专利名称：甲醛生物降解剂及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种生物降解剂，尤其是涉及一种甲醛生物降解剂及其制备方法。
背景技术：
甲醛是一种广泛使用的重要化工原材料，但易造成空气污染，给人们的身体健康带来很大的威胁。室内空气甲醛污染主要来自家具和装修用的各种人造板材，它易发生加成、氧化、还原、聚合反应，有高度的水溶性和生物大分子的高度反应性，甲醛在接触部位吸收或降解，进入人体后，主要与人体的蛋白质和核酸反应，损害DNA，引起细胞核的基因突变、DNA单链内交连、DNA与蛋白质交连和抑制DNA损伤的修复；与氨基结合，改变蛋白质的内部结构并凝固，扰乱人体细胞的正常代谢，具有致畸、致癌的危害性。在我国有毒化学品优先控制的名单上，甲醛位居第2位。统计显示，中国每年有11万人死于与室内污染有关的疾病，北京儿童医院经过半年问诊调查发现近90%的小儿白血患者家中近期都曾经装修过。各国对工作场所及居室中的甲醛浓度都作出了极限规定。如法国、丹麦工作场所临界极限为lppm，英国定为2ppm，美国定为3ppm。各国对室内空气中甲醛浓度极限规定丹麦为0. 12ppm，美国、法国为0. lppm，瑞典为0. 4ppm。除了造成空气污染之外，甲醛在水产品方面所造成的食品安全问题也很严重。农业部颁布的《无公害食品、渔用药物使用准则(NY 5071-2002)》中，对甲醛没有明确的规定， 既没有规定是违禁药物，也没有规定是允许使用的药物。农业部第627号公告中批准104 种药物允许在水产养殖中使用，也没有甲醛药物。而《无公害食品水产品中有毒有害物质限量(NY 5073-2001)》中规定甲醛在所有水产品中是不得检出的。由于没有明确禁止，因此甲醛在一些水产养殖中仍旧得到使用，并且由于滥用导致的甲醛超标时有发生。水产养殖中应用的甲醛是福尔马林(含36% 40%的甲醛)溶液，具有较强的广谱杀菌和杀虫功能。使用例包括作为防治病害的药物，用法为全池泼洒、药浴、浸泡，正常使用浓度为20 40ppm福尔马林；也可用于水泥池的清塘、消毒，用量为200ppm;此外，也有用甲醛防治鱼类创伤、溃疡、糜烂等疾病，例如用20 40ppm福尔马林和其它抗菌药物治疗鳗鱼的烂尾病等。甲醛在水产品中的药代动力学研究不多，最近有研究结果显示，大菱鲆工厂化养殖规范化使用甲醛，在第8天可以达到未检出水平，不会影响产品可食部分。可见，甲醛的停药期 8天，就能符合上市要求。但是很多养殖户并没有做到足够的停药期，相反，为了在运输、贮藏中进行保鲜，还要添加甲醛，因此造成水产制品中的甲醛超标问题严重。目前，空气中甲醛污染的处理方法基本采用物理或化学方法，例如用化学制剂、光触媒、活性炭吸附、室内植物的吸收转化等。公开号为CN1421255A的中国专利提供一种由各种化学物质经共聚共混所职称的化学甲醛消除剂，主要用于降低用人造板装修后的室内空气中的游离甲醛。公告号为CN1404891A的中国专利提供一种由酰胼类化合物为主要成分的甲醛消除剂，适合于人造板工业生产后处理。公告号为CN1425725的中国专利提供一种以茶叶为原料以乙醇为媒介取得的茶多酚，可喷在家具涂料表面。而公告号为 CN101293373的专利，则采用抽真空的办法使游离甲醛抽离出板材，然后再通入氨气，使甲醛与氨气反应20 50分钟，生成六亚甲基四胺。而在水产品中超标甲醛的去除方面，目前没有相关的研究论文和专利。上述方法中化学处理方法会造成二次污染，物理吸附法仅仅是将甲醛转移到另外的载体上，并没有从根本上清除甲醛。而生物降解方法可将甲醛真正转化为无毒害的物质， 是最有效的方法。很多微生物、植物都已被发现可以耐受或者转化甲醛，例如黄爱葵在容积为0. 5m3玻璃箱内对爱玉合果玉、黄金葛、金边虎尾兰、吊兰和中斑吊兰等几种室内常见盆栽观赏植物净化室内主要污染气体的能力进行研究，发现爱玉合果玉对甲醛的吸收效果最好，Ilh能将甲醛浓度从0. 001113mg/L降为0. 000008mg/L。邵茂清([1]邵茂清，重庆建筑室内空气中甲醛污染调查及植物净化甲醛的实验研究.2005 重庆.39-42)将大小不同的9盆吊兰放在56. 7m3的卧室中，24h空气中甲醛浓度从0. 00033mg/L降至0. 00008mg/L, 而大小不同的9盆芦荟24h可将44. Im3的室内甲醛浓度从0. 00031mg/L降至0. 0001mg/L。植物虽然能有效降解甲醛，但是其作用浓度非常低，远远低于微生物能降解甲 Il 白勺 fi。 Saeed Mirdamadi 等人([2]Saeed M, A. R. ， Pooneh K, et al, Isolation of bacteria able to metabolize high concentrations of formaldehyde. Microbiology and Biotechnology, 2005. 21 (3) :1299-1301)报道 2 株 M. extorquens (ESS 和 PSS)和 4 株 P. pseudoalcaligenes (LSff, SSff, NSW, OSS)能降解甲醛的细菌，其中 P. pseudoalcaligenes OSS培养24h后可完全消耗3700mg/L的甲醛，培养72h可将5920mg/L的甲醛消耗70%， M. extorquens ESS 和 M. extorquens PSS 还能完全降解甲酸 2960mg/L。Yamazaki 等人([3]Yamazaki, T. , W. Tsugawa, and K. Sode, Biodegradation of formaldehyde by a formaldehyde-resistant bacterium isolated from seawater. Appl Biochem Biotechnol, 2001. 91-93 :213-217)从海水中分离了一株甲醛耐受细菌，发现它在3%的氯化钠里能降解甲酸 400mg/L。Tetsuya Kondo 等人([4]Kondo，Τ.，et al.，Purification and characterization of formate oxidase from a formaldehyde-resistant fungus. FEMS Microbiol Lett，2002. 214 (1) : 137-142)从土壤中分离一株甲酸耐受真菌(可称甲醛降解菌)Aspergillus nomius IRI013，它能生长在最高甲醛浓度为4500mg/L里并把它完全消耗掉。但这些微生物均只能以“在体”形式消耗或降解甲醛，即甲醛的消耗依赖于微生物的生长，其应用受到很大限制。
发明内容
本发明的目的是提供一株假单胞菌I0FA1 (Pseudomonas sp. I0FA1)。本发明的另一目的是提供一种甲醛生物降解剂及其制备方法。所述假单胞菌I0FA1 (Pseudomonas sp. I0FA1)已于2010年10月26日保藏在中国典型培养物保藏中心，该保藏中心保藏编号为CCTCC NO =M 201(^80，该保藏中心的地址为中国.武汉.武汉大学。所述假单胞菌I0FA1的样品来源为印度洋深海2000m水深的沉积物经分离获得的。菌株的筛选分离和培养方法为将所述沉积物2g放入30mL含甲醛浓度50mg/L的 2216E液体培养基中，4°C富集；然后将富集液稀释100 1000倍，涂布于50mg/L、IOOmg/ L、200mg/L甲醛浓度的2216E平板上，16°C培养；将得到的菌株进一步纯化保种，并通过对 16S rRNA的测序进行初步的菌种鉴定，进一步从中筛选出可在非“在体”条件下降解甲醛的IOFAl菌株。假单胞菌IOFAl经16S rDNA序列分析鉴定为假单胞菌属，其与模式种 Pseudomonas monteilii CIP 104883 (AF064458)的同源性为 99. 787%。所述假单胞菌IOFAl可作为出发菌株，制备假单胞菌IOFAl菌体破碎液，所述假单胞菌IOFAl菌体破碎液具有以下性质1)含不依赖于NAD的甲酸脱氢酶(formaldehyde dehydrogenase，FDH)，可直接降解甲醛而不需要其它的辅助因子(例如NAD+)。2)作用时间短，活性高。Img经冷冻干燥后的菌体破碎液干粉可在Ih内完全降解 20yg甲醛。按照国标计算，Im3空间内的甲醛污染程度彡0. OSmgJP 假设室内甲醛污染超过100倍，即Im3空间里有8mg甲醛，用0. 4g的甲醛降解剂就能在Ih内完全降解。3)稳定性好，200C以下的温度中放置沈天可保持活性不变；在30°C放置在6天内保持95 %以上活力，26天后仍可保持约60 %的活力。所述甲醛生物降解剂为假单胞菌IOFAl菌体破碎液干粉。所述甲醛生物降解剂的主要成分为甲醛脱氢酶，按质量百分比，所述甲醛脱氢酶至少占90%，所述甲醛脱氢酶为一种甲醛降解酶，甲醛生物降解剂中还含有10%以下的杂蛋白，所述杂蛋白与甲醛降解功能无关。所述假单胞菌IOFAl菌体破碎液，即甲醛生物降解剂的制备方法包括以下步骤1)将假单胞菌IOFAl用培养基进行活化后，接种于培养基中，振荡培养；2)在培养基中加入甲醛溶液继续振荡培养；3)将步骤2)中所得的培养液在4°C温度下离心，去除上清液，收集菌体；4)在菌体中加入IOOmL无菌水，悬浮起菌体，收集悬浮液；5)将悬浮液中的菌体破碎后离心，去除沉淀，将上清液过滤除菌，并冷冻干燥，即得假单胞菌IOFAl菌体破碎液干粉，再经纯化，即得甲醛生物降解剂。在步骤1)中，所述培养基可采用LB培养基；所述培养的条件可为在20 37°C 的条件下振荡培养至0D_ = 0. 8 1. 5 ；所述LB培养基的配制方法为称取IOg氯化钠， IOg蛋白胨和5g酵母膏，溶解于蒸馏水中，并用蒸馏水定容至1L，经121°C灭菌20min。在步骤2、中，所述在培养基中加入甲醛溶液最好至终浓度为100 200mg/mL ；所述继续振荡培养的条件可为在20 37°C条件下振荡培养M 72h。在步骤4)中，所述无菌水可采用经4°C预冷的无菌水。在步骤5)中，所述破碎可采用勻浆机破碎，条件为勻浆压力为700MPa，时间为 5min ；或采用超声波破碎，条件为模式01，变幅杆03，工作时间lOmin，超声2. 5s,间隙 7. k，功率30%，可选用信仪-II D超声仪；所述过滤可采用0. 22 μ m的滤膜进行过滤；所述滤膜可为亲水性滤膜，例如纤维素膜、聚醚砜膜等。以下给出甲醛含量的测定方法1)配制甲醛反应液，加入15g醋酸铵，0. 3mL冰醋酸，0. 2mL乙酰丙酮，加入纯净水定容至100mL。2)测定时，在2mL待测液体加入2mL甲醛反应液，并以2mL纯净水加2mL甲醛反应液为对照，在37°C培养箱中放置45min，然后测量0D412。与现有的甲醛降解剂相比，本发明采用假单胞菌I0FA1制备的甲醛生物降解剂及其制备方法具有以下突出优点1)由于在发酵制备过程中加入甲醛，因此可有效刺激甲醛降解酶的产生，提高产量。2)由于甲醛生物降解剂中不含菌体，因此不存在微生物的人工扩散问题。3)由于甲醛生物降解剂中的甲醛脱氢酶降解甲醛时不需要NAD的参与，因此不仅作用条件简单，而且作用时间短，活性高，Img甲醛生物降解剂在Ih内完全降解20 μ g甲醛； 同时稳定性好，20°C条件下6d可保持活性不变，S卩Img甲醛生物降解剂在Ih内完全降解 20 μ g甲醛；25 30°C条件下3d保持40%活力，S卩Img甲醛生物降解剂在Ih内完全降解 8ug甲醛，而一般室内空气中甲醛污染的浓度均在lmg/m3以下，因此每m3空间仅需50mg甲醛生物降解剂，即可在Ih内完全降解。4)经测试，甲醛生物降解剂可有效降低装修材料所释放的甲醛，使室内空气中的游离甲醛含量达到现行国家标准(彡0.08mg/m3)；也可有效降解水产品(制品)中残留的甲醛污染。
图1为甲醛生物降解剂中酶组分分析的SDS-PAGE电泳图。在图1中，M 分子量标准；1 2 甲醛生物降解剂；3 洗脱液；由图1可见，含有2条主要的条带，分子量分别约为 45kd和20kd，分别将两个条带切下回收，结果表明，条带2中不含蛋白，应为SDS-PAGE电泳时上样缓冲液中的溴酚兰染色剂所形成的条带；将条带1进行质谱分析，将所得片段结果进行比对，表明其为甲醛脱氢酶(FDH)。
具体实施例方式下面通过实施例对本发明作进一步详细描述，但本发明不仅仅局限于以下实施例。实施例1甲醛生物降解剂制备实施例1)将菌株假单胞菌IOFAl用LB培养基进行活化后，按1 %的比例接种于液体LB 培养基中，在30°C的条件下振荡培养至OD6tltl =1.0；2)在LB培养基中加入甲醛溶液至终浓度为lOOmg/mL ；继续在30°C条件下振荡培养 36h ；3)将步骤幻中的假单胞菌IOFAl培养液在4°C下离心，去除上清液，收集菌体；4)在菌体假单胞菌IOFAl中加入200mL经4°C预冷的无菌水，悬浮起菌体，收集悬浮液；5)对悬浮液中的菌体进行破碎，在4°C下离心，去除沉淀，将上清液用0. 22 μ m的滤膜进行过滤除菌，并冷冻干燥，所得干粉即为甲醛生物降解剂。所述破碎可采用勻浆机破碎，条件为勻浆压力为700MPa，时间为5min ；或采用超声波破碎，条件为模式01，变幅杆 03，工作时间lOmin，超声2. 5s，间隙7. 5s，功率30%，可选用信仪-IID超声仪；所述滤膜可为亲水性滤膜，例如纤维素膜、聚醚砜膜等。以下给出甲醛生物降解剂功能分析1.甲醛测定方法
1)配制甲醛反应液将15g醋酸铵溶解于50mL蒸馏水中，加入0. 3mL冰醋酸和 0. 2mL乙酰丙酮，混合均勻后用蒸馏水定容至100mL。2)酶解反应测定在反应管中加入20 μ L不同浓度的甲醛溶液和Img甲醛生物降解剂，加入蒸馏水补足体积到2mL，于25°C下反应15min，30min，60min后进行测量；3)加入2mL步骤1)中配制的甲醛反应液，25°C下放置45min，测量OD412，数值越小表示甲醛浓度越低。2.甲醛生物降解剂对不同浓度甲醛的降解效率参见表1。表1甲醛生物降解剂对不同浓度甲醛的降解效率
权利要求
1.一株假单胞菌 IOFAl (Pseudomonas sp. I0FA1)，所述假单胞菌 IOFAl (Pseudomonas sp. I0FA1)已于2010年10月沈日保藏在中国典型培养物保藏中心，该保藏中心保藏编号为CCTCC NO =M 201(^80，该保藏中心的地址为中国.武汉.武汉大学。
2.甲醛生物降解剂，其特征在于所述甲醛生物降解剂为假单胞菌IOFAl菌体破碎液干粉。
3.如权利要求2所述的甲醛生物降解剂，其特征在于所述甲醛生物降解剂的主要成分为甲醛脱氢酶，按质量百分比，所述甲醛脱氢酶至少占90%，所述甲醛脱氢酶为一种甲醛降解酶，甲醛生物降解剂中还含有10%以下的杂蛋白。
4.如权利要求2所述的甲醛生物降解剂的制备方法，其特征在于包括以下步骤1)将假单胞菌IOFAl用培养基进行活化后，接种于培养基中，振荡培养；2)在培养基中加入甲醛溶液继续振荡培养；3)将步骤幻中所得的培养液在4°C温度下离心，去除上清液，收集菌体；4)在菌体中加入IOOmL无菌水，悬浮起菌体，收集悬浮液；5)将悬浮液中的菌体破碎后离心，去除沉淀，将上清液过滤除菌，并冷冻干燥，即得假单胞菌IOFAl菌体破碎液干粉，再经纯化，即得甲醛生物降解剂。
5.如权利要求4所述的甲醛生物降解剂的制备方法，其特征在于在步骤1)中，所述培养基采用LB培养基。
6.如权利要求4所述的甲醛生物降解剂的制备方法，其特征在于在步骤1)中，所述培养的条件为在20 37°C的条件下振荡培养至OD6tltl = 0. 8 1. 5。
7.如权利要求5所述的甲醛生物降解剂的制备方法，其特征在于所述LB培养基的配制方法为称取IOg氯化钠，IOg蛋白胨和5g酵母膏，溶解于蒸馏水中，并用蒸馏水定容至1L， 经 121 °C 灭菌 20min。
8.如权利要求4所述的甲醛生物降解剂的制备方法，其特征在于在步骤2)中，所述在培养基中加入甲醛溶液至终浓度为100 200mg/mL ；所述继续振荡培养的条件为在20 37°C条件下振荡培养M 72h。
9.如权利要求4所述的甲醛生物降解剂的制备方法，其特征在于在步骤4)中，所述无菌水是采用经4°C预冷的无菌水。
10.如权利要求4所述的甲醛生物降解剂的制备方法，其特征在于在步骤5)中，所述破碎采用勻浆机破碎，条件为勻浆压力为700MPa，时间为5min ；或采用超声波破碎，条件为 模式01，变幅杆03，工作时间lOmin，超声2. 5s,间隙7. 5s，功率30%，选用信仪-IID超声仪；所述过滤采用0. 22 μ m的滤膜进行过滤；所述滤膜为亲水性滤膜，所述亲水性滤膜选自纤维素膜或聚醚砜膜。
全文摘要
甲醛生物降解剂及其制备方法，涉及一种生物降解剂。提供一株假单胞菌IOFA1，以及甲醛生物降解剂及其制备方法。所述甲醛生物降解剂为假单胞菌IOFA1菌体破碎液干粉。所述甲醛生物降解剂的主要成分为甲醛脱氢酶。所述制备方法为将假单胞菌IOFA1用培养基进行活化后，接种于培养基中，振荡培养；在培养基中加入甲醛溶液继续振荡培养；将培养液在4℃温度下离心，去除上清液，收集菌体；在菌体中加入100mL无菌水，悬浮起菌体，收集悬浮液；将悬浮液中的菌体破碎后离心，去除沉淀，将上清液过滤除菌，并冷冻干燥，即得假单胞菌IOFA1菌体破碎液干粉，再经纯化，即得甲醛生物降解剂。
文档编号A62D101/28GK102181385SQ201110054640
公开日2011年9月14日 申请日期2011年3月4日 优先权日2011年3月4日
发明者叶德赞, 曾润颖, 陈兴麟 申请人:国家海洋局第三海洋研究所