一种用于靶向捕获癌细胞的叶酸功能化纳米纤维的制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于靶向捕获癌细胞纳米材料的制备领域，特别涉及一种用于靶向捕获癌 细胞的叶酸功能化纳米纤维的制备方法。
【背景技术】
[0002] 循环肿瘤细胞（CTC)是肿瘤转移过程中在血液循环系统中存活的肿瘤细胞，该细 胞的生成被认为是肿瘤发生转移的必要前提。恶性肿瘤是我国死亡率最高的重大疾病之 一，90%以上肿瘤患者的死亡都是由于肿瘤转移所致。侵袭与转移是恶性肿瘤最显著的特 征之一，肿瘤细胞自发或因诊疗操作从原发肿瘤脱落，发生上皮-间质转化（EMT)，从而具 有流动特性，进入外周血中，就形成了循环肿瘤细胞（CTC)。CTC的检测有助于研宄肿瘤转 移机制、指导肿瘤治疗、判断治疗效果、为推断预后提供可靠参考，是国内外肿瘤治疗关注 的焦点。
[0003] 纳米材料由于其尺寸较小（l-100nm)，具有特殊的光学、电子学和磁学等性质受到 越来越多的关注。据报道证明纳米结构可以很好地促进其与细胞间的相互作用，大大提高 捕获效果。随着纳米科学与技术的发展，人们获得了结构可控的、表面功能化的纳米材料和 纳米结构，靶向CTC表面标志物的特异性识别分子修饰的纳米材料对CTC细胞的检测研宄 受到了科学家的广泛关注，并取得了令人瞩目的成果。2013年，《自然》(Nature)杂志将CTC 纳米检测列为最具创新性和转化潜力的肿瘤诊断新方法[MARXV.Trackingmetastasis andtrickingcancer[J].Nature, 2013, 494(7435):133-8. ]〇
[0004] 静电纺丝技术因为其设备简单，操作容易以及高效等特点，并且通过其制备的纳 米纤维比表面积高、均一性好以及纤维形貌可调可控等优点，而成为近年来备受关注、应用 最多的制备纳米纤维的方法。使用该方法可以制备出直径l〇nm~10ym的超细纤维，在催 化剂载体、生物医学、增强材料、过滤材料、电极材料、传感器等方面都有很好的应用。
[0005] 聚乙烯醇（PVA)具有优异的生物可降解性、生物相容性，在外科用缝合线、体内植 入材料、药物载体及组织工程支架方面有着广泛的应用。PVA是一种半晶状聚合物，具备较 高的化学稳定性和热稳定性。PVA无毒，对动物体没有负面影响，与皮肤接触不会造成任何 损伤。聚乙烯亚胺（PEI)表面含有大量氨基，表面易修饰，且与PVA混纺可以很容易实现表 面交联，提高其水稳定性，目前正受到越来越广泛的关注。
[0006] 目前，抗体、多肽、E-选择素等细胞配体已被功能化修饰至纳米纤维表面，并应 用于癌细胞的特异性捕获。文献[ZHAZB，COHNC，DAIZF，etal.Nanofibrouslipid membranescapableoffunctionallyimmobilizingantibodiesandcapturing specificcells[J].AdvMater, 2011，23(30) :3435-40.]中表明叶酸（FA)与叶酸受体 (FR)有很高的亲和力。叶酸受体（FR)在许多上皮源性和非上皮源性恶性肿瘤细胞显著高 表达，其表达水平大大高于正常细胞，具有组织特异性。FR是细胞摄取叶酸的重要途径，其 机制为受体介导的内吞效应，这种机制具有亲和力尚、特异性强的特点，有良好的物质转运 潜能。叶酸是包括DNA合成、DNA修复和细胞分裂在内的很多生物过程所需的一种必要维 他命。"正常"细胞表达数量相对较少的三个叶酸受体FRa、FRf3和FR丫，而它们在癌细胞 中普遍过度表达FRa和FR0。能够过度表达叶酸受体的癌症细胞包括卵巢癌、肺癌、肾癌、 子宫内膜癌、乳腺癌、脑癌、结肠癌和造血系骨髓细胞癌等。
[0007] 有文献报道[Zhao,Y. , etal., Dendrimer-functionalizedelectrospun celluloseacetatenanofibersfortargetedcancercellcaptureapplications. JournalOfMaterialsChemistryB,2014. 2(42):p. 7384-7393.]，通过将叶酸与树状大分 子结合，并修饰到聚电解质自组装纳米纤维表面，对癌细胞特异性地捕获。该方法操作复 杂，自组装的步骤繁琐，且成本昂贵。
[0008] 聚乙烯亚胺（PEI)表面含有大量氨基，易修饰，且成本低廉，检索国内外相关文献 和专利结果表明：通过运用聚乙烯亚胺（PEI)进行表面修饰，用于靶向捕获癌细胞的叶酸 功能化纳米纤维的制备方法，尚未见报道。
【发明内容】
[0009] 本发明所要解决的技术问题是提供一种用于靶向捕获癌细胞的叶酸功能化纳米 纤维的制备方法，该方法制备的靶向分子叶酸修饰的功能化静电纺聚乙烯醇/聚乙烯亚胺 (PVA/PEI)纳米纤维材料可用于特异性捕获癌细胞；该发明制备的癌细胞捕获材料具有制 备工艺简单、特异性强、可短时间内靶向捕获癌细胞等优点，在癌症的早期诊断方面具有很 好的应用前景。
[0010] 本发明的一种用于靶向捕获癌细胞的叶酸功能化纳米纤维的制备方法，包括：
[0011] ⑴以水为溶剂，聚乙烯醇PVA与聚乙烯亚胺PEI按照质量比为3:1配制纺丝液， 通过静电纺丝制备得到PVA/PEI纳米纤维膜；
[0012] (2)将步骤⑴中制备得到的PVA/PEI纳米纤维膜与戊二醛溶液在干燥器中进行 交联反应，得到不溶于水的交联PVA/PEI纳米纤维膜；
[0013] (3)以二甲基亚砜DMS0为反应溶剂，通过1-(3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺 盐酸盐EDC? HC1和N-羟基琥珀酰亚胺NHS活化叶酸FA的羧基，将活化后的FA加入到带 有一端羧基和一端氨基的聚乙二醇NH2-PEG-C00H溶液中，进行酰胺化反应，然后透析，冷冻 干燥，得到 FA-PEG-C00H;
[0014] (4)用EDC?HC1和NHS活化步骤⑶中得到的FA-PEG-C00H的羧基，将活化后的 FA-PEG-C00H加入到步骤（2)中得到的纳米纤维膜中，摇床反应3-5天，得到叶酸功能化修 饰的纳米纤维，加入三乙胺和乙酸酐进行乙酰化处理，洗涤，干燥，即得叶酸功能化纳米纤 维。
[0015] 所述步骤（1)中PVA的重均分子量^为88000,PEI的重均分子量M"为25000。
[0016] 所述步骤（1)中纺丝液中PVA的浓度为12wt%。
[0017] 所述步骤（1)中静电纺丝技术的参数为：电压为18. 6kv，流速设置为0.3ml/h，纺 丝距离设置为25cm，环境湿度为40-50%。
[0018] 所述步骤（2)中得到的交联后纳米纤维的表面颜色由交联前的白色变为棕色。
[0019] 所述步骤⑶中NH2-PEG-C00H的^为2000。
[0020]所述步骤⑶中投料摩尔比为 FA:EDC? HC1:NHS:NH2_PEG-C00H=2. 5:2:2:1。
[0021] 所述步骤⑷中投料摩尔比为FA-PEG-COOH:EDC?HC1:NHS= 1:5:5。
[0022] 所述步骤⑷中乙酰化的条件为三乙胺和乙酸酐的摩尔量均为5倍于PEI的表面 氨基的摩尔量，反应时间为1天。
[0023] 所述步骤（4)中得到叶酸功能化纳米纤维应用于表面高叶酸受体表达的癌细胞 的特异性捕获。
[0024] 本发明中FA-PEG-COOH的制备过程：
[0025]NH2-PEG-COOH的]\^为2000;FA的分子量为 441. 4;EDC.HC1 的分子量为 191. 7;NHS 的分子量为 115. 09。称取NH2-PEG-COOH79. 42mg，溶于 7ml的DMSO中。称取FA43. 82mg， 溶于5mlDMSO中。EDOHC1和NHS分别为15. 22mg和9. 14mg各溶于lmlDMSO中。用 EDC*HC1和NHS活化FA羧基3小时后，加入到NH2-PEG-COOH中，在磁力搅拌器上混合反应 3天。
[0026] 反应结束后，将反应液放入截留分子量为1000的透析袋中，用夹子夹紧，在纯水 中透析3天，让未反应的小分子透出，尽可能地提高整个体系的纯度。透析完成后，把反应 液转移到50ml的离心管中，放入-80°C冰箱1小时，使其冷冻结冰。把冷冻好的样品，快速 取出，放入冻干机中，冻干3天后，就可以得到粉末状的FA-PEG-COOH。
[0027] 本发明以靶向分子叶酸功能化纳米纤维为基质，通过培养叶酸受体高表达人脑胶 质瘤细胞（U87MG)和叶酸受体低表达小鼠成纤维细胞（L929)探宄其特异性捕获癌细胞的 效果。
[0028] 本发明通过核磁共振（NMR)对FA-PEG-COOH的结合效率进行了表征。借助扫描电 镜（SEM)对戊二醛交联前后的纳米纤维和靶向分子修饰后的纤维形貌进行表征，利用傅里 叶变换-红外光谱（FTIR)对其结构进行表