专利名称：大豆根际土壤微生物群落宏基因组文库的构建及其应用的利记博彩app
技术领域：
本发明属于环境微生物学技术领域，具体涉及大豆根际土壤微生物群落宏基因组 文库的构建及其应用。
背景技术：
由于培养条件和技术手段的限制，传统的微生物培养方法获得的微生物可能还不 到自然界中实际微生物总数的1%。为了更真实全面地反应土壤微生物多样性情况及开 发利用土壤中未可培养微生物资源，一种基于直接提取土壤微生物DNA并将其克隆到合适 的载体再导入宿主菌中构建基因组文库的方法逐渐发展起来，这就是土壤宏基因组学。宏 基因组学作为一种探索微生物多样性的强有力工具，经过十余年的发展，可以超越培养手 段而直接获得新颖的生物催化剂和有价值的活性物质(Handelsman，2004，Microbiol Mol Biol Rev. ；Streit et al. ,2004,Curr Opin Biotechnol. ；Schmeisser et al. ,2007,Appl Microbiol Biotechnol.)。宏基因组文库促使人们将目光转向微生物群落和功能研究上， 为未培养微生物遗传信息的研究提供方法和手段，并用以解决医学、农业和工业上的问题。宏基因组决定了生物群体的生命现象，包含了远比可培养的微生物类群更海量 的遗传信息。国外已有很多从不同环境样品的宏基因文库中通过功能性筛选获得新的抗 生素、脂肪酶、几丁质酶、蛋白酶、DNA连接酶、膜蛋白、4-羟基丁酸脱氢酶等合成基因或基 因簇，以及对群落结构组成和功能进行分析的报道(Herme et al.，1999，Appl Environ Microbiol. ；Entcheva etal. ,2001, Appl Environ Microbiol. ；Beja et al. , 2002, Appl Environ Microbiol. ；Rolf Daniel,2005, Nature ；Yun et al. ,2004, Appl Environ Microbiol. ；Pathak et al. ,2009, Environ Microbiol·)。国内也逐步开展起相关研究 (Liu et al. , 2009, Appl Microbiol Biotechnol·)。微生物生态学研究为更好的认识环境中微生物群落结构、变化以及微生物在其中 的活动提供了理论依据，而分子生物学方法的引入让我们能更充分了解土壤中的微生物群 落。而这些方法的共同基础，是从土壤中提取大量不含抑制物并且具有典型群落代表性的 微生物总DNA，这也是宏基因组文库构建过程中至为关键的第一步。因此需要尽可能地使 所提取的基因组DNA具有代表性，保持较大片段以增加获得完整的目的基因或基因簇的 可能，还要达到较高的纯度以增加建库效率。为了达到这些要求，很多实验室致力于摸索 DNA提取的最佳条件，也有研究者将环境样品经过有针对性地富集后再进行DNA提取，但富 集培养极可能会导致样品中微生物多样性的降低。通过设计根际箱系统获得根际土壤可 用于提取土壤总DNA，但仍然难以完全排除根毛对微生物基因组DNA的影响。而采用一种 以Nycodenz为介质的高速密度梯度离心法，来回收和纯化细菌细胞(Bertrand，et al., 2005，J Microbiol. ；Amalfitano，et al. ,2008, J Micobiol Meth.)则可获得高纯度的土 壤微生物DNA。这种“间接”的方法更适合提取未降解的DNA，因为细菌团处于Nycodenz介 质中从而限制了 DNA和土壤组分的接触，对于去除粘性土壤中腐植酸和金属离子等效果显 著。虽然操作难度和成本较高，但可以得到浓度和纯度很高，片段较大的基因组DNA，为后续的酶切操作和构建高质量的文库奠定了很好的基础。大豆作为一种重要的油料农作物，为我国食物的主要植物蛋白来源，同时又是具 高效“固氮作用”可用于改良土壤的植物。通过构建大豆根际微生物宏基组文库，有助于比 较完整地阐述根际微生物群落的多种特征。通过随机挑取克隆并进行序列测定，来鉴定和 表征根际范围内微生物所有存在的基因，从而了解不可培养微生物新的代谢途径、基因调 控因素、未知功能基因及对病原物具有抗性的基因等。因此通过构建根际土壤宏基因组文 库并对部分克隆进行测序，有助于明确根际微生物群落(包括固氮菌群)结构、遗传、功能 多样性，深入探讨其在改善土壤营养状况中的作用机制，对于完整揭示整个土壤微生物群 落的生态过程和功能具有重要的应用价值。
发明内容
本发明需要解决的问题是构建一个能够反映大豆根际微生物群落原位生态的宏 基因组文库及获得新的基因序列。(1)本发明的技术方案为通过高速密度梯度离心法获得纯净但代表原位状态 的根际微生物菌体细胞，提取基因组DNA后酶切回收2_8Kb的片段，与酶切并去磷酸化的 PUC19连接后，转化大肠杆菌DH5 α菌株并通过蓝白斑筛选，挑取阳性克隆组成一个含9504 个克隆的宏基因组文库。随机挑取4个阳性克隆并两端测序，经Blast比对证实SM-2为新
序列。
本发明所提供的宏基因组文库随机挑选的克隆SM-I的全序列，是具有SEQID Nol的cDNA序列
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本发明所提供的宏基因组文库随机挑选的克隆SM-2正向测序片段序列，是具有SEQID No2的DNA序列
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本发明所提供的宏基因组文库随机挑选的克隆SM-2反向测序片段序列，是具有SEQID No3的DNA序列
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5
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本发明所提供的宏基因组文库随机挑选的克隆SM-3正向测序片段序列，是具有SEQID No4的DNA序列
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本发明所提供的宏基因组文库随机挑选的克隆SM-3反向测序片段序列，是具有SEQID No5的DNA序列
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本发明所提供的宏基因组文库随机挑选的克隆SM-4反向测序片段序列，是具有SEQID No7的DNA序列
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所用的基因组DNA提取方法为细菌基因组DNA提取法，DNA和pUC19载体酶切时
使用的内切酶为I3St I，酶切后的DNA片段与载体连接时使用T4DNA Ligase0连接产物采 用CaC12转化法转化大肠杆菌DH5 α感受态细胞。(2)本发明与现有技术相比，其有益效果是我们通过根际箱系统，收集大豆根际土壤样本，使用高速密度梯度离心法分离、纯 化获得菌体细胞，从而得到大片段、高浓度、高纯度的基因组DNA。既能代表大豆根际微生物 群落的原位状态，又可无须纯化直接进行后续的酶切等分子生物学操作，并且能够有效排 除植物和微生物互作研究中植物根系残留物对微生物基因组的影响。从构建的文库中随机 挑取克隆进行两端测序后，经由生物信息学的方法证实存在未见报道过的新序列。因此，我 们构建的这个包含9504个阳性克隆的宏基因组文库存在新的微生物基因序列，对于从生 态基因组的角度阐述大豆根际微生物群落生态及其功能具有重要意义和应用价值。
图1用于获得大豆根际土壤样本的根际箱示意图(Α为大豆生长区，B为根际区，C 和D为水)图2高速密度梯度离心法回收得到的菌体细胞(Α为菌体细胞带)图3细菌基因组总DNA电泳4不同限制性内切酶酶切基因组DNA后效率比较电泳5基因组DNA酶切图谱图6与载体连接后的外源DNA转化宿主细胞后蓝白斑筛选图7阳性克隆保存图8克隆菌检与质量验证
具体实施例方式
8
实施例1、大豆根际土壤样本的获得与菌体回收通过在根际箱(图1)中定期取样，获得大豆根际土壤样本，置于-20°C冰箱备用。 利用高速密度梯度离心法回收菌体新鲜土壤样品加入焦磷酸钠缓冲液)，勻浆分散 土壤颗粒后低速离心(15°C，280g，aiiin)得到上清液，然后将上清液高速离心(IOOOOg)得 到菌泥沉淀。用0. 8%的氯化钠溶液重悬后，将Nycodenz (Axis-shied Poc, Oslo, Norway) 溶液(8g/10ml)加入离心管底部托起泥浆，使用甩平转子进行密度梯度离心G°C，14500g， 90min)。吸出白色的细胞层(菌体带)(图2)，用0. 8%的氯化钠溶液稀释后高速离心， 15000g,20min)获得菌体沉淀。密度梯度离心法操作难度较高，但可以有效排除根际样品中 根毛的影响，且为后续操作中得到高纯度的基因组DNA提供保证。利用该菌体提取纯化流 程获得的菌体最终得率在30%以上，且获得的菌体细胞在一定程度上代表了原始土壤中的 细菌群落结构多样性，并能直接用于较大片段DNA分离提取，无需再纯化。实施例2细菌基因组总DNA的提取与酶切按照细菌基因组DNA的提取方法，提取得到高纯度、高浓度，可直接用于后续酶 切操作的基因组总DNA( > 23Kb)(图3)。将得到的每份样品的DNA分别测定浓度后，等 量混合作为一份总基因组DNA样品进行后续操作。经稀释测定浓度后，建立60ul酶切体 % :10XBuffer6y L, Pst I 或 EcoR I 或 Hind III (TaKaRa Biotech. Co. , Ltd. , Dalian, 01土皿)3111^，模板0嫩33111^，灭菌水补齐到60 μ L。经实验证实，同等条件下酶切效率为 Pst I > EcoR I > Hind III (图4)，故使用使用I^st I酶切(图5)。回收目标片段范围 为2-8Kb，为了提高大片段酶连和转化效率，需要分开回收。一部分为2-5Kb，另一部分为 5-8Kb，分别回收纯化备用。实施例3酶切片段与载体连接及转化将使用Pst I 酶切后的 PUC19 载体(TaKaRa Biotech. Co.，Ltd.，Dalian, China) 去磷酸化后过Gel extraction kit中的纯化小柱(Omega Bio-Tek，USA)纯化，然后按比 例与酶切后的基因组DNA连接。酶连体系为=IOXiMDNALigase Buffer (TaKaRa Biotech. Co.，Ltd.，Dalian, China) 2 μ L, DNA 片段 12 μ L, pUC19 3 μ L, T4DNALigase 1 μ L,灭菌水补 平至20yL，16°C酶连过夜。实施例4挑取阳性克隆与菌检验证将含有约5ug外源DNA的连接产物，转化DH5 α高效感受态细胞(Tiangen， Beijing，China)。每管连接产物QOul)转化4管感受态细胞，复苏后每管菌液均勻分开涂 布2-3块直径12cm平板预先涂布X-Gal和IPTG(Amresco)。37°C培养12 16h后，蓝 白斑法筛选含有重组质粒的阳性克隆(图6)。共计转化30管感受态细胞，涂布约80块左 右平板，得到9504个阳性克隆(图7)。每板随机挑取5个克隆进行PCR菌检(图8)。完 整基因文库应包含的克隆数目，预测公式为Ν= 1η(1-ρ)/1η(1- ·)。实施例5阳性克隆测序与功能分析随机挑取阳性克隆两端测序，得到的序列(SEQ ID Nol,SEQ ID No2，SEQ ID No3， SEQID No4，SEQ ID No5，SEQ ID No6)去除两端引物后，进行BLAST-N鉴定分析。比对分析 表明，SM-2(SEQ ID No2)与已知序列同源性很低，为新序列。
权利要求
1.一种大豆根际土壤宏基因组文库，其特征是将提取的土壤微生物DNA进行酶切后获 得的2-81Λ的DNA片段连接入pUC19载体后转化大肠杆菌，通过蓝白斑筛选获得的9504个 阳性克隆。
2.根据权利要求1所述的大豆根际土壤宏基因组文库的构建方法，其特征是将土壤 样本勻浆并经Nycodenz介质高速密度梯度离心后，获得纯净的根际微生物菌体细胞，提取 DNA并酶切回收2-8Kb的目标片段，连接pUC19载体后转化大肠杆菌，通过蓝白斑筛选获得 阳性克隆。
3.根据权利要求1所述的大豆根际土壤宏基因组文库中的所有克隆在微生物资源开 发中的应用。
全文摘要
本发明属于环境微生物学技术领域，具体涉及大豆根际土壤宏基因组文库的构建及其应用，其特征包括根际土壤样本获得、菌体细胞回收、细菌基因组DNA提取、DNA酶切及与pUC19连接、转化大肠杆菌后蓝白斑筛选得到阳性克隆，及构建成含9504个阳性克隆的宏基因组文库，随机挑取克隆测序并进行生物信息学分析。该发明在明确根际微生物群落(包括固氮菌群)结构、遗传、功能多样性具有重要的意义，并为深入探讨其在改善土壤营养状况中的作用机制、开发利用大豆根际土壤中的不可培养微生物资源及深入揭示整个土壤微生物群落的生态过程和功能提供重要的信息，具有重要的应用价值。
文档编号C40B50/06GK102071471SQ20101061434
公开日2011年5月25日 申请日期2010年12月30日 优先权日2010年12月30日
发明者孔令如, 戚金亮, 李永春, 李爱倩, 杨永华, 杨统一, 汤程贻, 王焱, 黄惺祺 申请人:南京大学