新的肿瘤阻抑基因的利记博彩app

专利名称：新的肿瘤阻抑基因的利记博彩app
本申请是1993年12月20日递交的序号为U.S.08/170,586的申请的部分续申请，该申请的内容作为本发明的参考。
背景技术：
本发明属于肿瘤阻抑基因(抗—癌基因)领域，并且总的来说涉及实施针对各种人癌症的广谱肿瘤阻抑基因治疗法所用的产品和方法。特别是本发明涉及治疗肿瘤细胞的方法，该方法包括(1)以含有为本文中称作为H-NUC的新的蛋白质编码的核酸序列的载体给药或者(2)以有效量的由该核酸序列编码的蛋白质给药。
在美国癌症和肿瘤是第二大最流行的死亡原因，每年导致450,000人死亡。在三个美国人中将有一人得癌症并且五个人中有一个将死于癌症(Scientific American Medicine，第12部分，I，1，章节，1987年)。在鉴别引发癌症的某些类似环境和遗传原因方面取得了实质性进步，而癌症死亡率统计学数字表明对癌症和其它相关疾病和紊乱的治疗有待实质性的改善。
已有人识别出许多与癌症的遗传方式相关的所谓癌症基因，即癌症病因学中涉及的基因，并存在于许多的经过充分研究的肿瘤细胞中。对癌症基因进行研究可帮助我们弄懂肿瘤发生过程。而有关癌症基因仍遗留许多问题有待研究，目前已知的癌症基因可用作为理解肿瘤发生的有效的模型。
从广义上说可将癌基因划分为“癌基因”，和“肿瘤阻抑基因”，当将“癌基因”活化时，可促进肿瘤发生，而将“肿瘤阻抑基因”破坏时，不能阻抑肿瘤发生。这些分类方式提供了用于将肿瘤发生概念化的有效方法，而依据某个基因的特定的等位基因形式，其调节元件，遗传背景以及其起作用的组织环境不同，一个特定的基因可以产生不同的作用。
一种普遍认为的假设的癌症活动方式如下(1)大多数各种类型的人癌症是遗传疾病并且(2)癌症是由特定基因(即正常细胞生长调节基因的突变形式或病毒或其它外源基因)在哺乳动物细胞中进行不恰当，不定时的表达或表达失败或其它各类重要的生长调节基因的异位表达引起的。
对瘤形成的生物基础的较简单看法是存在两个大类的癌基因。第一种类是由正常细胞基因的径突变的或另外的异常的等位基因组成的，它们参与对细胞生长或复制的控制。这些基因是细胞的原癌基因。被突变时，它们可以编码破坏正常细胞生长和复制的新的细胞功能。这些变化的结果是产生了显性表达的肿瘤表现型。在该显性表达癌基因的模型中，由于出现了瘤形成的遗传和突异基础的概念，形成了一种居支配地位的观点，假设在细胞的发育进程或生长特性中单个野生型某位基因的存在不足于阻止瘤形成的变化。因此对这些癌基因的活化起作用的遗传因素被想象的“单击”事件。在伯基特氏淋巴瘤中mye癌基因的肿瘤发生活动的活化，和在患有慢性骨髓性的白血病的患者中表达bcr-ab1嵌合基因产物，以及其它肿瘤中H-ras和K-ras癌基因的活化代表了在临床人癌症中有所述转化癌基因参与的某些证据。针对显性表达瘤形成疾病的基因治疗的方法可能要求负责基因的表达特定地关闭或失活。肿瘤阻抑基因最新发现的癌相关基因族是所谓的肿瘤阻抑基因，有时称作为抗癌基因，生长阻抑或癌阻抑基因。最近研究强烈地暗示在该类基因中丧失了功能突变，所述基因可能参与高百分数的人癌症的发生；在几种人癌症中已经鉴别出许多个人肿瘤阻抑基因的合适的候选物。已经鉴别并克隆了参与成视网膜细胞瘤(rb)，乳腺，结肠和其它癌(p53)，wilm肿瘤(wt)以及结肠癌(dcc)的发病机制的肿瘤阻抑基因。已经阐明了它们在人肿瘤形成的作用的某些方面。
成视网膜细胞病(RB)是原养型肿瘤阻抑基因。在各种各样的人肿瘤中已经发现了该基因的突变(Bookstein andLee，Crit.Rev.Oncog.，2211-227(1991)；Goodrich andLee，Biochim.Biophys.Acta.，115543-61(1993)；Riley etal.，Annu.Rev.Cell Biol.，101-29(1994))。在裸鼠中将单拷贝的正常RB重导入到肿瘤细胞中抑制了其形成肿瘤的能力(Huang et al.，Science，2421563-1566(1988)；Sumegiet al.，Cell Growth Differ.，1247-250(1990)；Bookstein efal.，Science，247712-715(1990)Chen et al.，Cell GrowthDiffer.，3119-125(1992)；Goodrich et al.，Proc.Natl.A-cad.Sci.USA，885257-5261(1991)。另外，在细胞周期的G1期早期将未磷酸化的Rb蛋白质微注射到细胞中阻止其发育到S期，表明Rb蛋白根本上参与了细胞生长的调节过程(Goodrich et al.，Cell，67293-302(1991))。通过最近在基因工程鼠系中观察结果进一步证实了这些结果。从一个人Rb转基因过量表达的Rb蛋白结果导致生物体水平上的生长延滞(Bignon et al.，Genes Del.，71654-1662(1993))。此外，在由于RB基因的纯合失活而导致功能性Rb表达完全消除的鼠胚胎中，未成熟时停止发育并且胚胎死于子宫内(Lee et al.Nature，359288-294(1992)；Jacks等人，Nature，359295-300(1992)；Clarke et al.，Nature，359328-330(1992))。这些实验为确定Rb蛋白在细胞生长和体内分化中的重要性提供了基本资料。
Rb基因编码一种核蛋白，该蛋白质的丝氨酸和苏氨酸残基以依赖细胞周期的方式被磷酸化(Lee et al.，Nature，329642-645(1987)；Buchkovich et al.，Cell，581097-105(1989)；Chen ef al.，Cell，581193-1198(1989)；De Caprioet al.，Cell，581085-1095(1989)。在细胞周期的G1阶段，按照微注射试验，蛋白质是活化时，Rb以低磷酸化状态存在(Goodrich et al.，Cell，67293-302(1991)；Goodrich andLee，Nature，360177-179(1992))，低磷酸化的Rb也存在于G0阶段。在该静止期，该Rb似乎是有维持细胞的关键作用，而在该阶段，Rb等待着对外部信号作出应答并作出进入细胞周期或者进行分化的决定(Goodrich and Lee，Biochim.Biophys.Acta.，115543-61(1993)；Pardee，A.B.，Science，246603-608(1989)。
在晚G1，S，和M期，可能由CDK激酶族成员将Rb高磷酸化(Lees et al.，EMBO J.，104729-4290(1991)；Lin etal.，EMBO J.，10857-864(1991)；Hu et al.，Mol Cell.Bi-ol.，12971-980(1992))。Rb上某些残基发生磷酸化可能允许细胞进行增殖。Rb蛋白质的磷酸化方式与其生长抑制功能有关，因此目前可接受的假设是磷酸化作用对该蛋白质的生长阻抑功能具有负调节作用(Hollingsworth et al.，Cu-ur.Opin.Genet.Dev.，355-62(1993)；Sherr，C.J.，TrendCell Biol.，415-18(1994))。在中M期出现了Rb蛋白的去磷酸化作用，并导致在下一细胞周期之前使该蛋白质被重活化。有证据强力地表明1型蛋白磷酸酶是该脱磷酸化作用的关键(Alberts et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90388-392(1993)；Durfee et al.，Genes Dev.，7555-569(1993))。
目前尚未完全阐明Rb参与这些细胞活动的分子机理。一种通用的模式认为Rb与许多不同的细胞蛋白质相互作用，并且借助这些复合物发挥其功能。如果Rb蛋白质的功能是将细胞保持在G0/G1阶段，Rb必须将是活性的并且是进入G1期必要的其它蛋白质围在一起并使之失活(Lee etal.，CSHSOB，LVI211-217(1991))。这种“围捕”假设与最近观察结果相一致，最近实验结果认为一种重要的生长加强转录因子，E2F-1以负方式严格地受Rb调节(Helin et al.，Cell，70337-350(1992)；Kaelin et al.，Cell 70351-364(1992)；Shan et al.，Mol.Cell.Biol.，125620-5631(1992)；Helin et al.，Mol.Cell.Biol.136501-6508(1993)Shen ef al.，Mol.Cell.Biol.，14229-309(1994)。本文公开的蛋白质，H-NUC与Rb蛋白质相结合，并因此参与调节有丝分裂。
采用连锁分析方法分析某一家簇的乳腺癌基因BRCA-1在染色体17q21-22上的定位图。尚不清楚的是该基因起着肿瘤阻抑基因的作用或者起着显性癌基因的作用。但是，在人家簇癌综合症例如Li-Fraumeni综合症中涉及的基因p53明显地具有传统的肿瘤阻抑基因的作用；同样，RB基因的丢失与遗传性成视网膜细胞瘤有关(Knudson，1993，见上文)。多个步骤以及癌基因的合作在转化癌基因和纯隐性肿瘤阻抑基因的这两个最大的图谱之间存在许多明显地与许多人肿瘤的瘤形成变化特性演化相关的其它原理。许多年来已经确信许多人癌可能是由多种相互影响的遗传缺陷症引发的，任何一种缺陷症单独存在不足于使肿瘤演化，肿瘤的发育要求所有遗传缺陷症出现。在哺乳动物的瘤形成中细胞原癌基因和生长调节肿瘤阻抑基因的真实作用被认为相当于这两类基因之间的系列复合的相互作用。
发明概述本发明基于发现了一种编码具有肿瘤阻抑能力的新蛋白质(H-NUC)的核酸分子。已将该核酸分子定位于染色体17的q21-22区。H-NUC(从全长CDNA得到的氨基酸序列；能够与DNA结合并激活转录；在某些乳腺肿瘤细胞系中将该编码序列进行重排或丢失)的特性与H-NUC作为一种核蛋白和肿瘤阻抑蛋白的特性相符合。新近公开的全长cDNA编码了一种新824氨基酸蛋白质。该新的蛋白质含有TPR(34个氨基酸的肽)蛋白质族的十个34氨基酸重复区特性。
本文公开了利用核酸和蛋白质H-NUC的诊断方法。本发明还涉及在不具有内源性野生型H-NUC蛋白质的已建立的癌细胞中施用野生型H-NUC肿瘤阻抑基因或蛋白质用于阻抑，根除或逆转瘤形成表现型。本发明第一次证实了将野生型H-NUC基因施用到已建立的癌细胞中可以阻抑或逆转丢失了野生型H-NUC蛋白质的已建立的人癌细胞中瘤形成表现型或特性。这种对瘤形成表现型的阻抑作用继而阻抑或根除类似癌细胞的不正常群体即肿瘤，这种阻抑作用继而可能降低动物体对这种肿瘤的负担，继而可以增强被治疗动物的存活率。被监测和逆转的瘤形成特性包括丧失了正常H-NUC蛋白质的癌细胞的形态学，生长情况，以及最令人惊奇的是肿瘤发生性。因此，动物“肿瘤细胞负担降低”是在以野生型H-NUC肿瘤阻抑基因给药之后“阻抑了瘤形成表现型”的结果。“瘤形成表现型”可理解为是指细胞特性方面表现型的变化例如形态学，生长速率(例如加倍所需时间)，饱和密度，软琼脂菌落形成以及肿瘤性质(tumorici-ty)。
因此，本发明提供了编码H-NUC的载体和用于治疗肿瘤或癌症的H-NUC蛋白质，以及制备适用于治疗方法中的H-NUC蛋白质和载体的方法。
本发明还提供了治疗哺乳动物例如人的方法，以及治疗异常增殖细胞例如癌症或肿瘤细胞的方法或者阻抑瘤形成表型的方法。广义上说，本发明关注用任何合适方式治疗异常增殖细胞或者治疗以具有异常增殖细胞为特点的疾病的哺乳动物，已知所适用的方法允许与宿主细胞相容的H-NUC编码载体或一种H-NUC蛋白质进入待治疗的细胞，从而达到阻抑增殖的目的。
在一个实施方案中，本发明包括通过给具有以异常增殖细胞为特性的疾病的哺乳动物施用一种编码H-NUC的表达载体，将表达载体插入到异常增殖细胞，并在异常增殖细胞中表达其量能有效地抑制那些细胞增殖的H-NUC，从而对具有以异常增殖细胞的特性的疾病的哺乳动物进行治疗的方法。所述表达载体通过病毒感染或转导，脂质体介导的转染，聚凝胺—介导的转染，CaPO4介导的转染和电击穿，插入到异常增殖的细胞中。按照需要重复治疗。
在另一个实施方案中，本发明包括通过将一个编码H-NUC的表达载体插入到异常增殖的细胞中并在其中表达能有效抑制所述细胞增殖的量的H-NUC，而对一种哺乳动物的异常增殖细胞进行治疗的方法。如果需要治疗可重复进行。
在另一种可选择的实施方案中，本发明提供了一种能够阻抑异常增殖细胞生长的DNA分子。该DNA分子编码一种Rb结合蛋白，该分子包括一个具有至少与C-末端的9个四三共肽重复区有60％同源性的一个亚序列，条件是该DNA分子不再为S.pombe母NUC 2，构巢曲霉bimA和CDC27编码。这样一种Rb结合蛋白的实例是基本上具有SEQ ID NO.-的氨基酸序列的H-NUC蛋白质。在一个更优选的实施方案中，该DNA分子具有SEQ ID NO.1的DNA序列，并且由一种表达载体所表达。该表达载体可以是与任何宿主细胞相容性载体。优选地是该载体选自于由反转录病毒载体，腺病毒载体和疱疹病毒载体组成的组。
在另一个可选择方案中，本发明提供了基本上具有SEQID NO.-的氨基酸序列的H-NUC蛋白质及其生物学活性片段。
在另一个可选择方案中，本发明提供了采用下列步骤生产H-NUC蛋白质的方法将含有H-NUC编码基因的相容性表达载体插入到宿主细胞中并使该宿主细胞表达H-NUC蛋白质。
在另一个可选择方案中，本发明包括按下列步骤给患有异常增殖细胞的哺乳动物体外治疗的方法从哺乳动物中取出需要治疗的组织样品，该组织样品包括异常增殖细胞；将需要治疗的组织样本与有效剂量的编码H-NUC的表达载体相接触；在异常增殖细胞中表达能有效地抑制异常增殖细胞的增殖所需量的H-NUC。按照需要进行重复治疗；将待治疗的组织样品返回到原始或其它哺乳动物中。优选的是，体外治疗的组织是血或骨髓组织。
在另一个可选择的实施方案中，本发明包括给哺乳动物治疗特征在于异常细胞增殖的疾病的方法，该包括下列步骤给患有以异常细胞增殖为特征在疾病的哺乳动物施用H-NUC蛋白质，结果是H-NUC蛋白质以有效地抑制细胞的异常增殖的量插入到异常增殖细胞中。在一个优选的实施方案中，H-NUC蛋白质是为了插入到待治疗细胞而用胶囊包被的脂质体中。按照需要可重复治疗。
在另一个可选择实施方案中，提供了能够与H-NUC基因杂交的寡核苷酸片段以及利用这些片段的检测方法。这些寡核苷酸至少含5个核苷酸，而由约20-约30个寡核苷酸组成的寡核苷酸是优选的。这些寡核苷酸非强制性地用放射性同位素(例如氚，32P和35S酶(例如碱性磷酸酶和辣根过氧化物氧化酶)，荧光化合物(例如，荧光素，锭，铽络合物)或化学发光化合物(例如吖啶鎓酯，异鲁末诺等等)进行标记。这些。这些以及其它标记物，例如在“Non-isotopic DNAProbe Techmrques”，L，J.Kricka，Ed.，Academic Press，NewYork，1992，(引入本文作参考)讨论的，可与本文的寡苷酸一起使用。可将它们用于常规形式的DNA探针检测中，例如Southern和northern印迹分析。这种常规形式检测方法的描述可参见例如“Nacleic Acid Hybridization-A Practical Ap-proach”，B.D.Hames and S.J.Higgins，Eds.，IRL Press，Wash-ington，D.C.，1985，引入本文作参考，优选的是这些探针能在严谨条件下与H-NUC基因进行杂交。也可将这些寡核苷酸用作为聚合链反应技术的引物，如在例如“PCR Technol-ogy”，H.A.Ehrlich，Ed.，Stockton Press，New York，1989以及类似的参考资料描述的技术。
附图描述

图1A和1B显示为了与H-NUC和T-抗原结合需要的RB的类似区域。图1A是用于确定结合区的Gal4-RB融合体的图解。将Gal4 DNA结合区(1-147位氨基酸)与各种RB突变体融合。影线框显示RB的T/EIA结合区。打点框描述了受突变影响的区域。图1B显示在体内检测到的H-NUC和RB突变体之间的相互作用。用指定的一组Gal4-RB突变体成员识及Gal4-CH-NUC)表达克隆(Gal4-(C-49))或YIpPIG10共转化Y153。根据Durfee等人，GenesDevel.7555-569(1993)(引入本文作参考)描述，采用氯苯-红-β一半乳糖苷比色检测法(CPRG)对β-半乳糖苷酶活性进行定量检测，每种转化设置三个同样的实验组。
图2A和2B显示H-NUC与未磷酸化的RB的结合。图2A显示GST以及框架内GST与编码H-NUC的cDNA的融合(GST-491)以及大肠杆菌中表达的SV40 T抗原(GST-T)的氨基末端273氨基酸。GST和GST-融合体与谷胱肽-琼脂糖珠结合并充分地洗涤。通过对SDS-聚丙烯酰胺凝胶进行考马斯亮蓝染色而对样品定量检测，并且每一泳道中使用等同的蛋白质量。图2B显示的是从WR2E3细胞制备的提取物，所述细胞在室温下与结合样品混合30分钟。在经过广泛洗涤之后，采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶分离复合物并转移进行免疫吸印。通过用抗-Rb mAb 11D7抗体进行免疫沉淀(泳道1)而确定WR2E3细胞中存在的Rb蛋白质的量以及其磷酸化程度。用抗Rb mAb 11D7探查该印迹并采用荧光X线照相术进行观察。
图3是全长H-NUC cDNA和蛋白质的核苷酸(SEQ.I.D.NO1)和推测的氨基酸(SEQ.I.D.NO2)序列。
图4A和4B显示全长H-NUC编码蛋白质的34个氨基酸的肽重复(TPR)族的成员。图4A显示十个34-残基多肽重复单元在H-NUC，裂殖酵母S.pombe nuc2+和构巢曲霉bim A蛋白质中的定位。示意图显示了此十个(0～9)34-残基多肽重复单元(TPR)在nuc2+、H-NUC、和bim A蛋白质中的位置。称作34v-重复的该三个多肽中的重复单元3(斜线框所示)缺乏保守基元。图4B是这9个TPR重复单元(1-9)氨基酸序列在nuc2+、-H-NUC和bim A蛋白质中的线性排列。框线内的保守残基。所有三个蛋白质的TPR重复单元6在第6位为甘氨酸。nuc2的重复6的甘氨酸6被认为是必要的。
图5A和5B显示H-NUC的C末端TPR重复与RB蛋白质结合。图5A是用来测定结合域的Gal4-H-NUC融合体的图解。Gal4反式活化正被融合到各种H-NUC缺失突变体。-H-NUC的TPR重复单元示于斜线影线框。图5B显示在活体内RB和H-NUC缺失突变体之间相互作用的测试结果。所示泳道的Gal4-H-NUC突变体或者与Gal4-RB2或者与Gal4-H209一起共转化Y153。每次转化重复三次b-半乳糖苷酶活性的CPRG定量。
图6A和6B显示出640位氨基酸残基的必要甘氨酸的突变产生了温度敏感H-NUC突变体，该突变体在不许可温度下与RB的结合能力降低。图6A详细示出了在H-NUC(640D)中的氨基酸取代。muc2的必要甘氨酸(G)(540位的氨基酸)在温度敏感突变体中被精氨酸(D)所取代。因此，H-NUC的640位氨基酸残基的甘氨酸变成了天冬氨酸(D)。图6B显示在37℃RB和H-NUC(640D)突变体间的相互作用。Gal4-RB2或者和Gal4-H-NUC或者和Gal4-H-NUC(640D)一起共转化Y153。转化子在液体培养基中于28℃培养24小时。用新鲜培养基稀释过夜酵母培养物，并将其培养于37℃。在不同的时间点取等分的酵母培养物来测定酵母的生长(OD660)和β-半乳糖苷酶活性。每次转化β-半乳糖苷酶活性的CPRG定量做三个重复。
图7A和7B显示抗H-NUC抗血清的产生及在人细胞系中H-NUC的检测。图7A中，用Gst-491融合蛋白来免疫小鼠。免前血清(泳道1)、免疫血清(泳道2)、与Gst蛋白预保温的免疫血清(泳道3)和与Gst-491蛋白质预保温的免疫血清用来进行免疫沉淀。从K-562细胞中制备S35-标记的细胞溶胞产物。等量的细胞溶胞产物用于免疫沉淀。所得的免疫沉淀物在SDS-聚丙烯酰胺凝胶上电泳分离。图7B中，从CV-1细胞中制备S35-标记的细胞溶胞产物。等量的细胞溶胞产物被用于免前血清(泳道1)、或免疫血清(泳道2和3)的免疫沉淀。将所得的免疫沉淀物在200μl含溶液(泳道3)的2％SDS中煮沸变性，用200μl的NETN缓冲液稀释之。在SDS-聚丙烯凝胶电泳上分离该免疫沉淀物。如箭头所指，免疫血清特异地识别出90KD的蛋白质。
图8显示H-NUC蛋白具有DNA-结合活性。S35-甲硫氨酸代谢标记的K562蛋白溶胞产物通过双链小牛胸腺DNA-纤维素柱，并用增高浓度的NaCl洗脱。洗脱物或者用(A)mAb 11D7免疫沉淀来定位RB蛋白，或者用(B)免疫血清识别H-NUC来定位H-NUC。(C)等量的洗脱物不用来与谷胱甘肽琼脂糖珠一起温育。
图9显示编码H-NUC的基因定位于染色体17q21-22。
图10A和10B是用H-NUC做探针时，乳腺瘤细胞DNA的Southern印迹分析的结果。从细胞系中抽提DNA，用EcoRI消化之。图10A中探针标记的细胞系印迹均是正常的。图10B中，细胞系TA47D和MB157K中H-NUC基因的纯合缺失很明显。14Kbp EcoRI片段的杂交的减少揭示在细胞系MB231、BT0578-7和BT549中出现了该基因的杂合缺失。
图11显示在活体外AC-H-NUC抑制T-47D乳腺瘤细胞的细胞生长。左上方显示用ACN(MOI10)感染3天的并用结晶紫染色的MDA-BAB-231细胞。右上方显示由ACN(MOI10)感染的T-47D细胞。左下方显示由AC-H-NUC(MOI10)感染的MDA-MB-231细胞。右下方显示由AC-H-NUC感染的T-47D细胞。(+/-)表示MDA-MB-231细胞对H-NUC来说是杂合的。(-/-)表示T-47D细胞含有H-NUC的纯合缺失(ref.Lee，W.H.)。AC-H-NUC是重组的人腺病毒，其含有在人CMV启动子控制下的H-NUC肿瘤阻抑基因。ACN是不含H-NUC肿瘤阻抑基因的同样的重组人腺病毒载体。
图12显示AC-H-NUC在活体外阻抑T-47D肿瘤细胞的生长。将T47-D(H-NUC缺失的)和MDA-MB-231(H-NUC杂合的)乳腺癌细胞铺96孔板，并用AC-H-NUC或ACN从10和100倍复数感染之(重复四次)。细胞生长5天，用掺入到细胞核酸中的3H-胸苷来测量增殖。AC-H-NUC数据(平均数±SD)对ACN对照的平均增殖的百分数在相应的MOI做图。
图13显示AC-H-NUC抑制裸鼠中T-47D肿瘤生长。在体外用ACN或AC-H-NUC以30感染复数(N＝4/组)处理T-47D人乳腺癌细胞。将大约107细胞皮下注射到裸鼠的胁腹，每只动物在一侧胁腹接受ACN处理的细胞，对照侧接受AC-H-NUC细胞。用测经器测量肿瘤大小，用球体几何学计算估测来源于ACN和AC-CBTSG细胞所得的肿瘤做图。来源于未处理细胞的双侧肿瘤的平均体积(±SD)做的图用作对照。
本发明的详细描述本发明提供了新型的定名为H-NUC的哺乳动物蛋白质。H-NUC由824个氨基酸组成(图3)，具有大约95KD的分子量，并已经发现它与非磷酸化的全长的成视网膜细胞瘤(RB)蛋白相互作用。还发现H-NUC的衍生物，为H-NUC蛋白的截短型，在其C-末端含有最后6个“TPR”区(34个氨基酸的肽，34-氨基酸重复)，换名话说，含有从559到770位的氨基酸，与野生型Rb蛋白质结合。对该蛋白质的突变破坏其成视网膜细胞瘤—结合的功能可引起超增殖病理学，即RB阻性细胞的特征，如乳腺癌细胞。
H-NUC蛋白质是人蛋白，因此能从人组织中纯化之。“纯化”当用来描述H-NUC蛋白质或核酸序列的状态时，指的是该蛋白质或编码H-NUC的DNA不含在天然环境中与H-NUC蛋白质或编码H-NUC的DNA正常结合的其它蛋白质或分子。在此所用的术语“天然”指的是DNA、蛋白质、多肽、抗体或其片段是从自然界中分离出来的形式或者是没有有意的氨基酸变化，即取代、缺失或增加的那些形式。用本领域普通技术人员所知的方法可从SDS凝胶中收获纯化95kd H-NUC蛋白质，例如按下面更详细的描述将含H-NUC的细胞抽提物首先与抗-H-NUC抗体反应进行沉淀。分离蛋白抗体复合物，并用在此引作文献的Fisher等，Techniques in Protein Chemistry，ed.T.E.Hugli，AcademicPress，Inc.，PP.36～41(1989)中所描述的方法的SDS凝胶中洗脱收获该95kd H-NUC蛋白质。
在此所用的术语“超增殖细胞”包括但不限于具有自主生长，即不依赖于正常调控机制存活和再生能力的细胞。超增殖疾病可分成病理学类，即源于正常细胞的特征化或组成性疾病，或者可分成非—病理学类，即源于正常但与疾病的状态无关。病理学超增殖细胞是下列疾病状态的特征甲状腺增生—格雷夫斯氏病、银屑病、良性前列腺肥大、Li-Frau-meni综合症、癌包括乳腺癌、肉瘤和其它赘生物、膀胱癌、结肠癌、肺癌、各种白血病及淋巴瘤。非病理学超增殖细胞的例子也被发现了，例如，在哺乳动物泌乳发育过程的导管上皮细胞中和与伤口恢复相关的细胞中。病理学超增殖细胞特征性地表现出接触性抑制的丧失和选择性粘附的下降，该选择性粘附揭示细胞表面性质的变化和细胞间连结的进一步打破。这些变化包括分裂的剌激及蛋白水解酶的分泌能力。而且，将该蛋白质或编码该蛋白质的核酸导入细胞使失去的H—NUC功能从导入或补充能使该细胞恢复到非—超增殖状态。然后细胞的恶性增殖能被阻止了。
如本领域的技术人员所知，术语“蛋白质”指由肽键连接的特定顺序的线性氨基酸聚合体。除非特别指出在此所用的术语“氨基酸”指氨基酸的D或L立体异构型。H-NUC衍生物或等同物，如具有纯化的H-NUC蛋白质的生物活性H-NUC截短的蛋白、多肽或H-NUC肽也被包含在本发明的范围之内。H-NUC衍生物是指远离天然存在的蛋白质或多肽的线性序列，但具有氨基酸改变，即取代、缺失或插入以致所得的H-NUC衍生物保留H-NUC生物学活性。“生物学活性或生物活性”将意味着一方面具有能同非磷酸化成视网膜细胞瘤蛋白P110RB结合的能力。如果，例如高度保守的甘氨酸(640位氨其酸)被变成精氨酸时，H-NUC结合Rbd37℃丧失。这些H-NUC衍生物可由于一个或多个相关氨基酸的氨基酸缺失、取代或插入而同天然序列区别开来，例如，相似的带电氨基酸或侧链或官能团的取代或修饰。
进一步认识到在不破坏其功能的情况下，可对H-NUC的初级序列进行限制性修饰，而且为影响活性只需整个初级序列的一部分，所影响的一个方面即为与p110RB结合的活性。编码p110RB的核酸序列已由Lee，W.H.等在Science 2351394-1399(1987)公开发表，将其在此引为参考文献。它的生物学功能的另一方面是H-NUC与DNA结合的能力。本领域的技术人员可用Lee，W.-H.等在Nature(London)329642～645(1987)中描述的方法来测定其结合DNA的能力，该篇文献在此引作参考。一种生物学活性的H-NUC衍生物是在H-NUC的C-未端的含有最后6个TPR区蛋白质和融合蛋白-Gal4-C49，下面将详述之。Gal4-C49衍生物具有如图3所示的从559位氨基酸到该序列末端的序列。含有衍生物的TPR为图3所示具有559位到770位的氨基酸序列。而且，除了前面所述的Gal4-C49融合蛋白或TPR衍生物外，那些保留了整个蛋白功能的具有图3所示氨基酸序列的片段也被包括在H-NUC衍生物的定义之内。这些H-NUC衍生的可通过限制性酶消化图3的核酸分子并将所得的片段重组表达而产生。认识到对初级氨基酸序列的较小修饰能得到与图3所列的序列相比，其具有实质上等同的或增强的功能的蛋白质。这些突变可以是很精细的，如通过定点突变，或者是随机的，如通过H-NUC产物的受体的突变。只要保留H-NUC的生物活性，所有这些修饰都将被包括在内。
“抑制性活性”将意味着H-NUC蛋白突变体或片段(突变蛋白)，该突变蛋白以显隐性形式抑制蛋白质的正常功能，即抑制H-NUC的生物学作用—介导受体细胞分裂和/或受体细胞增殖的作用。这些蛋白质和片段可通过本领域的技术人员所熟知的那些化学方法得到。这些突变蛋白和抑制性活性片段在促进细胞的超增殖的治疗中十分有用，并可用于生产如抗体的诊断试剂。
用下述的方法在活体外或活体内将细胞与该试剂接触，这些试剂将有利于促进或抑制细胞的生长或增殖。相应地，本发明了提供了一种通过将细胞与试剂接触，抑制例如象乳腺癌细胞的超增殖细胞的生长或增殖的方法还提供了治疗，如乳腺癌，由超增殖细胞生长特征化的病理学的方法，即通过对适当的主体施给有效量浓度的这些试剂使细胞增殖得以抑制。该方法适当的主体包括但不限于脊椎动物、猿猴、鼠类和人类患者。
本发明也提供了含有上面所述的任一组分和一种或多种药物学可接受的载体的药物组合物。药物学可接受的载体是本领域所熟知的包括水溶液如生理缓冲的水或其它溶剂或载体如乙二醇、甘油、植物油(如橄榄油)或可注射的有机酯。药物学可接受的载体可用于在活体外对细胞或在活体内对主体给药H-NUC或其衍生物。
药物学可接受的载体可含有生理学上可接受的化合物，这些化合物起作用，例如稳定蛋白质或多肽或增加或减少该试剂的吸收。生理学上可接受的化合物包括，例如，碳水化合物如葡萄糖、蔗糖、葡聚糖，抗氧化剂如抗坏血酸、谷光甘肽，螯合剂，低分子量的蛋白质或其它稳定剂或赋形剂。其它生理可接受的化合物包括增湿剂、乳化剂、分散剂或对防止微生物生长或作用特别有用的防腐剂。各种防腐剂均是熟知的，包括，例如，石炭酸和抗坏血酸。本领域的技术人员知道依据，例如，多肽给药的途径和该特定多肽的特殊的生理—生化特性来选择药物学可接受的载体，包括生理学可接受的化合物。例如，象单硬脂酸铝或明胶的生理学可接受的化合物作为延迟剂是十分有用的。它们能延长施给主体的药物组合物的吸收速率。载体、稳定剂或佐剂的进一步的例子可在Martin，Remington′s Pharm.Sci.15th Ed.(Mack Publ.Co.，Easton，1975)中找到，这篇文献的此引作参考。如果需要，也可将药物组合物掺入到脂质体、微球体或其它多聚体基质中(Gregoriadis，Liposome Technology，Vol.1(CRC Press，BocaRaton，Florida 1984，该文献在此引作参考)。脂质体，例如，由磷脂或其它类脂组成，相对来说较容易制得和施给，是无毒性的生理可接受的和可代谢的载体。
纯化的H-NUC(蛋白质)或H-NUC(核酸)药物组合物对抑制细胞，如乳腺癌细胞的生长很有用，即通过使细胞与纯化的H-NUC或活性片段或含这些多肽或蛋白质的组合物接触。
为实现本发明的目的，所述的接触效果可在活体外、离体或活体内取得。当在活体外抑制细胞时，通过将本发明的核酸或蛋白质组合物与细胞培养基混合，然后以之饲喂细胞达到接触的效果或者通过直接将核酸组合物或蛋白质加到培养基中达到接触的效果。测量有效量的方法对本领域的技术人员来说都是熟知的。
本方法也可用于治疗和预防与主体活体内的异常增殖细胞相关的病理学。因此，当在活体内取得接触的效果时，以抑制该主体细胞增殖的有效量给药有效量的本发明组合物。为本发发明的目的，“主体”指任何脊椎动物，如动物，哺乳动物、人或大鼠。本方法对治疗和预防具有无功能H-NUC蛋白产物的患者的乳腺癌患者是特别有用的。
药物给药的方法在本领域是熟知的，包括但不限于口服、静脉内、肌肉内或腹膜内给药。可连续地或间断地实现给药，如同用其它治疗重组蛋白质一样，给药方式随着主体的不同而异。(Landman等，J.Interferon Res.12(2)103-111(1992)；Aulitzky等，Eur.J.Cancer 27(4)462-467(1991)；Lantz等，Cytokine 2(6)402-406(1990)；Supersaxo等，Pharm.Res.5(8)472-476(1988)；Demetri等，J.Clin.On-col.7(101545-1553(1989)；和LeMaistre等Lancet.3371124-1125(1991))。
本发明不进一步提供了编码相应于纯化的哺乳动物H-NUC蛋白质H-NUC衍生物、突变蛋白、其活性片段和抗-H-NUC抗体的氨基酸序列的分离的核酸分子。在此所用的“核酸”是指单链和双链DNA、cDNA和mRNA。在一个实施方案中，编码H-NUC蛋白质和片段的核酸分子具有图3所示的序列或其部分。那些在严谨条件能与核酸分子或其补体杂交的核酸分子，例如图3所示的序列，也包括在本发明的范围之内。这些杂交的核酸分子或探针可通过，例如图3的核酸分子的缺口翻译而制备，在这种情况下，杂交的核酸分子可以是该分子、图3所示序列的随机片段。制备这些片段的方法学，参见Sambrook等，Molecular CloningA Laborato-ry Manual，Cold Spring Harbor Press，Cold Spring Harbor，N.Y.(1989)，该书在此引作参考。含至少10个核苷的核酸片段作为杂交探针十分有用。分离的核酸也用于产生新的肽。反过来，这些肽被用作产生多克隆和单克隆抗体的免疫原。制备和使用这些探针和免疫原的方法对本领域的技术人员来说是熟知的。
这些核酸分子也用于抑制细胞的细胞分裂和增殖。将该核酸分子插入细胞，使细胞培养在该核酸能编码H-NUC蛋白质，并使之达到有效浓度的条件下，从而抑制细胞的生长。为达本发明的目的，可通过脂质体或脂质体DNA或其它基因载体如Sambrook等在Supra公开发表的病毒载体将该核酸插入，Supra在此引作参考。具有突变的H-NUC蛋白质产物的乳腺癌细胞即为得益于本方法的细胞。
用转基因治疗人类疾病现在已从理论阶段进入到实践的阶段。第一例人类基因疗法开始于1990所9月，即将腺苷脱氨酶基因转入患者的淋巴细胞，该患者患有此酶的致命性缺陷，产生了免疫缺陷。这一开创性试验的结果具有极大的鼓舞作用，并有助于进一步推动临床试验(Culver，K.W.，An-derson，W.F.，Blaese，R.M.，Hum.Gene.Ther.1991，2107)。
到目前为此，大部分已成功的人类转基因试验均依赖于逆病毒载体的基因转导。本文所称的逆病毒载体是已除去或变更了所有病毒基因的逆病毒，从而使受该载体感染的细胞不产生病毒蛋白质。用产生所有病毒蛋白质不产生病毒蛋白质。用产生所有病毒蛋白质但并不产生有侵染性病毒的逆病毒包装细胞提供病毒的复制功能。逆病毒载体DNA导入包装细胞，结果产生病毒粒子，该病毒粒子带有载体RNA并能侵染靶细胞，但侵染后不能进一步产生病毒的传播。为了区别这一过程与天然病毒侵染的不同，其中天然病毒侵染后继续复制和传播，术语“转导”比“侵染”更常用。
仅为描述的目的，核酸的插入传递系统是复制—非竞争性逆病毒载体。在此所用的术语“逆病毒”包括，但不限于，载体或具有选择靶位并使核酸导入分裂细胞能力的传递载体。在此所用的术语“复制—非竞争”定义为不能产生病毒蛋白质，防止该载体在受侵染的寄主细胞内传播。
复制—非竞争性逆病毒载体的另一个例子是LNL6(Miller，A.D等，BioTechniques 7980～990(1989))，该文献在此引作参考。用复制—非竞争性逆病毒进行标记基因的逆病毒—介导的基因转移的方法已经很好地建立了(Correll，P.H.等，PNAS USA 868912(1989)；Bordigton，C.等，PNASUSA 868912-52(1989)；Culver，K.等，PNAS USA 883155(1991)；Rill，D.R.等，Blood 79(10)2694～700(1991)，所有的这些文献在此均引作参考。临床研究表明没有或几乎没有与该病毒载体相关的副作用(Anderson，Sci-ence 256808～13(1992))。
逆病毒载体用于基因疗法的主要的好处是将基因高效转入复制细胞，转入基因精确整合到DNA上，和基因转导后没有该序列的进一步传播(Miller，A.D.，Nature，1992，357455～460)。
在生产逆病毒载体的过程中，复制—竞争性(辅助)病毒产生的潜在可能性仍是人们关心的问题，虽然在实际应用中此问题已经解决了。迄今为此，所有的FDA—合格的逆病毒载体是用PA317双性逆病毒包装细胞制得的(Miller，A.D.，和Buttimore，C.，Molec.Cell Biol.，1986，62895～2902)。在PA317细胞内使用没有或很少与病毒序列重叠的载体可免除辅助病毒的产生，即使在允许此类事件放大的严谨的试验中(Lynch，C.M.，和Miller，A.D.，J.Viral，1991，653887～3890)。也可用其它包装细胞系。例如，设计用来分离不同质粒上不同的逆病毒编码区的细胞系可通过重组减少辅助病毒产生的可能性。由这些包装细胞系产生的载体也为人类的基因疗法提供了有效的系统(Miller，A.D.，1992 Nature，357455～460)。
已经考虑非—逆病毒载体用于遗传治疗。一个这样的选择即为腺病毒(Rosenfeld，M.A.，等1992，Cell，68143～155；Jaffe，H.A.等，1992，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，896482～6486)。腺病毒载体的主要优点是它们能携带大DNA片段(36kb的基因组)，效价高(1011/ml)，能在原位特别是在肺部侵染组织。迄今为止使用该载体最令人兴奋的是通过气管内滴注将人包囊纤维化转膜传导调节(CFTR)基因导入棉鼠的气道表皮(Rosenfeld，M.A.，等，Cell，1992，63145～155)类似地，证明了疱疹病毒对人类的基因疗法也是有价值的(Wolfe，J.H.等，1992，Nature Genetics，1379～384)。当然，其它任何合适的病毒载体可用于本发明的遗传疗法。
用于人类的由FDA证明的其它转基因的方法是在人细胞的原位用质脂体直接转移质粒DNA(Nabel，E.G.，等1990Science，2491285～1288)。质粒DNA应易于证明能用于人基因疗法，因为不象逆病毒载体，它可以被纯化成均质的。除了质脂体—介导的转移外，其它几种物理学DNA转移方法如通过将质粒DNA与蛋白质复合使DNA定位于细胞上的受体的那些方法已在人类基因疗法中显示了前景(Wu，G.Y.，等1991 J.Biol.Chem.，26614338～14342；Curiel，D.T.等，1991，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，888850～8854)。
通过本领域技术人员熟知的方法将本发明的H-NUC的编码基因置于表达载体，如质粒或病毒表达载体上。通过磷酸钙转染、质脂体(例如，LIPOFECTIN)—介导转染、DEAE—葡聚糖介导转染、聚凝胺—介导的转染、电穿孔和将DNA导入细胞的其它方法可将质粒表达载体导入肿瘤细胞。
病毒表达载体可通过感染或转导以表达型导入靶细胞。这样的病毒载体包括，但不限于，逆病毒、腺病毒、疱疹病毒和禽痘病毒。当H-NUC在任何异常增殖的细胞内表达时，细胞的复制周期被阻碍，因此结果是细胞老化和细胞死亡并且最终是异常组织，即肿瘤或癌的体积的减小。可以用任何有效的方法将能将基因导入靶细胞并能在细胞内表达H-NUC的载体以细胞增殖—抑制量给药。
例如，可通过局部、眼内、肠胃外口服、鼻内、静脉内、肌肉内、皮下或其它任何有效的方法给药含有有效浓度活性载体的生理上适当的溶液。特别地，用针头将治疗靶组织肿瘤细胞有效量的载体直接注射到靶癌或肿瘤组织。
选择地，在体腔内存在的癌或肿瘤，如在眼内、胃肠道内、泌尿生殖道内(例如尿道膀胱)、肺和支气管系统内和其它存在的癌或肿瘤可接受生理上适当的组合物(即溶液如盐水或磷酸盐缓冲液，悬浮液、或乳剂，除载体外它们是经过消毒的)，该组合物含有效浓度的活性载体，通过针头直接注射或导管或其它置于遭受癌或肿瘤痛苦的中空的器官中的传递管给药该组合物。任何可想到的装置如X—射线、声波图或视纤维成像系统可用于靶组织的定位和用于针头和导管的指引。
在另一个可选择的方案中，对那些不能直接到达并可被解剖分离出的肿瘤或癌进行治疗。可将含有有效浓度活性载体的生理上适当的溶液通过血液循环系统地给药。
在另一个可选择的方案中，可用任何已知的方法将H-NUC蛋白质导入靶肿瘤或癌细胞而对其进行治疗。例如，脂质体是人工膜载体，它们可用于在活体外或活体内(Manni-no，R.J.等，1988，Biotechniques，6682～690)将药物、蛋白质和质粒载体传入靶细胞(Newton，A.C.和Huestis，W.H.，Biochemistry，1988，274655～4659；Tanswell，A.K.等1990，Biochmica et Biophysica Acta，1044269～274；和Ceccoll，J.等，Journal of Investigative Dermatology，1989，93190～194)。因此，H—NUC蛋白质可与脂质体载体高效地包入囊中，并将之在活体内或活体外导入哺乳动物细胞。
质脂体—包裹的H-NUC蛋白质可通过局部、眼内、肠胃外、鼻内、气管内、支气管内、肌肉内、皮下或其它任何有效的方式以有效治疗靶组织异常增殖细胞的剂量给药。将含有有效浓度的包裹的H-NUC蛋白质的任何生理上适当的组合物以脂质体给药。
其它载体用于本发明也是合适的，并将选择出有效传递编码H-NUC的基因的载体。该核酸可以是DNA，cDNA或RNA。
在一个独立的实施方案中，本发明的分离的核酸分子与RNA转录的启动子连接在一起。这些核酸分子用于重组生产H-NUC蛋白质和多肽或作为载体用于基因治疗。
本发明也提供了在其中插有上面所述分离的核酸分子的载体。例如，合适的载体可以是，但不限于质粒，粘粒或病毒载体。合适载体的例子参见Sambrook等，Supra，和Zhu等，Science 261209～211(1993)，该文献在此引作参考。当插入适当的寄主细胞即原核或真核细胞时，可重组产生H-NUC。适当的寄主细胞或包括哺乳动物细胞、昆虫细胞、酵母细胞、和细菌细胞。参见在此引作参考的Sambrook等，Supra。
本发明提供了生产H-NUC重组体或其衍生物的方法，将上面所述的寄主细胞生长在适当的条件下使编码H-NUC或其片段的核酸得以表达。合适的条件用本领域技术人员熟知的方法确定。例子参见在此引作参考的Sambrook等，Supra。本发明也提供了由此方式产生的蛋白质和多肽。
本发明也提供了能与H-NUC蛋白质或其片段特异地形成复合体的抗体。术语“抗体”包括多克隆抗体和单克隆抗体。抗体包括但不限于小鼠、大鼠、兔或人的单克隆抗体。
在此所用的“抗体或多克隆抗体”指的是对抗原或受体进行免疫应答而产生的蛋白质。术语“单克隆抗体”意思是由单克隆细胞产生的免疫球蛋白。由该克隆产生的所有单克隆抗体在化学上和结构上是一致的，并且对单一抗原决定簇是特异的。
生产多克隆抗体和单克隆抗体的实验方法在本领域是已知的，参见在此引作参考的Harlow和Lane，AntibodiesALaboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，New York(1988)。本发明的单克隆抗体可通过将H-NUC或其片段导入动物，如小鼠或兔子而生物制得。将动物的抗体产生细胞分离出来，并将之与瘤细胞或杂交瘤细胞融合产生杂交细胞或杂交瘤。相应地，也提供了生产本发明单克隆抗体的杂交瘤。以这种方式生产的单克隆抗体包括，但不限于下面所述的单克隆抗体。
因此，用H-NUC蛋白质或其衍生物，和熟知的方法，本领域的技术人员能生产和筛选具有和H-NUC结合能力的本发明抗体的杂交瘤细胞和抗体。
本发明也提供了上面所述的具有生物学活性的多克隆和单克隆抗体的片段。这些“抗体片段”保留了一些和抗原或免疫原选择性地结合的能力。这样的抗体片段可包括，但不限于(1)Fab，该片段含有单价抗原—结合的抗体分子片段，所述的抗体分子通过用木瓜蛋白酶消化产生完整的轻链和一重链的一部分而产生；(2)Fab′，该片段是用胃蛋白酶处理，接下来还原，以产生完整的轻链和部分重链而获得的抗体分子片段；每个抗体分子可获得两个Fab′片段；(3)(Fab′)2，该片段是用胃蛋白酶处理但不进行随后的还原步骤而获得的抗体片段；(Fab′)2是由两个二硫键连在一起的两个Fab′的聚合体；(4)Fv，定义为含有轻链可变区和重链可变区表达作为两链的遗传工程片段；和
(5)SCA，定义为由适当的多肽接头连接的含有轻链可变区，重链可变区和遗传融合的单链分子的遗传工程分子。
制备这片片段的方法在本领域是已知的，例子参见Har-low和Lane，Supra，这篇文献在此引作参考。
“生物活性抗体片段”的特异的例子包括抗体的CDR区。
本发明还提供了与抗体或其生物活性片段特异起反应的抗——独特型肽。在此所用的“抗——独特型肽”是从一个种中纯化的抗体，该抗体被注射到远缘种中，被识别为外源抗原而且产生强烈的体液免疫应答。对一般方法学的讨论，参见在此引为参考的Harlow和Lane的Supra。
那些重组产生的、生化合成的、化学合成的或化学修饰的保留了与H-NUC或其片段结合能力的，如同相应的天然多克隆或单克隆抗体的蛋白质或多肽也包括在本发明之内。用本领域所知的抗原结合试验如抗体捕获试验测定与抗原或免疫原结合的能力。例子参见在此引为参考的Harlow和Lane的Supra。
在一个实施方案中，抗体或核酸同检测试验连接起来，用于检测样品中的H-NUC蛋白质和片段，所用方法为标准的免疫化学技术如由Harlow和Lane在Supra中描述的免疫组织化学，该文献在此引作参考；或者用在“Principles andPractice of Immunoassays”，eds.C.J.Price and D.J.New-man，Stockton Press，New York，(1991)中描述的技术，该文献在此引为参考。
在一独立的实施方案中，给药抗体使之与H-NUC结合并改变其在细胞内的功能。用本领域技术人员熟知的方法给药抗体，以有效的浓度施给以使H-NUC的功能得以恢复。该抗体也可用来治疗，即通过与已丧失了与成视网膜细胞瘤蛋白结合能力的H-NUC的结合以抑制细胞生长或增殖。这个抗体与H-NUC结合，引起了它重新折叠成活性构象。换句话说，该试剂恢复了H-NUC的天然生物活性。
本发明的抗体和核酸分子用于检测或测定从患者身上取出的细胞或样品中的H-NUC蛋白或者选择性地变化了的-H-NUC蛋白或者选择性的变化了的-H-NUC基因的存在与否。这样，乳腺癌或患乳腺癌的可能性则可被诊断出来。
综上所述，上述的蛋白质、多肽、核酸、抗体、和其片段可用于制备治疗的药剂。
现在将结合下面的实施例对本发明做更进一步的详述。这些实例用于说明，但并不限制本发明。试验方法和结果用酵母双杂交系统，已分离出25个与RB(p56-RB)的C-末端区域相互作用的克隆。其中之一是克隆C49(Durfee等，Gene Devel.，7555～569(1993)。RB蛋白质的C-末端部分具有两个非邻近的对于几种DNA肿瘤病毒的癌蛋白的结合是必需的区域，和与DNA的结合活性有关的C-末端区。这里，一种RB-相关蛋白质的特征已被测定，其具有初级序列，并其生化性质类似于S.Pombe酵母的nuc2蛋白质和真菌中构巢曲霉的bimA的那些性质。这后两个基因在低等真核细胞中的突变使细胞停滞在中期，指示出这些蛋白质在有丝分裂的正常过程中起着重要的作用。这两个蛋白质含有新的以34个残基为基元的重复氨基酸，称之为TPR基元。这些重复的功能还不清楚，但据推断，它们可形成亲水脂的α-螺旋，原则上该螺旋使蛋白质—蛋白质相互作用。这里报道的这些蛋白质是人类首次分离出并报道的人TPR蛋白质。cDNA文库的筛选和序列分析为分离全长的H-NUC cDNA，用Durfee等的方法按上面描述的分离1.5kb的C-49 Bgl II片段，将其用缺口翻译标记，并通过噬菌斑杂交来筛选人成纤维细胞cDNA文库。将cDNA插入片段亚克隆到pBSK+载体(stratagene，SanDiego，CA.)的EcoRI位点，从而使之能进行DNA测序。按照商家的说明(US Biochemicals)，用双脱氧-NTPs和测序酶进行测序。用DNASTAR软件进行序列分析和同源搜索(DNAS-TRA，Inc，Madison，WI)。GST融合体的构建、蛋白质的制备和在活体外的结合为构建GST-491，用Bgl II消化质粒C-49并将1.3kb的插入片段亚克隆到pDGEX-3X(Pharmacia，Piscataway，N.J.)的BamHI位点。通过用Hind III切Y62-25-2，用Klenow补平末端，并将该823bp的片段亚克隆到用SmaI切断的pGEX-3X上而制得GST-T。用0.1mM IPTG诱导GST融合蛋白质在大肠杆菌中表达(Smith和Johnson，Jene，6731～40(1988))。将细胞在10K离心5分钟，将所得到沉淀物重新悬浮于Lysis 250缓冲液(25mM NaCl，5mM EDTA，50mM Tris(pH8.0)，0.1％NP40，1mM苯甲基磺酰氟(PMSF)，8μg亮抑酶肽，8μg木瓜蛋白酶抑制剂)。加入4mg溶菌酶，并使细胞置于4℃30分钟，用超声作用使细胞裂解。离心(10K 30分钟)除去细胞碎片，将上清液加到谷光甘肽包被珠中。
活体外的结合试验按下述方式进行。在室温下将2×106个2E3细胞(Chen等，1992，infra，在此引作参考)的抽提物与含有2～3μg GST或GST融合蛋白的珠子在Lysis 150缓冲液中一起温育30分钟，所述Lysis 150缓冲液为50mMTris(pH7.4)，150mM NaCl，5mM EDTA，0.1％NP-40，50mM NaF，1mM PMSF，每ml 1μg亮抑抑酶肽，每ml 1μg木瓜蛋白酶抑制剂。用Lysis 150缓冲液充分洗涤复合物，并将之在上样缓冲液中煮沸，在7.5％的SDS-PAGE上跑胶。将凝胶转移到固定化膜上，用抗-RB单克隆抗体，11D7进行免疫印迹。在加入了碱性—磷酸酶—接合的二级抗体后，用5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸甲苯铵和氮蓝四唑(BCIP；NBT；Promega Madison，WT)可见结合的RB蛋白质。抗体的产生和蛋白质的鉴定用本领域技术人员熟知的方法生产抗-H-NUC抗体，Harlow和Lane的AntibodiesA Laboratory Manual，Cold SpringHarbor Laboratory(1988)，在此引作参考。简言之，用大约100μg的GST-491融合蛋白质免疫小鼠，并进行三次加强免疫。从免疫的小鼠中收集血清，并将其直接用于免疫沉淀试验。用34S—蛋氨酸对每个细胞系的大约1×107个细胞进行标记2小时，并随后将之在冰冷的Lysis 250缓冲液中溶胞产。将澄清的裂解物与各种抗体在4℃温育1小时，然后加入蛋白A琼脂糖珠，并将之在4℃继续保温30分钟。用裂解缓冲液充分洗涤后，在SDS样品缓冲液中煮沸琼脂糖珠，用7.5％SDS-PAGE进行分离免疫沉淀物。为进行双免疫沉淀，将所得的免疫复合物在200ml分离缓冲液I(20mMTrisCl，pH7.4，50mM NaCl，1％SDS和5mM 5Mm DTT)中煮沸以变性蛋白质。该变性的蛋白质用200ml分离缓冲液II(20mM TrisCl，pH7.4，50mM NaCl，1％NP40和1％脱氧胆酸钠)稀释并用抗体再进行免疫沉淀。细胞分级分离步骤分离膜、核、和细胞浆级分的步骤由Lee，H.W.，等Na-ture(1987)Supra中而来，该文献在此引作参考。所有的三个级分均按上面所述通过免疫沉淀对RB蛋白质和H-NUC含量进行分析，而且将等分的每一级分与谷光甘肽珠进行温育以证实每部分的组合物。DNA结合分析大约1×107个K562人慢性骨髓性白血病细胞(ATCC)用35S-蛋氨酸进行标记，然后将之在Lysis 250缓冲液中裂解。离心以澄清溶胞产物，并用2体积的上样缓冲液稀释，上样缓冲液为10mM KH2PO4，pH6.2，1mM MgCl2，0.5％NP40，1mM DTT，10％甘油。将稀释的抽提物过DNA—纤维素柱(天然小牛胸腺DNA，Pharmacia，Piscataway，NJ)，该柱在轻微的振荡下于40℃温育1小时。接下来用5床体积的上样缓冲液洗涤柱子，然后用含有提高浓度NaCl的同样的缓冲液洗脱。如上所述用抗-RB抗体或者用抗-H-NUC抗体对级分进行免疫沉淀分析。等分的每种级分也与谷光甘肽珠一起温育用以检测谷光甘肽转移酶。H-NUC酵母表达质粒；缺失突变体将源于H-NUC cDNA的DNA片段亚克隆到pSE1170上(Durfee等，1993 Supra)克隆491是由酵母双杂交筛选分离得到的原初克隆。把33kb的XhoI片段插入到修饰的pSE1107中得到框内融合蛋白质来构建H-NUC，RV含有N-末端XhoI-EcoRV片段。BR208，BR207、B5和B6是Sau3A部分消化的产物，来源于这些构建体的Gal4融合蛋白质含有的氨基酸分别为H-NUC为1-824位的氨基酸，491为559～824位的氨基酸，RV为1-663位的氨基酸，BR2-8为699～824位的氨基酸，BR2-7为797～824位的氨基酸，B5为559～796位的氨基酸和B6为597～796位的氨基酸。用复性引物替换H-NUC的NsiI片段可产生温度敏感突变株。该引物如下引物1TGGTATGACCTAGGAATGATTTATTACAAGCAAGAAAAATTCAGCCTTGCAGAAATGCA引物2TTTCTGCAAGGCTGAATTTTTCTTGCTTGTAATAAATCATTCCTGGTCATACCATGCA所有的构建体均已由DNA序列分析得到了证实。酵母转化和β-半乳糖苷酶活性的定量如以前所述用LiOAC方法进行酵母转化(Durfee等，1993，Supra，该文献在此引作参考)，转化后，将细胞铺板于缺乏色氨酸和亮氨酸的合成液滴培养基中，以选择存在的质粒。在30℃生长2至3天后，每次转化的单一克隆接种于适当的选择培养基中。2.5ml培养物在适当的选择培养基中生长至OD600 1.0～1.2。然后按Guarente，L.，Methods Enzy-mol，101181～191(1983)中描述的制备细胞，渗透细胞，该文献在此引作参考。用氯苯基-红-β-D吡喃半乳糖苷(CPRG；Boehringer Mannheim)在标准条件下进行定量(Durfe-e，1993，Supra)，该文献在此引作参考。H-NUC与未磷酸化的RB的类似于SV40 T-抗原结合区的区域结合构建了一批缺失突变体。这些突变体原来是用于描述T-结合域的，按以前所述将其亚克隆到含有Gal-4 DNA一结合域的质粒，PAS1中(Durfee等，1993，Supra)，该文献在此引作参考。这些构建体中的两个，Gal-4活化域-C-49融合表达质粒(即原初的克隆C-49)和YIpPTG10——含有β-半乳糖苷酶的指示质粒。用于共转化醋母菌株Y153(Dur-fee等，1993，Supra)。用Sambrook等，Molecular CloningALaboratory Manul，Cold Spring Harbor Press，Cold Spring Har-bor，N.Y.(1989)——该文献在此引作参考中描述的方法通过Weston印迹测量每种RB融合蛋白质的表达水平，结果相差不到2～3倍。如上所述对所得的转化子进行β-半乳糖苷酶活性的分析。如图1所示，由于许多和RB蛋白质一样的突变，包括使SV40 T-抗原结合丧失的706位氨基酸半胱氨酸突变成苯丙氨酸的点突变，减少了C-49融合蛋白质和Gal-4-RB的结合。然而有一个例外，C-49不能与Ssp突变体结合，该突变体缺少了RB蛋白质的C-末端的160个氨基酸，但T-抗原却能结合，尽管亲合力降低了。缺失了在两结合亚域之间的接头区部分的MI缺失(612～632位氨基酸)突变体，是唯一能同H-NUC和T-抗原结合的突变体。显然，与RB蛋白质类似的但不相同的区域对结合T-抗原和C-49来说是必要的。
接下来，在活体外测量C-49蛋白质与p110RB结合的能力。p110RB的氨基酸序列由Lee，W·H·，等在Science 2351394～1399(1987)中公开，该文献在此引作参考。1.3kb cD-NA(图3)克隆在大肠杆菌中表达谷光甘肽S-转移酶(GST)融合蛋白(Smith和Johnson，Gene 6731～40(1988)，该文献在此引作参考)。含有等量GST-C-49蛋白质和另外两种对照的谷光甘肽珠，单独的GST和GST-T抗原(图2A)与从人成视网膜细胞瘤细胞系(WERI RB27)提取的所有细胞一起温育，所述的细胞系用RB基因重建(Chen等，CellGrowth Differ，3119～125(1992)。在标准的培养条件下，这些WERI(RB+)细胞表达不同的同型的RB蛋白质，如图2B(泳道2)所示代表不同的磷酸化状态。充分洗涤后，结合到珠子上的蛋白质用SDS-PAGE和Weston印迹按照Sam-brook等公开的方法分析，Sambrook等Supra在此引作参考。用抗-RB抗体，11D7对所显的印迹进行标记(Shan等，Mol.Cell.Biol.125620～5631(1992)，该文在此引作参考)。在这些条件下，H-NUC只能和末磷酸化的p110RB以与Gst-T相似的亲合力相结合，Gst-T作为阳性对照。GST单独不能和任何的Rb蛋白质相结合(参见图1A，2～4道)。这些结果揭示H-MUC蛋白质只能与末磷酸化的天然的全长RB蛋白质复合。全长的cDNA和其序列为更充分地分析该新蛋白质的特征，用1.3kb的cDNA作探针来筛选人的成纤维细胞cDNA文库。在分离出的12个克隆中，最长的cDNA克隆，3.3kb，其序列已完全测出。其开放的阅读框编码824个氨基酸的蛋白质(图3)。该蛋白质与两个已知的蛋白质，S.pombe酵母nuc2和构巢曲霉bimA在总体上有35％的同源性。已知两个低等真核蛋白质参与有丝分裂，因为这两个基因的温度——敏感型突变体将细胞阻止在中期。nuc2和bimA蛋白质含有10个34-氨基酸重复，如图4所示，一个重复在N-末端区，9个在C-末端区成族排列。在新的RB——相关蛋白质中也发现了类似的重复排列。如果仅将这三个蛋白质的9个重复区进行比较，相同的序列占60％(图4B)。然而，nuc2和bimA的第一和第二重复的序列间具有很低的同源性。来源于C-49的蛋白质也存在这样差的同源性。基于序列的同源性，分离的克隆很象人与酵母nuc2和构巢曲霉bimA的同源性。因此，C-49克隆即为H-NUC。与RB蛋白质结合的C-末端重复该H-NUC蛋白质既不含已知的L-X-C-X-E基元，该基元是T-抗原和腺病毒E1A用于结合RB的，也不含已显示出对结合RB很重要的E2F的18-氨基酸序列。这一发现提示H-NUC蛋白质用不同的基元结合RB。为帮助确定这样基元，构建了一系列缺失突变体，每一种突变体含有H-NUCcDNA的不同的区域，如图5所示表达Gal-4融合蛋白质。在活体内的结合分析中，用前面所述(Durfee，1993，supra)的酵母双杂交系统来测定含结合基元的蛋白质区域。全长的蛋白质和原初的克隆(含6个重复)与RB的结合同样地好。然而，含有第一个重复的N-末端都不能与RB结合。这些数据提示H-NUC以一种新的方式与RB结合，可能通过该蛋白质的较大的区域以特异的二级结构来实现。将640位的甘氨酸变成天冬氨酸产生了敏感型H-NUC突变体，该突变体降低了在非容许温度下与RB的结合为了帮助证实H-NUC与RB的结合在生理学上很重要，通过对H-NUC蛋白质的定点突变产生在640位氨基酸的单一点突变(Gly→Asp)。nuc2的Gly504变成Asp的相似的变化产生了温度敏感型表型，该突变阻止S.pombe酵母的中期发育(Hirano.T.，Y.Hiraoka和M.Yahagida，J.Cell Biol1061171～1183(1988))。既然该甘氨酸残基在H-NUC蛋白质中是保守的，如同酵母的同源序列，产生Gly到Asp的突变将测试在非容许温度下H-NUC蛋白质是否是结合RB的缺陷型。如图6所示，含有Gly-640突变的H-NUC蛋白质在酵母于37℃(非容许温度)下生长时不能与RB相互作用，但在酵母于22℃(容许温度)下生长时，该突变蛋白却保留了其与RB结合的能力。这些数据证明了在假定的中期阻滞的温度敏感(ts)表型和Rb-结合特性之间存在着联系。H-NUC抗体的制备和H-NUC蛋白质的鉴定为在蛋白质凝胶和Weston印迹中鉴定该新的H-NUC蛋白质，制备了它的小鼠抗体。在大肠杆菌中表达的Gst-C-49(Smith和Johnson，1988，supra，和Shan等，1992，supra，每篇文献在此均引作参考)，用谷光甘肽珠纯化之，并将其用作抗原来诱导小鼠产生抗体应答。然后收获含多克隆抗-H-NUC抗体的血清。得到抗体后，如前所述，用35S-蛋氨酸代谢标记红白血病细胞系(K562)，用该细胞系制备细胞溶胞产物，并用多克隆抗体对之进行免疫沉淀。如图6A所示，用免疫血清(泳道2)沉淀出具有大约95kb分子量的特异蛋白质，但用免疫前血清则未沉淀出。该复合体在凝胶中分离开。因为35S-蛋氨酸只对K562特异性地标记，因此只有95kDa的蛋白质可被见到。当用GST蛋白质进行竞争性免疫沉淀时，该95kd的蛋白质也可被检出，这证明了多克隆抗体不仅仅只识别GST。另一方面，该原初的抗原能与内源性细胞蛋白质进行竞争，该95kd的带变得不可检测了(泳道3和4)。当初级免疫沉淀物变性和再免疫沉淀时，该抗体的特异性得到了进一步证实。如图6B所示(泳道3)，95kd蛋白质是唯一能被检出的带，且背景是清楚的。因此，所有的免疫学证据提示95kd蛋白质即为H-NUC基因产物。H-NUC蛋白质具有DNA-结合活性用35S-蛋氨酸标记大约1×107个细胞，然后将之在Ly-sis250缓冲液(250mM NaCl，5mM EDTA，50mM Tris(pH8.0)，0.1％NP40，1mM苯甲基磺酰氟(PMSF)，8μg/ml的亮抑肽酶和8μg/ml的木瓜蛋白酶抑制剂)中裂解。离心澄清溶胞产物，并用2体积的上样缓冲液(10mM KH2PO4，pH6.2，1mM MgCl2，0.5％NP40，1mM DTT，10％甘油)稀释。然后，如前所述，将稀释的提取物上到DNA-纤维素柱(天然的小牛胸腺DNA，Pharmacia，Poscatawas，NJ)，并使该混合物在轻微振荡下于4℃保温1小时。用5床体积的上样缓冲液洗涤该柱，然后用含有提高NaCl浓度的同样的缓冲液洗脱。
用抗成视网膜细胞瘤蛋白质的抗体11D7，图7A)、H-NUC(图7B)、或GST珠(图7C)对每种洗脱液的级分进行免疫-沉淀分析。等分的每种级分也用来与谷光甘肽一起温育，用以检测谷光甘肽转移酶。RB蛋白质具有DNA结合活性，把其用作阳性对照。H-NUC蛋白质具有类似的DNA-结合活性，但单独的谷光甘肽转移酶却没有这样的活性。同源序列分析表明H-NUC的DNA-结合区位于TRP区域之外。H-NUC定位于染色体17q21～22图谱如图9所示3H-标记的3.3kb-H-NUC cDNA探针对人染色体的原位杂交表明在17号染色体的q21-22区显示出特异性的标记。从统计的150个细胞的320中，发现有42例13.1％在17q21-22。背景上其它位点未见标记。因为所用的探针的一部分含有其假基因的同源序列，在每个受检测的细胞中均检出了近端着丝粒染色体的多重杂交，而且它们被排除在分析之外。用体细胞杂交法也获得了相似的做图结果，即H-NUC被做图定位于第17号染色体。H-NUC的定位很有趣，因为家族性乳腺癌基因也已被做图定位于相同的区域。H-NUC的肿瘤抑制活性在活体外的细胞培养条件下和在裸鼠动物模型中对H-NUC的肿瘤抑制活性进行了估测。用于估测H-NUC肿瘤抑制活性的细胞系是MDA-MB-231和T-47D，MDA-MB-231含有H-NUC的一个功能性等位基因，T-47D是H-NUC座位的纯合突变体。
简言之，用腺病毒表达载体表达H-NUC后对H-NUC对上面两种细胞系增殖的作用效果进行估测。ACN是缺乏cDNA插入片段的对照腺病毒载体，而AC-H-NUC是在人CMV启动子控制下的表达H-NUC的腺病毒载体。含H-NUC的腺病毒载体为构建腺病毒表达载体，用PCR从Quick Clone双链胎盘eDNA(Clontech)对含有H-NUC全长cDNA的2520个碱基对的片段进行扩增。为扩增H-NUC所用的引物给该片段的5′-末端增加了Kpn I限制酶位点，给3′-末端增加了Xho I位点，这样使该片段定向克隆到pBluescript II KS+的多克隆位点(5端引物寡核苷酸为5′CGCGGTACCATGACGGTGCTGCAGGAA3′；3端引物的寡物苷酸为5′ATCGGCTCGAGCAGAAGTTAAAATTCATC3′)。PCR循环如下1圈在94℃1分钟；30圈在94℃1分钟，53℃11/2分钟，72℃2分钟；和1圈在72℃7分钟。用TnT Coupled Reticulo-cyte Lysate System(Promega)筛选能产生95KD蛋白质的克隆。Bluescript载体的T3启动子能使H-NUC编码序列在免网状细胞中转录和翻译。每一个网状细胞反应中加入1μg的微—溶胞产物DNA，并将其在30℃温育1小时。10μl的反应物与上样缓冲液混合，在165V电压下，在10％的聚丙烯酰胺凝胶(Nevex)上跑胶 小时。干燥凝胶，并将之与胶片过夜曝光。对产生全长蛋白质的4个克隆进行了测序。用KpnI和HindII消化从载体上收获H-NUC插入片段，并将之亚克隆到pAdCMVb-载体的KpnI-BgIII位点(载体中BgIII的填入产生了平端)。所有的4个克隆均含有一些突变。将两个克隆的片段连接起来产生了含有正确的野生型序列的克隆。
为构建重组腺病毒，用NruI将上面的质粒线化，并与用ClaI消化的d1309突变体的大片段，用CaPO4转染试剂盒(Stratagene)共转染(Jones和Shenk，Cell，17683～689(1979)，该文献在此引作参考)。分离病毒斑，通过限制酶消化分析和用针对于H-NUC cDNA序列的引物的PCR对重组子进行鉴定。通过限制性稀释进一步纯化重组病毒，用标准方法纯化病毒粒子并测定效价(Graham和Van der Erb，Vi-rology，52456～457(1973)；Graham和Prevec，Manipulationof adenovirus vectors.InMethods in Molecular Biology Vol T；GeneTrans+er and Protocols，Murray E.J.(ed.)The HumanPress Inc.，Clifton N.J.，T109～128(1991))，这两篇文献在此均引作参考。
为保证上面的H-NUC载体表达适当大小的蛋白质，在提高病毒/细胞噬斑形成单位的感染复数(MOI)的条件下，用对照或者用含H-NUC的重组腺病毒感染T-47D细胞。用PBS洗涤细胞一次，并在裂解缓冲液(50mM Tris-HCl.pH7.5，250mM NaCl，0.1％NP40，50mM NaF，5mM ED-TA，10μg/μl的抑蛋白酶肽，10mg/ml的亮抑酶肽，和1mMPMSF)中收获之。通过10％SDS-PAGE分离细胞蛋白质，并将之转移到硝酸纤维素膜上。将膜与抗-H-NUC抗体温育，然后将之与连接有辣根过氧化物酶的羊抗-鼠IgG一起温育，通过化学发光在Kodak XAR-5胶片上可见H-NUC的精确表达(ECL kit，Amersham)。在活体外将乳腺癌细胞系，MDA-MB-231和T-47D以每100mm板1×106个细胞接种于Kaighn′s F12/DME培养基中(Irvine Scientific)，对T-47D细胞，培养基中补加10％FBS和0.2IU的胰岛素(Sigma)。该板于37℃7％CO2下保温过夜。第二天，给细胞再喂以10ml的生长培养基，并用ACN对照病毒溶胞产物(MOI 10)或者用AC-H-NUC病毒溶胞产物(MOI 10)感染细胞，在37℃保温。3天后，除去培养基，用1∶5的乙酸—甲醇溶液固定细胞。用20％甲醇-0.5％结晶紫溶液对细胞染色30分钟，并用水漂洗以除去多余的染料。
用AC-H-NUC对细胞的感染，结果由于H-NUC蛋白质的表达而产生了这些细胞的生长抑制(图11)。当与ACN对照细胞相比时，可观察到用结晶紫染色的AC-H-NUC感染的细胞显示出细胞数目的减少(大约50％)。另外，T-47D细胞发生了形态变化。该细胞看起来变得稠密，丧失了其正常生长的特征。当T-47D细胞用对照ACN病毒侵染时，未发现明显的变化。作为对照，杂合细胞，MDA-MB-231，没有出现在活体外被ACN或AC-H-NUC的感染。
胸苷的掺入也用来估测H-NUC对细胞增殖的作用效果。简言之，将大约3×103MDA-MB-231和T-47D细胞铺板于96-孔板(Costar)的每一孔中，并将之保温过夜(37℃，7％CO2)。用DMEF12/15％FBS/1％谷氨酸对ACN或AC-H-NUC进行系列稀释，以感染复数为10和100(MOI)的每种腺病毒对细胞进行感染(每个MOI做4孔的重复)。感染后24小时时更换一半体积的细胞培养基，并每48小时换一次，直到收获细胞。收获前18小时，向每个孔中加入1μCi的3H-胸苷。感染后5天，将细胞收获于玻璃-纤维滤纸上，用液闪法检测掺入到细胞核酸内的3H胸苷(TopCount，Packard Instruments)。每种MOI的细胞增殖(cpm/孔)以占未处理细胞增殖平均数的百分数来表达。
所得的结果显示出用ACN或AC-H-NUC处理后，MDA-MB-231细胞(对H-NUC而言是杂合的)的增殖是相似的(参看图12)。作为对照，在T-47D细胞中观察到了对AC-H-NUC的特异应答，T-47D细胞是H-NUC缺失的，所述应答在高MOI时增强。这些数据表明腺病毒—介导的H-NUC基因的转移对H-NUC变化了的细胞产生抗—增殖的作用。体外基因治疗为估测H-NUC的表达对致瘤性的影响，上面的肿瘤细胞系在裸鼠模型内试验了其产生肿瘤的能力。将大约2×107T-47D细胞铺板于T225瓶中，并用含有MOI为3或30的ACN或AC-H-NUC的蔗糖缓冲液处理细胞。过夜感染后，收获细胞，并将大约107细胞经皮下注射到BALB/c裸鼠的左胁和右胁(4只/组)，该裸鼠在此之前经皮下接受过17β-雌二醇。一侧胁用ACN-处理的细胞注射，而对照侧胁则用AC-H-NUC细胞注射，每只小鼠做为自身的对照。双侧胁接受未经处理的细胞注射的动物做为肿瘤生长的另外的对照。每周测量二次肿瘤的大小(长、宽、高)和体重。假定肿瘤的半径等于测得的肿瘤大小平均数的一半，以球体几何来估算每只动物肿瘤的体积。
该试验的结果示于图13，揭示出在表达H-NUC的细胞中肿瘤生长明显减少。简言之，在细胞接种21天后，测量所有动物双侧的肿瘤。对所有4只小鼠，源于由AC-H-NUC(MOI＝30)处理的细胞肿瘤小于对照侧源于用ACN(MOI＝30)处理的细胞的肿瘤。在21天的期间内，AC-H-NUC(MOI＝30)处理的细胞引起的肿瘤的平均大小一直比由ACN(MOI＝30)处理的细胞引起的肿瘤的大小要小。(参见图3)。这些数据进一步证实了此处公开的H-NUC的肿瘤抑制活性。H-NUC在活体内的肿瘤抑制将人乳腺癌细胞系T-47D细胞经皮下注射到雌性BALB/C无胸腺裸鼠中。使肿瘤发育32天。此时，在肿瘤周围靠近肿瘤的地方注射一次ACN(对照)或AC-H-NUC(含H-NUC基因)的腺病毒载体。然后在注射腺病毒2天或者7天后，切下肿瘤，并从每个肿瘤中分离多聚腺苷+RNA。然后用使用了H-NUC特异引物的反转录酶-PCR探测经处理的肿瘤中的H-NUC RNA。使用肌动蛋白引物的扩增做为RT-PCR反应的对照，而含有重组体-(H-NUC)序列的质粒做为该重组体-(H-NUC)特异带的阳性对照。
在一独立的试验中，T-47D细胞经皮下注射到小鼠右胁的皮下，并使肿瘤生长2周。小鼠接受每周2次共计8剂的缓冲液或重组病毒的靠近肿瘤的注射。在整个处理过程中对监测接受ACN和缓冲液的对照动物和那些接受AC-H-NUC的动物中肿瘤的生长进行。体重和存活时间也在被监测之列。乳腺癌细胞系T-47D细胞中外源H-NUC的表达来自乳腺癌细胞系T-47D的乳腺癌细胞，因是H-NUC基因的纯合突变而不含有内源的H-NUC，因此为H-NUC的功能性研究，提供了干净的背景。用可比较效价的AC-H-NUC或对照ACN载体感染T-47D细胞。多数的克隆各自繁殖成块状培养物。
用35S对受侵染的细胞进行代谢标记，并将之用来制备细胞溶胞产物以估计产生的蛋白质的量。根据在裸鼠中测得的形态学、生长速率(例如倍增的时间)、饱和密度、软琼脂集落的形成和致肿瘤性，把AC-H-NUC侵染的培养物和对照细胞进行比较。
虽然本发明结合参考文献对目前优选的实施方案进行了描述，但应理解为在不背离本发明精神的前提下可对本发明进行各种修饰。相应地，本发明不受下列权利要求的限制。
权利要求
1.分离和纯化的编码Rb结合蛋白质的DNA序列，所述的蛋白质在C-末端含有与9个34个氨基酸的肽重复有至少60％同源性的亚序列，条件是所述的DNA序列既不编码S.pombe酵母蛋白nuc2、构巢曲霉bimA蛋白质，也不编码啤酒酵母(S.cerevisiae)CDC27蛋白质。
2.权利要求1所述的分离和纯化的编码Rb结合蛋白质的DNA序列，所述的DNA序列与Sequence I.D.No.1的465到770位氨基酸有60％的同源性。
3.权利要求1所述的分离和纯化的DNA序列，该序列编码Sequence I.D.No.1的465到770位的氨基酸。
4.根据权利要求1的分离的和纯化的DNA序列，基本上按照Sequence I.D.No.1中所列的顺序编码H-NUC。
5.含有权利要求1、2、3或4的分离和纯化的DNA的重组载体。
6.权利要求5的重组载体，其中所述载体是粘粒、质粒、或由病毒衍生而来。
7.含有权利要求1、2、3或4所述的DNA分子的表达载体，该载体能将所述的DNA分子插入哺乳动物寄主细胞，并在其中表达蛋白质。
8.权利要求7的表达载体，其中所述的表达载体选自由质粒和病毒载体所组成的组。
9.权利要求8的表达载体，其中所述的病毒载体选自由逆病毒载体和腺病毒载体所组成的组。
10.权利要求9的表达载体，其中所述的表达载体是AC-H-NUC。
11.用于生产具有H-NUC蛋白质生物活性的多肽或蛋白质或其生物活性衍生物的寄主—载体系统，该系统包括在适宜的寄主细胞中的权利要求7、8、9或10的载体。
12.权利要求11的寄主—载体系统，其中寄主细胞是原核细胞。
13.权利要求11的寄主—载体系统，其中寄主细胞是真核细胞。
14.含有权利要求7的载体和药物学可接受载体的药物组合物。
15.含有权利要求8的载体和药物学可接受载体的药物组合物。
16.含有AC-H-NUC载体和药物学可接受载体的药物组合物。
17.由互补于权利要求1的DNA序列的至少大约27个核苷酸组成的DNA探针。
18.权利要求17的DNA探针，其中的核苷酸互补于Se-quence I.D.No.1的DNA序列。
19.分离和纯化的结合Rb蛋白的哺乳动物蛋白质，所述的蛋白质在C-末端含有具有至少6个34个氨基酸的肽重复的氨基酸序列，条件是所述的蛋白质不是S.pombe酵母的nmc2蛋白质、构巢曲霉bimA蛋白质，也不是啤酒酵母CDC27蛋白质。
20.权利要求19的分离和纯化的哺乳动物蛋白质，在其C-末端含有具有9个34个氨基酸的肽重复的氨基酸序列。
21.权利要求20的分离和纯化的哺乳动物蛋白质，该蛋白质是具有Sequence I.D.No.2氨基酸顺序的H-NUC。
22.生产权利要求19的蛋白质的方法，包括以下步骤a.将含有编码权利要求19的蛋白质基因的相容性表达载体插入寄主细胞；b.使所述的寄主细胞表达所述的蛋白质。
23.按照权利要求22的方法，其中所述的寄主细胞选自由原核寄主细胞和真核细胞组成的组。
24.根据权利要求23的方法，其中所述的寄主细胞是哺乳动物寄主细胞的真核寄主细胞，且所述的表达载体与所述的哺乳动物寄主细胞是相容的。
25.抑制没有内源性H-NUC蛋白质的癌细胞成瘤表型的方法，包括对这样的癌细胞给药有效量的权利要求1、2、3或4的DNA。
26.权利要求25的方法，其中H-NUC基因的施给是通过重组载体。
27.抑制没有内源性H-NUC蛋白质的癌细胞成瘤表型的方法，包括对这样的细胞给药权利要求19至21的蛋白质。
28.与Rb-结合蛋白质结合的抗体，所述的蛋白质在其C-末端含有具有至少6个34个氨基酸的肽重复的亚序列，条件是所述的蛋白质既不是S.pombe酵母蛋白质nuc2、构巢曲霉bimA蛋白质、也不是啤酒酵母CDC27蛋白质。
29.权利要求28的抗体，所述抗体与具有Sequence I.D.No.2氨基酸序列的H-NUC蛋白质结合。
30.产生单克隆抗体的杂交瘤，所述的单克隆抗体与具有Sequence I.D.No.2氨基酸序列的H-NUC蛋白质结合。
31.检测肿瘤细胞中H-NUC不存在的方法，包括如下步骤a.从肿瘤中制备组织切片；b.将权利要求26或27的抗体与所述的组织切片接触；c.检测所述的抗体与所述的组织切片的结合是否存在。
全文摘要
本发明涉及分离和纯化的编码Rb结合蛋白质的DNA序列、含有所述DNA序列的载体、基于所述DNA的DNA探针和使用所述的DNA的载体进行治疗的方法。本发明也涉及由所述DNA编码的蛋白质、使用所述蛋白质进行治疗的方法、和表达所述蛋白质的方法。最后，本发明还涉及针对所述蛋白质的抗体、产生所述单克隆抗体的杂交瘤、和使用所述抗体诊断方法。
文档编号C07H21/04GK1138295SQ94194569
公开日1996年12月18日 申请日期1994年12月20日 优先权日1993年12月20日
发明者李文华, 陈芳兰 申请人:德克萨斯系统大学董事会