专利名称：：一种检测海水中病原菌污染的寡核苷酸微阵列技术的利记博彩app
技术领域：
：本发明属于海水污染监测领域，主要内容是一种寡核苷酸微阵列技术，能够高通量地监测海水中病原细菌污染情况。能够同时检测多种致病细菌，包括河流弧菌，副溶血弧菌，溶藻弧菌，霍乱弧菌，拟态弧菌，弗尼斯弧菌，哈维弧菌，创伤弧菌，粪肠球菌，李斯特菌，铜绿假单胞菌，沙门氏菌，金黄色葡萄球菌，产气荚膜梭菌。并且这种微阵列技术能够不通过富集培养，直接从海水中检测多种指标菌，包括不能被人工培养的细菌，而不受季节的影响。除了能够评估相应海域的病原菌的污染程度，还能指示该海域是否受到生活废水污染等。
背景技术：
：海洋的病原菌污染和其他污染相比，比较隐蔽，但是却直接威胁到沿岸居民的健康。并且海水病原菌污染的致病细菌种类的分布特点能够直接反映海水受到生活污水、城市污水的污染情况。检测海水中致病细菌的分布状况具有多重意义。海水中污染病原菌种类多样，陆地上的一些致病细菌经过地表径流最终汇入海水中，因此各种能够导致人类疾病的病原菌都有可能在海水中存在。此外海水中本身自然生存有丰富的病原菌，其中许多病原菌能够感染人类。这些特点要求海洋病原菌的监测提供尽可能全面和有代表性的检测信息。DNA微阵列检测技术能同时检测多个病原菌指标，并且可以按照需求对检测信息进行细化。这一优点正好满足海水致病菌污染监测的要求。此外，DNA微阵列技术在DNA分子水平检测，还具有反应灵敏，操作简单，耗时短，准确性高，易于推广等特点。由于使用过滤富集，因此不需培养增菌。该技术还能检出不能人工培养的苛刻性菌和死菌，大大提高阳性率。鉴于这些优点，DNA微阵列技术能够作为开发海水病原菌检测的良好技术平台。目前，全面检测海水中的污染病原菌的报道不多，大多数只能够检测有限的少数种病原菌。比如多重PCR技术。但是检测两三种菌病不能有效地给出海水病原菌的整体污染状况。并且多数已报道的海水检测技术并不是以评估海水污染状况为目的。而DNA微阵列技术能够很好地克服这些缺点。
发明内容本发明的目的是提供一种综合监测海水中多种病原菌及污染指标菌的寡核苷酸微阵列技术。该微阵列技术以16S-23SrRNA基因转录间区序列作为检测耙点，通过一次聚合酶链式反应扩增，并同时获得地高辛标记，然后进行寡核苷酸杂交；通过酶标抗体催化底物显色，判读获得监测结果。检测信息丰富详尽，具有高通量的特点。并且检测不需要通过目标菌培养富集，能够在较短的时间内快速得到检测结果。本发明是通过以下技术方案实现的一种检测海水中病原菌污染的寡核苷酸微阵列技术的43条探针序列如下<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>本发明中寡核苷酸微阵列技术使用方法如下:(1)寡核苷酸微阵列制作1)制备探针稀释液IX鲑鱼精DNA溶液(Ig/L)2)制备探针溶液用探针稀释液配置成0.1ug/nL探针溶液3)把探针溶液点于5cmX5cm尼龙膜基质上，80。C保温2小时。探针点样顺序如下表<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>(2)海水样本处理和DNA提取1)样本处理①取表层海水20L，分装于灭菌处理的塑料桶中。取得的海水在3h内进行处理。②先用0.15毫米孔径筛子过滤除去悬浮物质，然后用Mini-pelliconsystem(Millipore，美国)进行加压过滤收集菌体，滤膜孔径为0.22um(Milipo，美国)。每过滤2L海水对应一张滤膜，即每2L海水作为一个样本，每个采样点对应10个平行样本。③用无菌水将滤膜上的菌体冲洗下来，并立即用10000r/min离心5min收集菌体。收获的菌体和杂质沉淀用于DNA抽提。2)DNA提取①海水菌体过滤得到样本的菌体和泥沙悬浊液12000r/min离心2min。②沉淀物加入550uL的TE缓冲液(10mMTrisHC1，lmMEDTA;pH8.0)，反复吹打使之重新悬浮，加入30nL10。/。SDS和15uL的蛋白酶K，混匀，37'C温育lh.③加入100iiL5mol/LNaCl'混匀，再加入80yLCTAB/NaCl溶液(5gCTAB溶于100mL0.5MNaCl溶液中)，混匀，65'C温育10min。加入等体积的酚/氯仿/异戊醇充分混匀，离心4-5ndn,将上清转入一只新管中，加入0.6-0.8倍体积的异丙醇，轻柔颠倒混匀，-2(TC放置20min。⑤沉淀用lmL的70。/。乙醇洗涤，倒置干燥，重溶于50nLTE缓冲液。⑥DNA样品煮沸5分钟然后在冰上淬火。-2(TC保存备用。(3)聚合酶链式反应和地高辛标记1)扩增和标记体系试剂IOX聚合酶链式反应BufferF-E-TB-E-Td,体系中各组分终浓度和体积(yL)5.0uL10umol/L(4.OnL)10yraol/L(4.OpL)10mmol/L(0.3iiL)Digoxigenin-l1-dUTP25nmol/L(0.3tiL)DNA模板5.0jxLTaqDNAPolymerase5U/uL(0.3yL)双蒸水31.1u1.总计50.OnLIOX聚合酶链式反应Buffer:Tris-HC1pH8.5，100mmol/L;KC1，500ranol/L;MgCl2，15mmol/L。2)聚合酶链式反应程序①预变性阶段95'C5min②第一循环阶段(5个循环)94°C30sec54。C30sec72。C50sec③第二循环阶段(5个循环)94°C30sec56'C30sec72。C40sec④第三循环阶段(IO个循环)94°C30sec58°C30sec72。C40sec⑤第三循环阶段(15个循环)94°C30sec62。C40sec⑥结束阶段72。C5min4°C保温(4)杂交检测过程杂交反应使用美国Roch公司地高辛检测试剂盒。1)每个寡核苷酸微阵列浸入600yL杂交液(Roch公司)中50。C预杂交45min。2)将地高辛标记的PCR扩增产物95'C变性10min然后淬火。3)将50uL变性的PCR产物加入到600yL新换的杂交液(Roch公司)中，加入预杂交完的尼龙膜5(TC晃动杂交1小时。4)杂交完成后将膜冷却，室温下分别用2XSSC(+0.1%SDS)，0.5XSSC(+0.1%SDS)和洗涤缓冲液(Roch公司)按顺序各洗涤2min，5)用封闭液封闭30min,加入酶联抗-地高辛抗体结合30min。6)用洗涤缓冲液洗涤15minX2次。用检测缓冲液(Roch公司)平衡5min，加入含色原底物的显色液避光显色2小时后观察结果。20XSSC:175.3gNaCl和88.2g柠檬酸钠，溶于800mL水，加入NaOH调节pH至7.0，定容1L。2XSSC:将20XSSC用水稀释10倍。0.5XSSC:将20XSSC用水稀释40倍。本发明的一种检测海水中病原菌污染的寡核苷酸微阵列技术还可以在检测其它海水水域病原菌污染中的应用。本发明与现有技术相比的优点在于运用微阵列技术检测获得众多致病菌和污染指标菌的分布状况，即具有高通量的优点；能够直接利用海水作为样本，在保持海水中菌群数目天然比例的情况下真实地获得目标菌的污染状况信息，而现有的检测技术大多数需要富集培养的步骤，不仅破坏了菌群组成的原始比例，由于苛刻性菌不被人工培养，结果的可靠程度也较低，并且检测流程较长；寡核苷酸微阵列技术检测操作流程短，特异性高，比较准确，灵敏，快速。图l:海水样本l检测结果具体实施例方式下面结合附图与具体实施方式对本发明作进一步详细描述。实施例l:海水样本l1寡核苷酸微阵列制作1)制备探针稀释液IX鲑鱼精DNA溶液(Ig/L)2)制备探针溶液用探针稀释液配置成0.1llg/pL探针溶液3)固定探针于尼龙膜基质上把探针溶液点于5cmX5cm尼龙膜基质上，8(TC保温2小时。2海水样本处理和DNA提取1)样本处理①取表层海水20L,分装于灭菌处理的塑料桶中。②先用0.15mm孔径筛子过滤除去悬浮物质，然后用Mini-pelliconsystem(Millipore，美国)进行加压过滤收集菌体，滤膜孔径为0.22ym(Milipo，美国)。每过滤2L海水对应一张滤膜，即每2L海水作为一个样本，每个采样点对应10个平行样本。③用无菌水将滤膜上的菌体冲洗下來，并立即用10000r/min离心5min收集菌体。收获的菌体和杂质沉淀用于DNA抽提。2)DNA提取①海水菌体过滤得到样本的菌体和泥沙悬浊液12000r/min离心2min。②沉淀物加入550yL的TE缓冲液(10mMTris'HCl，lraMEDTA;pH8.0)，反复吹打使之重新悬浮，加入30uL10y。SDS和15uL的蛋白酶K，混匀，37。C温育lh.③加入100uL5mol/LNaCl，混匀，再加入80uLCTAB/NaCl溶液(5gCTAB溶于lOOmLO.5mol/LNaCl溶液中)，混匀，65。C温育10min。加入等体积的酚/氯仿/异戊醇充分混匀，离心4-5min,将上清转入一只新管中，加入0.6-0.8倍体积的异丙醇，轻柔颠倒混匀，-2(TC放置20min。沉淀用ltnL的70%乙醇洗涤，倒置干燥，重溶于50uLTE缓冲液。DNA样品煮沸5分钟然后在冰上淬火3聚合酶链式反应和地高辛标记1)扩增和标记体系试剂IOX聚合酶链式反应BufferF-E-TB-E-TdNTPDigoxigenin_ll-dUTPDNA模板TaqDNAPolymerase双蒸水总计IOX聚合酶链式反应BufferMgCl2，15mmol/L。2)聚合酶链式反应程序①预变性阶段-循环阶段(5个循环)-2(TC保存备用,体系中各组分终浓度和体积(uL)5.OnLlOtimol/L(4.OnU10pmol/L(4.OnL)10mmol/L(0.3uL)25画1/L(0.3uL)5.OnL5U"L(0.3wL)31.1pL50.OnLTris-HClpH8.5，10Ommol/L;KC1，500mraol/L;③第二循环阶段(5个循环)④第三循环阶段(IO个循环):⑤第三循环阶段U5个循环)⑥结束阶段:95°C5min94°C30sec54°C30sec72°C50sec94°C30sec56。C30sec72°C40sec94°C30sec58°C30sec72°C40sec94°C30sec62°C40sec72°C5min4°C保温4杂交检测过程杂交反应使用美国Roch公司地高辛检测试剂盒。1)每个寡核苷酸微阵列浸入600yL杂交液(Roch公司)中50'C预杂交45min。2)将地高辛标记的PCR扩增产物95'C变性10min然后淬火。3)将50yL变性的PCR产物加入到600wL新换的杂交液(Roch公司)中，加入预杂交;的尼龙膜5(TC晃动杂交1小时。4)杂交完成后将膜冷却，室温下分别用2XSSC(+0.1%SDS)，0.5XSSC(+0.WSDS)和洗涤缓冲液(Roch公司)按顺序各洗涤2min，5)用封闭液封闭30min，加入酶联抗-地高辛抗体结合30min。6)用洗涤缓冲液洗涤15minX2次。用检测缓冲液(Roch公司)平衡5min，加入含色原底物的显色液避光显色2小时后观察结果。结果见附图。附图海水样本l检测结果附图中方格内显现出圆点的表示阳性结果，未显色的表示阴性结果。其中1行9列^~一阳性对照，]行3列的探针是Vfu710b，表示检测出了弗尼斯弧菌；l行6列的探针是Sal-l，6行7列的探针是Sal-2，5行7列的探针是Sal-3，表示检测出了沙门氏菌；2行1列的探针是Vpiapro，4行2列的探针是Vp-nl，表示检测出了副溶血弧菌；4行6列的探针是PSE-1，2行6列的探针是PSE-3，表示检测出了铜绿假单胞菌；4行3列的探针是Mchar，表示检测出了霍乱弧菌；5行4列的探针是Vh710b，表示检测出了哈维弧菌。序列列表SEQUENCELISTING<110>南开大学<120〉一种检测海水中病原菌污染的寡核苷酸微阵列技术<130〉20090622<160>43<170>Patentlnversion3.5<210>1<211>26<212>DM<213>人工合成〈220〉<221>misc—feature<222>(1)..(26)<400>1catc肪t肪tateitgtgtgeigeicgta26<210〉2<211〉26<212〉DNA<213>人工合成<220><221>misc_feature<222>(1)..(26)<400〉2tcaatcagtatgctacgatagcaacc26〈210〉3<211>26〈212〉DNA<213〉人工合成<220〉<221〉misc_feature<222>(1)..(26)〈400〉3gcatgcteitggatgcatactgattca26<210>4<211>28<212〉DNA<213〉人工合成<220〉<221〉misc_feature<222〉(1)..(28)<400>4tatcgtaggtacagatcactaactctca28<210>5<211>26<212〉腿<213〉人工合成<220><221〉misc—feature<222〉(1).(26)<400〉5gactctccatcttgtataataatagc26<210〉6<211〉26<212〉DNA<213〉人工合成<220〉<221>misc—feature<222>(1)..(26)<400〉6ttattatgctgtatgtcatatagtca26<210〉7<211>22<212〉DNA<213〉人工合成<220><221〉misc_feature<222>(1).(22)<400〉7ttaatcacatacacgaatataa22<210>8<211〉27<212>DNA〈213〉人工合成<220〉<221〉miscfeature<222>(1)..(27)<400>8gcttactacataagaagtgataa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种检测海水中病原菌污染的寡核苷酸微阵列技术，属于海水污染监测领域，主要技术方案是以16S-23SrRNA基因转录间区序列作为检测靶点，通过一次聚合酶链式反应扩增，并同时获得地高辛标记，然后进行寡核苷酸杂交；通过酶标抗体催化底物显色，判读获得监测结果。与传统检测海水污染的产品相比，运用微阵列检测获得众多致病菌和污染指标菌的分布状况，即具有高通量的优点；能够直接利用海水作为样本，在保持海水中菌群数目天然比例的情况下真实地获得目标菌的污染状况信息，而现有的检测技术大多数需要富集培养的步骤，不仅破坏了菌群组成的原始比例，结果的可靠程度也较低，并且检测流程较长；寡核苷酸微阵列检测操作流程短，比较灵敏，快速。文档编号C40B40/06GK101580877SQ20091006942公开日2009年11月18日申请日期2009年6月24日优先权日2009年6月24日发明者谦孙,李永君,田雪莹,许晶晶,黄熙泰申请人:南开大学