专利名称：一种以氯嘧磺隆为底物的混菌降解菌剂的筛选方法
技术领域：
本发明涉及生物降解农药残留技术领域，具体的说是一种以氯嘧磺隆为底物的混 菌降解菌剂的筛选方法。
背景技术：
氯嘧磺隆是广谱广效的大豆田除草剂，90年代初就开始在我国使用，每公顷用有 效量仅为15-22. 5克，使用方便，成本低，应用面积非常广泛，我国每年大豆种植面积约900 万公顷，氯嘧磺隆的使用面积就达250多万公顷，接近1/3。仅黑龙江省，每年大豆田氯嘧磺 隆使用量就超过400吨，覆盖133万公顷。但是由于氯嘧磺隆不易挥发，不易光解，残留期很 长，所以易对后茬敏感作物造成药害，这样就严重影响了作物的轮作，换茬及种植结构的调 整，使农民只能被动的连作，造成病虫害难以控制的恶性循环。同时，氯嘧磺隆对土壤功能 微生物，例如荧光假单胞菌和硝化细菌有一定的影响，也会导致土壤功能的改变甚至衰退。 所以，如何消除氯嘧磺隆的残留毒害问题一直视专家们关注的热点。目前，国内外很多专家采取了一系列措施来减少氯嘧磺隆残留所造成的危害，主 要有添加复配剂降低氯嘧磺隆的用量，开发抗药性转基因作物，开发化学解毒剂等，但这些 措施并不能从根本上解决农药残留问题。国内外开发微生物菌剂来消除农药残留污染的先 例已经很多，而且有很多成功的案例，比如有机磷类农药，拟除虫菊酯类农药，氨基甲酸酯 类农药等，但是分离出的单菌菌剂活性较低，在环境中退化和遭排斥的可能性很大，活性不 稳定，限制了应用。磺酰脲类除草剂比较难降解，目前这方面的菌剂很少，但是研究发现，微 生物降解也是该类农药的一个主要的降解途径，由于结构复杂，难降解，所以考虑混菌菌剂 应该是生物降解农药的可行方向。
发明内容
本发明的目的是提供一种快速、高效的以氯嘧磺隆为底物的混菌降解菌剂的筛选方法。为实现上述目的，本发明采用的技术方案为以氯嘧磺隆为底物的混菌降解菌剂的筛选方法取土壤菌悬液，其为田间多年受 氯嘧磺隆污染的土样为处理对象，制成土壤菌悬液，在1/5LB培养基中添加氯嘧磺隆浓度 为100mg/L，按照体积百分比5-10%的接种量接种菌悬液，28-30°C，150-180r/min摇床培 养5-7天，按体积百分比5-10%的接种量将培养液接种于新的1/5LB培养基，氯嘧磺隆的 浓度按100mg/L递增，依次类推，5次转接后，培养基中氯嘧磺隆浓度为500mg/L，再按体积 比5-10%的接种量转接5次，氯嘧磺隆的添加浓度始终为500mg/L，得到富集的混菌菌种， 液相色谱法测得该混菌菌种对培养基中氯嘧磺隆的降解率达到70%以上，将上述菌种发酵 扩大培养经处理后，即得到以氯嘧磺隆为底物的混菌降解菌剂。所述的1/5LB培养基的配方为胰蛋白胨2g，酵母粉lg，氯化钠2g，蒸馏水1000ml pH = 7. 0。
液相色谱法测降解率的条件为，C18反相柱(4. 6umX250mm)，DAD 二级管阵列检测 器，流动相为甲醇、水和冰醋酸，其体积比为70 30 0. 1 ；流速为lml/min ；检测波长为 254nm ；柱温为28-30 °C ；进样量为5-10 yl。所述发酵培养为，富集得到的混菌菌种，在1/5LB培养基中，进行发酵扩大培养， 发酵结束后菌体数量达到10亿个/mL以上，用麦麸和泥炭在40-50°C下吸附风干粉碎，即 得到以氯嘧磺隆为底物的混菌降解菌剂。扩大培养，发酵罐的条件为无菌空气的通气量 为1 0.8-1，搅拌速度为180-200r/min，培养温度为28-30°C，培养时间为48-60h。二级 发酵结束后菌体数量达到10亿个/ml以上，用质量比2 8-1 9的麦麸和泥炭吸附，在 40-50°C下风干粉碎。本发明的优点在于1.富集得出高效混菌菌剂，降解农药残留，活性更高更稳定，成本降低。2.取田间污染土样作为处理对象，菌种取之土，用之土，增强适应能力。3.利用微生物降解农药残留，绿色环保，不仅保护后茬作物，更重要的是对调整种 植结构，提高作物的病虫害抵抗能力。4.本发明采用对氯嘧磺隆敏感的玉米作为指示作物，盆栽实验，能够直观地验证 本发明的菌剂对土壤中氯嘧磺隆的降解效果。具体的实施方式实施例1取田间(佳木斯市抚远县大豆田)多年受氯嘧磺隆污染的土样为处理对象，用蒸 馏水稀释制成土壤悬液，在1/5LB液体培养基中添加氯嘧磺隆的浓度为100mg/L，接种土壤 悬液，按体积百分比接种量为10%，28°C，150r/min摇床培养5天，将该培养液按相同的接 种量接种于氯嘧磺隆浓度为200mg/L的新鲜的1/5LB培养基中，然后相同条件摇床培养5 天，依次类推，接种5次，按氯嘧磺隆100mg/L的浓度梯度递增，使培养基中的氯嘧磺隆最终 浓度为500mg/L，再按体积比10%的接种量转接5次，氯嘧磺隆的添加浓度始终为500mg/L， 得到富集的混菌菌种。用液相色谱法测定富集菌种的降解率色谱条件为，C18反相柱(4. 6umX250mm)， DAD 二级管阵列检测器，流动相为甲醇、水和冰醋酸，其体积比为70 30 0.1;流速为 lml/min ；检测波长为254nm ；柱温为28°C ；进样量为5 yl。得出该混菌菌种对培养基中氯 嘧磺隆的降解率达到72%。将上述降解率达到72%的混菌菌种在1/5LB培养基发酵扩大培养，培养条件为， 无菌空气的通气量为1 0.8，搅拌速度为180转/min，培养温度为28°C，培养时间为48h。 发酵结束后菌体数量达到10亿个/ml以上，用麦麸和泥炭(质量比2 8)在40°C下吸附 风干粉碎，即得到以氯嘧磺隆为底物的混菌降解菌剂。而后以玉米中金736作为指示作物，室内盆栽测定上述所得以氯嘧磺隆为底物的 混菌降解菌剂的降解效果，10天的盆栽试验结果表明，本发明的混菌降解菌剂对土壤中的 氯嘧磺隆残留有明显的降解作用，经菌剂处理的土壤，玉米根长明显长于没有施用菌剂的 土壤，能够有效保护后茬作物。经液相色谱法(条件同上)测定土壤中氯嘧磺隆的含量，得 出该菌剂10天对土壤中氯嘧磺隆的降解率能达到63. 7%。实施例2
取田间(佳木斯市抚远县大豆田)多年受氯嘧磺隆污染的土样为处理对象，用蒸 馏水稀释制成土壤悬液，在1/5LB液体培养基中添加氯嘧磺隆的浓度为100mg/L，接种土壤 悬液，按体积百分比接种量为5%，30°C，180r/min摇床培养7天，将该培养液按相同的接种 量接种于氯嘧磺隆浓度为200mg/L的新鲜的1/5LB培养基中，然后相同条件摇床培养7天， 依次类推，接种5次，按氯嘧磺隆100mg/L的浓度梯度递增，使培养基中的氯嘧磺隆最终浓 度为500mg/L，再按体积比5%的接种量转接5次，氯嘧磺隆的添加浓度始终为500mg/L，得 到富集的混菌菌种。用液相色谱法测定富集菌种的降解率色谱条件为，C18反相柱(4. 6umX250mm)， DAD 二级管阵列检测器，流动相为甲醇、水和冰醋酸，其体积比为70 30 0.1;流速为 lml/min ；检测波长为254nm ；柱温为30°C;进样量为10 yl。得出混菌菌种对培养基中氯嘧 磺隆的降解率达到71.3%。将上述降解率达到71. 3 %的混菌菌种在1/5LB培养基发酵扩大培养，培养条件 为，无菌空气的通气量为1 1，搅拌速度为200转/min，培养温度为30°C，培养时间为60h。 发酵结束后菌体数量达到10亿个/ml以上，用麦麸和泥炭(质量比1 9)在50°C下吸附 风干粉碎，即得到以氯嘧磺隆为底物的混菌降解菌剂。而后以玉米中金736作为指示作物，室内盆栽测定上述所得以氯嘧磺隆为底物的 混菌降解菌剂的降解效果，15天的盆栽试验结果表明，本发明的混菌降解菌剂对土壤中的 氯嘧磺隆残留有明显的降解作用，经菌剂处理的土壤，玉米根长明显长于没有施用菌剂的 土壤，能够有效保护后茬作物。经液相色谱法(条件同上)测定土壤中氯嘧磺隆的含量，得 出该菌剂15天对土壤中氯嘧磺隆的降解率能达到75. 2%。实施例3取田间(佳木斯市抚远县大豆田)多年受氯嘧磺隆污染的土样为处理对象，用蒸 馏水稀释制成土壤悬液，在1/5LB液体培养基中添加氯嘧磺隆的浓度为100mg/L，接种土壤 悬液，按体积百分比接种量为10%，28°C，150r/min摇床培养5天，将该培养液按相同的接 种量接种于氯嘧磺隆浓度为200mg/L的新鲜的1/5LB培养基中，然后相同条件摇床培养5 天，依次类推，接种5次，按氯嘧磺隆100mg/L的浓度梯度递增，使培养基中的氯嘧磺隆最终 浓度为500mg/L，再按体积比10%的接种量转接5次，氯嘧磺隆的添加浓度始终为500mg/L， 得到富集的混菌菌种。用液相色谱法测定富集菌种的降解率色谱条件为，C18反相柱(4. 6umX250mm)， DAD 二级管阵列检测器，流动相为甲醇、水和冰醋酸，其体积比为70 30 0.1;流速为 lml/min ；检测波长为254nm ；柱温为28°C ；进样量为5 yl。得出混菌菌种对培养基中氯嘧 磺隆的降解率达到74.3%。将上述降解率达到74. 3 %的混菌菌种在1/5LB培养基发酵扩大培养，培养条件 为，无菌空气的通气量为1 0.8，搅拌速度为180转/min，培养温度为28°C，培养时间为 48h。发酵结束后菌体数量达到10亿个/ml以上，用麦麸和泥炭(质量比2 8)在40°C下 吸附风干粉碎，即得到以氯嘧磺隆为底物的混菌降解菌剂。而后以玉米丹玉53作为指示作物，室内盆栽测定上述所得以氯嘧磺隆为底物的 混菌降解菌剂的降解效果，10天的盆栽试验结果表明，本发明的混菌降解菌剂对土壤中的 氯嘧磺隆残留有明显的降解作用，经菌剂处理的土壤，玉米根长明显长于没有施用菌剂的
5土壤，能够有效保护后茬作物。经液相色谱法(条件同上)测定土壤中氯嘧磺隆的含量，得 出该菌剂10天对土壤中氯嘧磺隆的降解率能达到60. 23%。实施例4取田间(佳木斯市抚远县大豆田)多年受氯嘧磺隆污染的土样为处理对象，用蒸 馏水稀释制成土壤悬液，在1/5LB液体培养基中添加氯嘧磺隆的浓度为100mg/L，接种土壤 悬液，按体积百分比接种量为5%，30°C，180r/min摇床培养7天，将该培养液按相同的接种 量接种于氯嘧磺隆浓度为200mg/L的新鲜的1/5LB培养基中，然后相同条件摇床培养7天， 依次类推，接种5次，按氯嘧磺隆100mg/L的浓度梯度递增，使培养基中的氯嘧磺隆最终浓 度为500mg/L，再按体积比5%的接种量转接5次，氯嘧磺隆的添加浓度始终为500mg/L，得 到富集的混菌菌种。用液相色谱法测定富集菌种的降解率色谱条件为，C18反相柱(4. 6umX250mm)， DAD 二级管阵列检测器，流动相为甲醇、水和冰醋酸，其体积比为70 30 0.1;流速为 lml/min ；检测波长为254nm ；柱温为30°C;进样量为10 yl。得出混菌菌种对培养基中氯嘧 磺隆的降解率达到75.7%。将上述降解率达到75. 7 %的混菌菌种在1/5LB培养基发酵扩大培养，培养条件 为，无菌空气的通气量为1 1，搅拌速度为200转/min，培养温度为30°C，培养时间为60h。 发酵结束后菌体数量达到10亿个/ml以上，用麦麸和泥炭(质量比1 9)在40°C下吸附 风干粉碎，即得到以氯嘧磺隆为底物的混菌降解 菌剂。而后以玉米丹玉53作为指示作物，室内盆栽测定上述所得以氯嘧磺隆为底物的 混菌降解菌剂的降解效果，15天的盆栽试验结果表明，本发明的混菌降解菌剂对土壤中的 氯嘧磺隆残留有明显的降解作用，经菌剂处理的土壤，玉米根长明显长于没有施用菌剂的 土壤，接近于没有施用农药的对照根长，说明本发明的混菌降解菌剂能够有效保护后茬作 物。经液相色谱法(条件同上)测定土壤中氯嘧磺隆的含量，得出该菌剂15天对土壤中氯 嘧磺隆的降解率能达到71. 9%。
权利要求
一种以氯嘧磺隆为底物的混菌降解菌剂的筛选方法，其特征在于取土壤菌悬液，在1/5LB培养基中添加氯嘧磺隆浓度为100mg/L，按照体积百分比5-10％的接种量接种菌悬液，28-30℃，150-180r/min摇床培养5-7天，按体积百分比5-10％的接种量将培养液接种于新的1/5LB培养基，氯嘧磺隆的浓度按100mg/L递增，依次类推，5次转接后，培养基中氯嘧磺隆浓度为500mg/L，再按体积比5-10％的接种量转接5次，氯嘧磺隆的添加浓度始终为500mg/L，得到富集的混菌菌种，液相色谱法测得该混菌菌种对培养基中氯嘧磺隆的降解率达到70％以上，将上述菌种发酵扩大培养经处理后，即得到以氯嘧磺隆为底物的混菌降解菌剂。
2.根据权利要求1所述的以氯嘧磺隆为底物的混菌降解菌剂的筛选方法，其特征在 于所述的1/5LB培养基的配方为胰蛋白胨2g，酵母粉lg，氯化钠2g，蒸馏水1000ml pH =7. 0。
3.根据权利要求1所述的以氯嘧磺隆为底物的混菌降解菌剂的筛选方法，其特征在 于液相色谱法测降解率的条件为，C18反相柱(4. 6umX250mm)，DAD 二级管阵列检测器，流 动相为甲醇、水和冰醋酸，其体积比为70 30 0. 1 ；流速为lml/min;检测波长为254nm; 柱温为28-30°C ；进样量为5-10 μ 1。
4.根据权利要求1所述的以氯嘧磺隆为底物的混菌降解菌剂的筛选方法，其特征在 于所述发酵培养为，富集得到的混菌菌种，在1/5LB培养基中，进行发酵扩大培养，发酵结 束后菌体数量达到10亿个/mL以上，用麦麸和泥炭在40-50°C下吸附风干粉碎，即得到以氯 嘧磺隆为底物的混菌降解菌剂。
5.根据权利要求4所述的以氯嘧磺隆为底物的混菌降解菌剂的筛选方法，其特征在 于扩大培养，发酵罐的条件为；无菌空气的通气量为1 0.8-1，搅拌速度为180-2001·/ min，培养温度为28-30°C，培养时间为48_60h。
6.根据权利要求4所述的以氯嘧磺隆为底物的混菌降解菌剂的筛选方法，其特征在 于二级发酵结束后菌体数量达到10亿个/ml以上，用质量比2 8-1 9的麦麸和泥炭 吸附，在40-50°C下吸附风干粉碎。
全文摘要
本发明涉及生物降解农药残留技术领域，具体的说是一种以氯嘧磺隆为底物的混菌降解菌剂的筛选方法。取菌悬液，在1/5LB培养基中添加氯嘧磺隆浓度为100mg/L，按体积百分比5-10％的量接种菌悬液，28-30℃，150-180r/min摇床培养5-7天，按体积百分比5-10％的量将培养液接种于新的1/5LB培养基，氯嘧磺隆的浓度按100mg/L递增，5次转接后，培养基中氯嘧磺隆浓度为500mg/L，再按体积比5-10％的接种量转接5次，氯嘧磺隆的添加浓度始终为500mg/L，得到混菌菌种。经液相色谱法检测，降解率达到70％以上。将上述菌种发酵扩大培养后即得到以氯嘧磺隆为底物的混菌降解菌剂。
文档编号A62D101/28GK101845393SQ20091001087
公开日2010年9月29日 申请日期2009年3月25日 优先权日2009年3月25日
发明者张惠文, 张晓黎, 李新宇, 李旭, 苏振成, 蔡颖慧 申请人:中国科学院沈阳应用生态研究所