专利名称：漂浮于液体表面的试样的扫描电子显微镜观察方法
技术领域：
本实施例涉及用电子显微镜观察浮于离子液体的微小试样的凝集、分散，各试样的取向性等的方法。
背景技术：
漂浮于液体表面的微小试样根据亲水性、疏水性的不同而凝集、分散、排列。进一步地发现各颗粒根据磁场、电场、压力、温度等物理条件而在特定方向取向的现象。反过来，利用液面上的微小试样的不固定，通过控制磁场、电场、压力、温度等物理条件，自由地控制微小试样的方向的方法也已经实用化。通过在电子显微镜下观察这些物质的漂浮形态，对于分析催化剂、医药品、化妆品等功能性物质、微小晶体、有机粉末材料的物性、微小生物的生态而言是重要的。然而，现有的方法中将漂浮于液体表面的微小试样在高倍率下观察存在困难。这是由于通过电子显微镜的观察是在真空中进行的，水溶液、有机溶剂在真空环境下会挥发的缘故。作为解决该问题的方法，有人设计使用低温台(cool stage)、冷冻台(cryostage)，在冰点下使液体冻结后，用电子显微镜进行观察的方法。然而该方法在使液体冻结时，存在使微小试样的形状、凝集、分散、排列、取向性等形态变形的问题、即使将试样冻结在真空中水分也挥发的问题。另一方面，也有人考虑使用作为在真空环境中也不蒸发的液体材料的油。然而，对于该方法也存在伴随电子束的照射浮于油脂表面的试样剧烈地流动的问题、产生电荷(charge up)的问题。进一步地,还有人设计将液体置于大气压力下,使之与真空环境下的电子显微镜镜筒内的分界以薄膜分隔等方法，但即使用该方法，有时也不能观察漂浮于液体表面的微小试样。另一方面，还有在碳糊(力一> 一 ^卜)等中撒入微小试样，模拟再现微小试样在液体上漂浮的方 法的方法。在该方法中，由于解决了产生电荷(charge up)的问题、也没有流动性，具有电子显微镜下的观察变得容易的优点。然而，由于碳糊会快速凝固，在凝集、分散、排列、或者取向结束前，微小试样被快速固定，因此很难说使漂浮于液面上的微小试样的形态再现。另外，一旦将试样撒在碳糊上之后，微小试样被快速固定，因此不能控制各颗粒的方向。因此，作为在电子显微镜下观察以及控制液体中的微小试样的方法，开发了使用离子液体的方法。例如在专利文献I (W02007/083756)中，通过在试样表面涂布离子液体，可以解决产生电荷(charge up)的问题，进而可以用扫描电子显微镜以及透射电子显微镜观察试样的实际形状。在专利文献2(日本特开2009-266741号公报)中，将离子液体保持在微网(microgrid)、网格(mesh)等中,通过在其中投入试样使试样在离子液体中漂浮而观察。在专利文献3 (日本特开2010-25656号公报)中，通过在试样上涂布离子液体，可以使试样表面不暴露在大气中。现有技术文献
专利文献专利文献1:W02007/083756专利文献2:日本特开2009-266741号公报专利文献3:日本特开2010-25656号公报
发明内容
发明要解决的问题在上述现有技术中，存在以下的问题。在专利文献I中记载的发明的情况下，由于在试样表面涂布离子液体，存在试样本来的细小的结构、微小试样掩埋于离子液体中的问题。另外，在专利文献2中记载的发明的情况下，使用透射电子显微镜，可以透过离子液体中的试样而观察，但存在只要试样不露出离子液体的表面就不能通过扫描电子显微镜观察的问题、只要试样保持部件不被移动就不能控制试样的方向的问题。由于专利文献3在试样表面涂布离子液体，存在试样本来的细小的结构、微小试样掩埋于离子液体中的问题。因此，本实施例的目的是，实现使漂浮于离子液体表面的微小试样不被离子液体覆盖而在扫描电子显微镜下观察，使液面上的微小试样的凝集、分散、排列形态保持为自然状态，进一步地控制各微小试样的取向性、方向的方法。解决问题的手段通过使漂浮性或者疏水性试样浮于亲水性离子液体水溶液的表面，防止微小试样被离子液体覆盖。在亲水性试样的情况下，使用疏水性离子液体。通过使用粘性低、流动性大的离子液体水溶液，使微小试样能够在离子液体的表面自由地凝集、分散、排列，进一步地可以使沉降在离子液体中的微小试样能够再浮起。微小试样的形态稳定后，为了使在扫描电子显微镜下的观察容易，通过在电子显微镜观察前使离子液体水溶液干燥，降低离子液体水溶液的流动性。通过实施这些前处理之后在扫描电子显微镜下观察，解决现有的问题。进一步地，通过分别使用疏水性离子液体和亲水性离子液体，控制各微小试样的方向以及取向性。发明效果本实施例的使漂浮性或者疏水性试样浮于亲水性离子液体水溶液的表面而观察的方法，具有能够在自然状态下用电子显微镜观察液体表面的微小试样的凝集、分散、排列状态的效果。通过分别在疏水性试样的情况下使用亲水性离子液体、在亲水性试样的情况下使用疏水性离子液体，具有防止离子液体在试样表面的附着、可以观察微小试样、试样表面的微小结构的效果。进一步地，具有通过使不必要的物质在离子液体中沉淀，漂浮性或者疏水性试样的电子显微镜观察变得容易的效果。在仅一部分被亲水性化的试样的情况下，由于仅被亲水化后的面接触离子液体，因此可以使疏水性部位朝向电子显微镜的检测器的方向。另外，在使用疏水性离子液体的情况下，由于试样的朝向逆转，因此可以使亲水性部位朝向电子显微镜的检测器的方向。这样，在本实施例中，通过分别使用亲水性或者疏水性的离子液体，具有能够控制试样的方向性的效果。特别地，对于培养细胞、漂浮性浮游生物、花粉等微小生物、催化剂、医药品、化妆品等功能性物质、疏水性或者亲水性树脂、两亲性物质在扫描电子显微镜下的观察是有效的。
图1是实施例1的电子显微镜的试样室的侧视图。图2是实施例1的电子显微镜的试样室侧视图中的、使试样90°倾斜的说明图。图3是实施例1中的水表性黄金色藻(Chromophyton rosanoffii)的示意图。图4是表示通过实施例1的方法得到水表性黄金色藻的电子显微镜图像的程序的说明图。图5是表不实施例1中，将含有水表性黄金色藻的培养液滴在娃晶薄片上的状态的说明图。图6是表示实施例1中，在含有水表性黄金色藻的培养液中加入离子液体水溶液，制成图中16所示培养液与离子液体的混合液的状态的说明图。图7是表示实施例1中，在含有水表性黄金色藻的培养液中加入离子液体水溶液后放置3小时以上的状态的说明图。图8是使用实施例1的方法，实际用电子显微镜观察水表性黄金色藻的电子显微镜图像，是表示用本实施例的方法能够观察水表性黄金色藻的说明图。图9是不使用离子液体，用电子显微镜观察培养液中的水表性黄金色藻的电子显微镜图像，是表示能够看到来源于培养液的盐类的结晶、不能看到水表性黄金色藻的说明图。图10是表示实施例2中的、将离子液体水溶液滴在硅晶薄片之上的状态的说明图。图11是表示实施例2中的、在离子液体的水溶液中撒入花粉的程序的说明图。图12是使用实施例2的方法、实际用电子显微镜观察花粉的电子显微镜图像，是表示用本实施例的方法能够观察花粉的说明图。图13是表示实施例3的仅一部分被亲水性化的疏水性试样的概略的说明图。图14是表示实施例3中，将亲水性离子液体的水溶液滴在硅晶薄片上以后，撒入仅一部分被亲水性化的疏水性试样的程序的说明图。图15是表示在实施例3中，将仅一部分被亲水性化的疏水性试样滴在离子液体水溶液上以后，放置一定时间的状态，疏水性部位朝向上方而定向的状态的说明图。图16是在实施例3中，在疏水性离子液体中撒入仅一部分被亲水性化的疏水性试样后，放置一定时间的状态，亲水性部位朝向上方而定向的状态的说明图。
具体实施例方式以下用附图对本申请发明的各实施例进行说明。实施例1在图1中，表示了本实施例的电子显微镜的试样室的侧视图。本实施例的电子显微镜为扫描电子显微镜，试样室内部由电子显微镜物镜1、从电子显微镜物镜I对试样2照射的电子束3、检测来自试样2的反射电子信号4的反射电子检测器5、检测来自试样2的二次电子信号6的二次电子检测器7构成。试样2浮于滴在硅晶薄片8之上的离子液体9的表面。在本实施例中，将离子液体9滴在固定于电子显微镜用试样台10上的硅晶薄片8之上，但也可以将离子液体9直接滴在电子显微镜用试样台10上。试样中含有的杂质11沉于离子液体9的液滴底部，由于离子液体9在电子显微镜下是不透明的，杂质11在电子显微镜下观察不到。在本实施例中，由于可以将试样2固定于离子液体9的表面，因此，如图2所示，也可以将电子显微镜用试样台10倾斜为直角而从侧面观察试样2。 在本实施例中，将具有在液体上漂浮性质的植物浮游生物水表性黄金色藻作为试样，说明观察离子液体上的微小生物的方法。这里的实施例的形态不仅限于水表性黄金色藻，可以适用于以节肢动物、浮游生物、培养细胞为代表的微小生物的观察、其他密度比离子液体或者离子液体溶液轻的漂浮性试样、医药品、化妆品等功能性物质、微小晶体、有机粉末材料。水表性黄金色藻的概略示于图3。图3中水表性黄金色藻由细胞体12和柄部13形成，以柄部与液面接触的方式浮于培养液14中。图4是表示根据本发明的实施方式得到水表性黄金色藻的电子显微镜图像的程序的说明图。首先将含有水表性黄金色藻的培养液滴在硅晶薄片上，图5是表示该状态的说明图。代替硅晶薄片，也可以使用电子显微镜用金属性试样台，但优选试样台的表面平坦。图5中，含有水表性黄金色藻的培养液14使用水表性黄金色藻栖息的水池的水，是含有盐类的水溶液。图5中，15所示的用于滴加含有水表性黄金色藻的培养液的器具优选为能够进行计量的微量移液器，但如果没有必要规定培养液的滴加量，没有计量功能的移液器也可以。最适的培养液滴加量根据硅晶薄片或者试样台而变化，但如果是Icm2左右大小，20 μ I左右就是适当的。以下如图6的说明图所示，在含有水表性黄金色藻的培养液中加入离子液体水溶液，制成图中16所示的培养液与离子液体的混合液。离子液体水溶液是将离子液体用蒸馏水稀释后的溶液，浓度优选为20%以下。离子液体的浓度高的情况下，干燥不充分，离子液体流动化，有时导致干扰电子显微镜下的观察。本实施例中，由于以具有疏水性质的水表性黄金色藻为例，使用亲水性离子液体(C8H15N2BF4),但在为具有亲水性特征的试样的情况下，优选使用疏水性的离子液体。图6中，17所示的用于滴加离子液体水溶液的器具优选为能够进行计量的微量移液器，但如果没有必要规定离子液体的滴加量，没有计量功能的移液器也可以。最适的离子液体水溶液滴加量根据培养液的量而变化，但滴入的离子液体水溶液量优选比培养液少。在本实施例中，在含有水表性黄金色藻的培养液中滴入离子液体水溶液，但反过来，也可以对于离子液体滴入含有水表性黄金色藻的培养液。图7是在培养液中加入离子液体水溶液后放置3小时以上的状态。通过放置3小时以上，图7中11所示的水表性黄金色藻的细胞体浮起，使得以12所示的柄部与培养液与离子液体的混合液16接触。可是，由于水表性黄金色藻浮起的时间根据水表性黄金色藻的生长状况而变化，因此3小时的放置时间是基准。此时，在长时间放置期间，由于培养液与离子液体的混合液16中的水分蒸发，体积也减小，因此液滴的形状在薄膜上变化。培养液与离子液体的混合液16中的水分主要来源于培养液，但由于培养液中也含有盐分，伴随干燥，盐分浓度的上升，因而培养液中的盐分结晶化。图7中，18所示结晶化的盐分存在于培养液与离子液体的混合液16中，而结晶化的盐分可以通过光学显微镜以及目测观察。如果培养液与离子液体的混合液的干燥充分，在图7的状态下可以通过电子显微镜观察。在被认为干燥不充分的情况下，可以在真空环境下进行干燥。如果使用观察窗附带的真空脱泡装置还能够确认突沸的有无，因此作为在放入电子显微镜的试样室之前的前处理以及安全对策是有效的。可是，在培养液中加入离子液体水溶液后的干燥时间为3小时左右的情况下，由于残留有培养液与离子液体的混合液的流动性，有时在电子显微镜下水表性黄金色藻剧烈地流动。因此，干燥时间越长越好。可是，也可以使用干燥装置而使干燥时间缩短。图8是实际使用本实施例的方法用电子显微镜观察水表性黄金色藻的例子。图8中11为水表性黄金色藻的细胞体、12为水表性黄金色藻的柄部、16为培养液与离子液体的混合液。该观察例中使试样70°倾斜，但由于培养液与离子液体的混合液的流动被抑制至最小限度，因此水表性黄金色藻保持为直立状态。作为参考，图9中表示了不使用本实施例的方法而观察水表性黄金色藻的例子。在不使用离子液体的情况下，来源于水表性黄金色藻的培养液的盐类结晶化，成为水表性黄金色藻的观察的障碍。另外，由于培养液也完全干燥，不能观察漂浮于液体上的水表性黄金色藻。图9中，18为盐类的结晶。在使用图8的本实施例的方法的情况下，盐类的结晶被认为处于沉淀于培养液与离子液体的混合液中或者溶解于混合液中的状态。在电子显微镜下，由于培养液与离子液体的混合液是不透明的，观察不到沉淀到混合液的内部的盐类。因此，水表性黄金色藻的观察变得容易。实施例2以下说明根据本实施例的方法，从含有砂粒的花粉，仅将花粉分离于离子液体上，使花粉的电子显微镜观察容易的方法。该方法不仅适用于花粉，可以适用于以孢子、螨、昆虫为代表的微小生物的观察、其他密度比水轻的漂浮性试样或者疏水性试样。首先将离子液体的水溶液滴在硅晶薄片上，图10是表示该状态的说明图。代替硅晶薄片，也可以使用电子显微镜用金属性试样台，但优选试样台的表面平滑。图10中，17所示的用于滴加离子液体水溶液的器具优选为能够进行计量的微量移液器，但如果没有必要规定离子液体水溶液的滴加量，没有计量功能的移液器也可以。最适的离子液体水溶液的滴加量根据硅晶薄片或者试样台而变化，但如果是Icm2左右大小，20 μ I左右就是合适的。图10中，离子液体水溶液19是将离子液体用蒸馏水稀释后的溶液，浓度优选为5%以下，也可以为1%。离子液体的浓度高的情况下，有时会干燥不充分，离子液体流动化而有时导致干扰电子显微镜下的观察。离子液体的水溶液由于离子液体的浓度越低粘性越小，因此低浓度的话易于在硅晶薄片上薄薄地铺开。如果通过之后的干燥将离子液体水溶液的水分除去，则离子液体水溶液19的厚度进一步变薄，成为薄膜状。在本实施例中使用了亲水性离子液体(C8H15N2BF4),但在具有亲水性特征的试样的情况下，优选使用疏水性离子液体。以下如图11所示，在图中离子液体的水溶液19中，撒入花粉20，放置一昼夜而使剩余的水分干燥。此时，也可以将离子液体的水溶液放置一昼夜而使之充分地干燥后，撒入花粉20。为了将多余的水分除去，优选放置一昼夜，但也可以通过减少离子液体水溶液的滴加量、使用干燥装置而使放置时间缩短。在离子液体水溶液的干燥之前将花粉撒入的情况下，花粉为半埋于干燥后的离子液体水溶液的液面上的状态，因而花粉的固定良好。另一方面，在离子液体水溶液的干燥后将花粉撒入的情况下，花粉不会埋没于离子液体中，能够很好地观察。在任意一种情况下，比重比离子液体水溶液重的物质、例如砂粒等杂质在沉降在离子液体中而从作为目的物的花粉分离。由于离子液体在扫描电子显微镜下是不透明的，从扫描电子显微镜的视野观察不到砂粒等杂质。在使离子液体的水溶液干燥前将花粉撒入的情况下、在干燥后将花粉撒入的情况下，只要离子液体水溶液中的水分充分地蒸发，任何一个都可以用电子显微镜观察。为了充分地进行干燥，也可以在用电子显微镜观察之前进行真空干燥。在图12中，显示了在离子液体水溶液的干燥后将花粉撒入的情况下的电子显微镜图像。在图12中，19为离子液体水溶液，20为花粉。花粉20不埋没于离子液体水溶液19中而固定。实施例3以下，根据本实施例的方法，对于仅一部分被亲水性化的疏水性试样，说明确定试样的方向性而固定的方法。在图13中，显示了仅一部分被亲水性化的疏水性试样的概略。如图13所示，仅一部分被亲水性化的疏水性试样是指图13中，由疏水性部位21和亲水性部位22形成的试样。首先，将图14中23所示亲水性离子液体的水溶液滴在硅晶薄片上。代替硅晶薄片，也可以使用电子显微镜用金属性试样台，但优选试样台的表面平坦。最适的离子液体水溶液的滴加量根据硅晶薄片或者试样台而变化，但如果为Icm2左右大小，20 μ I左右就是合适的。离子液体水溶液是将离子液体用蒸馏水稀释的后的溶液，浓度优选为5%以下，也可以为1%。以下如图14所示，在图中23所示亲水性离子液体的水溶液中，撒入仅一部分被亲水性化的疏水性试样，放置一昼夜。在溶液中含有仅一部分被亲水性化的疏水性试样的情况下，用移液器等滴在离子液体水溶液之上。反过来，也可以对于含有试样的溶液滴入离子液体水溶液。将仅一部分被亲水性化的疏水性试样撒在离子液体水溶液上以后，通过放置一定时间，如图15所示，仅一部分被亲水性化的疏水性试样的亲水性部位与离子液体水溶液接触，疏水性部位21朝向上方而定向。进一步地，通过多余水分的蒸发，试样被紧紧地固定于离子液体水溶液的表面。通过进行处理至图15的状态，可以用电子显微镜观察。为了将离子液体的水溶液中多余的水分除去，优选放置一昼夜，但也可以通过减少离子液体水溶液的滴加量、使用干燥装置而使放置时间缩短。该方法在用电子显微镜只观察仅一部分被亲水性化的疏水性试样的疏水性部位时是有效的。与此相反，在想要观察仅一部分被亲水性化的疏水性试样的亲水性部位的情况下，如图16所示，通过使用图中的疏水性离子液体24，可以使亲水性部位22朝向上方。符号说明I:电子显微镜物镜；2:试样；3:电子束；4:反射电子信号；5:反射电子检测器；6: 二次电子信号；7: 二次电子检测器；8:硅晶薄片；
9:离子液体；10:电子显微镜用试样台；11:杂质；12:水表性黄金色藻的细胞体；13:水表性黄金色藻的柄部；14:含有水表性黄金色藻的培养液；15:用于滴加含有水表性黄金色藻的培养液的器具；16:含有水表性黄金色藻的培养液与离子液体的混合液；17:用于滴加离子液体水溶液的器具；18:盐类的结晶；19:离子液体水溶液；20:花粉；21:仅一部分被亲水性化的疏水性试样的疏水性部位；22:仅一部分被亲水性化的疏水性试样的亲水性部位；23:亲水性离子液体的水溶液；24:疏水性离子液体。
权利要求
1.电子显微镜以及标本观察方法，以由阳离子和阴离子构成的、在真空中完全不挥发、或者几乎不挥发的离子液体为必需成分，使扫描电子显微镜(SEM)用试样浮于离子液体，从而能够观察液体表面的标本的运动。
2.标本的利记博彩app与标本制作装置， 其为使用扫描电子显微镜观察的标本的利记博彩app和标本制作装置， 包括以下工序:使用粘性低的离子液体水溶液，在使标本在离子液体的内部或者表面自由地运动后，使离子液体干燥，将水分除去，从而提高离子液体溶液的粘性，使标本固定。
3.标本的利记博彩app与标本制作装置， 其为用于浮于离子液体的扫描电子显微镜用标本的利记博彩app与标本制成装置， 包括以下工序:将粘性低的离子液体溶液涂布在电子显微镜用试样台上之后，将粉末标本撒在离子液体上而使标本固定。
4.标本的利记博彩app与标本制作装置， 其为用于浮于离子液体的扫描电子显微镜用标本的利记博彩app与标本制作装置， 包括通过将离子液体或者离子液体溶液与含有粉末标本的悬浊液混合而使试样固定的工序。
5.标本的利记博彩app与标本制作装置， 其为用于浮于离子液体的扫描电子显微镜用标本的利记博彩app与标本制作装置， 包括通过使疏水性标本浮于亲水性离子液体而从标本的表面将离子液体除去的工序。
6.标本的利记博彩app与标本制作装置， 其为用于浮于离子液体的扫描电子显微镜用标本的利记博彩app与标本制作装置， 包括通过使亲水性标本浮于疏水性离子液体而从标本的表面将离子液体除去的工序。
7.标本的利记博彩app与标本制作装置， 其为含有亲水性部位和疏水性部位的扫描电子显微镜用标本的观察方法， 包括以下工序:通过使含有亲水性部位和疏水性部位的标本浮于疏水性离子液体，使亲水性部位朝向扫描电子显微镜的检测器的方向。
8.标本的利记博彩app与标本制作装置， 其为含有亲水性部位和疏水性部位的扫描电子显微镜用标本的观察方法， 包括以下工序:通过使含有亲水性部位和疏水性部位的标本浮于亲水性离子液体，使疏水性部位朝向扫描电子显微镜的检测器的方向的工序。
9.标本的利记博彩app与标本制作装置， 其为用于浮于离子液体的用扫描电子显微镜观察的标本的利记博彩app与标本制作装置，包括以下工序:使用离子液体或者离子液体溶液，将比重比离子液体或者离子液体溶液轻的标本从比重比离子液体或者离子液体溶液重的杂质分离。
10.标本的利记博彩app与标本制作装置， 其为用于浮于离子液体的扫描电子显微镜用标本的利记博彩app与标本制作装置， 包括以下工序:从含有盐的标本中，通过使盐溶入离子液体或者离子液体溶液中或者通过使离子液体或者离子液体溶液中的盐结晶，将盐从标本分离，所述盐为阴离子(anion)与来源于碱的阳离子(cat ion )进行离子结合后的化合物。
全文摘要
使漂浮在离子液体表面的微小试样不被离子液体覆盖而通过扫描电子显微镜观察。通过使漂浮性或者疏水性试样浮于亲水性离子液体水溶液表面，防止微小试样被离子液体覆盖。在亲水性试样的情况下，使用疏水性离子液体。通过使用粘性低、流动性大的离子液体水溶液，微小试样能够在离子液体表面自由地凝集、分散、排列，进而使沉降在离子液体中的微小试样能够再浮起。微小试样的形态稳定后，为了使在扫描电子显微镜下的观察容易，通过在电子显微镜观察前使离子液体水溶液干燥，使离子液体水溶液的流动性降低。
文档编号H01J37/20GK103168221SQ20118004864
公开日2013年6月19日 申请日期2011年9月16日 优先权日2010年10月8日
发明者盐野正道, 西村雅子, 许斐麻美, 桑畑进 申请人:株式会社日立高新技术