专利名称：基于ito玻璃基底的细胞培养芯片的制备方法及其应用的利记博彩app
技术领域：
本发明属细胞培养芯片领域，特别是涉及一种玻璃细胞培养芯片的制备方法及其应用。
技术背景利用C02培养箱培养细胞的常规培养方法是一种研究活细胞的良好方法，在病毒学、免疫学、遗传学、肿瘤学等各个领域都得到了广泛的应用，但仍然存在明显不足。首先是 细胞操作方法繁琐，不易控制细胞生长的微环境，难以全面模拟细胞生活的真实环境；还 有就是细胞所需数量巨大，不易进行单细胞的控制和操纵，观察不直接，耗费世纪。将微 流控芯片和细胞培养技术相结合所得到的细胞培养芯片，具有明显的优越性。从器件尺寸 而言，芯片特征尺寸可与细胞大小相比拟，有助于实现单细胞的生物化学实验；从结构上 而言，芯片内物质传输与热传导非常迅速，有利于细胞培养环境的快速稳定；从集成性而 言，芯片上可以集成多种分析手段，实现细胞培养的微型化。由于这些优势的存在，细胞 培养芯片在细胞迁移、细胞分化、药物筛选等多个领域正在发挥越来越重要的作用。在设计芯片时，必须考虑芯片材料的生物兼容性、培养液流动导致的机械力对细胞的 影响和有效成分的传递输送等因素。其中，如何通过简单快速的微细加工工艺加工生物兼 容性良好的材料是需要解决的首要问题。目前用于加工细胞培养芯片的材料主要有硅、玻 璃和聚二甲基硅氧烷(PDMS)等聚合物材料。PDMS芯片通常采用复制压模技术制作， 能够实现微米级图案的高保真复制，并且具有良好的生物兼容性，可直接培养各类细胞。 但由于PDMS为弹性材料，易受有机试剂作用产生微通道变形、溶胀等现象。并且PDMS 管道表面为疏水性，很难润湿亲水性溶液，在培养液进样过程中容易产生气泡而损伤细胞。硅材料亲水，能够耐受硫酸；盐酸等液体，性质相对稳定，加工技术成熟。其缺点主 要是易碎、价格较高、不透光、电绝缘性不够好、表面化学行为较复杂。与硅、PDMS材 料相比，玻璃廉价、易得，且具有良好的亲水性能、力学性能，制作设备与传统IC (集成 电路)工艺设备相兼容。然而，现在制作玻璃芯片的方法是在玻璃基底上溅射一层金属 或多晶硅等薄膜材料作为刻蚀掩模层，然后进行湿法或干法刻蚀，最后在超净环境中利用 高电压或高温进行键合，整个加工工艺复杂，价格昂贵。细胞体外培养还需要一定的恒温环境和合适的气体供应。常规培养下，C02培养箱能 够为细胞培养提供37X:的恒温环境和适当的02、 C02供应。因此，制作细胞培养芯片时， 需要集成温度控制装置，并满足细胞对气体的需求。 发明内容本发明的目的是提供一种基于ITO (Indium-Tin-Oxide,氧化铟锡)玻璃基底的细胞培 养芯片制备方法及其应用，克服现有的聚二甲基硅氧烷(PDMS)芯片的疏水性问题和玻 璃材质芯片的加工工艺复杂问题，为细胞在体外的稳定培养提供了良好的条件。本发明的基于ITO玻璃基底的细胞培养芯片的制备方法，包括步骤以ITO玻璃为细胞培养芯片的基质材料；以ITO玻璃未溅射ITO薄膜的一側甩涂 AZ4620光刻胶作为玻璃腐蚀的掩模层，根据设计的掩膜版进行曝光、显影；将PDMS单 体、固化剂按比例均匀混合，浇注在ITO薄膜一侧，加热固化；将ITO玻璃置于腐蚀液中， 刻蚀得微管道和"坝型"结构；剥离ITO薄膜上的PDMS;将PDMS单体、固化剂按比例 均匀混合后，平铺在载玻片上，加热固化得PDMS薄膜将PDMS薄膜和己刻蚀微管道的 ITO玻璃一侧在氧等离子体作用下键合得到细胞培养芯片；再在ITO玻璃未键合PDMS薄 膜的一侧通过黏附金属导线连入外部温度控制系统。所述的微管道分两个区域，其中一个区域为细胞培养区域，另外一个区域为培养液进 样区域，两个区域通过"坝型"结构连接；所述的"坝型"结构髙度小于微管道深度；所述的腐蚀液是BOE (Buffered Oxide Etch);所述的固化剂是Dow Coming公司所提供的sylgard184产品；所述的PDMS单体与固化剂的重量混合比为10:1;所述的加热固化是8(TC加热固化1小时；所述的黏附金属导线是通过导电胶将金属导线黏附在ITO薄膜上； 所述的外部温度控制系统，其温度控制对象为芯片微管道内液体的温度，其温度传感器为PtlOOO温敏电阻，其加热方法为ITO薄膜导电发热的直接加热方式，其控制中心为ADfiC812单片机。本发明的一种基于ITO玻璃基底的细胞培养芯片的应用在于细胞迁移、细胞分化、细 胞之间相互作用研究。所述的细胞是动物细胞或植物细胞，或正常体细胞或肿瘤细胞； 所述细胞的培养中使用的培养液添加Leibovitz's L-15培养基。 本发明的有益效果(1)利用玻璃湿法腐蚀过程中的钻蚀效应刻蚀出高度低于微管道深度的坝型结构，隔离 细胞培养区域和培养液进样区域，减少了培养液进样所产生的流体剪切力对细胞培养的影 响；(2) 利用ITO玻璃的ITO薄膜导电发热性质，在芯片上集成温度控制系统(3) 利用PDMS材料的透气性特点，在实验过程中无须通入氧气，降低了细胞培养微系 统设计的复杂度；(4) 在细胞培养过程中使用的培养液添加了Leibovitz'sL-15培养基，可以保持培养液pH 值的稳定，从而去除CCb的供应。
图1是ITO玻璃芯片制作工艺过程示意图；图2是芯片的掩膜版设计示意图；图3是玻璃刻蚀后的微管道示意图图4是细胞培养和观察微系统示意图；图5是P正C内皮细胞在芯片内的贴壁展开示意图；图6是3T3细胞在芯片内的相对运动示意图。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一歩阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术 人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限 定的范围。实施例1细胞培养玻璃芯片制作工艺流程如图1所示，具体如下1. 清洗ITO (Indium-Tin-Oxide,氧化铟锡)玻璃，先用丙酮和酒精各超声11分钟，再用 去离子水冲洗干净；2. 在ITO玻璃未溅射ITO薄膜的一侧甩涂AZ4620光刻胶(2000转/秒，30秒)，8(TC前 烘3分钟；3. 根据设计的掩膜版(如图2所示)进行曝光；4. 显舉，130*0后烘，得到与芯片设计所对应的图形结构；5. 将聚二甲基硅氧烷(PDMS)单体和固化剂(Dow Coming公司所提供的sylgaidl'84产 品)按重量比10:1混合均匀，脱气处理30分钟后浇注在ITO薄膜一侧，80X:固化1 小时；6. 将ITO玻璃置于1:6稀释的BOE腐蚀液中腐蚀50分钟，将图形转移到ITO玻璃上， 刻蚀得到的微管道深度约为39微米，得到的坝型结构最大高度约为31微米，刻蚀完 成后的微管道如图3所示；7. 去除覆盖在ITO玻璃上的PDMS材料，将玻璃用丙酮、酒精各超声5min清洗干净；8. 将PDMS单体和固化剂按10:1重量比混合均匀后，脱气处理30分钟，浇注在水平放 置的载玻片上，8(TC固化一个小时，获得厚度为lmm的PDMS薄膜9. 将PDMS薄膜和已刻蚀微管道的ITO玻璃一侧在等离子体刻蚀仪内处理45秒，完成两 者的不可逆键合；10..在ITO玻璃未键合--侧，即溅射有ITO薄膜处，利用导电胶黏附金属导线，连入外部 温度控制系统，其温度控制对象为芯片微管道内液体的温度，其温度传感器为PtlOOO温敏 电阻，其加热方法为ITO薄膜导电发热的直接加热方式，其控制中心为AD(iC812单片机。实施例2培养液采用1640培养基，将其与L-15培养基以1:1混合后，补充10%的胎牛血清、 100Unit/ml链霉素。用胰酶消化液(含0.25%胰蛋白酶和0.02%EDTA)消化常规培养的 P正C内皮细胞、离心去上清、培养液分散重悬，将细胞悬浊液的浓度调整到4xlOscells/ mm3,然后用注射器吸入细胞悬浊液，通过注射泵缓慢注入芯片内。将此已导入细胞的芯 片和温度控制装置、培养液进样装置相连进行细胞的培养。温度控制目标设置在37±0.51C, 培养液进样速度为8fiL/s。芯片置于倒置显微镜下实时观察的细胞的生长状况。细胞培养 和观察微系统如图4所示。图5为PIEC内皮细胞在导入芯片4小时内，利用视频系统记 录下来的细胞贴壁展开图。实施例3培养液采用DMEM (髙糖)培养基，将其与L-15培养基以1:1混合后，补充10%的胎 牛血清、100Unit/ml链霉素。用胰酶消化液(含0.25。/。胰蛋白酶和0.02%EDTA)消化常规 培养的3T3细胞、离心去上清、培养液分散重悬，将细胞悬浊液的浓度调整到4"05cdls/ mm3,，然后用注射器吸入细胞悬浊液，通过注射泵缓慢注入芯片内。将此已导入细胞的 芯片和温度控制装置、培养液进样装置相连进行细胞的培养。温度控制目标设置在37±0.5 X:，培养液进样速度为8jiL/s。芯片置于倒置显微镜下实时观察的细胞的生长状况。细胞 培养和观察微系统如图4所示。图6为3T3细胞在芯片培养过程中，利用视频系统记录下来的两个细胞在2小时内相 对移动过程。
权利要求
1.一种基于ITO玻璃基底的细胞培养芯片的制备方法，包括步骤以氧化铟锡ITO玻璃为细胞培养芯片的基质材料；以ITO玻璃未溅射ITO薄膜的一侧甩涂AZ4620光刻胶作为玻璃腐蚀的掩模层，根据设计的掩膜版进行曝光、显影；将聚二甲基硅氧烷PDMS单体、固化剂按比例均匀混合，浇注在ITO薄膜一侧，加热固化；将ITO玻璃置于腐蚀液中，刻蚀得微管道和“坝型”结构；剥离ITO薄膜上的PDMS；将PDMS单体、固化剂按比例均匀混合后，平铺在载玻片上加热固化得PDMS薄膜；将PDMS薄膜和已刻蚀微管道的ITO玻璃一侧在氧等离子体作用下键合得到细胞培养芯片；再在ITO玻璃未键合PDMS薄膜的一侧通过黏附金属导线连入外部温度控制系统。
2. 根据权利要求1所述的基于ITO玻璃基底的细胞培养芯片的制备方法，其特征在于-所述的微管道分两个区域，其中一个区域为细胞培养区域，另外一个区域为培养液进样区 域，两个区域通过"坝型"结构连接。
3. 根据权利要求1或2所述的基于ITO玻璃基底的细胞培养芯片的制备方法，其特征在 于所述的"坝型"结构高度小于微管道深度。
4. 根据权利要求1所述的基于ITO玻璃基底的细胞培养芯片的制备方法，其特征在于 所述的腐蚀液是Buffered Oxide Eteh。
5. 根据权利要求1所述的基于ITO玻璃基底的细胞培养芯片的制备方法，其特征在于 所述的PDMS单体与固化剂的重量混合比为10:1。
6. 根据权利要求1所述的基于ITO玻璃基底的细胞培养芯片的制备方法，其特征在于 所述的加热固化是80'C加热固化1小时。
7. 根据权利要求l所述的基于ITO玻璃基底的细胞培养芯片的制备方法，其特征在于 所述的黏附金属导线是通过导电胶将金属导线黏附在ITO薄膜上。
8. 根据权利要求1所述的基于ITO玻璃基底的细胞培养芯片的制备方法，其特征在于 所述的外部温度控制系统，其温度控制对象为芯片微管道内液体的温度，其温度传感器为 PtlOOO温敏电阻，其加热方法为ITO薄膜导电发热的直接加热方式，其控制中心为 ADnC812单片机。
9. 一种基于ITO玻璃基底的细胞培养芯片的应用在细胞迁移、细胞分化、细胞之间相互 作用研究。
10. 根据权利要求IO所述的基于ITO玻璃基底的细胞培养芯片的应用，其特征在于所 述的细胞是动物细胞或植物细胞。
11. 根据权利要求IO所述的基于ITO玻璃基底的细胞培养芯片的应用，其特征在于所述的细胞是正常体细胞或肿瘤细胞。
12.根据权利要求IO、 11或12所述的基于ITO玻璃基底的细胞培养芯片的应用，其特征 在于所述细胞的培养中使用的培养液添加Leibovitz's L-15培养基。
全文摘要
本发明涉及一种基于ITO玻璃基底的细胞培养芯片的制备方法及其应用，制备以ITO玻璃为基质材料；在ITO玻璃未溅射ITO薄膜的一侧甩涂AZ4620光刻胶，曝光、显影；将PDMS单体、固化剂混合，浇注在ITO薄膜一侧，加热固化；将ITO玻璃置于腐蚀液中，刻蚀；剥离ITO薄膜上的PDMS；制备PDMS薄膜；PDMS薄膜和已刻蚀微管道的ITO玻璃在氧等离子体作用下键合得到细胞培养芯片；再在ITO玻璃未键合PDMS薄膜的一侧连入外部温度控制系统。该芯片克服PDMS芯片的疏水性问题和玻璃材质芯片的加工工艺复杂问题，并且便于直接控制芯片温度，可应用于细胞迁移、细胞分化、细胞之间相互作用研究。
文档编号C03C15/00GK101148324SQ20071004599
公开日2008年3月26日 申请日期2007年9月14日 优先权日2007年9月14日
发明者蕾 吴, 杨才表, 辉 赵, 赵建龙, 强 陈 申请人:中国科学院上海微系统与信息技术研究所