用于检测稀有细胞的方法和装置的利记博彩app

专利名称：用于检测稀有细胞的方法和装置的利记博彩app
技术领域：
本发明申请涉及成像技术，特别地涉及一种稀有细胞的成像。
背景技术：
下列内容涉及成像技术。参照示例性实施方式具体描述下列内容，所述实施方式 涉及离心血样的血沉棕黄层中的稀有细胞例如上皮细胞的成像。然而，下列内容更一般地 涉及用于在大的视场产生实质上均勻的静态照明的照明系统，以及涉及使用同样原理的显 微镜。在定量血沉棕黄层分析技术中，使用抗凝血添加剂、离心法等将血液分离成包括 血沉棕黄层成分的组分来提取和处理全血样品，血沉棕黄层主要包含白血球。使用合适的 荧光染料来标记出现在血沉棕黄层中的感兴趣的稀有细胞，如与一些癌有关的一些上皮细 胞，然后使用荧光显微成像来计数荧光染料所标记的感兴趣的细胞。定量血沉棕黄层分析 是用于筛检一些癌、用于监控癌治疗等的有希望的非侵害性技术。血沉棕黄层中的荧光染料标记的稀有细胞的浓度是低的。光学扫描荧光显微术通 过相对于血沉棕黄层样品扫描显微镜的视场能够实现大面积的血沉棕黄层样品的评估。通 过相对于血沉棕黄层样品移动显微镜、通过相对于显微镜移动血沉棕黄层或通过其中的 一些组合可实现扫描。用高强度均勻光照明的大视场对于快速和准确地分析血沉棕黄层样 品中荧光染料标记的稀有细胞是有利的。所述照明还可方便地使用单色光或窄带宽光以便 促进稀有细胞荧光和分散照明之间的光谱差异。然而，在大的视场范围内提供均勻的高强度照明是困难的。在白光源的情况下，一般需要滤波以提供单色或至少在光谱上被限制的照明。光 谱滤波阻挡了在所选的光谱范围外的大部分光输出。因此，用白光源照明是光效率低的。高 强度白炽白光源例如氙灯也产生大量的热，这可不利地影响定量血沉棕黄层分析。激光光源在产生光谱窄的光方面是更光学有效的。例如，氩激光器在488nm和 514nm输出高强度窄光谱线，以及在其它波长输出较弱的线。这些波长适于在一些标记染料 中激发发光，这些染料在约550nm处发光。然而，激光器一般输出严格平行光束(collimated beam)，其在窄光束截面区具有 高度不均勻的高斯强度曲线或分布。此外，激光束是相干的，以及由于波前之间的干涉一般 呈现出散斑图。所述散斑图可具有与稀有细胞的典型尺寸重叠的空间频率。当扫描所述视场时，所述散斑图还可移动或改变。激光的这些方面实质上使确定所检测的发光特征是荧 光染料标记的稀有细胞还是照明假象变得复杂化。使用光束均勻器可改善空间均勻性。一种光束均勻器通过提供实质上抵消高斯光 束分布的逆高斯吸收分布来操作。另一种光束均勻器以将所述光重新分布成平的空间分布 的方式使用两个或更多透镜(或复合透镜)来折射高斯光束。然而，在显微荧光成像中使 用光束均勻器是存在问题的，因为通过显微镜物镜聚焦均勻的光束可引入另外的光束不均 勻性。此外，光束均勻器实质上一般不降低散斑不均勻性。在称作共焦显微术的另一方法中，激光束在大的视场快速扫描或扫掠。所述视场 被采样而不是作为整体成像。在此动态方法中，在任何给定时刻及时照明的样品的部分比 所述视场小的多。通过在所述视场上快速扫描聚焦的激光束，从所获得的样品点可构造图 像。通过快速采样所述视场实际上动态模拟了均勻照明。共焦显微术是已建立的技术。然而，所述光束扫描实质上增加了显微镜系统的复 杂性和成本。共焦显微术对透镜或其它光学部件中的小缺陷还可能是高度灵敏的。因此， 应使用很高质量的光学器件，这又增加了系统成本。参考引入于2002年10月3日提交的no. 10/263，974以及于2004年4月8日被公布为美 国Publ. Appl. No. 2004/0067162A1的美国申请，在这里通过参考被全部加入。于2002年10月3日提交的no. 10/263，975以及于2004年4月8日被公布为美 国Publ. Appl. No. 2004/0067536A1的美国申请，在这里通过参考被全部加入。与本发明同时提交，题目为“《用于稀有细胞的检测的方法和设备》(Method and Apparatus for Detection of Rare Cells) ”、发明人为 Albert Ε. Weller, III，以及相应 于代理人档案号no. BATZ 00009的美国专利申请no.—，，在这里通过参考被全部加入。与本发明同时提交，题目为“《取样管处理设备》(Sample Tube HandlingApparatus) ”、发明人为 Steve Grimes、Thomas D. Hauber 和 Eric R. Navin,以及 相应于代理人档案号no. BATZ 200010的美国专利申请no.—，，在这里通过参考被全部 加入。

发明内容
根据一方面，公开了一种方法，用于识别生物流体层中的荧光染料标记的稀有细 胞，所述生物流体层包含在试管内壁和浮体壁间的环状间隙中，所述方法包括以下步骤使 用显微镜系统在一个或更多焦深处获取一个或更多分析图像；图像处理所获取的每一分析 图像以识别候选的稀有细胞图像；选择性地旋转所述试管；沿试管轴线选择性地相对平移 所述试管和所述显微镜系统；对通过所述选择性旋转和选择性地相对平移以及实质上跨越 所述环状间隙所进入的多个视场，重复获取和图像处理步骤。优选地，所述的方法还包括向相关的人类分析员显示每个被识别的稀有细胞图 像；以及从所述相关的人类分析员接收显示的所述候选的稀有细胞图像是否相应于染料标 记的稀有细胞的指示。优选地，显示的步骤包括显示包含从所述分析图像提取的所述候选的稀有细胞 图像的图像区域，所述分析图像包含所述候选的稀有细胞图像；以及显示从另外的分析图像提前的至少一个相应的图像区域，所述另外的分析图像在深度上相邻于包含所述候选的 稀有细胞图像的所述分析图像。优选地，所述的方法还包括基于所述生物流体层中的背景荧光来确定用于获取 所述一个或更多分析图像的所述一个或更多焦深。根据另一方面，公开了一种装置，包括非易失性存储介质，所述装置编码可由数字 处理器执行的指令以实行一种方法，所述方法用于识别在显微镜所获取的生物流体层的分 析图像中的荧光染料标记的细胞，所述生物流体层具有的所述染料标记的细胞的密度小于 每分析图像约一个染料标记的细胞，所述方法包括图像处理每一分析图像以识别具有特 征尺寸的候选特征，所述特征尺寸实质上与所述分析图像中荧光染料标记的细胞图像的期 望尺寸相应。优选地，所述图像处理包括使用滤波核来匹配滤波每一分析图像，所述滤波核具 有的尺寸实质上相应于所述分析图像中荧光染料标记的细胞图像的所述期望尺寸。优选地，所述滤波核是方形的。优选地，所述滤波核是圆形的。优选地，每一分析图像的所述图像处理还包括为匹配滤波的所述分析图像限定 阈值，以生成相应的二进制图像；以及基于所述二进制图像的连接性分析来识别所述候选 特征。优选地，所述限定阈值采用根据所述分析图像的信噪比计算的阈值。根据又一方面，公开了一种方法，用于使用显微镜系统识别生物流体层中的荧光 染料标记的细胞，所述显微镜系统具有在可选择的焦深的视场，所述显微镜的视场实质上 小于所述生物流体层的区域，所述方法包括以下步骤基于由所述荧光染料标记造成的所 述生物流体层的背景荧光，来识别所述生物流体层的深度；使用所述显微镜系统，在或接近 所述生物流体层的识别的所述深度的一个或更多焦深处，来获取一个或更多分析图像；图 像处理获取的所述一个或更多分析图像以识别可以与染料标记的细胞相应的候选特征；以 及相对移动所述视场和所述生物流体层；以及重复识别、获取、图像处理和相对移动的步骤 以识别在所述生物流体层的所述区域上的候选特征。优选地，识别的步骤包括在跨越预选的环绕深度范围的不同焦深处获取多个深 度采样图像；以及识别所述生物流体层的所述深度为相应于获取的最亮的所述深度采样图 像的所述焦深。优选地，所述一个或更多分析图像包括至少获取的最亮的所述深度采样图像。优选地，所述一个或更多分析图像包括至少最亮的所述深度采样图像以及两个额 外的深度采样图像，所述两个额外的深度采样图像具有的焦深接近于最亮的所述深度采样 图像的光学焦深。优选地，所述一个或更多分析图像被以高于所述深度采样图像的分辨率获取，并 且被在获取所述多个深度采样图像之后获取。优选地，深度采样图像的数量大于或等于所述预选的环绕深度范围除以所述显微 镜系统的景深。优选地，识别所述生物流体层的所述深度的步骤包括通过所述显微镜系统的物 镜照明所述生物流体层；以及识别所述显微镜系统的所述物镜的焦深，在所述焦深处所述照明产生通过所述物镜观察的最大的背景荧光。优选地，所述生物流体层的厚度大于所述显微镜系统的景深，以及获取所述一个 或更多分析图像的步骤包括获取大于或等于生物流体样品的厚度除以荧光成像器的景深 的多个分析图像。优选地，每一分析图像的所述图像处理包括使用滤波核来匹配滤波所述分析图 像，所述滤波核的尺寸实质上匹配所述分析图像中荧光染料标记的细胞的图像。优选地，每一分析图像的所述图像处理还包括采用根据所述分析图像的信噪比 计算的阈值来为匹配滤波的所述分析图像限定阈值，以生成在其中识别所述候选特征的相 应的二进制图像。优选地，所述的方法还包括在试管中布置包含荧光染料标记的细胞的生物流体 样品；在所述试管中布置浮体，所述浮体界定所述浮体的外表面与所述试管的内表面之间 的环状间隙；以及离心在其中布置所述生物流体样品和所述浮体的所述试管，所述离心使 得包括所述荧光染料标记的细胞的所述生物流体样品的组分在所述环状间隙处分离以界 定所述生物流体层。优选地，所述生物流体样品是血样，分离的所述生物流体层是包含荧光染料标记 的细胞的血沉棕黄层。优选地，所述浮体包括与所述试管的所述内表面接合以密封所述环状间隙的至少 两个环状脊，所述环状脊在离心期间从所述试管的所述内表面脱离，以允许所述生物流体 样品的分离的所述组分进入所述环状间隙。本发明的许多优点和益处在本领域的普通技术人员阅读下面优选实施方式的详 细说明时将变得显而易见。


本发明可采取多种部件和部件配置以及多种过程操作和过程操作配置的形式。附 图仅是为了说明优选实施方式，以及不解释为限制本发明。图1简要示出包括光学系统的显微镜系统，光学系统实质上在整个显微镜视场提 供大体上均勻的静态照明。图2简要示出具有修改的光学系统的图1的显微镜系统。图3简要示出具有另一修改的光学系统的图1的显微镜系统。图4简要示出具有又一修改的光学系统的图1的显微镜系统。图5-10示出试管支架的多个视图图5示出所述支架的透视图，其中框架以虚线显示以展示内部部件。图6示出所述支架的侧视图，其中框架以虚线显示。图7示出试管以及定位和偏置轴承的透视图。图8示出包括偏置力的指示的试管支架的顶视图。图9示出包括成形基部的试管的第二端的侧视图。图10示出旋转联接器的顶视图，旋转联接器包括设置成与图9所示的试管的成形 基部匹配的轮廓。图IlA和IlB示出另一实施方式的试管支架的顶视图，其中试管具有被加载的偏
8心截面。图12示出使用倾斜滚柱轴承的试管支架的一部分的侧视图。图13示出使用倾斜滚柱轴承的试管支架的一部分的侧视图，滚柱轴承沿试管轴 交错，以及具有螺旋形脊的浮体能够实现试管的螺旋扫描。图14示出试管支架的透视图，试管支架水平支持试管以及使用试管作为偏置力。图15示出试管支架的顶视图，试管支架使用衬套表面作为定位轴承以及使用一 组球轴承作为偏置轴承。图16简要描述与执行定量血沉棕黄层分析有关的一些测量参数，该分析使用在 试管内壁和浮体外表面之间的环状间隙中收集的血沉棕黄层样品。图17简要示出合适的定量血沉棕黄层测量/分析方法。图18简要示出另一合适的定量血沉棕黄层测量/分析方法。图19简要示出用于标记候选细胞的合适的图像处理方法。图20示出用于方形滤波核(filter kernel)的像素布局，方形滤波核适于在匹配 滤波中使用。图21示出图20的方形滤波核的像素强度截面A-A。图22简要示出用于使分析员能够确认或拒绝候选细胞的合适的用户验证过程。优选实施方式的详细说明参考图1，显微镜系统10使与血沉棕黄层样品重合的显微镜视场成像，所述棕黄 层样品布置在环状间隙12的大体上平面的部分，所述环状间隙12在透光试管壁14和布置 在试管内的浮体的浮体壁16之间。用于获得和制备这样的血沉棕黄层样品的合适的方法 和装置在例如美国 Publ. Appl. No. 2004/0067162A1 和美国 Publ. Appl. No. 2004/0067536A1 中公开。尽管所述试管和浮体是弯曲的，所述显微镜视场通常是平面的，因为所述显微镜 视场一般比试管壁14和浮体壁16的曲率半径在尺寸上小的多。虽然所述视场实质上是平 的，然而布置在透光试管壁14和浮体壁16之间的血沉棕黄层样品可具有的厚度实质上大 于显微镜系统10的景深(cbpth ofview)。所述试管以有助于扫描跨越所述环状间隙的显微镜视场的方式安装在相应于显 微镜系统10的固定位置。正如将要讨论的，优先提供合适的机制，以在包含血沉棕黄层样 品的环状间隙范围内实现视场的相对旋转和/或平移扫描。显微镜系统10包括激光器18，例如气体激光器、固态激光器、半导体激光二极管 等，其产生激光束形式的源光20(在图1中用虚线简要示出)，所述激光束具有照明波长和 不均勻的空间分布，该分布一般为高斯或大致高斯形状，在所述光束的中心区强度最高，以 及随着离光束中心的距离增加，强度降低。光学组件22设置成接收空间不均勻源光20以 及输出校正的空间分布。光束扩散器包括凹透镜24，其一般使激光束发散；和以较大的直径校准扩散光 束的准直透镜26，该直径实质上与光束均勻器30的高斯空间特性曲线的直径匹配。光束均 勻器30实质上通过使所述源光的高斯或其它不均勻分布均勻来使扩展的激光束变平，以 产生具有改善的空间均勻性的输出光。在一些实施方式中，光束均勻器30通过具有相应于逆高斯的空间不均勻吸收分布来操作。在这样的实施方式中，所述光束均勻器在相应于所述扩展激光束的最高强度中 心区域的中心区域内具有最高的吸收，以及在相应于所述扩展激光束的较低强度外部区 域的周边具有较低的吸收或无吸收。在其它实施方式中，光束均勻器30例如使用合适的透镜对来折射性地重新分布 光以使在所述扩展激光束的所述区域的光强度均勻化。折射的光束均勻器将来自所述扩展 激光束的高强度中心区的光折射进较低强度的周边区域。聚焦透镜34和配合透镜36将扩展且平或均勻的激光束减少到期望的光束直径以 输入到物镜40，激光束在显微镜视场被聚焦。二向色镜44被选择以实质上在激光束波长或 波长范围反射光，以及实质上在荧光染料的荧光波长或波长范围透射光，所述荧光染料用 于标记血沉棕黄层样品中的稀有细胞。光学组件22包括静止的光学部件24、26、30、34、36，其设置成将校正的空间分布 输出到物镜40，当校正的空间分布被物镜40聚焦在显微镜视场时，实质上在整个显微镜视 场提供大体上均勻的静态照明。物镜40将校正的照明聚焦到显微镜视场。物镜40可包括 单个物镜透镜或可包括两个或更多物镜透镜。例如通过调整物镜40和透光试管壁14之间 的距离，可调整显微镜系统10的焦深(focus depth) 0另外或可选地，通过在物镜40内相 对移动两个或更多透镜或透镜元件可调整所述焦深。光束均勻器30设计成输出实质上一致的均勻光束，以用作合适直径的高斯输入 光束。然而，物镜40 —般引入一些空间不均勻性。因此，一个或更多静止光学部件，例如发 散透镜24、准直透镜26、聚焦透镜34和/或聚焦透镜36可选地设置成将空间不均勻性引入 到所述空间分布，从而当所述光束被物镜40聚焦时，提供显微镜视场的实质上均勻的静态 照明。在一些预期的实施方式中，此校正的空间不均勻性由一个或更多专用光学部件(未 显示)引入，其包括在用于此目的的光学组件22中。所述显微镜视场的实质上均勻的静态照明使布置在所述显微镜视场内的任何荧 光染料标记的上皮细胞发荧光。另外，所述荧光染料一般会给血沉棕黄层产生较低强度的 背景荧光。所述荧光由物镜40捕获，以及所捕获的荧光50 (在图1中用虚线简要示出)通 过二向色镜44，以及通过可选的用于排除任何杂散源光的滤波器52，以由摄像机系统56 成像。摄像机系统56可例如包括用于获得电子图像的电荷耦合器件(CCD)摄像机，所述电 子图像可存储在计算机、存储器卡或其它非易失性存储器中以用于随后的图像处理。参考图2和图3，描述了其它合适的显微镜系统。图2示出显微镜系统10’，其类似于图1的显微镜系统10，除了光学组件22’，其不 同之处在于，图1的静止光束均勻器30由静止的漫射器30’替代。漫射器30’可例如为全 息漫射器，例如可从Physical Optics Corporation (Torrance, CA)获得。这样的全息漫射 器使用提供随机非周期性光学结构的全息图，所述光学结构漫射光以产生改善的空间均勻 性。然而，所述光的漫射还产生伴随的光束发散。一般，光的较强的漫射往往产生较多的空 间均勻性，但是也往往产生较大的光束发散。全息漫射器根据发散角的半高全宽(FWHM)被 适当分类，较大的发散角一般提供较多的漫射以及较大的光均勻性，但是由于增加的光束 发散也导致显微镜系统10’内增加的光损失。在显微镜系统10’的一些实施方式中，漫射器30’为小角度漫射器，其具有的FWHM 小于或约为10°。较小角度的漫射器一般优先提供较小的发散，并因而提供较好的照明通
10过效率；然而，若发散FWHM太低，那么漫射器将不提供足够的光漫射以产生足够的光束均 勻性。低漫射降低了漫射器30’均勻化高斯分布的能力，以及还降低了漫射器30’去除散 斑的能力。参考图3，另一实施方式的显微镜系统10”类似于显微镜系统10’，以及包括使用 漫射器30”的光学组件22”，所述漫射器30”类似于显微镜系统10’的漫射器30’。然而， 漫射器30”相对于光学组件22”的光路倾斜角度θ，以便实质上降低源光20的散斑图。不 局限于任何特定的操作理论，认为所述倾斜将散斑图移到较高的空间频率，这实际上使所 述散斑的尺寸更小。所述散斑尺寸通过所述倾斜在空间上被移动，从而频移的散斑实质上 小于成像的像素尺寸。在一些实施方式中，使用相对于光学组件22”的光路至少约30°的倾斜角Θ，对 于具有低到约5°的FWHM的漫射器30”，这被认为实质上降低了散斑。另一方面，即使对 于具有5°的FWHM的小角度漫射器，大于约45°的倾斜角θ被认为由于散射增加而降低 了照明通过效率。参考图4，应理解，在此公开的显微镜系统适合于除了包含在试管或由其支持的样 品成像外的其它显微应用。在图4中，显微镜系统10”’包括发光二极管(LED) 18”’作为光 源，而不是使用在先前显微镜系统10、10’、10”中的激光器18。由于LED18”’输出发散的 源光20”’而不是准直的激光束，光学组件22”’被更改，其中光速扩展的凹透镜24被适当 地省略，如图4所示。可替换地，一透镜可包括在透镜24的位置，但被选择来提供合适的发 散角调整，以通过准直透镜26准直。光学组件10”’使用类似于漫射器30’、30”的漫射器 30”，。LED18”，输出相干光，因此散斑一般不出现。然而，LED18”，的输出一般具有非高斯 分布，例如朗伯分布。由于源光20”’的这些特性，漫射器30”’并不倾斜，以及在一些情况 下，漫射器30”’可比不倾斜的漫射器30’具有更小的发散角，漫射器30’用于在图2的显 微镜系统10’中产生激光束源光20的空间均勻性。图4的显微镜系统10”’进一步不同于显微镜系统10、10’、10”，这是因为显微镜 系统10”’使布置在平面载物片60上的样品成像，可选地，载物片60由可选的盖玻片62盖 住。载物片60布置在x-y平面平移台64上，以实现所述样品的扫描。应理解，LED18”’和 光学组件22”’还适合于使布置在环状间隙12中的血沉棕黄层样品成像，所述环状间隙12 在透光试管壁14和浮体壁16之间，如图1-3所示。相反地，应理解，激光器18和光学组件 22、22’、22”’还适合于使载物片60上的平面样品成像，如图4所示。光学组件22、22’、22”、22”’具有部件，其在所述部件不旋转、相对振动或相反相对 移动的意义上是静止的。然而，作为整体移动光学组件和物镜40和/或包括光束转向元件 等以相应于所述样品能够实现所述视场的相对扫描是预期的。描述了用于使包含在试管或由其支持的环状样品成像的合适的显微镜系统。环状 间隙12 —般具有实质上大于显微镜物镜40的景深的厚度。试管壁12和浮体壁16 —般在 试管或浮体的整个表面是不一致的。尽管显微镜物镜40 —般具有可调整的焦深(通过移 动内部光学部件和/或通过向或远离试管壁12移动物镜40来调整)，然而调整范围是有限 的。因此，应夹持所述试管，以便当所述试管旋转和当物镜40或所述试管沿着管轴平移时， 接近物镜40的表面在远离物镜40的明确定义的距离处。接下来描述用于获得这样的方面的合适的试管支架。
参考图5-10，试管支架70在其中安装了试管72，试管72被试管塞子73密封。密 封的试管72包含浮体74和血，其被适当地处理和离心以分离出包括红血球、血浆和血沉 棕黄层的组分，例如在美国Publ.申请2004/0067162A1和2004/0067536A1中描述的。浮 体74具有的密度小于充满红血球的组分的密度(1. 090g/ml)，以及大于血浆组分的密度 (1.028g/ml)。因此，在离心后，浮体74沿试管轴线75 (在图6中画出和标记出)在充满红 血球的层和血浆层之间布置，即一般与血沉棕黄层重合。在离心后，血沉棕黄层一般布置在 试管壁14和浮体壁16之间的环状间隙12中。(见图6中的标志)。在浮体74端部的环 状密封脊76、78当试管72静止时与所述试管的内表面接合，以便密封环状间隙12。然而， 在离心期间，试管72伸展以提供跨越脊76、78的流体传递，以便使血沉棕黄层能够实质上 收集在环状间隙12中。在示例性试管支架70中的至少一个第一定位轴承，即径向间隔的两个第一定位 轴承80、81布置在环状样品区12的第一侧。在示例性试管支架70中的至少一个第二定位 轴承，即径向间隔的两个第二定位轴承82、83布置在环状样品区12的第二侧，环状样品区 12的第二侧沿试管轴线75与环状样品区12的第一侧相对。定位轴承80、81、82、83为固定 的滚柱轴承，其通过紧固构件85 (在图8中显示)固定到框架84。在示例性试管支架70中的至少一个偏置轴承，即两个偏置轴承86、87与定位轴 承80、81、82、83径向间隔开，以及被弹簧90弹性偏置以对着定位轴承80、81、82、83压试管 72,从而相对于定位轴承80、81、82、83对准环状样品区12接近物镜40的一侧。在示例性 试管支架70中，两个第一定位轴承80、81和第一偏置轴承86径向隔开120°的间隔，并位 于环状样品区12第一侧上的第一公共平面92内。相似地，两个第二定位弹簧82、83和第 二偏置弹簧87径向隔开120°的间隔，并位于环状样品区12第二侧上的第二公共平面94 内。弹簧90固定到框架84，以及通过构件98与偏置轴承86、87连接。更一般地，轴承80、81、86和轴承82、83、87可具有除了 120°以外的径向间隔。例 如，偏置轴承86可离每个定位轴承80、81相等的径向角被隔开。作为特定的例子，偏置轴 承86可离每个定位轴承80、81 135°被隔开，以及在此特定的例子中，两个定位轴承80、81 分离90°被隔开。可选地，第一公共平面92还包括浮体脊76，以使轴承80、81、86在脊76处压试管 72,以及相似地，第二公共平面94可选地还包括浮体脊78，以使轴承82、83、87在脊78处压 试管72。此方法降低了使环状样品区12扭曲的可能性。偏置轴承86、87提供了使试管72 向着定位轴承80、81、82、83偏置的偏置力96。框架包括沿着试管轴线75延伸的观察窗100。物镜40通过观察窗100观察环状 样品区12接近物镜40的一侧。在一些实施方式中，物镜40可沿试管轴线75线性平移，如 平移范围双箭头指示符104所指示的。这可例如通过将物镜40和光学组件22、22’、22”或 22”’安装在共同的板上来实现，所述板可相对于试管支架70平移。在另一方法中，显微镜 系统10、10，、10”、10”，是静止的，以及包括框架84的所述管支架70作为一个单元来平移， 以穿过所述窗100相对平移物镜40。在又一个实施方式中，物镜40平移，而光学组件22、 22’、22”或22”’保持静止，以及提供合适的光束转向部件(未显示)以将光束输入到物镜 40。例如通过在聚焦范围106内向或远离试管72移动物镜40，所述物镜40还可聚焦(平 移范围104和聚焦范围106仅在图6中示出)。
环状样品区12的扫描要求沿试管轴的平移，以及试管72绕试管轴线75的旋转。 为了实现旋转，旋转式联接器110设置成响应于由电动机112选择性地施加的扭矩而驱动 试管72绕管轴线75旋转，所述电动机112通过轴114与旋转式联接器110连接。示例性试 管支架70的旋转式联接器110在一端或其基部与试管72连接。试管72的相对端，弹簧加 载的盖116压试管72的塞子73以防止所述旋转使试管72沿试管轴线75的伴随的平动 滑移。具体参考图9和图10，在一些实施方式中，旋转式联接器110为成形联接器，其具 有设置成与试管72的成形基部122相匹配的轮廓120。在图9和图10所示出的实施例中， 联接器110的轮廓120包括四个凹陷，其接纳试管72的成形基部122的四个凸出部。可使 用其它轮廓特征。在一些实施方式中，轮廓120和成形基部122通过分别在联接器110和试管基部 122中的合适的旋转不对称的形状124、126(在图9和图10以虚线示出)来调节，以当试 管72的成形基部122与旋转式联接器110的轮廓120相匹配时限定试管72的绝对旋转位 置。以此方式，可保持所述绝对旋转位置(例如测量为以度数的绝对角度值)，即使试管72 从试管支架70移去然后重新安装到所述试管支架70。在提供绝对角位置的另一方法中，所示试管可选地包括基准标记，例如光可读反 射基准标记(未显示)以指示所述试管的绝对旋转位置。在一些实施方式中，第二侧定位滚柱轴承82、83被省略，以及旋转式联接器110限 定至少一个第二定位轴承，其沿试管轴线75布置在与环状样品区12的第一侧相对的环状 样品区12的第二侧上。在这样的实施方式中，所述旋转式联接器作为机械驱动定位轴承来 提供试管72的定位和旋转。可选地，在这样的实施方式中，第二侧偏置轴承87与相应的滚 柱轴承82、83 —起也被省略。另一方面，在一些其它设想的实施方式中，旋转式联接器110被省略，以及滚柱轴 承81、82、83、84、86、87的一个或更多为机械驱动的以旋转试管72。在这样的实施方式中， 所述驱动的滚柱轴承用作旋转式联接器。所述驱动轴承可以为定位轴承81、82、83、84的之 一或更多，或可以为偏置轴承86、87之一或更多。为了将试管72安装在试管支架70中，框架84装配有铰链盖或门130(在图5中 显示为开着，以及在图6中显示为关着)。当铰链盖或门130为开着时，弹簧加载的盖116 升离试管72的塞子73。可选地，支持偏置轴承86、87的支持构件73包括手动把手或杠杆 (未显示)，其用于抵抗弹簧90的偏置力来用手拉偏置轴承86、87离开试管72，从而便于从 所述支架70加载或卸载试管72。试管支架70可方便地对准所示出的具有直边的试管72。试管支架70也可容纳和 对准有一点锥形的试管。锥形试管的支持位置在图6中由指示锥形试管的锥形边缘的虚线 134示出。所示出的锥体134使所述试管最接近旋转式联接器110的端部比所述试管最接 近弹簧加载的盖116的端部直径小。如图6所示，偏置轴承86、87的偏置对着定位轴承81、 82、83、84压所述试管以保持环状样品区12接近物镜40的一部分的对准，而不管锥体134。 应理解，支架70可类似地容纳和对准具有相反锥体的试管，其中接近旋转式联接器110的 端部比最接近弹簧加载的盖116的端部直径大。在实质上为锥体的情况下，或在试管具有高度偏心或非圆形截面的情况下，对着定位轴承81、82、83、84的偏置不完全补偿锥体或截面的偏心率或椭圆率。这是因为第一定 位轴承81、82的径向间隔和第二定位轴承83、84的径向间隔允许向较窄的管延伸一段较远 的距离到第一定位轴承81、82间的间隙以及到第二定位轴承83、84间的间隙。参考图IlA和11B，更改的具有椭圆截面的试管72’通过每支撑浮体脊使用三个 轴承组被更精确地对准，其中所述三个轴承包括仅一个定位轴承81’以及两个或更多偏置 轴承86，。定位轴承81，与物镜40在相同的径向位置(在图IlA和IlB中以虚线示出)。 当椭圆试管72’旋转时，对着定位轴承81’偏置的成像边保持与径向重合的物镜40精确对 准，而不管成像边相应于椭圆试管72’的短轴(图11A)，还是成像边相应于椭圆试管72’的 长轴(图11B)。参考图12，在另一变形中，轴承140相对于试管72的管轴线75倾斜，以产生与管 轴线75平行的力分量而将试管72推向旋转式联接器110。在此装置中，弹簧加载的盖116 可选地被省略，因为在旋转期间，轴承140的倾斜阻止试管72的平动滑移。参考图13，在另一变形中，更改的浮体74’包括螺旋脊76’，以及倾斜的轴承142 依照螺旋间距沿管轴线75被隔开以响应于试管72的旋转跟踪螺旋密封脊76’。在此方法 中，倾斜的轴承142产生使试管72沿管轴线75平移的力，从而物镜40可保持在固定位置 而当扫描环状间隙12’时没有平移。在此方法中，滚柱轴承142适当地被机动化以产生试 管72的旋转。S卩，滚柱轴承142还用作旋转联接器。参考图14，在另一变形中，通过机械装置而非偏置轴承可提供机械偏置。在实施例 图14中，试管72水平布置，置于定位轴承181、182、183、184上，且物镜40安装在试管72 下。包括浮体74的试管72的重力186 (所述重力在图14中由向下的箭头186简要示出) 形成为对着定位轴承181、182、183、184压试管72的机械偏置。在其它设想的实施方式中， 使用真空夹盘、正气压、磁引力或其它机械偏置来对着所述定位轴承压所述试管。定位轴承 181、182、183、184可机械旋转以使定位轴承181、182、183、184用作旋转式联接器，或可提 供单独的旋转式联接器。参考图15，所述轴承可不同于滚柱轴承。例如，所述轴承可以为辊子、球轴承或衬 套表面。在图15所示的不同的试管支架中，框架200提供用于弹簧202的簧片，其对着试 管72压一组偏置球轴承204，以对着定位轴承211、212压试管72，所述定位轴承211、212 由框架200的衬套表面确定。可使用其它类型的轴承用于偏置和/或定位轴承，当试管旋 转时这些轴承支持所述试管。在除图13的实施方式以外所示出的实施方式中，所述试管并不在所述管支架内 平移，而通过平移物镜40或通过平移作为一个单元的所述试管和管支架来实现平移扫描 部分。在其它设想的实施方式中，可考虑保持物镜固定或在试管框架内平移试管，例如通过 包括连接电动机112和旋转式联接器110的轴114中的线性平移性能，使得试管72沿试管 轴线75平移。描述了合适的显微镜系统和试管支架，其用于使包含在试管中或由其支持的环状 样品区成像。应理解，环状样品区可以不同于包含在试管壁14和浮体壁16之间的间隙12 中的所示出的流体样品。例如，环状样品区可以为附在试管外表面上的膜或涂层，或环状样 品区可以为附在试管内表面上的膜或涂层。此外，术语“试管”应广义解释为包括除所示出 的常规试管72以外的其它管状样品 架。例如，所述试管可以为圆柱形杆，其插入所包含的容积、固体物体或其它感兴趣的对象中，从而用感兴趣的对象样品来覆盖所述圆柱形杆 的外侧，或所述试管可以为圆柱形地质核样品等。描述了合适的显微镜系统和试管支架，其用于从包含在试管中或由其支持的环状 载物片或环状样品区获取数据，现在描述合适的处理方法，其用于识别或量化在环状生物 流体层中的荧光染料标记的细胞。参考图16，简要示出一些测量参数。物镜40在视场(FOV)范围内和在位于焦深 的景深范围内成像。在图16中，所述焦深相对于物镜40被指示出，然而，所述焦深可相对 于另外的参考被标出。在一些实施方式中，物镜40的景深为约20微米，而试管壁14和浮 体壁16间的环状间隙12为约50微米。然而相应于环状间隙12的焦深由于试管和/或浮 体中的不均勻性或其它因素可实质上改变。期望环状间隙12位于环绕深度范围内的某处。 在一些实施方式中，300微米的环绕深度范围被认为是合适的。这些尺寸是例子，以及对于 特定的实施方式可实质上不同，这取决于特定的物镜40、透光试管、浮体、离心类型或所使 用的其它样品处理等。参考图17，简要示出一合适的数据获取方法300。在过程操作302中，在跨越所述 环绕深度范围的多个焦深处获取分析图像。为了避免沿所述深度方向的间隙，在操作302 中所获取的分析图像的数量应至少等于物镜40的景深除以所述环绕深度范围。在一些实施方式中，在可选的操作304处理所述分析图像，以基于图象亮度来识 别约在生物流体层(例如棕黄层)深度的一个或更多分析图像。此可选的选择利用荧光染 料一般产生背景荧光的观测结果，所述背景荧光作为增强的总图像亮度在所获取的分析图 像中被检测出。以多种方式，例如平均像素强度、均方根像素强度等可估计图像亮度。在图像处理操作306中，使用合适的技术例如滤波、限定阈值等处理所述分析图 像或在可选的选择操作304中所选的那些一个或更多分析图像，以将所观察的特征识别为 候选细胞。在生物流体层中染料标记的细胞的密度一般低于每视场约一个染料标记的细 胞。因此，所识别的候选细胞比率一般是低的。当候选细胞被图像处理306识别时，合适的 候选细胞标记添加到一组候选细胞标记310中。例如，候选细胞标记基于合适的索引系统 和所述候选细胞特征的χ和y坐标可识别所述图像。尽管稀有细胞的密度一般是低的，可 设想，图像处理306有时可仍然在单个分析图像上识别两个或更多候选细胞。另一方面， 在一些分析图像中，没有候选细胞可被识别。在判定点312，确定是否完成样品扫描。若没有，则在操作314移动视场。例如，通 过合并物镜40沿试管轴线75平移和试管72的旋转可越过环状间隙12中的生物流体样品 相对扫描视场。可替换地，使用图13的管支架，通过螺旋式地移动试管72来进行扫描。对 于每一新的视场，重复过程操作302、304、306。当判定点312指示完成样品扫描时，可选地使用用户验证过程320以使分析员能 够确认或拒绝每一细胞的候选资格。若图像处理306足够准确，那么可选地省略用户验证 过程320。执行统计分析322以计算由分析员确认的细胞的合适的统计数据。例如，若生物 流体样品的体积或质量已知，那么可计算每单位体积或每单位重量的稀有细胞的密度(例 如细胞/毫升或细胞/克)。在另一统计分析方法中，合计确认的细胞的数量。当使用标准 血沉棕黄样品配置，例如标准试管、标准浮体、标准全血样品量和标准离心处理时，这是合适的度量。统计分析322还可包括阈值警告。例如，若细胞数或密度度量大于第一阈值，那 么这可指示癌的可能性增加，这要求进一步的临床研究，而若细胞数量或密度超过第二、更 高的阈值，这可指示癌的高度可能性，这要求立即治疗的医学关注。参考图18，简要示出更改的获取方法300’。在更改的过程操作304’，使用输入而 不是分析图像来首先确定用于最大背景荧光强度的焦深，接下来是约在用于最大背景荧光 的焦深处获取一个或几个分析图像的操作302’。例如，通过在多个深度获取低分辨率的图 像可执行搜索过程304’。为了避免沿深度方向的间隙，在操作304’获取的低分辨率图像的 数量应至少等于物镜40的景深除以所述环绕深度范围。在另一方法中，大面积的亮度传感 器(未显示)可耦合到所捕获的荧光50(例如，使用摄像机56中的部分反射镜或是使用置 入摄像机56的强度仪表)，以及物镜40的焦点扫过所述环绕深度范围。在扫描期间所述传 感器或仪表的峰值信号指示提供最高亮度的焦点。在由过程操作304’所确定的生物流体样品的深度的情况下，获取过程302’约在 所识别的最高亮度的焦深处仅获取一个或几个分析图像。为了确保全部覆盖生物流体层， 所获取的分析图像的数量应至少为环状间隙12的厚度除以物镜40的景深。例如，若环状 间隙12具有约50微米的厚度，以及景深为约20微米，那么适当地获取三个分析图像_ 一 个在最高亮度的焦深，一个在大了 15-25微米的焦深，以及一个在小了 15-25微米的焦深。更改的获取方法300’的优点在于，所获取的高分辨率分析图像的数量被降低，这 是因为在获取分析图像之前确定焦深。通过在确定的焦深和在稍微大一点或稍微小一点的 焦深获取分析图像来分类所述确定的焦深是有利的。此方法说明在偏离发光背景为最大的 深度处可最佳成像稀有细胞的可能性。参考图19，描述了图像处理306的合适的实施方式，其利用预期的稀有细胞尺寸 的先验知识来识别分析图像330中的任何候选细胞。在匹配滤波过程332，合适的滤波核卷 积所述图像。匹配滤波过程332使用滤波核，其具有的尺寸可与分析图像330中的稀有细 胞的图像的预期尺寸相比较。继续参考图19和进一步简要地参考图20和21，在一些实施方式中，使用方形滤波 核334。核334包括像素的中央正区，每一个像素具有+1值；以及像素的外负区，每一个 像素具有-1值。正区的面积与负区的面积应约有相同的尺寸。内或外区的外面的点具有 0的像素值。可选地，除了 +1和-ι的其它像素值分别用于内和外区，从而给予滤波器稍微 正或稍微负的响应。继续参考图19，匹配滤波去除或减少由背景照明引起的偏移，还改善稀有细胞的 信噪比(SNR)。正匹配区内的点数增加信号，而正和负匹配区内的点的数量增加噪声。SNR 的增益是由于信号直接增加，而噪声按所组合的样品数量的均方根(RMS)值或平方根增 加。对具有N个正点和N个负点的滤波器，获得或的增益。方形滤波核334在计算上是有利的，因为其边缘与分析图像330的χ和y坐标方向 对齐。圆形滤波核334’或另外形状的核可选地使用来代替方形滤波核334。然而，圆形滤 波核334’比方形滤波核334在计算上更昂贵。与圆形滤波核334’相比，方形滤波核334 的另一优点在于，方形滤波核334的总的滤波器边缘长度从两倍的检测尺寸降低到1. 414 倍的检测尺寸。这降低了边缘效应，允许使用更接近分析图像330的边缘的数据。滤波核的尺寸应选择成实质上匹配分析图像330中染料标记的细胞的预期图像
16尺寸，以提供最佳的SNR改善。例如，具有10个像素的正(+1)区的方形滤波核334，为也具 有约10个像素的直径的细胞图像提供最佳SNR改善。对于此匹配的情况，信号预期增加了 约78倍，而噪声预期增加了约14倍，这提供约5. 57 1的SNR改善。另一方面，使用相同 的方形滤波器，更小的8个像素直径的细胞的SNR改善预期为约3. 59 1。使用相同的方 形滤波器，更大的14个像素直径的细胞的SNR改善预期为约3. 29 1。可以以多种方式来实现匹配滤波过程332。在一方法中，输入图像中的每一点被总 计到输出图像中在正内区的所有点。然后，输出图像中在外负区但不在内正区的所有点被 扣除。当输出图像内每一点被外方框像素区计数接触多次时，输入图像内每一点被接触一 次。在另一合适的方法中，对于输出图像内每一点，来自输入图像的在正内方框内的 所有点被读取和总计。在正内方框外但在负外方框内的所有点然后被扣除。当每一输出图 像像素被接触一次时，每一输入图像像素被外方框像素计数接触。在另一合适的方法中，两个内部值被产生用于输入图像的当前行在负外方框距 离的行内所有点的总数，以及在内正方框距离的行内所有点的总数。在所述当前行所有输 出图像列点让输入图像从其扣除了在外方框的所有点的总数。在内正方框内所有输出图像 的列点得到在内正方框距离的分两次相加的输入图像行点的总数。通过一加和一减可对所 述行中的下一点更新行总数。这使执行成本减少到约为滤波器方框的高度。在匹配滤波过程332中，可使用多种边缘条件。例如，在一方法中，对于其滤波器 重叠分析图像330的边缘的任何点，没有输出产生。此方法避免边缘伪像，但产生减少了可 用面积的输出图像。在另一合适的实施例的边缘条件中，缺省值(例如零或所计算的平均 水平)用于远离边缘的所有点。继续参考图19，在匹配滤波332后，应用二进制阈值处理338。执行阈值338的困 难在于合适的阈值的选择。阈值的选择因一些分析图像包括没有细胞、或只有单个细胞或 只有两个或几个细胞的可能性而变得复杂。在一方法中，阈值选择为这样的一值其为在过 滤的数据中所见的最高像素强度以下所选的百分率。然而，此阈值使噪声在没有细胞出现 时被检测出，因为在这种情况，像素的峰值在噪声中。另一方法使用固定的阈值。然而，若 背景强度在分析图像间实质上改变，或若匹配滤波实质上改变像素强度的动态范围，固定 的阈值可能远非最佳。在所示出的方法中，基于未滤波分析图像330的SNR的处理340确定阈值。通过 首先确定输入图像的标准偏差，可计算在滤波器输出的预期噪声。所述噪声一般升高了所 总计的像素数量的平方根，该总计的像素数量为像素计数中的外方框面积。在一些实施方 式中，阈值设置在此噪声水平的约7西格码(sigma)。当此滤波器没有准确的零DC响应时， 合适的平均水平还适当地被总计到阈值。阈值338产生二进制图像，其中为细胞图像的一部分的像素一般具有第一二进制 值(例如“1”)，而不为细胞图像的一部分的像素一般具有第二二进制值(例如“0”)。因 此，执行连接性处理344以识别与细胞相应的第一二进制值的所连接的像素组。连接性分 析344将所连接的组的所有第一二进制值的像素集合或联系为候选细胞以作为一个单元 考察。此所连接的组或单元的中心可被确定和使用为候选细胞标记中的细胞位置坐标。参考图22，描述可选的用户验证过程320的合适的实施方式。在选择操作350中选择用于验证的标记。在显示操作352，显示包含候选细胞标记的分析图像的区域，可选地 连同分析图像的相应区域，该分析图像在深度上临近包含候选细胞的分析图像。显示在深 度上临近的分析图像给检查分析员提供另外的观察，其幸运地包括比自动处理306检测候 选细胞的分析图像更多的可识别的细胞图像。在操作354分析员确认或拒绝候选资格。循 环操作356将所有的候选细胞标记看一遍以通过每个候选细胞的分析员提供检查。统计分 析322对被分析员确认的那些细胞候选标记操作。参照图16-22，在定量血沉棕黄层分析的背景下，描述了示例性的数据获取和分 析处理，该血沉棕黄层分析使用试管壁14和浮体壁16之间环状间隙12中环状样品。然 而，应理解，所述处理容易应用于其它的样品扫描方法，例如在图4中所描述的平面样品载 物片60的扫描。所述示例性的实施方式主要涉及定量血沉棕黄层分析。然而，应理解，在此公开的 装置和方法可应用于其它类型的生物测定。例如，细胞可被染色而不是被荧光标记，或细胞 可具有能够通过光学显微术实现评估的固有的光学标记(荧光、对比等)。所评估的特征可 以不同于稀有细胞。例如，所评估的特征可以为细胞碎片、细菌或多细胞结构。所述样品可 以为生物样品而不是血沉棕黄层样品。参照优选实施方式描述了本发明。很明显，在阅读和理解前述说明后，其它人将想 到修改和变更。本发明的意图应解释为包括所有这样的修改和变更，只要其落在所附权利 要求或其中等效物的范围内。因此描述了优选实施方式。
权利要求
一种方法，用于识别生物流体层中的荧光染料标记的稀有细胞，所述生物流体层包含在试管内壁和浮体壁间的环状间隙中，所述方法包括以下步骤使用显微镜系统在一个或更多焦深处获取一个或更多分析图像；图像处理所获取的每一分析图像以识别候选的稀有细胞图像；选择性地旋转所述试管；沿试管轴线选择性地相对平移所述试管和所述显微镜系统；对通过所述选择性旋转和选择性地相对平移以及实质上跨越所述环状间隙所进入的多个视场，重复获取和图像处理步骤。
2.如权利要求1所述的方法，还包括向相关的人类分析员显示每个被识别的稀有细胞图像；以及从所述相关的人类分析员接收显示的所述候选的稀有细胞图像是否相应于染料标记 的稀有细胞的指示。
3.如权利要求2所述的方法，其中显示的步骤包括显示包含从所述分析图像提取的所述候选的稀有细胞图像的图像区域，所述分析图像 包含所述候选的稀有细胞图像；以及显示从另外的分析图像提前的至少一个相应的图像区域，所述另外的分析图像在深度 上相邻于包含所述候选的稀有细胞图像的所述分析图像。
4.如权利要求1所述的方法，还包括基于所述生物流体层中的背景荧光来确定用于获取所述一个或更多分析图像的所述 一个或更多焦深。
5.一种装置，包括非易失性存储介质，所述装置编码可由数字处理器执行的指令以实 行一种方法，所述方法用于识别在显微镜所获取的生物流体层的分析图像中的荧光染料标 记的细胞，所述生物流体层具有的所述染料标记的细胞的密度小于每分析图像约一个染料 标记的细胞，所述方法包括图像处理每一分析图像以识别具有特征尺寸的候选特征，所述特征尺寸实质上与所述 分析图像中荧光染料标记的细胞图像的期望尺寸相应。
6.如权利要求5所述的装置，其中所述图像处理包括使用滤波核来匹配滤波每一分析图像，所述滤波核具有的尺寸实质上相应于所述分析 图像中荧光染料标记的细胞图像的所述期望尺寸。
7.如权利要求6所述的装置，其中所述滤波核是方形的。
8.如权利要求6所述的装置，其中所述滤波核是圆形的。
9.如权利要求6所述的装置，其中每一分析图像的所述图像处理还包括为匹配滤波的所述分析图像限定阈值，以生成相应的二进制图像；以及基于所述二进制图像的连接性分析来识别所述候选特征。
10.如权利要求9所述的装置，其中所述限定阈值采用根据所述分析图像的信噪比计 算的阈值。
11.一种方法，用于使用显微镜系统识别生物流体层中的荧光染料标记的细胞，所述显 微镜系统具有在可选择的焦深的视场，所述显微镜的视场实质上小于所述生物流体层的区 域，所述方法包括以下步骤基于由所述荧光染料标记造成的所述生物流体层的背景荧光，来识别所述生物流体层 的深度；使用所述显微镜系统，在或接近所述生物流体层的识别的所述深度的一个或更多焦深 处，来获取一个或更多分析图像；图像处理获取的所述一个或更多分析图像以识别可以与染料标记的细胞相应的候选 特征；以及相对移动所述视场和所述生物流体层；以及重复识别、获取、图像处理和相对移动的步骤以识别在所述生物流体层的所述区域上 的候选特征。
12.如权利要求11所述的方法，其中识别的步骤包括在跨越预选的环绕深度范围的不同焦深处获取多个深度采样图像；以及识别所述生物流体层的所述深度为相应于获取的最亮的所述深度采样图像的所述焦深。
13.如权利要求12所述的方法，其中所述一个或更多分析图像包括至少获取的最亮的 所述深度采样图像。
14.如权利要求12所述的方法，其中所述一个或更多分析图像包括至少最亮的所述深 度采样图像以及两个额外的深度采样图像，所述两个额外的深度采样图像具有的焦深接近 于最亮的所述深度采样图像的光学焦深。
15.如权利要求12所述的方法，其中所述一个或更多分析图像被以高于所述深度采样 图像的分辨率获取，并且被在获取所述多个深度采样图像之后获取。
16.如权利要求12所述的方法，其中深度采样图像的数量大于或等于所述预选的环绕 深度范围除以所述显微镜系统的景深。
17.如权利要求11所述的方法，其中识别所述生物流体层的所述深度的步骤包括通过所述显微镜系统的物镜照明所述生物流体层；以及识别所述显微镜系统的所述物镜的焦深，在所述焦深处所述照明产生通过所述物镜观 察的最大的背景荧光。
18.如权利要求11所述方法，其中所述生物流体层的厚度大于所述显微镜系统的景 深，以及获取所述一个或更多分析图像的步骤包括获取大于或等于生物流体样品的厚度除以荧光成像器的景深的多个分析图像。
19.如权利要求11所述的方法，其中每一分析图像的所述图像处理包括使用滤波核来匹配滤波所述分析图像，所述滤波核的尺寸实质上匹配所述分析图像中 荧光染料标记的细胞的图像。
20.如权利要求19所述的方法，其中每一分析图像的所述图像处理还包括采用根据所述分析图像的信噪比计算的阈值来为匹配滤波的所述分析图像限定阈值， 以生成在其中识别所述候选特征的相应的二进制图像。
21.如权利要求11所述的方法，还包括在试管中布置包含荧光染料标记的细胞的生物流体样品；在所述试管中布置浮体，所述浮体界定所述浮体的外表面与所述试管的内表面之间的 环状间隙；以及离心在其中布置所述生物流体样品和所述浮体的所述试管，所述离心使得包括所述荧 光染料标记的细胞的所述生物流体样品的组分在所述环状间隙处分离以界定所述生物流体层。
22.如权利要求21所述的方法，其中所述生物流体样品是血样，分离的所述生物流体 层是包含荧光染料标记的细胞的血沉棕黄层。
23.如权利要求21所述的方法，其中所述浮体包括与所述试管的所述内表面接合以 密封所述环状间隙的至少两个环状脊，所述环状脊在离心期间从所述试管的所述内表面脱 离，以允许所述生物流体样品的分离的所述组分进入所述环状间隙。全文摘要
荧光染料标记的稀有细胞被布置在包含在试管内壁(14)和浮体壁(16)之间的环状间隙(12)的生物流体层中。利用显微镜系统(10、10’、10”、10”’)来在一个或更多焦深处获取一个或更多分析图像。获取的每一分析图像中每一个被进行图像处理，以识别候选稀有细胞图像。试管(72)被选择性地旋转。试管和显微镜系统被选择性地沿着试管轴(75)相对地平移。对通过选择性旋转和选择性地相对平移以及实质上跨越环状间隙所进入的多个视场，重复获取和图像处理。
文档编号G02B21/36GK101907622SQ20101015304
公开日2010年12月8日 申请日期2005年10月27日 优先权日2004年11月24日
发明者史蒂芬·格莱姆斯, 托马斯·D·豪伯特, 约翰·S·拉乌多, 艾伯特·E·韦勒三世, 艾瑞克·R·纳文 申请人:巴特尔纪念研究所