专利名称：一种二羟基双加氧酶多个基因改良的家族改组技术体系的利记博彩app
技术领域：
本发明属微生物基因工程领域，具体涉及一种二羟基双加氧酶多个基因改良的家族改组技术体系，特别是涉及一种联苯/多氯联苯生物降解过程中的酶相关基因改良的基因体外定向分子进化技术体系，尤其是涉及该技术体系在二羟基双加氧酶体外定向改造中的应用，进而在联苯/多氯联苯生物降解中的应用。
背景技术：
基因的化学法全合成(Chemical DNA synthesis)是基因工程一种重要的改造手段，在过去的30年中，基因合成方法和技术的成熟使的基因合成的长度从上世纪80年代的小于11Λ，到目前能够合成长大321Λ的基因家族。目前基因的化学合成已经成功的应用在对基因的改造实现外源基因的不同宿主的高表达。目前基因化学合成主要是基于PCR方法建立的Xiong 等，2004，NucleicAcids Res，32，e98 :1-10 ；Xiong 等，Nature Protoc,2006, 1 :791-797 ；Xiong 等，2008，FEMS Microbiol Rev, 32 :522_540。体夕卜定向分子进化技术(Directed molecular evolution in vitro)是一种重要的基因和酶改造方法。随着PCR技术的发展和成熟，上世纪九十年代提出的DNA Shuffling 技术更趋成熟，应用更广泛，涉及的基因也更多。该技术将一组精密关联核酸序列随机片段化、片段经自配对PCR和重组装PCR延伸、最后组装成一个完整的全长核酸序列，此过程中引入了突变并进行了重组，实现核苷酸序列的体外迅速进化，从而改变或提高其编码蛋白的功能。使用此手段，短时间内即可在基因水平上大幅度地进化生物酶，使之适应于实际催化过程，为酶的改造和应用提供了开创性的机会。权威人士认为“定向进化”的方法，最终可能成为基因工程出现以来生物技术领域最重要的进步之一。目前体外定向分子进化已在农业、化学工业、基因治疗、疫苗、蛋白药物等方面取得瞩目的成果Stemmer，1994Nature 370,389-391 ；Sen 2007Applied Biochemistryand Biotechnology 143,212-223 ； Shivange 等，2009 Current Opinion in ChemicalBiology 13，19一25。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提供一种二羟基双加氧酶多个基因改良的家族改组技术体系，具体是提供一种通过基因体外定向分子进化的技术体系，以克服现有二羟基双加氧酶改造技术中的利用单一基因进行改组导致的突变率低、突变潜力小、获得目标形状难度大等不足。本发明通过相关二羟基双加氧酶基因的设计合成，进行家族改组进化， 筛选获得高活性等性状改变的二羟基双加氧酶突变个体。为了达到以上目的，本发明采用以下技术方案来实现。所述的二羟基双加氧酶多个基因改良的家族改组技术体系，具体包括以下步骤1、设计并合成四个二羟基双加氧酶基因采用PTDS方法(PCR-based two-step DNA synthesis)设计并合成4个不同种类的二羟基双加氧酶基因，分别为PSBPHCI序列(如SEQ ID No 1所示)、RRBPHCI序列(如SEQ ID No 2 所示)、MTBPHCI 序列(如 SEQ ID No 3 所示)和 BSBPHCI 序列(如 SEQ ID No 4 所示)。合成方法参考Xiong，aisheng 等，2004，Nucl Acids Res 32，e98。2、二羟基双加氧酶多个基因改良的家族改组突变技术体系本步骤通过二羟基双加氧酶家族改组突变过程获得二羟基双加氧酶家族改组突变片段的突变体库。二羟基双加氧酶家族改组突变过程包括(1)四个二羟基双加氧酶基因片段的扩增，⑵四个二羟基双加氧酶基因片段PCR产物等比例混合后用DNA酶降解得到小片段，(3)小片段进行无引物的PCR扩增以及(4)取无引物PCR产物为模板进行引物 PCR扩增。其详细过程具体如下(1)四个二羟基双加氧酶基因片段的扩增根据全合成的二羟基双加氧酶基因核苷酸序列，首先合成八个寡核苷酸引物， 分别为PSBPHCI-1序列如SEQ ID No 5所示，PSBPHCI-23序列如SEQ ID No 6所示； RRBPHCI-1 序列如 SEQ ID No 7 所示，RRBPHCI-22 序列如 SEQ ID No 8 所示，MTBPHCI-1 序列如 SEQ ID No 9 所示，MTBPHCI-23 序列如 SEQ ID No 10 所示，BSBPHCI-1 序列如 SEQ ID No 11所示，BSBPHCI-M序列如SEQ ID No 12所示。然后分别以上述四个合成的二羟基双加氧酶基因为模板，分别采用上述8根引物进行扩增，得到长度为909bp、900bp、915bp和 960bp的四个二羟基双加氧酶基因的扩增产物。(2)回收上述四个二羟基双加氧酶扩增产物，回收的四个二羟基双加氧酶基因的 DNA片段等比例混合后用DNA酶进行降解，形成长度为30-200bp的弥散扩增条带小片段，通过透析袋回收50-100bp的小片段。(3)将上述通过透析袋回收产物进行无引物PCR扩增，形成200_400bp的弥散条
市ο(4)以上述无引物扩增产物为模板，加入引物PSBPHCI-1(序列如SEQID No 5所示)和PSBPHCI-23(序列如SEQ ID No 6所示)进行PCR扩增，其扩增产物即为二羟基双
加氧酶家族改组突变库。本发明的二羟基双加氧酶多个基因改良的家族改组技术体系可应用于该二羟基双加氧酶基因进化体系改造中，还可以用于联苯或多氯联苯生物降解。本发明的有益效果本发明公开了一种通过多个相关二羟基双加氧酶基因的合成并结合体外定向分子进化相结合的二羟基双加氧酶改造体系。该体系中设计并合成四个不同种类的二羟基双加氧酶基因，多个基因参与的家族改组，能够获得比单个基因改组突变更大的突变潜力。
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明作进一步阐述，但实施例并不限制本发明的保护范围。下述实施例中，所用的试验材料及其来源包括1细菌菌株和质粒大肠杆菌DH5 α (Ε. Coli DH5 α )(购自宝生物工程大连有限公司)由上海市农业科学院生物技术研究所植物基因工程研究室保存；克隆载体PMD18-T购自宝生物工程大连有限公司。2化学试剂和酶制剂各类限制性内切酶、Taq聚合酶、连接酶、dNTP、X-Gal、CN 102383199 A
说明书
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10XPCR buffer和DNA marker购自宝生物工程大连有限公司。所有的化学试剂都从美国西格玛化学公司和上海国药化学试剂购买。3引物合成本发明涉及的引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。本发明涉及的分子生物学实验若没有特殊说明，均参考《分子克隆》一书 [Sambrook J,Frets E F,Mannsdes T et al. In :Molecular Cloning. 2nd ed. ColdSpring Harbor Laboratory Press, 1989].该书及其后续出版版本是本领域技术人员在进行与分子生物学相关的实验操作时最常用的具有指导性的参考书籍。实施例1 :PTDS方法合成二羟基双加氧酶基因PSBPHCI(一 )试验方法1、本发明基因合成采取 PTDS 方法Xiong，aisheng 等，2004，Nucl AcidsRes 32， e98，共设计23根引物用于基因的合成，参见表1。扩增片段1 在50 μ 1反应体系中，内侧引物(PSBPHCI2-PSBPHCI11)的添加量为 1. 5pmol，外侧引物(PSBPHCI 1，PSBPHCI 12)添加量为 30pmol，扩增条件为:94°C预热 IOmin ； 94°C，30s ；52°C, 30s ；72°C, 30s ；30 个循环；最后 72°C延伸 lOmin。使用的 iTaq DNA 聚合酶 Spyrobest taq酶(Takara公司大连)扩增目的基因。扩增片段2 在50 μ 1反应体系中，内侧引物(PSBPHCI 14-PSBPHCI22)的添加量为1.5pmol，外侧引物(PSBPHCI 13, PSBPHCI23)添加量为30pmol，扩增条件为94°C预热 IOmin ;94°C，30s ;52°C，30s ;72°C，30s ;30 个循环；最后 72°C延伸 IOmin0 使用的 Taq DNA 聚合酶为pyrobest taq酶(Takara公司大连)扩增目的基因。全长基因的扩增在50μ 1反应体系中，扩增片段1和扩增片段2分别加入lOOng， 最外侧引物(PSBPHCI 1，PSBPHCI23)添加量为30pmol。扩增条件为94°C预热IOmin -MV, 30s ；52°C,30s ；72°C,lmin 30s ；30 个循环；最后 72°C延伸 IOmin。使用的 Taq DNA 聚合酶为KOD FX taq酶(Toyobo公司日本)扩增目的基因。 PCR结束后，1 %琼脂糖胶回收，取10 μ L直接与Τ/Α克隆载体相连(大连宝生物公司)。4°C连接过夜，高效转化DH5ci感受态中。获得阳性克隆。鉴定正确的阳性克隆即为本发明的二羟基联苯双加氧酶基因，命名为PSBPHCI基因，并对其进行测序，_20°C保存待用。( 二)试验结果其DNA序列测定分析结果表明本发明设计并合成的密码子偏爱优化二羟基联苯双加氧酶PSBPHCI基因开放阅读框为909bp (参见SEQ ID No 1)。表 1
权利要求
1.一种二羟基双加氧酶多个基因改良的家族改组技术体系，其特征在于，包括以下步骤1)采用PTDS方法设计并合成四个二羟基双加氧酶基因，分别为PSBPHCI基因、序列如 SEQ ID No 1所示，RRBPHCI基因、序列如SEQ ID No2所示，MTBPHCI基因、序列如SEQ ID No 3所示，以及BSBPHCI基因、序列如SEQ ID No 4所示；2)分别以上述四个二羟基双加氧酶基因为模板，加入引物进行PCR扩增；3)回收上述四个二羟基双加氧酶基因的PCR扩增产物，等比例混合后，用DNA酶降解为小片段基因，并通过透析袋回收其中的部分小片段基因；4)对上述通过透析袋回收的部分小片段基因进行无引物PCR扩增；5)以上述无引物扩增产物为模板进行PCR扩增，所获得的扩增产物即为二羟基双加氧酶家族改组突变体库。
2.根据权利要求1所述的二羟基双加氧酶多个基因改良的家族改组技术体系，其特征在于，所述步骤2)中的四个二羟基双加氧酶基因的引物分别为PSBPHCI-1、序列如SEQ ID No 5 所示，PSBPHCI-23、序列如 SEQ ID No 6 所示；RRBPHCI-1、序列如 SEQ ID No 7 所示， RRBPHCI-22、序列如 SEQ IDNo 8 所示；MTBPHCI-1、序列如 SEQ ID No 9 所示，MTBPHCI-23、 序列如 SEQ ID No 10所示；BSBPHCI-1、序列如 SEQ ID No 11 所示，BSBPHCI-24、序列如 SEQ ID No 12 所示。
3.根据权利要求1所述的二羟基双加氧酶多个基因改良的家族改组技术体系，其特征在于，所述步骤3)DNA酶降解为30-200bp的小片段基因，通过透析袋回收50_100bp的小片段基因。
4.根据权利要求1所述的二羟基双加氧酶多个基因改良的家族改组技术体系，其特征在于，所述步骤4)无引物PCR扩增形成200-400bp的小片段基因。
5.根据权利要求1所述的二羟基双加氧酶多个基因改良的家族改组技术体系，其特征在于，所述步骤5)中的PCR扩增引物为PSBPHCI-1和PSBPHCI-23，序列分别如SEQ ID No 5 和 SEQ ID No 6 所示。
6.权利要求1所述的二羟基双加氧酶多个基因改良的家族改组技术体系在该二羟基双加氧酶基因进化体系改造中的应用。
7.权利要求1所述的二羟基双加氧酶多个基因改良的家族改组技术体系在联苯或多氯联苯生物降解中的应用。
全文摘要
本发明涉及一种二羟基双加氧酶多个基因改良的家族改组技术体系。即首先设计并合成四个不同种类的二羟基双加氧酶基因，通过基因家族改组及高通量的筛选体系，即获得高活性等性状改变的二羟基双加氧酶突变个体。由于二羟基双加氧酶是联苯/多氯联苯生物降解中的一个关键酶，因此本发明获得的活性提高的二羟基双加氧酶可用于提高生物降解联苯/多氯联苯的效率，减少环境污染，具有较大的生态效益。
文档编号C40B50/06GK102383199SQ20101027114
公开日2012年3月21日 申请日期2010年8月31日 优先权日2010年8月31日
发明者付晓燕, 姚泉洪, 帅建军, 彭日荷, 朱波, 熊爱生, 田永生, 许晶, 赵伟, 金晓芬, 陈晨, 韩红娟 申请人:上海市农业科学院