专利名称：热稳定的酶用作饲料添加剂的利记博彩app
技术领域：
本发明涉及将酶用作动物饲料添加剂，具体地讲涉及将热稳定的酶用作动物饲料添加剂，以便在相对高温的饲料加工期间该酶的活性不发生明显的下降。本发明还提供了饲料添加剂及包含所述热稳定的酶的谷物基料饲料。
人们一直在追寻能使动物高效消化其饲料的改进饲料。主要的关注点之一是在不增加单位重量成本的前提下提高饲料转换比率(FCR)。饲料的FCR是消耗的饲料是与动物的增重的比值。低的FCR表示给定量的饲料导致生长动物增重较多。这意味着动物能更有效地利用饲料。可降低FCR的途径之一是通过改善动物对其的可消化性，从而增加可使动物增重的营养。
对饲料的营养成分，如淀粉、脂肪、蛋白质和氨基酸的可消化性有各种限制。这些限制包括(i)动物肠内的物质的粘性。所述的粘性是由于，至少部分是由于可溶的非—淀粉多糖，如混交联β-葡聚糖和阿拉伯糖基木聚糖引起。
(ii)饲料的细胞壁对营养物的捕获(entrapment)，特别是谷物的糊粉层的细胞壁对营养物的捕获。所述的捕获是由谷物的细胞壁里的大量的非淀粉多糖引起的，所述的谷物细胞壁相对地耐受动物消化系统的裂解。这就防止了动物对被捕获在细胞内的营养物的营养获得；及(iii)动物和肠微生物，尤其是在年幼动物的内源酶活性的缺乏。
防碍可消化性的上述问题在谷物基料食料，如那些小麦含量高的食料中尤为显著。
由于饲料里的营养物的可消化性差的问题，有必要使饲料含有提供大量的能量和蛋白质的物质以便满足动物的营养需要。
现在基本上有证据证明，即在谷物基料的动物饲料里掺入某些(补加的)酶可有利于降低动物肠内的物质的粘性。这种降低可通过酶，如水解可溶木聚糖的木聚糖酶来实现，因而降低了是消化过程主要限制的消化物的粘性。
作为添加剂加入的木聚糖酶的目标动物胃肠道内的pH和温度条件下必须是稳定的和有活性的。如果当把它们暴露于活体外这样的条件时，它们是不稳定和无活性的，它们则不能使消化物粘性降至任何显著的程度。目前已知将来自真菌，如Longibrachiatum木霉(Trichoderma Longibrachiatum)，黑色曲霉(Aspergillus niger)和insolens腐质霉(Humicola insolens)的木聚糖酶作为添加剂应用在动物饲料中。
Bedford和Classen(The Journal of Nutrition，122卷，560-569页)披露在适合煎烤的雏鸡活体内测得的消化物粘性和体重增重及FCR值之间显著相关。在用小麦和黑麦基料食料喂养家禽时，表明多至70-80％的体重增重和FCR间的差异仅基于肠内粘性的差异。这就突出了含有大量可溶性阿拉伯糖基木聚糖的谷物基料饲料的消化物粘性的重要性。当消化物粘性增高时，通过妨碍胰酶、底物及消化过程的终产物的扩散而降低所有营养物的可消化性。
已经发现在动物饲料里包含木聚糖酶有助于牲畜降低消化物粘性。结果是，动物消化饲料的能力得到了提高，动物消耗单位量的饲料的体重增重得到了提高，且饲料的FCR得以降低。
传统地通过将酶浸透到生理上可接受的载体，如谷物上而将酶添加剂，如木聚糖酶包含到动物饲料中。被浸透的载体与饲料的基它组分混合，然后将其压成可直接饲喂动物的方块或丸片饲料。
最近在将各种饲料组分加工成有形体如方块和颗粒饲料方面有了很大进展。所述的加工已发展为使用相对高的湿度。这首先提高了生产过程的效率，其次使生产出的饲料不含有害的细菌，尤其是沙门氏菌。另外，高温的使用提高了所得方块和颗粒饲料的质量和耐久性，扩大了可被有效地处理的成份的范围，并且也增加了液体成份，如可被掺入到饲料中的脂肪和糖蜜的量。
当前所用的加工技术对饲料组分的混合物施用相对的高温达相对长的时间。而且，混合物在加工过程受相对的高压，也有助于提高所形成的方块和丸片饲料的耐久性。
已用来改善饲料的营养性质的加工方法之一是蒸汽压丸。该方法包括用蒸汽处理化合的饲料从增中它的温度和湿度会含量的步骤。该步骤称为调理。依据饲料的类型和组成，调理步骤持续几秒到数分钟。调理器内的温度可升至100℃。然后，使饲料通过压丸模；由于摩擦，该模使其温度迅速增高。
最近，为饲料的预处理或调理引入了新的装置，称为膨化器(expander)。该装置允许在压力下进行调理，然后压丸。按照本技术，将先前受蒸汽调理的各种饲料组分装入注入了更多蒸汽的螺旋压缩机内，增高物料块所受的压力并进行剪切，然后使之通过可变(大小)的出口。将压缩的产物，在颗粒尺寸缩小后，装入标准的压丸机。
饲料组分在膨化器内停留的时间为大约5-20秒，而温度可高达145℃。压缩压力可达给3.5MPa，可很快建立所述的温度和压力且两者在产物从出口被挤后可快速降低。
膨化器的使用是有利的，因它们能有效地去除有害细菌，尤其是沙门氏菌。而且，有可能在造料前在混合物中包含相对大量的脂肪和其它液体成份。另外，蒸煮和压/切步骤导致较大量的淀粉凝胶的形成。
但是，这样的高温和高压的加工条件，特别是当用于在造粒过程中经常遇到的潮湿条件下时，对某些饲料组分有潜在的破坏作用。这在酶，包括木聚糖酶存在时更甚。
已熟知，酶是蛋白质，因此由氨基酸组成。氨基酸的特定顺序，“一级结构”决定了蛋白质的性质。然后氨基酸链可排列成许多“二级结构”，如片层和螺旋。这些结构也彼此相互组织起来得出“三级结构”；例如，片层可彼此平行排列，很象报纸的纸页。最后，在特定的酶里，几个亚单位可结合在一起，这也导致了“四级结构”。
如有功能，酶还须有活性位点，该位点能催化特定底物的反应，该活性位点经常具有特异的形状，所述形状由酶的一级、二级、三级、四级结构决定。催化位点形状的变化可能使酶失活。
有几个因素，包括热、压力和pH，可改变酶的形状而且也可改变其活性位点的形状。在饲料的加工过程中，已存在于混合物中的任何酶将遭受使酶至少部分变性并因此而丧失一些或全部活性的温度和压力的影响。在加工过程中，酶所暴露的温度越高，其活性下降的越多。典型地，嗜温木聚糖酶在直至65℃时还是稳定的，但如暴露于95℃至少在水溶液中全部活性丧失。
如在饲料加工过程中发生这样的温度介导的变性，当然是极为不利的，因所加的酶将不会起到效果，或仅起到有限程度的效果。克服这一问题的一个可能为在饲料里包含更相对大量的酶以便补偿一定比例的失活。然而，从经济的观点来说，添加这样额外量的酶是不利的，因为掺与到动物饲料中的酶相对来说是昂贵的。
有研究表明可通过将酶包被在特殊的载体上或用特殊的包被技术包被它们以稳定酶。然而，这样的方法还不能有效地应付在高温蒸汽压丸、在膨化器中或在挤出机中遇到的相对剧烈的加工条件。
另一个解决办法是将酶，如木聚糖酶加入到已经热处理过的预先形成的颗粒饲料中。然而，该方法不是理想的解决办法，首先需要复杂而昂贵的机器以将酶精确包被到颗粒饲料上而得到所需的包入的相对量。其次，在所述的包被步骤中使用的酶的溶液具有有限的贮藏稳定性，并且可被细菌污染。
因此，尽管可得到对饲料加工过程中的酶稳定性问题部分解决的办法，它们均不能以完全有效的形式解决该问题。
在下面的说明书及权利要求中，提到了木聚糖酶活力单位。本发明所用的所述活力由下面试验方法测量。
木聚糖酶活性的试验方法一个单位的木聚糖酶的活性为在下面所述的条件下在一分钟内使一微摩尔的还原糖(由木糖等同物表示)从底物中释放出来的酶量。
试剂1.1％(W/V)的木聚糖底物向1.0g的木聚糖(Fluka 95590)中加入0.5M氢氧化钠10ml。用磁力搅拌器混合30分钟。加入大约40ml的0.05M，pH6.5的乙酸钠缓冲液。用1M乙酸调节pH至6.5。用0.05M，pH6.5的乙酸钠缓冲液加到100ml。当使用时，应一直混合底物。
2.1M乙酸用移液管将5.7ml冰乙酸加入有体积刻度的烧瓶中，并用蒸馏水补至100ml。
3.0.05M的乙酶钠缓冲液，pH6.5A.将4.1g乙酸钠用蒸馏水溶解，并用蒸馏水补至1000ml。
B.将3.0g冰乙酸用蒸馏水溶解，并用蒸馏水补至1000ml。
用溶液B调节溶液A的pH至pH6.5。
4.二硝基水杨酸(DNS)试剂将20.0g 3，5-二硝基水杨酸悬浮于大约800ml的蒸馏水中。边连续搅拌边逐渐加入300ml的氢氧化钠溶液(32.0g的NaOH溶于300ml的蒸馏水)。边搅拌边在水浴(温度不能超过+48℃)里温热该悬浮液直至溶液澄清。逐渐加入600g的酒石酸钾钠。如需要，温热该溶液(温度不能超过+48℃)直至溶液澄清。
用蒸馏水补至2000ml并用粗烧结下的玻璃过滤器过滤。
于室温在黑色的瓶中贮存。该试剂最多稳定6个月。
步骤1.酶样品在50℃校准1ml的酶稀释液(在0.05M的乙酸钠缓冲液里，pH6.5)。加入1ml的木聚糖底物搅拌并在50℃精确温浴30分钟。加入3ml的DNS试剂，搅拌并煮沸反应混合物达5分钟。将反应混合物在冷水浴中冷却至室温，并以蒸馏水为对照在540nm测吸光度。
2.酶空白将1ml木聚糖底物在+50℃温育30分钟。加入3ml的DNS试剂并搅拌。加入1ml的酶稀释液(在0，05M的乙酶钠缓冲液里，pH6.5)并搅拌。煮沸混合物达恰好5分钟。将反应混合物在冷水浴中冷却至室温，并以蒸馏水为对照在540nm测吸光度。
酶样品和酶空白之间的吸光度的差异应为3.0-0.5。
3.标准曲线用0.05M乙酸钠缓冲液，pH6.5制备无水木糖的标准溶液。标准溶液的木糖浓度应为0.05-0.5mg/ml。用移液管移取1ml的标准溶液、1ml的木聚糖底物和3ml的DNS试剂加到试管中。搅拌并煮沸达恰好5分钟。在冷水浴中冷却至室温并以标准空白为对照在540nm测吸光度。在标准空白中，木糖溶液以1ml的0.05M的乙酸钠缓冲液，pH6.5来替代。在其它方面，标准空白象木糖标准那样进行处理。
绘制木糖浓度对吸光度的函数曲线。对每一新的DNS-试剂制作新的标准曲线。计算按照下式计算样品的木聚糖酶的活力 其中A(X)＝酶样品的吸光度A(O)＝酶空白的吸光度k＝标准曲线的斜率Ce＝木糖标准曲线的截距1000＝因子，mmol-＞μmolDf＝稀释因子(ml/g)MWxyl＝木糖的分子量(150.13mg/mmol)t＝反应时间(30分钟)基于上述考虑，本发明的目的之一在于提供木聚糖酶用作动物的饲料的添加剂，当其被暴露于相对高温的加工技术能基本上保持它的全部活性。
因此，本发明提供将热稳定的木聚糖酶用作动物饲料添加剂，所述木聚糖酶的特征为能耐受1分钟的调至95℃的水浴加热而基本上不丧失其活性；所述的活性由其在pH6.5和40℃的温度下使1％的小麦阿拉伯糖基木聚糖溶液的粘度降至与未加热对照相同的终粘度±0.0001帕斯卡秒的能力而确定的。
优选地，木聚糖酶能在pH6.5和40℃的温度下使1％的小麦阿拉伯糖基木聚糖溶液的粘性降至与未加热对照相同的终粘度±0.005帕斯卡秒。
上面概述的木聚糖酶活性试验是用小麦阿拉伯糖基木聚作为粘性底物在模拟发现于动物的胃肠道的那些条件下在活体外的粘性—降低试验。在关于木聚糖酶(或木聚糖酶的混合物)在用作动物饲料的添加剂时是否具有所需的降低消化物粘性的作用时，在活体外的这样的试验起到了指导作用。
用于测量木聚糖酶降低粘性的能力的粘性—降低试验的详细情况如下。在所有情况下，试验均设重复。
用具有pH6.5的0.1M的磷酸钠缓冲液稀释需试验的木聚糖酶以便调整木聚糖酶的浓度，使所得的溶液具有每ml 1.0单位的木聚糖酶活。按照上述所详细描述的木聚糖酶活力的试验方法测定木聚糖酶的活力。
将100μl的酶溶液加入玻璃试管内的400μl溶于0.1M磷酸钠，pH6.5的小麦阿拉伯糖基木聚糖溶液，使所得溶液的酶的终浓度为0.2U/ml，和小麦阿拉伯糖基木聚糖的终浓度为1.0％w/w。
然后将含有溶液的试管封住并置于调至95℃的水浴中一段时间，典型1分钟或5分钟。该热处理后，试管在冰水浴里冷却。20分钟后，用每秒钟测一次粘性的Brookfield DV-II，CP40粘度计在40℃的温度下测所得溶液的粘度。
根据本发明用热稳定性的木聚糖酶作为动物饲料的添加剂具有的好处是在它与其它组分结合后，木聚糖酶的活性基本上不减小且易于进行传统的饲料加工，如用膨化器或挤出机。
可从合适的来源获取用于本发明的热稳定的木聚糖酶。一般从微生物，优选从真菌细菌中获取热稳定的木聚糖酶。产生用于本发明的热稳定的木聚糖酶的细菌生物包括古细菌(Archaebacteria spp.)；芽孢杆菌(Bacillus spp.)，尤其是嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)；热纤维菌(Caldocellum spp.)尤其是解糖热纤维菌(Caldocellum saccharolyticum)；纤维单孢菌(Cellulomonas spp.)；梭状芽孢杆菌(Clostridium spp.)，尤其是丙酮丁醇梭状芽孢杆菌(Clostridium acetobutylicum)；Dictyoglomus spp.；真杆菌(Eubacterium spp.)，尤其是thermotoga真杆菌(Eubacteriumthermotoga)；灰色腐质霉菌thermoidea变种(Humicola grisea Var.thermoidea)；Malbranchia spp.，尤其是Malbranchia cinnamonmea及Mallbranchia var.Sulfurea；毁丝霉菌(Myceliopthora spp.)，尤其是嗜热毁丝霉菌(Myceliophtora thermophilum)；红栖热菌(Rhodothermus spp.)，尤其是海生红栖热菌(Rhodothermus marinus)；裂褶菌(Schizophyllum spp.)，Scotothermus spp.；糖单孢菌(Saccharomonospora spp.)；孢子丝菌(Sporotrichum spp.)；链霉菌(Streptomyces spp.)；栖热菌(Thermus spp.)；热厌氧细菌(Thermoanaerobacter spp.)，尤其是解糖热厌氧细菌(Thermoanaerobactersaccharlyticus)；热子囊菌(Thermoascus spp.)，尤其是橙色子囊菌(Thermoscusauranticus)；热菌丝菌(Thermomyces spp.)，尤其是疏棉状毛热子囊菌(Thermoascuslanuginosus)；热单孢菌(Thermomonospora spp.)；和马杜拉放线菌(Actinomadura spp.)根据本发明真菌生物也是优选的木聚糖酶的来源。具体地讲，根据本发明产生热稳定的木聚糖酶的真菌包括盛泡曲霉；烟曲霉；和构巢曲霉。更优选产生木聚糖酶的褐色热单孢菌(Thermomonospora fusca)和锯齿小四孢菌(Microtetraspora flexuosa)。
Irwin等在Applied and Enviromental Microbiology，60卷，763-770页(1994)提供了来自褐色热单孢菌(Thermomonospora fusca)的木聚糖酶的特征及氨基酸序列。可按照本领域已知的方法进行褐色热单孢菌(Thermomonospora fusca)的发酵以生产用于本发明的热稳定的木聚糖酶。例如，Rothlisberger等在AppliedMicrobiological.Biotechnology，37卷，416-419页(1992)及在EP-A-0 473545中描述了适当的发酵步骤。当提供了在文献中描述的来自褐色热单孢菌(Thermomonospora fusca)的木聚糖酶的生化特征时，本领域的技术人员可按照本领域已知的任何方法对所产生的热稳定的木聚糖酶进行纯化。
来自锯齿小四孢菌(Microtetraspora flexuosa)的热稳定的木聚糖酶的分离详细描述于下。已经发现从锯齿小四孢菌(Microtetraspora flexuosa)中可分离出5种不同的热稳定的木聚糖酶。这些木聚糖酶以下被分别称为木聚糖酶1-5。这些木聚糖酶已被纯化为由银染等电聚焦电泳测得的匀质。通过离子交换层析和疏水反应层析的结合进行木聚糖酶的纯化。每种纯化的木聚糖酶在宽的pH范围内其特征均为热稳定的。特别地，在pH 6-9的范围内每种木聚糖酶均保留了大于80％的活性。
木聚糖酶的特征进一步分析如下。木聚糖酶1具有约33,100道尔顿的分子量，约8.5的pI，且在pH7.0-7.5的范围内，在70℃的温度下具有最大的活性。木聚糖酶2具有大约13,300道尔顿的分子量，约7.5的pI，且在pH7.0-7.5的范围内在约65℃的温度下具有最大的活性。木聚糖酶3具有约31,000道尔顿的分子量，约6.2的pI，且在pH约7.5和约65℃的温度下具有最大的活性。木聚糖酶4具有约50,000道尔顿的分子量，约5.8的pI，且在pH约7.5和约65℃的温度下具有最大的活性。木聚糖酶5具有约35,000道尔顿的分子量，约5.3的pI，且在pH约7.5和约70℃的温度下具有最大的活性。
锯齿小四孢菌(Microtetraspora flexuosa)的木聚糖酶可根据本发明以所有5种木聚糖酶的混合物，使用即以木聚糖酶上清液的全部独自使用，也可以其任意结合而使用。对那些可用于本发明的可从其它真菌或细菌源获得的其它的热稳定的木聚糖酶来说也是一样的。制备用于本发明的木聚糖酶的另一途径是通过重组DNA技术构建能产生所需的热稳定的木聚糖酶的合适的宿主微生物。因此可以受遗传操纵，如将编码热稳定的木聚糖酶的基因包含到宿主细菌或真菌菌株中的宿主中获得木聚糖酶。
来自锯齿小四孢菌(Microtetraspora flexuosa)的木聚糖酶1-5可从保藏于ATCC，Bethesda，ND，USA(此处易于得到菌株)的ATCC35864号菌株中产生。新的木聚糖酶的分离包括依据所纯化的木聚糖酶通过离子交换层析(IEC)和疏水反应层析(HIC)的任意顺序的结合进行的细胞外木聚糖酶的纯化。
对来自锯齿小四孢菌(Microtetraspora flexuosa)的5种化学上明显区别的木聚糖酶的分离和特征分析的两种纯化方法如下。在两种方法中，均通过离心除去锯齿小四孢菌(Microtetraspora flexuosa)细胞，用超过滤浓缩培养基肉汤。在第一方法中，木聚糖酶1(pI8.5)、木聚糖酶2(pI7.5)、和木聚糖酶4(pI5.8)被分离并纯化。不含细胞的完全培养基肉汤制备物中加到阴离子交换柱中，用提高盐(NaCl)梯度的溶液洗涤和洗脱。收集级分后，用remazol亮蓝染的桦木木聚糖试验(RBB-木聚糖试验)测量木聚糖酶的活性。柱中的木聚糖酶1和木聚糖酶2被突然洗脱。收集突然的洗脱物并从新上样到疏水反应柱(苯基琼脂糖)。通过用提高乙二醇的浓度进行洗脱将木聚糖酶1和木聚糖酶2分离开。木聚糖酶4与阴离子交换柱相结合，以与其它结合的木聚糖酶(木聚糖酶3和5)的盐梯度洗脱。通过HIC将木聚糖酶4与其它木聚糖酶分离开。该分离更详细地描述于下面的实施例1。通过等电聚焦和质谱(MS)或十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)对纯化的木聚糖酶1、2和4进行进一步的分析。
在第二方法中，作为第一步对上面在所述的不含细胞的完全培养基肉汤进行HIC来纯化木聚糖酶3(pI6.2)和木聚糖酶5(pI5.3)。两种木聚糖酶在相同的硫酸铵浓度下共洗脱出来。为将木聚糖酶3和木聚糖酶5彼此分离开，对收集的洗脱的活性酶物质进行了IEC。木聚糖酶3比木聚糖酶5以较低的盐浓度从阴离子交换柱中被洗脱出来。首先用等电聚焦和MS或SDS-PAGE对两种纯化的木聚糖酶进行特征分析。
每种木聚糖酶通过其独特的生化特征，如分子量、pI、最适温度和pH、疏水性和温度稳定性而与其它酶相区别。所有的5种木聚糖酶可耐受直至90℃的高温和在pH7.0-10.0范围内的碱性条件。这5种纯化的木聚糖酶在80℃的半衰期为30分钟到110分钟内变化。在下面的参考例2中进一步描述了5种纯化为匀质的木聚糖酶特征。
根据本发明的另一方面提供了包含生理上可接受的载体和热稳定的木聚糖酶的饲料添加剂，所说的木聚糖酶的特征为能耐受1分钟的调至95℃的水浴加热而基本上不丧失其活性；所述的活性由其在pH6.5和40℃的温度下使1％的小麦阿拉伯糖基木聚糖溶液的粘度降至与未加热的对照相同的终粘度±0.001帕斯卡秒的能力而确定的。
按照该方面，热稳定的木聚糖酶可以是前面所述的木聚糖酶任何一种或木聚糖酶的任意混合物。因此，优选从锯齿小四孢菌(Microtetraspora flexuosa)或褐色热单孢菌(Thermomonospora fusca)获得的木聚糖酶。
本发明该方面的生理学上可接受的载体优选谷物或谷物的衍生物。所述的谷物包括粉碎的小麦、玉米、大豆、糖、淀粉或任何这些物质的副产物。所述的这些载体在本技术领域中是惯用的，因此不再详细描述。
根据本发明的该方面的饲料添加剂与其它饲料组分结合来产生谷物基料饲料。所述的其它饲料组分包括一种或多种具有其它的(优选热稳定的)酶添加剂、维生素饲料添加剂、矿物质饲料添加剂和氨基酸饲料添加剂。所得的(结合的)可能包含几种不同类型化合物的饲料添加剂可以适当的量与其它饲料组分如谷物和蛋白质添加剂相混合来形成动物饲料。用目前使用的加工设备如双造粒机、蒸汽造粒机、膨化机或挤出机将这些化合物加工成动物饲料。
在所得的从谷物基料里存在热稳定的木聚糖酶具有降低其FCR的效果。木聚糖酶可选择地或额外地增加谷物基料饲料的可消化性。而且，包含的木聚糖酶可额外地或选择地增加动物消耗单位量的饲料的体重增重比率。
本发明在另一方面提供了含有至少20％重量的谷物、及每kg饲料含0.00001g-10g热稳定的木聚糖酶蛋白质的谷物基料饲料，所述的木聚糖酶的特征为能耐受1分钟的调至95℃的水浴的加热而基本上不丧失其活性；所说的活性由其在pH6.5和40℃的温度下使1％的小麦阿拉伯糖基木聚糖溶液的粘度降至与未加热的对照相同的终粘度±0.001帕斯卡秒的能力而确定的。
在本发明的该方面，热稳定的木聚糖酶可以是前面所述的热稳定的木聚糖酶的任何一种或其任意混合物。具体地讲，木聚糖酶可以从锯齿小四孢菌(Microtetraspora flexuosa)或褐色热单孢菌(Thermomonospora fusca)中获得。在所述的谷物基料饲料中，谷物优选至少是小麦、大麦、玉米、高梁、黑麦、燕麦、黑小麦和稻子之一。更优选谷物为小麦。
谷物基料饲料按照本发明可供给动物如火鸡、鹅、鸭、绵羊和奶牛。然而优选饲料供给猪或家禽，特别是煎烤用的雏鸡。
谷物基料饲料优选每千克饲料包含0.00001-1g的木聚糖酶蛋白质，而最优选0.001-0.1g/kg。
谷物基料饲料含有至少20％重量的谷物。更优选地，它应包含至少30％重量的谷物，而最优选至少50％重量的谷物。谷物可以是前面所提到的那些中任何种类，而小麦是特别优选的。
虽然谷物基料饲料的谷物组分构成了蛋白质的来源，通常在饲料里须包含补加的蛋白质的来源，如从鱼膳食、肉膳食或蔬菜里产生的那些。蔬菜蛋白质的来源包括至少全脂大豆、油菜籽、canola、大豆膳食、油菜子膳食和canola膳食之一。与传统的饲料相比，通过采用本发明的教导，可以减少补加的蛋白质如鱼膳食、肉膳食或蔬菜蛋白质的相对量，这也就导致了成本的显著节省。这是因为谷物的相对成本明显低于传统的蛋白质添加剂的成本。鉴于此，按照本发明的教导可制备与传统饲料相比在可得到的能量、氨基酸和蛋白质方面具有相同营养价值但可包含较大量的谷物和较少比例的蛋白质添加剂的饲料。还发现在动物饲料中包含热稳定的木聚糖酶具有减少为使饲料具有一定的功能水平而需在饲料中包含的能量添加剂如脂肪和油的量的效果。
根据本发明在动物饲料中包含热稳定的木聚糖酶能提高饲料的粗蛋白值和/或可消化性和/或氨基酸含量和/或消化系数，这使得以前必须在动物饲料中包含的可选择的蛋白质源和/或氨基酸添加剂的补交量得以减少。当蛋白质的消化系数和/或小麦的可利用的粗蛋白的含量通过热稳定的木聚糖酶的加入得以提高时，发现可大大减少传统上需加入的蛋白质和/或能量添加剂的量。或者，通过热稳定的木聚糖酶的加入，仅当氨基酸含量或消化系数值得以提高时，发现可大大减少传统上需加入到饲料中的氨基酸添加剂的量。
本发明的提供的饲料也可包含其它的酶添加剂，如β-葡聚糖酶、葡糖淀粉酶、甘露聚糖酶、α-半乳糖苷酶、肌醇六磷酸酶、脂酶、α-阿拉伯呋喃糖苷酶、蛋白酶、α-淀粉酶和果胶酶。特别优选包含蛋白酶作为另外的酶添加剂，如从杆菌中产生的枯草杆菌蛋白酶。这样的枯草杆菌蛋白酶作为实施例在US-A-4,760,025中有详细描述。
通过制备含生理上可接受的载体和热稳定的木聚糖酶的饲料添加剂，及然后将该添加剂从每千克0.01-50g，更优选0.1-10g/kg和最优选的1g/kg的量与其它组分混合组成动物饲料(包括谷物和其它的蛋白质添加剂来源)来得到根据本发明的适当的饲料。
以下提供了对说明书包含的3幅附图逐一进行的简要说明。
图1描述来自锯齿小四孢菌(Microtetraspora flexuosa)的5种纯化的木聚糖酶的活性pH曲线图。
图2描述来自锯齿小四孢菌(Microtetraspora flexuosa)的5种纯化的木聚糖酶的活性温度曲线图。
图3表示来自锯齿小四孢菌(Microtetraspora flexuosa)的5种纯化的木聚糖酶的温度稳定性曲线图。
通过下面的参考例和实施例对本发明作进一步的阐释。
参考例1由锯齿小四孢菌(Microtetraspora flexuosa)产生的5种木聚糖酶的纯化木聚糖酶试验用remazol亮蓝染的桦木木聚糖(RBB-木聚糖)底物(Megazyme，Australia是底物供货商)来测定木聚糖酶的存在。200ml的样品与250ml的底物溶液(溶于50mMpH6.5的柠檬酸钠，2％(W/V)RBB-木聚糖)相混合并于37℃温浴10分钟。通过加入1ml95％的乙醇将未被消化的木聚糖沉淀出来并离心除去。用分光光度法(OD590)定量释放出的留于溶液中的染料，以乙醇为空白，染料量与木聚糖酶的活性成比例。可用标准曲线定量活性并以XAU/ml(每毫升的木聚糖酶活性单位)来表示。
用RBB-木聚糖底物还建立了用以检测多种木聚糖酶存在和检测其等电点(pI)的凝胶覆盖的方法。以融化的琼脂糖/底物悬浮液(溶于50mM柠檬酸钠pH6.5的4％(W/V)琼脂糖，7mg/ml RBB-木聚糖，0.5％(V/V)甘油)覆盖等电聚焦(IEF)凝胶(pH梯度3-9)并于37℃温浴。约1小时后在清亮的区域木聚糖酶活性显现。使凝胶完全干燥并可贮存。与同样条件下跑的含银染的pI标准IEF凝胶相比来确定木聚糖酶pI。样品用超过滤(Amicon搅拌—池，350ml，PM-10膜)将不含细胞的锯齿小四孢菌(Microtetraspora flexuosa)ATCC 35864发酵肉汤上清液浓缩5倍。将所有的样品无菌过滤。通过BCA方法(Pierce)测蛋白质浓度为12.5mg/ml。凝胶覆盖分析测了5种木聚糖酶，pI8.5，7.5，6.2，5.8，及5.3有存在。该5种木聚糖酶在本文说明书中被分别称为木聚糖酶1-5。
纯化方法离子交换层析(IEC)和疏水反应层析(分别为IEC和HIC)相结合用来分析所有的5种木聚糖酶如下木聚糖酶1和2的纯化做为第一步，用IEC来纯化木聚糖酶1和2。将浓缩的样品对10mM tris-HCL，pH 9.0(缓冲液A)进行彻底透析。将50ml加到用Pharmacia FPLC系统从72ml Q-琼脂糖HP(Pharmacia)包被的从1ml/2分钟的缓冲液A校准的标准层析柱(PharmaciaC 16/40)中。用50ml的缓冲液A洗涤该柱，然后用400ml线性增加盐度梯度，缓冲液A到溶于缓冲液A的0.25M NaCl进行洗脱。用溶于缓冲液A的2MNaCl洗涤柱子中继续结合的蛋白质。收集10ml的级分并如前所述进行试验。
木聚糖酶1和2随最初的液流从柱子中一起被洗脱出来而大部分的蛋白质继续与柱子结合。(木聚糖酶1和2代表未与柱子结合的级分)。
作为第二步用疏水反应层析(HIC)来纯化和分离木聚糖酶1和2。集合活性级分且通过加入2M的硫酸铵而使硫酸铵的终浓度达0.2M。加入50mM的柠檬酸钠pH6.5使终浓度为10mM，并将材料(约100ml)加到标准层析柱(Pharmacia C 16/20)中，所述的标准层析柱是用36ml的苯基琼脂糖CL-4BC Pharmacia)包被的，用0.2M硫酸铵-10mM柠檬酸钠，pH6.5(缓冲液B)以0.5ml/分钟校准的。用60ml缓冲液B洗涤柱子，然后如下洗脱从逐步降低盐浓度至10mM的柠檬酸钠，pH6.5(缓冲液C)70ml，在缓冲液C中逐步降低至10％(V/V)的聚乙二醇(EG)50ml，用200ml的线性梯度10-32％的EG，以32％的EG80ml洗涤，用150ml梯度32-38％的EG和最终逐步升高到50％的EG 70ml彻底洗涤柱子。收集10ml的级分并进行上述试验。在这些条件下，匀质的木聚糖酶2被32％的EG洗脱而匀质的木聚糖酶1被32-38％的EG梯度的尾端洗脱。木聚糖酶4的纯化用前面所述的纯化木聚糖酶1和2的第一步(IEC)，木聚糖酶4和5在0.16M溶于缓冲液A中的NaCl而被同时洗脱出来。集合活性级分并如上所述使其为0.4M硫酸铵-10mM柠檬酸钠，pH6.5(缓冲液D)。将材料，约100ml，以1kml/分钟加上前面描述的已用缓冲液D校准的HIC柱中。柱子以50ml缓冲液D洗涤，并以线性梯度由缓冲液D至C130ml，紧接着以线性梯度由缓冲液C至50％的EG200ml洗脱。收集10ml的级分并进行上述试验。木聚糖酶4被约20％的EG洗脱。木聚糖酶3和5纯化在木聚糖酶3和5的情形下，HIC用作第一步。通过加入2M的硫酸铵而使浓缩样品具有溶于缓冲液C的0.5M的硫酸铵及50mM的柠檬酸钠，pH6.5(如前所述)。将材料过滤以除去任何痕量的沉淀，并将50ml以1ml/分钟加到前面所述的用溶于缓冲液C中的0.5M的硫酸铵(缓冲液E)校准的HIC柱中。接下来以87.5ml的缓冲液E洗涤柱子，然后用线性梯度由缓冲液E至缓冲液C的147ml洗脱。收集10ml的级分并进行上述试验。在约0.05的硫酸铵处木聚糖酶3和5被共洗脱出来。
用IEC来分离纯化木聚糖酶3和5。集合活性的HIC级分(70ml)，以10mMTris-HCL pH8.0(缓冲液F)进行完全透析并用前面所述的方法浓缩至约20ml。将材料以1ml/分钟加到前面所述的已用缓冲液F校准的IEC柱中。柱子以150ml的缓冲液F洗涤并以线性梯度由缓冲液F至溶于缓冲液F的0.25M NaCl 150ml洗脱。收集10ml的级分并进行如上所述的试验。木聚糖酶3在约0.05M NaCl处被洗脱而木聚糖酶5在约0.15M NaCl处被洗脱。
参考例2由锯齿小四孢菌(Microtetraspora flexuosa)产生的5种木聚糖酶的特征分析纯化后，按照下述步骤对每种木聚糖酶进行等电聚焦和分子量测定。木聚糖酶的生化特征分析结果列于表1。
用PhastSystem(Pharmacia Biotech)按照厂家的说明进行等电聚焦。用于pI测定的标志为宽谱pI试剂盒pH3.5-9.3(Pharmacia Biotech)。由PhastSystem建立的银染，按照说明，使蛋白质显现。
用两种方法完全分子量的测定二十烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和质谱分析(MS)。用前面所述的Phast系统进行SDS-PAGE和后来的通过银染的蛋白质显现。所用的分子量标准购自Sigma Chemical Co.(St.Louis，MO)。质谱分析由Charles Evans及Associates(301 Chesapeake Drive，Redwood City，CA94063)来完成。
表1锯齿小四孢菌(Microtetraspora flexuosa)木聚糖酶
除了依据所测的pH的范围，即pH4.5-12.0而改变缓冲液外，用前面所述的RBB试验测定最适pH(参见图1)。为试验选定的pH制备适当的缓冲液应在本领域的技术人员的能力之内。
温度稳定性代表在给定的温度下还剩一半活性的时间。在约18-37℃测量活性。将样品在给定的温度下温浴并用RBB试验测活性。半衰期是半数活性丧失的分钟数。(参见图3)。
最适温度是发现活性最高时的温度。图2表示用RBB试验测量的木聚糖酶1-5的温度曲线。在图1和2中，％最大的活性与最高活性测量值相应，并将其值定为100％，而其它所有的数值均是相对于该标准而测得的。实施例1按照上面详细描述的粘性降低试验测试来自锯齿小四孢菌(Microtetrasporaflexuosa)的木聚糖酶1-5，来自褐色热单孢菌(Thermomonospora fusca)的木聚糖酶TfxA和从绿色木霉(Trichoderma viride)及黑曲霉中得到的木聚糖酶以确定其降低小麦阿拉伯糖基木聚糖底物的粘性的相对能力。对每一个酶组合物，均测定其末经热处理(对照)和分别经1分钟和5分钟的95℃水浴的热处理后的粘度。这些试验的结果总结于表2。
表2
从上面的结果可以看出将所有的木聚糖酶或木聚糖酶的混合物暴露于95℃的温度中5分钟明显降低于木聚糖酶的活性，所述的活性由粘性降低试验测量。然而，还注意到在第1和第2木聚糖酶暴露于95℃1分钟后所测得的粘性与对照差异不显著，但均在±0.001帕斯卡·秒的范围内。另一方面，很显然来自绿色曲霉(T.viride)和黑曲霉(A.niger)的木聚糖酶与用于本发明的热稳定的木聚糖酶相比对热更敏感。实施例2按照实施例1所用的粘性降低试验测试得自锯齿小四孢菌(Microtetrasporaflexuosa)的木聚糖酶1和2的热稳定性。与实施例1相同，对每种木聚糖酶均设对照，所述的对照不经任何热处理。按照在95℃的水浴中对酶加热1分钟和5分钟的方式进行两种热处理。该试验的结果总结于表3。表3
从表3所列的结果可以看出由暴露于95℃1分钟后的木聚糖酶1和木聚糖酶2所测的粘性均在对照粘性的0.00006帕斯卡·秒以内。因此，很明显这两种木聚糖酶均不因95℃热处理1分钟其活性而基本减小。
权利要求
1.热稳定的木聚糖酶作为动物饲料添加剂的应用，所述的木聚糖酶的特征为能耐受1分钟的调至95℃的水浴加热而基本上不丧失其活性，所述的活性由其在pH6.5和40℃的温度下使1％的小麦阿拉伯糖基木聚糖溶液的粘度降至与未加热对照相同的终粘度±0.001帕斯卡秒确定。
2.按照权利要求1的应用，其中的木聚糖酶可从锯齿小四孢菌(Microtetrasporaflexuosa)或褐色热单孢菌(Thermomonospora fusca)中获得。
3.按照权利要求1或2的应用，其中的木聚糖酶可从锯齿小四孢菌(Microtetraspora flexuosa)中获得，并具有一个或多个的下列特征(i)-(v)(i)分子量为约33,100道尔顿，pI约8.5，并在pH7.0-7.5的范围内和约70℃的温度下具有最大活性；(ii)分子量为约13,300道尔顿，pI约7.5，并在pH7.0-7.5的范围内和约65℃的温度下具有最大活性；(iii)分子量为约31,000道尔顿，pI约6.2，并在pH约7.5和约65℃的温度下具有最大活性；(iv)分子量为约50,000道尔顿，pI约5.8，并在pH约7.5和约65℃的温度下个有最大活性；(v)分子量为约35,000道尔顿，pI约5.3，并在pH约7.5和约70℃的下具有最大活性。
4.含有生理上可接受的载体和热稳定的木聚糖酶的饲料添加剂，所述的木聚糖酶的特征为能耐受1分钟的调至95℃的水浴加热而基本上不丧失活性，所述的活性由其在pH6.5和40℃的温度下使1％的小麦阿拉伯糖基木聚糖溶液的粘度降至与未加热对照相同的终粘度±0.001帕斯卡秒确定。
5.按照权利要求4的饲料添加剂，其中的木聚糖酶可从锯齿小四孢菌(Microtetraspora flexuosa)或褐色热单孢菌(Thermomonospora fusca)中获得。
6.按照权利要求4或5的饲料添加剂，其中的载体是谷物或由谷物产生的。
7.按照权利要求6的饲料添加剂，其中的载体是粉碎的小麦、玉米、大豆或其任意副产物。
8.任意权利要求4-7的饲料添加剂的应用，加入谷物基料饲料以提高其饲料转化比率和/或以增加其可消化性和/或以增加动物每消耗单位量的饲料的体重增重比率。
9.谷物基料饲料，含有至少20％重量的谷物，及每kg饲料0.00001-10g的热稳定的木聚糖酶蛋白质，所述的木聚糖酶的特征为能耐受1分钟的调至95℃的水浴加热而基本上不丧失活性，所述的活性由其在pH6.5和40℃的温度下使1％的小麦阿拉伯糖基木聚糖溶液的粘度降至与未加热对照相同的终粘度土0.001帕斯卡秒确定。
10.按照权利要求9的谷物基料饲料，其中的木聚糖酶可从锯齿小四孢菌(Microtetraspora flexuosa)或褐色热单孢菌(Thermomonospora fusca)中获得。
11.按照权利要求9或权利要求10的谷物基料饲料，其中的谷物至少是小麦、大麦、玉米、高梁、黑麦、燕麦、黑小麦和稻子之一。
12.任意权利要求9-11的谷物基料饲料作为家禽饲料或猪饲料的应用。
全文摘要
本发明提供了热稳定的木聚糖酶用作动物饲料添加剂。所述的木聚糖酶是一种能耐受1分钟95℃水浴的加热而其活性基本上不丧失的酶。可从锯齿小四孢菌(Microtetraspora flexuosa)或褐色热单孢属(Thermomonosporafusca)中获得所述的木聚糖酶。还提供了包括所述的热稳定的木聚糖酶及生理上可接受的载体的饲料添加剂，所述的载体可以是谷物或谷物基料。还提供了包含至少20％重量的谷物和每千克饲料含0.0001～10g热稳定的木聚糖蛋白质的谷物基料饲料。所说的谷物可以是小麦、大麦、玉米、高梁、黑麦、燕麦、黑小麦和稻子的任何一种。所述的谷物基料饲料可提供给任何牲畜，特别是提供给家禽和猪。
文档编号D21C5/00GK1147271SQ95192807
公开日1997年4月9日 申请日期1995年4月28日 优先权日1994年4月28日
发明者安德鲁·约翰·摩根, 凯思琳·A·克拉克森, 伊丽莎白·A·博迪, 威廉·A·丘弗斯 申请人:费恩饲料国际有限公司