专利名称：：一种复合浸矿菌群及其在生物冶金中的应用的利记博彩app
技术领域：
：本发明涉及一种复合浸矿菌群及其应用。
背景技术：
：难处理金矿石中由于金被硫化矿物所包裹，从而呈现显微或次显微状态，采用传统的回收工艺处理，不但生产成本较高，能耗高，对环境污染重，而且回收率偏低。生物冶金技术利用嗜酸性微生物的作用克服上述弊病，嗜酸性菌种类繁多，可分为铁氧化菌和硫氧化菌，大多时候他们都是混合作用于硫化矿物，他们最适pH范围在1.5-2.0之间，而不同菌种又有各自不同的温度适应范围，在生物冶金过程中由于细菌氧化硫化矿物是放热反应，所以反应器内的温度往往高外界温度，但是仍然受到外界温度的较大影响，因此通常需要外加控温措施来保证菌群能够正常地工作，在温度随季节变化不大的地区，控温措施易于实施，控温成本也较低。在温度随季节变化而有较大变化的地区，为菌群保持一个恒定的温度难度较大，成本也较高，因此能够在较宽温度范围内进行正常工作的菌群更贴近现实，更具有实际意义。同时在反应器内由于机械搅拌对浸矿微生物产生较强的剪切力，为微生物的生长繁殖带来不利影响。此外硫化矿物中的砷在菌群的浸矿过程中起抑制作用，能够耐受较高砷离子浓度的菌群更具有应用活力。目前大多细菌浸出过程都试图在较宽的温度范围，较强的剪切力，较高的毒性离子浓度环境下进行。筛选分离能够在较宽温度范围，较强剪切力，较高毒性离子浓度条件下具有高氧化效率的冶金菌具有极大的应用前景。
发明内容本发明提供一种复合浸矿菌群及其在生物冶金中的应用，是在较宽的温度范围、较强的剪切力作用、较高的毒性离子、较低的pH值条件下，具有高氧化活性的复合浸矿菌群，它应用在生物冶金中。在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏号为CGMCCNo.2395，保藏日期2008.3.10。复合浸矿菌群硫杆菌属与钩端螺旋菌属。本发明的复合浸矿菌群中含有嗜铁钩端螺旋菌(Leptospirillumferriphilum)，嗜^!;氧^七硫硫4七杆菌(Sulfobacillusthermosulfidooxidans)，嗜热嗜酸硫杆菌(Acidithiobacilluscaldus)，及古生菌铁原体嗜酸菌(Ferrap/asmaac/d^//um)。嗜铁钩端螺旋菌的16SrRNA基因序列如SequenceNO.1所述，嗜热嗜酸硫杆菌的16SrRNA基因序列如SequenceNO.2所述，嗜热氧化硫硫化杆菌的16SrRNA基因序列如SequenceNO.3所述，铁原体嗜酸菌的16SrRNA基因序列如SequenceNO.4所述。这些菌交互作用于矿石，在复合菌群的生物浸矿中产生重要作用。本发明的复合菌群在30°C-52nC的温度范围内具有较强的氧化活性，工作pH在0.8-2.25之间，砷离子耐受度在0-20g/L。本发明的复合浸矿菌群在生物冶金工业中的应用；该菌群用于氧化Fe"和硫化矿物，是将二价铁化合物氧化为可溶性三价铁，将低价硫化合物氧化为可溶性硫酸盐；其中的硫化矿石包含黄铁矿、毒砂、斜方砷铁矿及黄铜矿和硫砷铜矿。本发明的复合浸矿菌群用于提取和回收金或铜。本发明的复合菌群既可用于金矿石的生物浸出，同时也可用于铜矿的生物浸出；该复合菌群具有良好的铁和硫氧化活性，可以在F,和S2—的氧化中得到应用。并具有强浸矿能力，可以用于含硫化物矿石的生物浸出。由于其具有较宽的温度适应范围，可在30°C-52°C温度范围内保持高氧化活性，为企业由于季节温度变化所进行的温度调控节约了较大成本。本发明的复合菌群可在较强的剪切力作用下保持较高的氧化活性，使生物浸出的效率更高。因浸矿复合菌群的砷离子耐受能力可达20g/L，在此种砷离子浓度下浸矿复合菌群仍保持强的氧化活性，拓宽了复合菌群的矿石处理范围。还能在较低的pH值条件下保持较高氧化活性，其最低工作pH值可达到0.8。本发明优点是通过菌种的富集培养、分离纯化后经过长期定向驯化等步骤筛选出一种具有高氧化活性的浸矿复合菌群，该复合菌群可在较宽的温度范围，较强的剪切力作用，较高的毒性离子、较低的pH值条件下保持较高氧化活性。本发明的菌群含有球状菌、螺旋菌和弧状菌，此混合菌群既能高效氧化Fe2+，又能高效氧化硫化物产生硫酸和硫酸盐，菌群中含有专性化能自养菌同时又包含兼性自养菌，各菌种混合作用于矿物，其对矿物的氧化速度远远快于中温氧化亚铁硫杆菌，菌群对矿物中的砷有较强的耐受能力，在砷离子浓度较高的情况下(20g/l以下)仍具有较强的氧化活性，大大的拓宽了生物冶金在金矿中的应用范围，同时由于其具有较宽的的温度适应范围，这样既提高了氧化速度又降低了生产成本，因此本发明的混合菌群在生物冶金工业中将会有重要的应用前景。图1是不同培养基于Fe3+浓度关系曲线；图2是不同pH值于Fe3+浓度关系曲线；图3是菌群在不同温度下Fe"农度与氧化时间关系曲线；图4是生物氧化液中三价砷含量的变化曲线；图5是氧化液全砷中三价砷所占百分比的变化曲线；图6是生物氧化过程中氧化液中F^+含量的变化曲线；图7是生物氧化过程中氧化液中F^+含量的变化曲线；图8是复合菌群工业实施实例2中，铜矿直接浸出和生物浸出对比。图9是复合菌群工业实施实例3中，铜矿直接浸出和生物浸出对比。具体实施例方式研究复合菌群的工作特性时的培养基以9K培养基为基础，经改进配制成3L、6L、9L培养基营养物质。下属各实施例中的培养方法为小型氧化槽搅拌培养的方法，所应用的检测分析方法为，细菌生长繁殖氧化？62+过程中，其中溶液中可溶性铁(Fe"和Fe3+)浓度的分析采用重铬酸钾容量法分析，A,浓度采用甲基橙--溴酸钾测定，TAs采用次磷酸钠还原一-碘量法测定，菌群生长的pH值以及氧化过程中产生的硫酸用pH计测定，氧化过程中的氧化还原电位利用电位计测定。1.菌群生长所需培养基菌群的生长繁殖需要有培养基来进行营养物质的补充，本发明菌群的培养基以9K培养基为基础，经改进配制成3L、6L、9L培养基营养物质。用四种培养基在同一条件下进行细菌繁殖，同时考察其氧化F,的速度，绘制不同培养基与Fe3+浓度关系曲线。如图l。图1曲线表明，菌群在3L-6L培养基中繁殖速度快，氧化Fe"的能力较强。2.菌群的制备本发明的复合菌群是由试验人员从云南一矿区采集的酸性废水中筛选而来，首先将采集的酸性废水中加入无菌的改制9K培养基，37"C恒温振荡培养箱振荡培养，对其进行富集培养，一段时间之后，镜下观察有大量运动细菌存在，然后对其进行矿物的适应性培养，待菌群在矿物中能够进行生长之后，对其进行矿物浓度梯度试验，逐步提高菌群工作的矿浆浓度，最后经过长时间的矿物定向驯化之后进行工业应用。3.菌群的鉴定方法采用16SrDNA库的建立及序列分析的方法a.总DNA的提取参考Laurent的方法(Laurentetal，2001)。样品在4T冰箱静置过夜后，将上清12000rpm离心收集，得到菌体和原矿颗粒的混合物。称取1g此混合物、0.6g玻璃珠(直径465-600iLim，Sigma公司)到4mL的离心管中，加入1.0mL的溶液A[IOOmMTris(pH8.0),100mMEDTA,100mMNaCl],100pL的10%的PVP(polyvinylpyrrolidone),200nL的20%的SDS。在振荡器上强烈振荡5-10min，12000rpm离心1min，将上清转移到干净的离心管中。加1/10体积预冷的乙酸钠(5M)，冰上放置10min后，12000rpm离心5min，再将上清转移到干净离心管中，加入lmL预冷的异丙醇，混匀并室温放置5min，12000rpm离心5min。小心将上清丢弃，用70°/。预冷的乙醇洗沉淀，12000rpm离心2min后，弃上清，将离心管放置37。C干燥10-15min，加入30|aLTERbuffer(10mMTris-HCl，1mMEDTA,100ng/mLRNaseA)，取3|uL样品电泳检验，剩余的DNA放置4。C保存。b.PCR扩增16SrDNA及建库用于扩增细菌16SrDNA的引物为一对通用引物(Devereuxetal,1995)，分别对应大肠杆菌16SrDNA的8-27bp和1495-1514bp，为BPf:5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG陽3'禾卩BPr:5'陽ACGGCTACCTTGTTACGACT-3'。PCR反应体系(50|LiL)为10xbuffer5ILiL，25mMMgCl24pL，10mMdNTPs1pL，25pM引物各1|^L,BSA0.5|iL，ddH2037^L,DNA聚合酶0.4|iL。PCR反应条件为94°C4min;95°C40s，48°C40s，72°Clmin，30个循环;72。C10min。用于扩增古菌16SrDNA的引物为一对通用引物(Bejaetal,2002andCytrynetal,2000)，分别为Ar20-F:5'陽TTCCGGTTGATCCYGCCRG-3，禾卩Ar958R:5，-YCCGGCGTTGAMTCCAATT-3，。反应体系与扩增细菌16SrDNA的体系相同，反应条件也相同，只是退火温度为55。C，延伸时间为45s。PCR扩增产物柱纯化(鼎国PCR产物纯化试剂盒)后，与T-vecter(T-easy，Promega公司)连接并电转化到大肠杆菌JM109中，氨节平板蓝白斑筛选阳性克隆，每个平板随即挑选10个阳性克隆，液体培养提取质粒，五coRI酶切检验建库质量并考察文库的深度。c.测序及序列分析16SrDNA文库送到北京华大基因组中心，以T-easy上的SSP6和T7为测序引物进行测序，得到的序列数据在网上进行序列比对Blastn(http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)，记录序列的相似性和相似菌的名称。嗜铁钩端螺旋菌的16SrRNA基因序列如SequenceNO.1所述，嗜热嗜酸硫杆菌的16SrRNA基因序列如SequenceNO.2所述，嗜热氧化硫硫化杆菌的16SrRNA基因序列如SequenceNO.3所述，铁原体嗜酸菌的16SrRNA基因序列如SequenceNO.4所述。4.细菌生长的适宜pH值将细菌在不同的pH值条件下进行培养，绘制出不同的pH值与Fe3+浓度关系曲线，见图2。由图2可见，浸矿菌群在培养过程中随着pH值的提高，在一定的范围内(pH值0.8-2.25)菌群对氧化Fe2+程度逐渐加强，Fe"浓度逐渐增大，当pH值升高到2.25之后，F,浓度呈现下降趋势，说明有部分三价铁沉淀，均群的氧化活性开始减弱，因此菌群的适宜工作pH值范围为1.5-2.25。在此范围内菌群的氧化活性较强，对硫化矿物氧化效果较好。5.菌群工作的环境温度将菌群分别在25、30、35、40、45、50(°C)环境下培养，定时监测菌液中Fe2+浓度的变化情况，绘制成菌群在不同温度条件下Fe"浓度与氧化时间关系曲线，如图3图3表明，菌群在35'C温度条件氧化Fe2+的速度最快，均群最佳的生长温度范围在30-40。C之间，再此温度范围内，菌群都表现出较强的氧化活性，氧化速度较快。6.菌群对矿物中毒性物质的耐受能力利用菌群对含砷量分别为2.46%、8.23%、14.00%的三个试样，分别进行生物氧化，氧化过程中分别测定溶液中As5+、As3+的离子含量，同时测定溶液中F^、Fe3+离子含量。见图4、图5、图6、图7。由上述各图可知，随着矿物中含砷量的增加，溶液中的三价砷离子含量逐渐增加，溶液中二价铁离子含量逐渐增加，说明菌群的氧化活性受到了一定程度的抑制，但是三价铁含量依然呈现逐步上升趋势，说明菌群仍然在进行正常的氧化工作，但溶液中含砷量达到20g/L时，菌群的氧化活性受到了极大程度的抑制，难以进行有经济效益的氧化工作，因此本浸矿菌群对含砷毒性矿物的耐受范围为0-20g/L。复合菌群工业实施实例实施例1.利用本发明的菌种在辽宁省某金矿投资建设生物氧化提金厂，工厂采用搅拌氧化的方式，利用本发明菌群对含硫含砷难处理金矿进行生物预氧化，之后进行氰化浸出，是我国第一家高纬度地区成功应用生物氧化预处理技术的厂家，工厂日处理金矿粉150吨，菌群的温度、pH值适应范围，砷离子耐受能力完全满足生产需求，且在原有基础上进一步得到拓展，金浸出率平均96%以上。利用本发明的菌群，采用氧化槽搅拌氧化的方式，对一定浓度的难处理金矿粉进行氧化预处理工作，通过了近五年的现场应用，及矿菌群的工作特性有了进一步的拓展，氧化温度30-52t之间，氧化过程的pH值在0.8-2.25之间，金矿中的砷离子含量最高可达20g/L，在添加MgS04、K2HP04、CaCl2作为微量元素的条件下，氧化预处理5-6天之后，Fe"的氧化率达到99%，金的浸出率达到96%以上，同时生物氧化预处理的成本较传统冶炼技术成本大幅降低，金浸出率有较大提高，同时利用本发明的菌群对金矿进行生物氧化预处理对环境友好，基本实现无污染排放。实施例2.利用本发明的菌群对辽宁某难处理金矿进行生物氧化提金试验，金的浸出率由直接浸出的17.23°/。提高到96.29%。矿石的多元素分析见下表。多元素分析结果元素Au(g/t)Ag(g/t)CuPbZnFeS含量(%)38.6623.840.020.030.0515.5515.11元素CAsSbCaOMgOA1203Si02含量(%)2.010.71.496.023.257.0239.17采用本发明的菌群以改进的9k培养基作为菌群的营养物质，对此种矿石进行生物氧化预处理，氧化矿浆浓度20%，搅拌氧化6天之后进行金的氰化浸出，金的浸出率达到95.29%，浸出率较高。具体浸出结果见图8实施例3.利用本发明的混合菌群对内蒙地区某铜矿进行生物浸出，浸出率由酸性浸出的15.38%提高到80.31%，矿石的多元素分析见下表多元素分析结果元素CuFePbZnSMo品位(％)0.262.270.200.262.050.015元素A1203Si02MgOCaOAs品位(％)12.6477.500.770.590.0211<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>利用本发明的菌群，采用搅拌氧化的方式对此种难处理铜矿石进行铜的生物提取，搅拌浸出IO天后，铜的浸出率为80.31%。具体浸出结果见图9。<110〉中国黄金集团公司技术中心长春黄金研究院〈120〉一种复合浸矿菌群及其在生物冶金中的应用<130>HFL1-4<160〉4〈170〉Patentlnversion3.2<210〉1〈211〉556〈212〉腿〈213〉嗜铁钩端螺旋菌<400〉1ccgacgtcgcatgctcccggccgccatggcggccgcggtaatctgatacggcctaccttt60aaccacttcaccccaatcaccggccataccgttgggcggctcccttccgtatccggttgg120ggcaccgacttcaggtacaacacgactttcgtggtgtgacgggcggtgtgtacaaggccc180gggaacgtatacaccgcgtcgtgctgatacgcgattactagcgattccgacttcatgagg240tcgagttgcagacctcaatccgaactgggaccggctttctcggatttgctccacctctcg300gtcttgcttccgtctgtaccggccattgttgctcgtgtgtggccctgggcataagggcca360tgatgacttgacgtcatcctctccttcctccaacttgtcgctggcagtcccctcagagtg420cccggcatgacccggtggcaacagagggcgagggttgcgctcgttgcgggactgaaccca480atacctcacggcacgagctgacgacagccatgcagcacctgttccgcttccggactgaac540cggtcggtccccttgc556<210>2<211〉563〈212〉DNA<213>嗜热嗜酸硫杆菌〈400〉2gggcccgacgtcgcatgctcccggtcgccatggcggccgcgggaatcgattagagtttgatcctggctcagatttgaacgctggcggcatgcctaacacatgcaagtcggacggcagcaggtccttcgggatgctggcgagtggcggacgggtgagtaatgcgtaggaacctatccttttgtgggggacaacccagggaaacttgggctaataccgcataagccctgagggggaaagcgggggatcttcggacctcgtgctgaaggaggggcctacgtccgattagctagttggtggggtaaaggcctaccaaggcgacgatcggtagctggtctgagaggacgaccagccacactgggactgagacacggcccagactcctacgggaggcagcagtggggaatttttcgcaatgggggcaaccctgacgaggcaatgccgcgtggatgaagaaggccttcgggttgtagagtcctttcgtgggggacgaaaaggcggatccgaatacggtctgctattaacgtgaacccaagaagaagcaccggctaactccgtgccagcag60120180240300360420480540563〈210〉3〈211〉670〈212>廳〈213〉嗜热氧化硫硫化杆菌〈400>3cgacgtccatgctcccggccgcatgtgcggccgcgggaattcgattagagtttgatcctg60gctcaggacgaacgctggcggcgtgcgtaatacatgcaagtcgagcggacctttgggtca120gcggcggacgggtgaggaacacgtgagtcatcgggctgtgagtgggggatatcgggccga180aaggcgcggcaatcccgcatacgttccgggaaaccggaagaaagcttggcaacaggcgct240cacaggggagctcgcggcccattagctagttgggggggtaatggcctcccaaggcgacga300tgggtagccggcctgagagggtgaacggccacactgggactgagacacggcccagactcc360tacgggaggcagcagtagggaatcttccacaatgggcgcaagcctgatggagcaacgccg420cgtgagtgaagacggccttcgggctgtaaagctctgtctgtcgggacgaagaccggcccg480gaagggccggggagccggtaccgacggaggaagcccctgcaaactacgtgccagcagccg540cggtaagacgtagggggcaagcgttgtccggaattactgggcgtaaagggcgtgtaggcg600gtgcgatacgtagcggtttaaagcctccggctcacccggaggagggcggctaaacggtcg660cgctagaggg670<210>4〈211〉963〈212〉腿〈213〉铁原体嗜酸菌〈400〉4ccggtcgccatggcggccgcgggaatcgattctcgctcgcccatcyggttgatcctgccg60gcggccactgctatcaagttccgactaagccatgcgagtcaaggtatcgtaagatgccgg120caaactgctcagtaacacgtggataatctaaccttgagtaagggataacttcgggaaact180gaaggtaataccttataattgcttaaaactggaatgtttttgcaataaaagttacgacgc240tcaaggatgagtctgcgacctatcaggtagtaggtggtgtaatggaccacctagcctcag300acgggtacggrccctgggaggggtagcccgg卿tggactctgagacataagtccaggcc360ctacggggcgcagcaggcgcgaacactgtgcaatgcgcgaaagcgcgacacggggagctt420gagtgtcttggcatagccaagacttttctcattcctaaaaagcatgaggaataagtgctg480ggtaagacgggtgccagccgccgcggtaacacccgcagcacgagtagtggtcacttttat540tgagcctaaagcgttxgtagccggttttgtaaatcttcagataaagcctgaagcttaact600ccagaaagtctgaagagactgcaagacttgrgatcgggtgaggttaaacgtactttcagg660gtaggggtaaaatcctgtaatcccggaaggacgaccagtggcgaaagcgtttaactagaa720cgaatctgacggtaeiggaacga鄉ctagggtagcaaaccggattagatacccgggtagt780cctagctgtaaacattgcccatttgatgttgcttttccgttgagggaaggcagtgtcgga840gcgaaggtgttaaatgggccgcttgggaagtatggtcgcaagactgaaacttaaaggaat900tggcgggggagcaccgcaacgggaggaatgtgcggtttaattggattcaacgccggaaaa%0etc96权利要求1、一种复合浸矿菌群，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号为CGMCCNo.2395。2、根据权利要求1所述的复合浸矿菌群，是嗜铁钩端螺旋菌(L印tosp/别wr7fem;pMum)、嗜^ft嗜酸i^杆菌(/Ac/c/欣/ojbac/7/t;sca/dt/s)、卩耆^j氧f七硫石克4七杆菌(Si//fo6ac,7/iysMe/mosu/ffctoox/'c/ans)禾口古生菌铁原体嗜酸菌(Ferrap/asmaac,饰Mum)的混合体，嗜铁钩端螺旋菌的16SrRNA基因序列如SequenceNO.1所述，嗜热嗜酸硫杆菌的16SrRNA基因序列如SequenceNO.2所述，嗜热氧化硫硫化杆菌的16SrRNA基因序列如SequenceNO.3所述，铁原体嗜酸菌的16SrRNA基因序列如SequenceNO.4所述。3、根据权利要求1中所述的复合浸矿菌群，其特征在于在30°C-52°C的温度范围内具有较强的氧化活性，工作pH在0.8-2.25之间，砷离子耐受度在0-20g/L。4、如权利要求1中所述的复合浸矿菌群在生物冶金工业中的应用。5、根据权利要求4中所述的复合浸矿菌群在生物冶金工业中的应用，其特征在于该菌群用于氧化Fe2+和硫化矿物，是将二价铁化合物氧化为可溶性三价铁，将低价硫化合物氧化为可溶性硫酸盐。6、根据权利要求5所述的复合浸矿菌群在生物冶金工业中的应用，其特征在于其中的硫化矿石包含黄铁矿、毒砂、斜方砷铁矿及黄铜矿和硫砷铜矿。7、根据权利要求4所述的复合浸矿菌群在生物冶金工业中的应用，其特征在于该复合浸矿菌群用于提取和回收金或铜。全文摘要本发明涉及一种复合浸矿菌群及其在生物冶金中的应用。该复合浸矿菌群在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号为CGMCCNo.2395，在30℃-52℃的温度范围内具有较强的氧化活性，工作pH在0.8-2.25之间，砷离子耐受度在0-20g/L。该复合浸矿菌群用于提取和回收金或铜，大大的拓宽了生物冶金在金矿中的应用范围，同时由于其具有较宽的温度适应范围，这样既提高了氧化速度又降低了生产成本，因此本发明的混合菌群在生物冶金工业中将会有重要的应用前景。文档编号C22B3/00GK101538540SQ20081005052公开日2009年9月23日申请日期2008年3月21日优先权日2008年3月21日发明者凤杨,郝福来,金世斌,韩晓光,高金昌申请人:中国黄金集团公司技术中心;长春黄金研究院