抗细胞或组织蛋白质单克隆抗体库的制备方法

专利名称：抗细胞或组织蛋白质单克隆抗体库的制备方法
技术领域：
本发明涉及单克隆抗体库的制备方法，特别是涉及抗细胞或组织蛋白质单克隆抗体库的制备方法。
背景技术：
抗体是宿主对体内存在的外来分子，微生物或者其它因子的应答而产生的免疫球蛋白。抗体以其高特异性和高亲和力在生命科学研究、临床诊断和治疗、动植物检疫、环境检测等方面具有重要的应用价值。特别是自二十世纪末以来，随着生命科学研究的重点从基因组学转向蛋白质组学，作为蛋白质组学研究的工具之一的抗体已受到越来越多的重视。抗体是蛋白质组学研究领域的重要工具之一，单克隆抗体以其高特异性和高亲和力在蛋白质的定性、定量、定位、相互作用的研究中发挥着不可替代的作用(Bradbury，A.et al.，Trends Biotechnol.2003，21，275-281；Trends Biotechnol.2003，21，312-317)。现有技术中，单克隆抗体制备方法可分为体内和体外两大类。体内法是指抗原(包括蛋白质、偶联多肽或DNA表达载体)免疫动物而产生单克隆抗体的技术(Kohle and Milstein，Nature265495-497，1975；Tang，D.C，et al.，Nature.1992，356，152-154)。体外法是使用基因克隆技术将抗体基因库展示在噬菌体等生物体表面上，然后筛选得到针对某一蛋白质的重组抗体分子(McCafferty，J.Griffiths AD，Winter G，Chiswell D.，Nature.1990，348，552-554)。由于以动物免疫制备的单克隆抗体分子是具有Fc段的天然二聚体分子，因此比噬菌体展示技术获得的重组抗体分子有更高的亲合力和稳定性，更适合于以免疫印迹、免疫沉淀、免疫组化以及抗体芯片等免疫技术来研究蛋白质的组织分布、细胞定位、翻译后修饰以及蛋白质相互作用。为了完成上述这些研究，本领域常常需要建立许多针对人或其他生物体各种细胞或组织的大量蛋白质的特异性单克隆抗体库。
建立于大约三十年前的杂交瘤技术(Kohle and Milstein，Nature 265495-497，1975)是生产单克隆抗体的最有效的技术之一，并且由于杂交瘤细胞系产生并分泌的单克隆抗体是具有天然二聚体结构的，是最适于蛋白质组研究需要的抗体。因此，相对于由噬菌体产生的重组单克隆抗体分子，这些单克隆抗体具有更高的抗原亲合力和稳定性。
通过杂交瘤细胞技术规模化制备针对生命体某一特定细胞或组织蛋白的单克隆抗体的主要瓶颈是如何首先获得一定量(通常为mg级)的、纯化的细胞或组织蛋白抗原。目前，获得细胞或组织蛋白抗原的主要手段是以基因克隆技术生产重组蛋白。虽然可以使用Gateway等技术有效地实现基因克隆(Heyman，J.A，Comthwaite J，Foncerrada L，Gilmore JR，et al.，Genome Res.1999，9，383-392)，但基因表达和蛋白质纯化步骤中仍存在一些限速步骤。例如本领域常用的大肠杆菌表达系统不能表达某些真核细胞基因或表达产物常常聚集形成无活性的包涵体(Williams，D.C.，Van Frank，RM，Muth，WL，Burnett，JP，Science.1982，215，687-689)，而且该系统也不适于表达那些结构复杂或需要翻译后修饰的蛋白质。尽管酵母、昆虫、哺乳动物表达系统已成功表达了一些真核细胞蛋白，但存在研制周期长、表达量低、成本高和不适合表达结构复杂的蛋白复合体等问题(Chambers，S.P.，Drug Discovery Today.2002，7，759-765)。无细胞翻译系统虽然具有表达周期短，表达量较高等优点，但也存在难以表达部分真核细胞基因或不适合表达某些结构复杂的蛋白质等问题(Renesto P，Raoult D.Ann N Y Acad Sci.2003，990642-52)。
制备一定量、高纯度蛋白抗原是构建抗细胞或组织蛋白单克隆抗体库的重要前提条件。当前，可通过生物化学方法(例如蛋白质分离纯化或肽化学合成方法)或基因工程方法得到足够量纯化的细胞/组织蛋白质。虽然可通过蛋白质分离纯化技术获得一定数目、具有一定纯度的组织蛋白(例如可通过有机溶剂结合液相色谱从血浆中提取白蛋白、球蛋白，从尿中提取HCG)，但这些提取方法只适应为数不多的细胞或组织中高丰度蛋白(如血液中的人血清白蛋白、免疫球蛋白)，且提取过程复杂，周期长、需要大量生物材料，同时会对其它蛋白活性造成破坏。另外。尽管可使用固相肽合成技术(例如Steward，J.M.andYoung J.D.，Solid Phase Peptide Synthesis，2nd Ed.，Pierce Chemical Company，Rockford，I11.，1984)迅速地合成得到任何具有已知氨基酸序列的肽，但是如果多肽序列的长度超过100个氨基酸，则可能遇到合成上的困难，而且所合成的多肽不能形成其天然结构。通过基因工程技术获得重组蛋白抗原是目前最常采用的方法之一，为了得到这些重组蛋白质抗原分子，通常须通过基因克隆、蛋白表达和纯化等繁杂的过程。尽管目前已建立了高通量的基因克隆技术(例如Gateway技术，参见Heyman，J.A，Cornthwaite J，Foncerrada L，Gilmore JR，et al.，Genome Res.1999，9，383-392)，但基因表达和蛋白质产物的纯化仍是很费时费力的。例如，使用大肠杆菌系统表达蛋白质常常因包涵体的形成而导致产物的损失或丢失(Williams，D.C.，Van Frank，RM，Muth，WL，Burnett，JP，Science.1982，215，687-689)；使用酵母和真核细胞系统则常常存在表达周期过长和蛋白质产率较低的问题(Chambers，S.P.，Drug Discovery Today.2002，7，759-765)。另外，由于被表达的蛋白质分子常常出现所带电荷、分子量及疏水性的变化，所以也存在表达产物纯化困难的问题。另外，一些具有膜或膜特征的蛋白质、一些结构复杂的组织蛋白质及一些蛋白质异构体很难通过基因工程的方法获得。因此，制备纯化的蛋白质抗原以杂交瘤技术制备抗细胞或组织蛋白质抗体库的一个主要障碍。
综上所述，利用目前较成熟的蛋白质表达系统来制备毫克级的细胞或组织蛋白存在以下几方面的问题(1)基因表达的不确定性，一些基因由于本身的结构特点，很难在蛋白质表达系统中获得表达；(2)一些蛋白质尤其是膜蛋白或具有膜相关结构的蛋白质很难在体外蛋白质表达系统中获得表达；(3)蛋白质异构体很难在体外蛋白质表达系统中获得；(4)由于每种蛋白质分子在所带电荷、分子量及疏水性等方面存在差异，所以存在表达产物纯化困难、纯化周期长和产量低等缺点。

发明内容
本发明的一个目的是提供一种抗细胞或组织蛋白质的特异性单克隆抗体库的制备方法。
为了克服传统的“先有抗原，后有抗体”的单克隆抗体制备技术中的上述缺陷，本发明建立了一种“先有抗体，后有抗原”的特异性单克隆抗体库的制备方法。该方法包括以下步骤A、首先用经过对特定细胞或组织蛋白质进行组分化，以组分化蛋白质为复合抗原(免疫原)免疫动物并以常规杂交瘤技术制备第一轮单克隆抗体；B、然后用首轮获得的单克隆抗体对组分化抗原制备差减抗原，以差减抗原为免疫原通过杂交瘤细胞技术制备下一轮单克隆抗体；C、最后鉴定每轮单克隆抗体所针对的特异性抗原。通过上述方法，本发明为在相对较短的时间内制备抗细胞或组织蛋白质的特异性单克隆抗体库提供了一种新的手段。
本发明所述的作为免疫原的组分化蛋白质是包括不同数目并且有不同分子量和电荷的一组蛋白质。
作为本发明的一个优选实施方案，所述步骤A中的组分化方法为液相层析和/或分级分离方法。本发明还可采取凝胶过滤法、等电点沉淀法、离子交换层析等方法将细胞或组织蛋白按照蛋白质分子量、带电电荷和疏水性大小分布不同的特点进行组分化。
作为本发明的一个优选实施方案，所述步骤B中的差减抗原的方法为亲和层析方法。
根据本发明方法的一个优选实施方案，其中使用符合抗原免疫动物以杂交瘤技术制备单克隆抗体的轮数至少为2轮。
根据本发明的一个优选实施方案，所述步骤C中用于鉴定抗原的方法选自酶联免疫吸附、免疫沉淀结合质谱或表达型cDNA文库分析方法。
本发明的另一个目的是提供按上述方法制备的抗细胞或组织蛋白质的特异性单克隆抗体用于制备蛋白质组研究的试剂的应用。在蛋白质组学研究中，可利用已获得的单克隆抗体通过ELISA、免疫印记(WB)、免疫沉淀(IP)、抗体芯片等技术对蛋白质进行定性、定量、定位及相互作用研究。
本发明的再一个目的是提供按上述方法制备的抗细胞或组织蛋白质的特异性单克隆抗体用于制备诊断疾病的药物的应用。在疾病诊断过程中，可利用已获得的单克隆抗体通过ELISA、免疫印迹(WB)、免疫层析、时间免疫荧光分辨、液相芯片等技术完成对肿瘤、感染性疾病的快速诊断。
本发明的再一个目的是提供按上述方法制备的抗细胞或组织蛋白质的特异性单克隆抗体用于制备治疗疾病的药物的应用。在疾病治疗中，可利用已筛选到具有治疗价值的单克隆抗体进行人源化改造用于人体肿瘤、病毒感染性疾病(例如HIV、HCV等的传染)的治疗。
与“先有抗原，后有抗体”的传统单克隆抗体库制备方法相比，本发明的“先有抗体，后有抗原”的抗细胞或组织蛋白质单克隆抗体库制备方法具有以下优点(1)由于本发明的方法是采用液相层析方法对细胞或组织蛋白进行组分化分离，这种分离方法一方面可以使细胞或组织蛋白按照蛋白质分子量、带电电荷和疏水性大小分布，另一方面可最大程度地保持蛋白质的生物活性，为制备高亲和力、高特异性的单克隆抗体提供基础；(2)由于本发明的方法是采用单克隆抗体介导的亲和层析对组分化抗原进行亲和吸附以制备差减抗原，以液相层析方法分离的蛋白质作为免疫原制备单克隆抗体，所以避免了上述使用固相肽合成和基因工程技术制备免疫原所带来的各种问题，更有利于对不同蛋白质抗原部分的俘获；(3)有可能获得抗细胞或组织中结构复杂的蛋白复合体、膜蛋白及蛋白质异构体等的单克隆抗体；(4)经过一次免疫和细胞融合可获得针对多种蛋白抗原的单克隆抗体，与传统单克隆抗体制备方法相比，本发明的方法可显著提高抗体的制备效率，例如，在本发明的实践中，采用该方法一次免疫和细胞融合可获得针对5～10种抗人血浆蛋白抗原的单克隆抗体以及针对15～20种抗人肝组织蛋白抗原的单克隆抗体；(5)所获得的单克隆抗体在亲和力、特异性等方面均优于以重组抗原为免疫原制备的单克隆抗体，并且所获得的单克隆抗体更适于成为研究蛋白质组学中蛋白质定量、定性、定位及相互作用的工具；(6)绕开了通过生物化学或基因工程技术制备细胞/组织蛋白抗原的繁琐过程，大大缩短了建立抗特定细胞或组织蛋白质的单克隆抗体库的周期。


图1图解显示本发明制备抗细胞或组织蛋白质的特异性单克隆抗体的总体策略。
图2A为Sephacryl S-200凝胶分离的人血浆组份SDS-PAGE电泳图谱。其中泳道1-3分别是HPS-I(泳道1)、HPS-II(泳道2)和HPS-III(泳道3)的还原样品。泳道5-7分别是HPS-I(泳道5)、HPS-II(泳道6)和HPS-III(泳道7)的氧化样品。泳道7是蛋白质分子量标准品(6～200KD，Bio-Rad)。
图2B显示人血浆蛋白经Sephacryl S-200分离获得的三个蛋白组分的免疫印迹分析。其中泳道1-3分别是HPS-I(泳道1)、HPS-II(泳道2)和HPS-III(泳道3)的还原样品，一抗是抗人球蛋白的单克隆抗体(1∶1000)。泳道5-7分别是HPS-I(泳道4)、HPS-II(泳道5)和HPS-III(泳道6)的还原样品，一抗是抗人白蛋白的单克隆抗体(1∶1000)。泳道M是生物素标记的蛋白分子量标准(6-200KDa，Bio-Rad)。
图3显示免疫印迹法分析一次细胞融合后阳性杂交瘤细胞所针对的血浆蛋白抗原的分布。其中泳道1～14样品均为正常人血浆蛋白，泳道1～14所结合的一抗为一次细胞融合后不同阳性杂交瘤细胞所分泌的单克隆抗体(1∶100)。
图4显示人血浆HPS-I和HPS-I-P蛋白组份的Western-blot分析结果。其中泳道1是生物素标记蛋白质分子量标准品(6～200KD，Bio-Rad)，泳道2是人血浆HPS-I组份，泳道3是人血浆HPS-I-P组份，用于检测的第一抗体为抗人血浆HPS-I组份的多克隆抗体。结果显示人血浆HPS-I组份中的A组蛋白条带和B组蛋白条带在人血浆HPS-I-P组份中已被差减除去。
图5显示人血浆HPS-I和HPS-I-P蛋白组份的双向电泳分析结果。其中图5A和图5B分别是HPS-I和HPS-I-P组份的双向电泳图谱(考马斯亮蓝染色)。第一向固相pH梯度胶条(pH3-10非线性，17cm)聚焦40,000伏特小时，第二向垂直胶浓度12.5％，每种样品上样量200ug。
图6显示以免疫印记方法进一步验证预先确定的4株单克隆抗体对相应抗原特异结合活性。泳道1IgA；泳道2IgM；泳道3巨球蛋白；泳道4抗胰蛋白酶；泳道5生物素标记蛋白质分子量标准品(6～200KD，Bio-Rad)。
图7显示亲和力测定结果用非竞争性ELISA法测定，用Microcal Origin 50软件对梯度稀释的HPS-II B014在不同浓度铜蓝蛋白包被下进行S型曲线拟合。
图8显示通过Western-blot(ECL)方法来检测抗人血浆的单克隆抗体对成人和胎肝胞浆蛋白反应。随机选择4株单克隆抗体进行分析。泳道2，5，8，11，14是人血浆蛋白；泳道3，6，9，12，15为胎肝胞浆蛋白；泳道4，7，10，13，16是成人肝胞浆蛋白。泳道1是蛋白分子量标准(6～200KD，Bio-Rad)。
图9显示成人肝组织的免疫组化分析。结果显示单克隆抗体特异识别肝窦，肝静脉和肝胞浆蛋白。
图10显示以免疫沉淀结合质谱方法鉴定单克隆抗体的抗原结合特异性。其中图10A显示免疫沉淀物的SDS-PAGE和Western-blot分析；图10B显示质谱分析；图10C显示质谱峰在Swiss-prot数据库的检索结果，显示与该株单克隆抗体结合的抗原为前转铁蛋白。
图11是显示利用已制备的单克隆抗体从人血浆中去除白蛋白、球蛋白的电泳结果。其中泳道1为正常人血浆(1∶10)，泳道2～4为不同体积正常人血浆(1∶10)经抗体吸附后的样品(泳道210ul；泳道320ul；泳道430ul)，泳道5和泳道1是蛋白分子量标准(6～200KD，Bio-Rad)。
具体实施例方式
本发明所述的抗细胞或组织蛋白质单克隆抗体库的制备方法，是在无需通过基因工程或多肽合成制备抗原材料的情况下，使用分级分离和差减分离的天然细胞或组织蛋白作为复合抗原(免疫原)，以杂交瘤细胞技术制备单克隆抗体，并借助免疫沉淀结合质谱或表达型cDNA文库等技术鉴定相应抗原的方法(参见附图1)。
本发明所述的抗细胞或组织蛋白质的特异性单克隆抗体库的制备方法，包括以下步骤A、首先用经过对特定细胞或组织蛋白质进行组分化，以组分化蛋白质为复合抗原免疫动物并以常规杂交瘤技术制备单克隆抗体；B、然后用已获得的单克隆抗体对组分化抗原制备差减抗原；以差减抗原为免疫原通过杂交瘤细胞技术制备下一轮单克隆抗体；C、最后鉴定每轮单克隆抗体所针对的抗原。
本发明所述的作为免疫原的组分化蛋白质是包括不同数目并且有不同分子量和电荷的一组蛋白质。
作为本发明的一个优选实施方案，所述步骤A中的组分化方法为液相层析和/或分级分离方法。本发明还可采取凝胶过滤法、等电点沉淀法、离子交换层析等方法将细胞或组织蛋白按照蛋白质分子量、带电电荷和疏水性大小分布不同的特点进行组分化。
作为本发明的一个优选实施方案，所述步骤B中的差减抗原的方法为亲和层析方法。
根据本发明方法的一个优选实施方案，其中使用符合抗原免疫动物以杂交瘤技术制备单克隆抗体的轮数至少为2轮。
根据本发明的一个优选实施方案，所述步骤C中用于鉴定抗原的方法选自酶联免疫吸附、免疫沉淀结合质谱或表达型cDNA文库分析方法。
实施例1制备和鉴定抗细胞蛋白单克隆抗体库的方法本实施例旨在以抗肝癌细胞蛋白单克隆抗体库的制备方法为例，举例描述本发明所述的抗细胞蛋白质的单克隆抗体库的制备方法的实际可应用性。
1、组分化抗原制备大量培养肝癌细胞HepG2和Hu-h7后，常规破碎细胞并离心(3000×g，10分钟)收集沉淀。将沉淀用无菌磷酸缓冲盐水(PBS)洗涤两次后，通过匀浆、高速及超速离心后分为细胞膜、细胞核、细胞器及胞浆蛋白(参见《细胞实验指南》D.L.斯佩克特，R.D.戈德曼，P289-295)。将膜沉淀重悬于含85mM NaCl和10％甘油的40mM磷酸盐缓冲液(pH8.0)中。再次离心(280,000xg，4℃，15分钟)，弃上清。将沉淀加入含85mM NaCl、10％甘油的40mM磷酸盐缓冲液(pH8.0)中，并向混合物中加入十二烷基麦芽糖苷(DDM，Sigma公司)至终浓度为3％(w/v)。4℃孵育30分钟后，离心(280,000×g，15分钟，4℃)得到上清即为膜蛋白部分。然后再通过脱盐柱(SephadexG-25)去除DDM。使用SephacrylS-200柱(Amersham)联合Superdex G75(Amersham)以液相层析法将胞浆蛋白进一步分为HCC-I、HCC-II、HCC-III和HCC-IV组分，并将通过DDM抽提的细胞膜蛋白分离成HCM-I、HCM-II和HCM-III三个组分。
2、差减抗原制备胞浆蛋白组分HCC-I、HCC-II、HCC-III、HCC-IV分别经抗白蛋白、低密度脂蛋白、触球蛋白、转铁蛋白单克隆抗体亲和吸附后获得差减抗原HCC-I-P、HCC-II-P、HCC-III-P、HCC-IV-P。
3、动物免疫取随机选择的BABL/c小鼠5只，首次用弗氏完全佐剂加抗原腹腔内途径免疫(50μg/只)。第7天后以弗氏不完全佐剂加抗原腹腔内注射进行二次免疫。第14天以单纯抗原尾静脉进行第三次免疫。第20天尾静脉采血测得抗体效价均＞1∶10000。细胞融合前，再次经尾静脉注射加强免疫1次(25μg)。
4、细胞融合和筛选末次免疫后3天，取被免疫小鼠的脾脏细胞(1×108个细胞)与骨髓瘤细胞株Sp2/0(1×107个细胞)，在50％PEG1450作用下进行常规细胞融合。用各组分蛋白建立的间接ELISA检测培养上清，选择阳性克隆，并用有限稀释法连续克隆化。扩增培养并收集克隆化后阳性率达100％的细胞，置液氮冷冻保存。各蛋白组分经过单次细胞融合和筛选后，共获得254株单克隆抗体，结果见表1。
表1已制得的抗肝癌细胞蛋白组分的单克隆抗体数(以杂交瘤细胞株数表示)

5、亚类鉴定按HyCult公司的鼠单克隆抗体亚类检测试剂盒说明书进行操作，检测阳性杂交瘤培养上清液，结果所测定所有抗体的亚类均为IgG。
6、抗体纯化给预先皮下注射石蜡油(0.5毫升/只)致敏的BALB/c小鼠腹腔内接种已建株的杂交瘤细胞约106个，7～10天后采集腹水并离心得上清。采用rProtein G亲和层析纯化腹水，经SDS-PAGE电泳鉴定其纯度＞90％。
7、鉴定抗体特异性抗原分别使用20ug白蛋白、低密度脂蛋白、触球蛋白、转铁蛋白、α2-巨球蛋白、甲胎蛋白、GPC3、PIKV II包板，以间接ELISA方法鉴定已制备的单克隆抗体，并通过免疫印迹法对ELISA阳性样品做进一步的证实(结果如表2所示)。ELISA阴性的单克隆抗体通过免疫沉淀结合质谱进行抗原鉴定。
表2抗肝癌细胞单克隆抗体的鉴定结果(ELISA方法鉴定)


实施例2抗组织蛋白单克隆抗体库的制备和鉴定本实施例旨在以抗人血浆蛋白的单克隆抗体为例，举例描述本发明所述的抗组织蛋白质的单克隆抗体库的制备方法的实际可应用性。
1、组分化抗原制备将混合的正常健康人血浆(10人份)按1∶1稀释于灭菌的PBS中，按1％上样量上样于经PBS(含蛋白酶抑制剂，PIERCE公司产品)平衡的分子筛Sephacryl S-200(Amersham Biosciences)，通过OD280检测蛋白峰。正常人血浆蛋白分为三个蛋白峰，依次命名为HPS-I，HPS-II，HPS-III。应用BCA试剂盒法(PIERCE公司产品)分别测定三个组分的蛋白浓度分别为2.0mg/ml、2.5mg/ml，0.5mg/ml。
在本实施例中，以分子筛层析法(例如使用有效分离范围大约为5-250千道尔顿(KDa)的Sephacryl S-200层析柱)将来源于健康人的正常血浆蛋白质(绝大多数血浆蛋白质的分子量约在1至200KDa)依据分子量的不同分成三个组分。采用聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白质印迹(West blot，WB)分析结果显示人血浆蛋白质组分I(HPS-I)主要蛋白由分子量大于100KDa的高分子量蛋白质组成，且大多为含有二硫键的蛋白质；而人血浆蛋白质组分II(HPS-II)和人血浆蛋白质组分III(HPS-III)的决大多数蛋白质则由分子量范围为10KDa至100KDa的中、低分子量蛋白质组成。作为含量最大的血浆蛋白质成分白蛋白主要存在于HPS-II和HPS-III组分中(见附图2)。
2、差减抗原制备在已鉴定的针对HPS-I的单克隆抗体中，大多数抗体是针对抗原IgG、IgM、触球蛋白和铜蓝蛋白的，同时这些蛋白质又是HPS-I中的高丰度蛋白。因此选用这四种抗体对HPS-I进行亲合吸附以制备差减抗原(HPS-I-P)。免疫印迹和双向电泳分析结果显示，亲合吸附后相应的四种高丰度蛋白均被从HPS-I有效地去除(见附图4和5)。
在本实施例中，以差减抗原HPS-I-P做为第二轮免疫原免疫BABL/c小鼠后，经过2次融合和筛选共获得95株单克隆抗体。经酶联免疫吸附法(ELISA)、蛋白质印迹技术(Westblot)以及免疫沉淀(IP)结合质谱方法(MS)鉴定上述杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体所对应的抗原，结果显示在已鉴定的针对HPS-I-P的单克隆抗体中，大多数抗体是针对抗原α2-巨球蛋白和纤维蛋白原的，而没有出现已经差减去除的IgG、IgM、触球蛋白和铜蓝蛋白。这一结果进一步说明，通过单克隆抗体介导的亲和吸附可有效去除在上一轮免疫原中已获得单克隆抗体的抗原，为下一轮使用差减抗原制备新的单克隆抗体提供了保障。
3、免疫、融合及筛选具体方法参见实施例1。以组份化抗原HPS-I、HPS-II和HPS-III分别免疫BABL/c小鼠，经过单次细胞融合和筛选共获得110株单克隆抗体，而差减抗原HPS-I-P经过2次细胞融合共获得95株单克隆抗体。上述结果表明经过一次典型的融合可获得29～70株单克隆抗体(见表3)，其中约有40～60％的抗体是针对不同分子量抗原的(见图3)。
4、抗体纯化和亚类鉴定具体方法参见参见实施例1。结果表明所测定抗体的亚类均为IgG。经SDS-PAGE电泳鉴定，采用rProtein G亲和层析纯化的抗体的纯度＞90％。
5、抗体亲合力测定抗体亲和常数测定参照Beatty et al.报道的方法进行(J ImmunolMethods.1987，100，173-179)。简单地说，分别以不同浓度地蛋白质包被，然后加入倍比稀释的单克隆抗体，再加入HRP标记羊抗鼠IgG抗体进行间接ELISA测定。反应后，以TMB显色法测D(λ)值。以抗体浓度的对数为横座标，以D(λ)值为纵座标，每种单克隆抗体可得出4条反应曲线。以每条曲线上部平坦段的D(λ)值作为100％，在曲线上查出50％D(λ)值时相对应的抗体浓度，按公式Kaff＝(n-1)/2(n[Ab′]t-[Ab]t)计算亲和常数。结果可见，测定结果表明，所测定单克隆抗体的亲合常数介于109M-1～1012M-1之间，这一结果表明通过本发明制备的单克隆抗体具有很高的亲和力(见图6)。
6、免疫印迹和免疫组化分析免疫印迹和免疫组化方法分别参照文献《细胞实验指南》(D.L.斯佩克特，R.D.戈德曼，P639-644)和《现代医学实验方法》(王谦，P46-48)中的有关描述。由于肝脏是血浆蛋白质的主要分泌器官，所以我们应用已制备的抗血浆蛋白质单克隆抗体分别对血浆蛋白组分、胎肝胞浆蛋白质和成人肝胞浆蛋白质进行免疫印迹分析，并对成人肝组织切片进行免疫组化分析。免疫印迹结果表明，所有被检单克隆抗体均与血浆蛋白呈阳性反应，部分单克隆抗体同时与血浆蛋白、肝脏胞浆蛋白呈阳性反应。免疫组化结果表明，所有被检单克隆抗体不仅可识别肝脏的血管内皮细胞和血窦，而且可特异地识别肝脏胞浆蛋白(见图7和8)。
7、抗体特异性抗原的鉴定通过已知的12种血浆高丰度蛋白质(人血清白蛋白、IgG、IgM、IgA、铜蓝蛋白、触球蛋白、转铁蛋白、α-抗胰蛋白酶、α2巨球蛋白、纤维蛋白原、酸性糖蛋白、低密度脂蛋白)所建立的间接ELISA、免疫印记法鉴定所制备的所有单克隆抗体。通过IP-MS鉴定不与上述12种血浆高丰度蛋白反应的单克隆抗体(图9)。通过两轮免疫、融合和筛选其获得针对人类血浆蛋白的单克隆抗体205株。其中，一次典型的融合可获得29～70株单克隆抗体，其中约有40～60％的抗体是针对不同抗原的。在第一轮免疫、融合过程中，抗原为健康人血浆蛋白通过分子筛Sephacryl S-200分成的三个蛋白组分HPS-I(MW＞90KD)、HPS-II(MW＞10KD)、HPS-III(MW＞5KD)。本轮共获得110株单克隆抗体，其中抗HPS-I的单克隆抗体50株，已鉴定出抗原的抗体共29株，它们分别针对9种不同的人类血浆蛋白(铜蓝蛋白、触球蛋白、IgM、IgG、维生素K相关S蛋白、补体C1qc、补体C4b、角蛋白、组蛋白H)；抗HPS-II的单克隆抗体29株，已鉴定出抗原的抗体共21株，它们分别针对7种不同的人类血浆蛋白(人血清白蛋白、IgG、IgM、铜蓝蛋白、触球蛋白、转铁蛋白、α-抗胰蛋白酶)；抗HPS-III的单克隆抗体31株，已鉴定出抗原的抗体共27株，它们针对6种不同的人类血浆蛋白(人血清白蛋白、IgG、IgM、转铁蛋白、α-抗胰蛋白酶、IgA)。在第二轮免疫和融合过程中，抗原是通过免疫差减吸附第一轮抗原HPS-I后所获得的，其介导的抗体是HPS-I免疫BABL/c小鼠产生的针对人IgG、IgM、铜蓝蛋白、触球蛋白三种人类血浆高丰度蛋白的单克隆抗体，所制备的差减抗原为HPS-I-P。本轮共获得95株单克隆抗体，已经被鉴定抗原的抗体为共40株，它们分别针对3种不同的人类血浆蛋白(IgA、α2巨球蛋白、纤维蛋白原)。与第一轮抗原HPS-I免疫后获得的抗体相比，第二轮抗原HPS-I-P免疫后所获得的85％抗体为新抗体。如果HPS-I-N再经抗人IgM、IgA抗体的差减吸附，这个比例更高(数据未示出)。
上述结果表明(1)本发明使用组织蛋白质复合抗原和/或抗体依赖性免疫差减吸附后得到的蛋白质作为免疫原，经循环免疫制备单克隆抗体这一技术路线是可行的；(2)免疫沉淀结合质谱技术是鉴定相应的特异性抗原的有效手段；(3)由于已获得了绝大多数高丰度蛋白的特异性单克隆抗体，因此通过第三、第四轮抗原制备和免疫后，可望获得功能更为重要的抗人类血浆低丰度蛋白的单克隆抗体，从而为这些蛋白质的功能研究奠定基础。
血浆蛋白质组是最复杂和最重要的人类蛋白质组，同其它人类蛋白质组相比，它具有三个显著的特征(1)血浆包含的蛋白质来源于几乎所有的人体组织，特别是肝脏和肾脏；(2)血浆中含约1万多种蛋白质，而且这些蛋白质的丰度差异巨大，其中白蛋白、免疫球蛋白、转铁蛋白、触球蛋白等10种高丰度蛋白含量占整个血浆总蛋白的99％左右；(3)血浆是最重要的临床检测样本，包含着各类疾病特异性或相关性的诊断和治疗性靶分子(Anderson，N.L.，Anderson，N.G.，Mol Cell Proteomics.2002，845-867)。因此，构建人类血浆蛋白单克隆抗体库显得十分重要。由于血浆中绝大多数蛋白质为中低丰度蛋白质，而且大多数蛋白质为糖蛋白及数目巨大的蛋白质异构体，因而通过传统的生物化学方法(例如蛋白质分离纯化或肽化学合成方法)或基因工程方法制备蛋白抗原分子是非常困难的。
本发明人在建立抗人血浆蛋白单克隆抗体库的研究中，经过长时间的摸索和反复实验，成功地建立了一种在无须首先制备抗原的情况下生产抗人血浆蛋白质单克隆抗体的方法，从而完成了本发明。本发明的方法为单克隆抗体的制备或生产提供了一种新的手段，也为建立其它生物体(病毒、细菌)的细胞/组织抗体库的研究提供了新的途径。
在本实施例中，以人血浆三个蛋白组分HPS-I、HPS-II和HPS-III做为第一轮抗原免疫BABL/c小鼠后，经过融合和筛选共获得110株单克隆抗体，其中抗HPS-I的单克隆抗体共50株，而HPS-II和HPS-III分别为29株和31株(见表3)。以上数据表明，以组织蛋白做为复合抗原免疫BABL/c小鼠后，一次典型的融合可获得30～50株单克隆抗体，其中40～60％的抗体是针对不同分子量抗原蛋白质的(参见附图3)。使用酶联免疫吸附法(ELISA)、蛋白质印迹技术(West blot)以及免疫沉淀(IP)结合质谱方法(MS)鉴定上述杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体所对应的抗原，结果如表3所示在已鉴定的针对HPS-I的单克隆抗体中，大多数抗体是针对抗原IgG、IgM，触球蛋白和铜蓝蛋白，同时这些蛋白又是HPS-I中的高丰度蛋白，因此选用这四种抗体对HPS-I进行亲合吸附以制备差减抗原(HPS-I-P)。从免疫印迹和双向电泳结果显示，亲合吸附后相应的四种高丰度蛋白均被从HPS-I有效地去除(参见附图4和5)。
表3以ELISA、IP和MS方法鉴定的可与抗人血浆蛋白质特异结合的抗原


a)6个细胞株中，2个用IP和MS方法鉴定，其余4个用ELISA方法鉴定；b)8个细胞株中，2个用IP和MS方法鉴定，其余6个用ELISA方法鉴定；c)25个细胞株中，2个用IP和MS方法鉴定，其余23个用ELISA方法鉴定。
从表3所示的结果可以看出，在抗HPS-I组分的单克隆抗体中，目前已鉴定了抗原的单克隆抗体至少有9种，它们分别是铜蓝蛋白、触球蛋白、IgM IgG、维生素K相关S蛋白、补体C1qc、补体C4b、角蛋白、组蛋白H；在抗HPS-II组分的单克隆抗体中，目前已鉴定抗原的单克隆抗体至少有7种，它们分别是白蛋白、铜蓝蛋白、触球蛋白、IgM、IgG、转铁蛋白、α1-抗胰蛋白酶；在抗HPS-III组分的单克隆抗体中，目前已鉴定抗原的单克隆抗体至少有6种，它们分别是白蛋白、IgM、IgG、IgA、转铁蛋白、α1-抗胰蛋白酶。
从上述结果可以看出，以血浆组分化蛋白为复合抗原免疫BABL/c小鼠，经单次细胞融合后，每个组分至少可产生针对6种以上不同蛋白抗原的单克隆抗体。由于本发明所述的方法是采用未知的组织蛋白复合抗原做为免疫原制备单克隆抗体，因此如何鉴定单克隆抗体结合的特异性抗原是本方法的另一个关键点。采用免疫沉淀结合质谱、表达型cDNA文库、ELISA三种方法对已制备的单克隆抗体进行抗原性鉴定。首先应用已知的12种人血浆高丰度蛋白(人血清白蛋白、IgG、IgA、IgM、转铁蛋白、铜蓝蛋白、触球蛋白、α1-抗胰蛋白酶、α2-巨球蛋白、纤维蛋白原、低密度脂蛋白、酸性糖蛋白)建立了间接ELISA方法对所有已制备并经亲和层析纯化的单克隆抗体进行鉴定，然后用免疫印迹方法对ELISA阳性结果作进一步验证(见附图9)。
由于是使用未知的组织蛋白复合抗原做为免疫原制备单克隆抗体，因此如何鉴定单克隆抗体结合的特异性抗原是本技术路线的另一个关键。采用免疫沉淀结合质谱，表达型cDNA文库及ELISA三种方法对已制备的单克隆抗体进行抗原性鉴定。首先使用人血清白蛋白、IgG、IgM、IgA、转铁蛋白、铜蓝蛋白、触球蛋白、α1-抗胰蛋白酶、α2-巨球蛋白、纤维蛋白原等10种人血浆高丰度蛋白进行ELISA鉴定，然后用WB方法对ELISA阳性样品作进一步验证。ELISA鉴定阴性的单克隆抗体再通过免疫沉淀结合质谱及表达cDNA文库进行鉴定。为了验证采用免疫沉淀结合质谱和表达型cDNA文库鉴定单克隆抗体所结合的特异性蛋白抗原的可靠性，我们采用免疫沉淀结合质谱和表达型cDNA文库对已知抗原的单克隆抗体进行鉴定，结果两种方法均准确鉴定出单克隆抗体所结合的特异性抗原。到目前为止，已采用免疫沉淀结合质谱方法鉴定了15株抗人血浆蛋白单克隆抗体所针对的特异性抗原(其中包括白蛋白，转铁蛋白等高中丰度血浆蛋白，以及角蛋白、组蛋白H等血浆低丰度蛋白)；采用表达型cDNA文库方法鉴定了针对6株单克隆抗体的特异性抗原，但该方法周期较长。因此，按照本发明的方法，联合使用已知的免疫沉淀和质谱技术，完全可以明确鉴定这些单克隆抗体的特异性抗原，并且可望实现高通量检测。
只有高质量的抗体才能保证通过免疫沉淀、免疫组化及抗体芯片等方法对蛋白质进行定性、定量和蛋白质相互作用研究，为此我们对已制备的部分单克隆抗体进行了亚类和亲合力测定。结果表明，已测定的所有单克隆抗体均为IgG，亲和力常数介于1010M-1-1012M-1。因此，这些抗体均可以完成免疫印迹和免疫组化分析，显示了良好的品质。
制备抗人组织或血浆蛋白单克隆抗体的初步研究表明(1)采用液相层析法对细胞或组织蛋白进行组化分离并结合抗体依赖的亲合吸附技术制备差减抗原完全可实现多轮的免疫差减；(2)免疫沉淀结合质谱分析及表达型cDNA文库技术可实现对抗体特异性抗原的鉴定。
实施例3本发明所述的方法制备的单克隆抗体用于制备蛋白质组研究的试剂的应用在蛋白质组学研究中，可利用已获得的单克隆抗体制备的试剂通过ELISA、免疫印迹(WB)、免疫沉淀(IP)、抗体芯片等技术用于对蛋白质进行定性、定量、定位及相互作用的研究。
1、蛋白质定量、定性研究试剂我们利用按本发明方法制备的单克隆抗体制备的抗体芯片，建立了可高通量测定人体血浆中各主要高丰度蛋白在生理或病理状态下蛋白浓度变化情况测定的方法。
2、蛋白质相互作用研究试剂抗体介导的免疫沉淀是目前研究蛋白质间相互作用的重要方法之一。由于按照本发明方法，单克隆抗体制备中使用的免疫原是细胞或组织来源的天然蛋白，所以不仅所制得的抗体具有很高亲和力和特异性，而且可获得非常适于完成蛋白质相互作用研究的抗蛋白复合体及跨膜蛋白的单克隆抗体。
3、高丰度蛋白去除试剂盒研究表明，在人血浆、血清及脊髓液中存在高浓度的人血清白蛋白、IgG、IgA、IgM、转铁蛋白、触球蛋白、a-1-抗胰蛋白酶、a-2-巨球蛋白、铜蓝蛋白，它们约占血浆总蛋白的90％以上，因此如何能从血浆中移去高丰度蛋白，是解决采用2DGE、LC/MS等蛋白质组学技术发现低丰度蛋白、鉴定新的肿瘤标志物的关键。应用本发明方法，我们已制备多株针对上述9种人类血浆高丰度蛋白的单克隆抗体，并从中筛选出特异性和亲和力高的抗体建立了简单、快速的高丰度蛋白去除试剂盒，其有效去处可达80％以上(见图11)。由于血浆中的高丰度蛋白也可能在其它组织中也是高丰度蛋白(例如肝脏)，因此这项技术可应用于其它组织蛋白质组学的研究中。
在本实施例中，为了评价利用本发明所述方法制备的单克隆抗体是否适用于蛋白质组学研究，本发明人进行了如下可行性和效果实验(1)抗体亚类测定从所制备的抗各蛋白组份的单克隆抗体中随机收集并培养5株杂交瘤细胞，用抗体亚类试剂盒鉴定培养物上清中单克隆抗体的亚类，结果证实所有被检测的抗体均为IgG，这样可以使用Protein G亲合柱层析法快速纯化所制备的单克隆抗体；(2)亲合力通过非竞争性ELISA方法随机测定了抗6种血浆蛋白(人血清蛋白、铜蓝蛋白、α1-抗胰蛋白酶、α2-巨球蛋白、IgM和IgG)的单克隆抗体的亲合常数(每种抗原的单克隆抗体随机挑选三株)。测定结果表明，所测定单克隆抗体的亲合常数介于1010M-1～1012M-1之间，这一结果表明通过本发明制备的单克隆抗体具有很高的亲和力(见附图6)；(3)免疫印迹和免疫组化由于肝脏是血浆蛋白的主要分泌器官，我们应用部分已制备的血浆蛋白单克隆抗体对血浆蛋白组分、胎肝胞浆蛋白质和成人肝胞浆蛋白质进行免疫印迹分析，并对成人肝切片进行免疫组化分析。免疫印迹结果表明，所有被检单克隆抗体均可对血浆蛋白呈阳性反应，部分单克隆抗体同时对血浆蛋白、肝脏胞浆蛋白呈阳性反应(见附图7)。免疫组化结果表明，所有被检单克隆抗体不仅可识别肝脏的血管内皮细胞和血窦，而且可特异地识别肝脏胞浆蛋白(见附图8)；(4)抗体芯片应用本发明方法制备的单克隆抗体建立了可用于分析人血浆白蛋白、球蛋白的抗体芯片。
上述这些结果表明，本发明方法制备的单克隆抗体完全适于制备用于完成蛋白质组学中抗体所执行的各项任务的试剂。
实施例4本发明所述的方法制备的单克隆抗体用于制备诊断和治疗疾病的药物的应用按本发明所述的方法制备的单克隆抗体也可用于制备诊断和治疗疾病的药物。例如，应用本发明所述的方法制备的抗人血浆铜蓝蛋白的单克隆抗体，以TRF技术建立了可快速对Wilsons病进行体外辅助诊断的方法。在疾病治疗方面，本发明人利用按本发明方法制备和鉴定的抗细胞/组织蛋白单克隆抗体建立了抗肝癌细胞膜蛋白单克隆抗体库，并从中筛选到一株有高解离常数的、能够特异地结合肝癌细胞的单克隆抗体，将该抗体分子的C末端偶联碘125后，成功地得到具有肝癌细胞杀死活性的肿瘤靶向杀伤剂，即可用于体外杀死肝癌细胞但对其它正常细胞没有损伤的肝肿瘤治疗剂(数据未示出)。
权利要求
1.抗细胞或组织蛋白质的特异性单克隆抗体库的制备方法，其特征在于该方法包括以下步骤A、首先用经过对特定细胞或组织蛋白质进行组分化，以组分化蛋白质为复合抗原免疫动物并以常规杂交瘤技术制备单克隆抗体；B、然后用已获得的单克隆抗体对组分化抗原制备差减抗原；以差减抗原为免疫原通过杂交瘤细胞技术制备下一轮单克隆抗体；C、最后鉴定每轮单克隆抗体所针对的抗原。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤A中的组分化方法为液相层析和/或分级分离方法。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤A中的组分化方法选自凝胶过滤法、等电点沉淀法或离子交换层析。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤B中的差减抗原的方法为亲和层析方法。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于使用符合抗原免疫动物以杂交瘤技术制备单克隆抗体的轮数至少为2轮。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤C中用于鉴定抗原的方法选自酶联免疫吸附、免疫沉淀结合质谱或表达型cDNA文库分析方法。
7.按权利要求1至6之一所述的方法制备的抗细胞或组织蛋白质的特异性单克隆抗体用于制备蛋白质组研究的试剂的应用。
8.按权利要求1至6之一所述的方法制备的抗细胞或组织蛋白质的特异性单克隆抗体用于制备诊断疾病的药物的应用。
9.按权利要求1至6之一所述的方法制备的抗细胞或组织蛋白质的特异性单克隆抗体用于制备治疗疾病治疗的药物的应用。
全文摘要
本发明涉及单克隆抗体库的制备方法，特别是涉及抗细胞或组织蛋白质单克隆抗体库的制备方法。本发明所述的方法包括以下步骤A.首先用经过对特定细胞或组织蛋白质进行组分化，以组分化蛋白质为复合抗原免疫动物并以常规杂交瘤技术制备单克隆抗体；B.然后用已获得的单克隆抗体对组分化抗原制备差减抗原；以差减抗原为免疫原通过杂交瘤细胞技术制备下一轮单克隆抗体；C.最后鉴定每轮单克隆抗体所针对的抗原。本发明克服传统的“先有抗原，后有抗体”的单克隆抗体制备技术中的上述缺陷，建立了一种“先有抗体，后有抗原”的特异性单克隆抗体库的制备方法。
文档编号C40B40/04GK1786298SQ20051010071
公开日2006年6月14日 申请日期2005年10月28日 优先权日2005年10月28日
发明者孙启鸿, 李明, 宁云山, 高建恩 申请人:上海博昂抗体生物科技有限公司