板
第3块文库保存板第1列中16个孔的单克隆菌液合并的离心管记为(3)-1， 第3块文库保存板第2列中16个孔的单克隆菌液合并的离心管标记为(3) -2，第3块文库保存板第3列中16个孔的单克隆菌液合并的离心管标记为(3) -3 第3块文库保存板第4列中16个孔的单克隆菌液合并的离心管标记为(3) -4 第3块文库保存板第5列中16个孔的单克隆菌液合并的离心管标记为(3) -5 第3块文库保存板第6列中16个孔的单克隆菌液合并的离心管标记为(3) -6 第3块文库保存板第7列中16个孔的单克隆菌液合并的离心管标记为(3) -7 第3块文库保存板第8列中16个孔的单克隆菌液合并的离心管标记为(3) -8 第3块文库保存板第9列中16个孔的单克隆菌液合并的离心管标记为(3) -9
第3块文库保存板第10列中16个孔的单克隆菌液合并的离f标记为(3)-10,第3块文库保存板第11列中16个孔的单克隆菌液合并的离f标记为(3)-11,第3块文库保存板第12列中16个孔的单克隆菌液合并的离f标记为(3)-12，第3块文库保存板第13列中16个孔的单克隆菌液合并的离f标记为(3)-13，第3块文库保存板第14列中16个孔的单克隆菌液合并的离f标记为(3)-14，第3块文库保存板第15列中16个孔的单克隆菌液合并的离f标记为(3)-15，第3块文库保存板第16列中16个孔的单克隆菌液合并的离f标记为(3)-16，第3块文库保存板第17列中16个孔的单克隆菌液合并的离f标记为(3)-17，第3块文库保存板第18列中16个孔的单克隆菌液合并的离f标记为(3)-18，第3块文库保存板第19列中16个孔的单克隆菌液合并的离f标记为(3)-19，第3块文库保存板第20列中16个孔的单克隆菌液合并的离f标记为(3)-20，第3块文库保存板第21列中16个孔的单克隆菌液合并的离f标记为(3)-21，第3块文库保存板第22列中16个孔的单克隆菌液合并的离f标记为(3)-22，第3块文库保存板第23列中16个孔的单克隆菌液合并的离f标记为(3)-23，第3块文库保存板第24列中16个孔的单克隆菌液合并的离f标记为(3)-24
依此类推，到第140块文库保存板时，合并单克隆菌液的离心管标记是 第140块文库保存板第1列中16个孔的单克隆菌液合并的离心管记为(140)-1， 第140块文库保存板第2列中16个孔的单克隆菌液合并的离心管标记为(140)-2， 第140块文库保存板第3列中16个孔的单克隆菌液合并的离心管标记为(140)-3， 第140块文库保存板第4列中16个孔的单克隆菌液合并的离心管标记为(140)-4， 第140块文库保存板第5列中16个孔的单克隆菌液合并的离心管标记为(140)-5， 第140块文库保存板第6列中16个孔的单克隆菌液合并的离心管标记为(140)-6， 第140块文库保存板第7列中16个孔的单克隆菌液合并的离心管标记为(140)-7， 第140块文库保存板第8列中16个孔的单克隆菌液合并的离心管标记为(140)-8， 第140块文库保存板第9列中16个孔的单克隆菌液合并的离心管标记为(140)-9， 第140块文库保存板第10列中16个孔的单克隆菌液合并的离心管标记为(140)-10 第140块文库保存板第11列中16个孔的单克隆菌液合并的离心管标记为(140)-11 第140块文库保存板第12列中16个孔的单克隆菌液合并的离心管标记为(140)-12 第140块文库保存板第13列中16个孔的单克隆菌液合并的离心管标记为(140)-13 第140块文库保存板第14列中16个孔的单克隆菌液合并的离心管标记为(140)-14 第140块文库保存板第15列中16个孔的单克隆菌液合并的离心管标记为(140)-15 第140块文库保存板第16列中16个孔的单克隆菌液合并的离心管标记为(140)-16库保存板第17列中16个孔的单克隆菌液合并的离心管标记为(140)-17， 第140块文库保存板第18列中16个孔的单克隆菌液合并的离心管标记为(140)-18， 第140块文库保存板第19列中16个孔的单克隆菌液合并的离心管标记为(140)-19， 第140块文库保存板第20列中16个孔的单克隆菌液合并的离心管标记为(140)-20， 第140块文库保存板第21列中16个孔的单克隆菌液合并的离心管标记为(140)-21， 第140块文库保存板第22列中16个孔的单克隆菌液合并的离心管标记为(140)-22， 第140块文库保存板第23列中16个孔的单克隆菌液合并的离心管标记为(140)-23， 第140块文库保存板第M列中16个孔的单克隆菌液合并的离心管标记为(140)-24 ； (2) 二级混合池的构建
对步骤(1)的一级混合池再进行组合，将每一块文库保存板所对应的M个一级混合池合并成一个二级混合池(图2)，具体操作是从第1文库保存板开始，依次，将每一文库保存板所对应的M个一级混合池中的混合菌液分别用最大量程为200 μ 1移液枪吸取50 μ 1 混合菌液，合加在一个空的1. 5ml离心管中，将离心管标记为X，X为文库保存板的编号， X=l，2，3，……自然数，该混合池命名为X号二级混合池；每次吸取一个一级混合池的混合菌液之前，先用该移液枪充分混勻，并且每次更换无菌移液枪头；将构建成的二级混合池放入37°C恒温摇床中培养6 他；因每一块文库保存板所对应的M个一级混合池合并成一个二级混合池，云南药用野生稻BIBAC基因文库有140块文库保存板，所以构成140个二级混合池，即二级混合池的数为X，X=云南药用野生稻BIBAC基因文库的文库保存板数；
以下以第1块文库保存板，第2块文库保存板，第3块文库保存板，第140块文库保存板为例，更具体地说明各文库保存板所对应的M个一级混合池合并成一个二级混合池及其标记
第1块文库保存板所对应的M个一级混合池分别是(I)-I号一级混合池，(1)-2号一级混合池，(1)-3号一级混合池，(1)-4号一级混合池，(1)-5号一级混合池，(1)-6号一级混合池，(1)-7号一级混合池，(1)-8号一级混合池，(1)-9号一级混合池，(I)-IO号一级混合池，(I)-Il号一级混合池，(1)-12号一级混合池，(1)-13号一级混合池，(1)-14号一级混合池，(1)-15号一级混合池，(1)-16号一级混合池，(1)-17号一级混合池，(1)-18号一级混合池，(1)-19号一级混合池，(1)-20号一级混合池，(1)-21号一级混合池，(1)-22 号一级混合池，(1) -23号一级混合池，(1)-24号一级混合池；将这M个一级混合池按上述方法合并后的二级混合池标记是1，X=I ；命名为1号二级混合池
第2块文库保存板所对应的M个一级混合池分别是(2)-1号一级混合池，(2)-2号一级混合池，(2)-3号一级混合池，(2)-4号一级混合池，(2)-5号一级混合池，(2)-6号一级混合池，(2)-7号一级混合池，(2)-8号一级混合池，(2)-9号一级混合池，(2)-10号一级混合池，(2)-11号一级混合池，(2)-12号一级混合池，(2)-13号一级混合池，(2)-14号一级混合池，(2)-15号一级混合池，(2)-16号一级混合池，(2)-17号一级混合池，(2)-18号一级混合池，(2)-19号一级混合池，(2)-20号一级混合池，(2)-21号一级混合池，(2)-22 号一级混合池，(2) -23号一级混合池，(2) -24号一级混合池；将这M个一级混合池按上述方法合并后的二级混合池的标记是2，X=2 ；命名为2号二级混合池；
第3块文库保存板所对应的M个一级混合池分别是(3) -1号一级混合池，(3) -3号一级混合池，(3) -4号一级混合池，(3) -5号一级混合池，(3) -6号一级混合池，(3) -7号一级混合池，(3)-8号一级混合池，(3)-9号一级混合池，(3)-10号一级混合池，(3)-11 号一级混合池，(3) -12号一级混合池，(3) -13号一级混合池，(3) -14号一级混合池， (3) -15号一级混合池，(3) -16号一级混合池，(3) -17号一级混合池，(3) -18号一级混合池，(3) -19号一级混合池，(3) -20号一级混合池，(3) -21号一级混合池，(3) -22号一级混合池，(3) -23号一级混合池，(3) -24号一级混合池；将这M个一级混合池按上述方法合并后的二级混合池的标记是3，X=3 ；命名为3号二级混合池；
依此类推，到第140块文库保存板时，第140块文库保存板所对应的M个一级混合池分别是(140) -1号一级混合池，(140) -2号一级混合池，(140) -3号一级混合池，(140) -4 号一级混合池，(140) -5号一级混合池，(140) -6号一级混合池，(140) -7号一级混合池， (140) -8号一级混合池，(140) -9号一级混合池，(140) -10号一级混合池，(140) -11号一级混合池，(140) -12号一级混合池，(140) -13号一级混合池，(140) -14号一级混合池， (140)-15号一级混合池，(140)-16号一级混合池，(140)-17号一级混合池，(140)-18号一级混合池，(140) -19号一级混合池，(140) -20号一级混合池，(140) -21号一级混合池， (140) -22号一级混合池，(140) -23号一级混合池，(140) -24号一级混合池；将这M个一级混合池按上述方法合并后的二级混合池的标记是140，X=140 ；命名为140号二级混合池；
(3)三级混合池的构建
按步骤(2)的二级混合池编号顺序从1号二级混合池开始，每10个二级混合池合并成为一个三级混合池(图3)，将每10个二级混合池中混合菌液分别用最大量程为200 μ 1移液枪吸取100 μ 1混合菌液，合加在一个空的1. 5mL离心管中，将离心管标记为1，即n=l，该混合池命名为1号三级混合池，共构成X/10个三级混合池，X与文库保存板的编号相同，云南药用野生稻BIBAC基因文库有140块文库保存板，即X=140，X/10=140/10=14，所以构成 14个三级混合池；
以下从1号二级混合池开始，将1号二级混合池至10号二级混合池的10个二级混合池合并成一个三级混合池，依次，至140号二级混合池的合并及标记如下
将1号二级混合池，2号二级混合池，3号二级混合池，4号二级混合池，5号二级混合池，6号二级混合池，7号二级混合池，8号二级混合池，9号二级混合池和10号二级混合池共10个二级混合池按上述方法合并成一个三级混合池，其离心管标记为1，n=l，该混合池命名为1号三级混合池；
将11号二级混合池，12号二级混合池，13号二级混合池，14号二级混合池，15号二级混合池，16号二级混合池，17号二级混合池，18号二级混合池，19号二级混合池和20号二级混合池共10个二级混合池按上述方法合并成一个三级混合池，其离心管标记为2，n=2, 该混合池命名为2号三级混合池；
将21号二级混合池，22号二级混合池，23号二级混合池，M号二级混合池，25号二级混合池J6号二级混合池，27号二级混合池，观号二级混合池，四号二级混合池和30号二级混合池共10个二级混合池按上述方法合并成一个三级混合池，其离心管标记为3，n=3, 该混合池命名为3号三级混合池；
将31号二级混合池，32号二级混合池，33号二级混合池，34号二级混合池，35号二级混合池，36号二级混合池，37号二级混合池，38号二级混合池，39号二级混合池和40号二级混合池共10个二级混合池按上述方法合并成一个三级混合池，其离心管标记为4，n=4, 该混合池命名为4号三级混合池；
将41号二级混合池，42号二级混合池，43号二级混合池，44号二级混合池，45号二级混合池，46号二级混合池，47号二级混合池，48号二级混合池，49号二级混合池和50号二级混合池共10个二级混合池按上述方法合并成一个三级混合池，其离心管标记为5，n=5, 该混合池命名为5号三级混合池；
将51号二级混合池，52号二级混合池，53号二级混合池，54号二级混合池，55号二级混合池，56号二级混合池，57号二级混合池，58号二级混合池，59号二级混合池和60号二级混合池共10个二级混合池按上述方法合并成一个三级混合池，其离心管标记为6，n=6, 该混合池命名为6号三级混合池；
将61号二级混合池，62号二级混合池，63号二级混合池，64号二级混合池，65号二级混合池，66号二级混合池，67号二级混合池，68号二级混合池，69号二级混合池和70号二级混合池共10个二级混合池按上述方法合并成一个三级混合池，其离心管标记为7，n=7, 该混合池命名为7号三级混合池；
将71号二级混合池，72号二级混合池，73号二级混合池，74号二级混合池，75号二级混合池，76号二级混合池，77号二级混合池，78号二级混合池，79号二级混合池和80号二级混合池共10个二级混合池按上述方法合并成一个三级混合池，其离心管标记为8，n=8, 该混合池命名为8号三级混合池；
将81号二级混合池，82号二级混合池，83号二级混合池，84号二级混合池，85号二级混合池，86号二级混合池，87号二级混合池，88号二级混合池，89号二级混合池和90号二级混合池共10个二级混合池按上述方法合并成一个三级混合池，其离心管标记为9，n=9, 该混合池命名为9号三级混合池；
将91号二级混合池，92号二级混合池，93号二级混合池，94号二级混合池，95号二级混合池，96号二级混合池，97号二级混合池，98号二级混合池，99号二级混合池和100号二级混合池共10个二级混合池按上述方法合并成一个三级混合池，其离心管标记为10， n=10，该混合池命名为10号三级混合池；
将101号二级混合池，102号二级混合池，103号二级混合池，104号二级混合池，105号二级混合池，106号二级混合池，107号二级混合池，108号二级混合池，109号二级混合池和 110号二级混合池共10个二级混合池按上述方法合并成一个三级混合池，其离心管标记为 11，n=ll，该混合池命名为11号三级混合池；
将111号二级混合池，112号二级混合池，113号二级混合池，114号二级混合池，115号二级混合池，116号二级混合池，117号二级混合池，118号二级混合池，119号二级混合池和 120号二级混合池共10个二级混合池按上述方法合并成一个三级混合池，其离心管标记为 12，n=12，该混合池命名为12号三级混合池；
将121号二级混合池，122号二级混合池，123号二级混合池，124号二级混合池，125 号二级混合池，126号二级混合池，127号二级混合池，128号二级混合池，129号二级混合池和130号二级混合池共10个二级混合池按上述方法合并成一个三级混合池，其离心管标记为13，n=13，该混合池命名为13号三级混合池；
将131号二级混合池，132号二级混合池，133号二级混合池，134号二级混合池，135号二级混合池，136号二级混合池，137号二级混合池，138号二级混合池，139号二级混合池和 140号二级混合池共10个二级混合池按上述方法合并成一个三级混合池，其离心管标记为 14，n=14，该混合池命名为14号三级混合池。按上述方法所构建的混合池为本发明所述的BIBAC基因文库混合池。实施例3 —种基因的快速筛选的方法
本实施列以筛选抗白叶枯病基因)(a21为例，阐述本发明所述的一种基因的快速筛选的方法，其步骤如下
(1)、按实施例2构建云南药用野生稻BIBAC基因文库一级混合池、二级混合池和三级混合池；
(2)、根据抗白叶枯病基因)Ca21的序列设计引物，并合成该引物
根据在Genbank查找抗白叶枯病基因办21的序列设计特异引物，所述的特异引物的碱基序列是
5 ‘ -AGACGCGGAAGGGTGGTTCCCGGA-3‘； 5 ‘ -AGACGCGGTAATCGAAAGATGAAA-3‘ 上述引物对委托上海生工生物工程技术服务有限公司合成；
(3)以步骤(1)所构建的三级混合池为第一步筛选的模板，用步骤(2)所获得的引物按常规PCR方法进行筛选，得到阳性克隆池；
所述的第一步筛选的模板分别是云南药用野生稻BIBAC基因文库混合池的如下14个三级混合池
1号三级混合池；2号三级混合池；3号三级混合池；4号三级混合池；5号三级混合池； 6号三级混合池；7号三级混合池；8号三级混合池；9号三级混合池；10号三级混合池；11 号三级混合池；12号三级混合池；13号三级混合池；14号三级混合池。经试验，确定最佳PCR反应体系和反应条件如表1，PCR反应总体系为20 μ 1 ；
权利要求
1.BIBAC基因文库混合池的构建方法，包括如下步骤(1)一级混合池的构建待BIBAC基因文库的文库保存板中的单克隆菌液完全融化后，将每一块文库保存板中每一列中的16个孔内的单克隆菌液合并成一个一级混合池，将一级混合池标记为(X)-y， X为文库保存板的编号，X=l，2，3，……自然数，y为每一块文库保存板中列的编号，y=l， 2,3,……自然数，该一级混合池命名为(X) _y号一级混合池；(2)二级混合池的构建将每一块文库保存板所对应的一级混合池合并成一个二级混合池，将二级混合池标记为X，X=l，2，3，……自然数，该二级混合池命名为X号二级混合池；X与文库保存板的编号相同；(3)三级混合池的构建按二级混合池编号顺序从1号二级混合池开始，每10个二级混合池合并成为一个三级混合池，将三级混合池记为η，η =1,2,3,……自然数，该三级混合池命名为η号三级混合池。
2.—种BIBAC基因文库混合池，所述的BIBAC基因文库混合池是按权利要求1所述的 BIBAC基因文库混合池的构建方法构建获得。
3.一种基因的快速筛选方法，包括以下步骤(1)按上述技术方案1所述的BIBAC基因文库混合池的构建方法构建一级混合池、二级混合池和三级混合池；(2)根据目的基因的特异序列或同源基因序列设计引物，并合成该引物；(3)以步骤(1)所构建的三级混合池为第一步筛选的模板，用步骤(2)所获得的引物按常规PCR方法进行筛选，得到阳性克隆池；(4)用步骤(3)所得到阳性克隆池所对应的二级混合池为第二步筛选的模板，按照步骤(3)相同的PCR体系进行筛选，得到阳性克隆池；(5)用步骤(4)获得的阳性克隆池所对应的一级混合池作为第三步筛选的模板，按照步骤(3)相同的PCR体系进行筛选，得到阳性克隆池；(6)对步骤(5)所述的阳性克隆池所对应的16个单克隆，按照步骤(3)相同的PCR体系进行筛选，得到阳性克隆；(7)，采用目的基因的特异序所设计的引物进行PCR时，如果步骤(3)到步骤(6)各步骤所得到的阳性克隆的片段大小相同，即可认定步骤(6)获得的阳性克隆为目的基因；采用同源基因序列设计的引物进行PCR时，将步骤(6)得到阳性克隆回收纯化，测序、进行blast 比对，以比对结果确定目的基因。
全文摘要
本发明公开了BIBAC基因文库混合池的构建方法及其混合池和基因的快速筛选方法，BIBAC基因文库混合池的构建是将每一块文库保存板中每一列中的16个孔内的单克隆菌液合并成一个一级混合池；将每一块文库保存板所对应的一级混合池合并成一个二级混合池；每10个二级混合池合并成为一个三级混合池。基因的快速筛选方法是以三级混合池为第一步筛选的模板，用设计的引物进行PCR，筛选得到阳性克隆池；然后逐一以得到阳性克隆池所对应的混合池为筛选的模板，最后得到阳性克隆；根据各步骤所得到的阳性克隆的片段大小或测序比对，确定目的基因。所构建混合池能准确地找到任何单拷贝序列，基因的快速筛选方法可节省大量工作量和大量成本。
文档编号C40B50/06GK102443854SQ201110256870
公开日2012年5月9日 申请日期2011年9月2日 优先权日2011年9月2日
发明者付坚, 余腾琼, 侯思名, 张敦宇, 张薇, 李娥贤, 李定琴, 李维蛟, 殷富有, 王玲仙, 程在全, 蒋聪, 郭怡卿, 钟巧芳, 陈玲, 黄兴奇 申请人:云南省农业科学院生物技术与种质资源研究所