专利名称：一种聚丙烯腈固定化酶的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种使用聚丙烯腈纳米纤维膜固定化酶的制备方法。
背景技术：
固定化酶与游离酶相比，在保持其高效、专一及温和的酶催化反应特性的同时，还呈现贮存稳定性高、分离回收容易、多次重复使用、操作连续可控、工艺简便等特点。当酶以游离的状态存在时，一些缺陷如稳定性差、使用寿命短等未得到改善，将酶固定在分离膜上可以有效地避免上述的不足。另外，当酶以游离态存在时，由于酶膜表面的不利吸附而造成酶的空间结构改变或活性位点遮蔽，而降低了酶的活性。固定化酶的材料和方法有很多种，其中纳米材料固定化酶因其高载酶量受到了研究者的青睐，尤其是一些具有多孔结构、大比表面积的载体材料有利于提高固定化酶的载酶量，并有利于底物向酶活性中心和产物向反应区域以外扩散以提高固定化酶的生物活性和催化效率。具有空间连续性的纳米纤维膜作为固定化酶的载体具有较大的比表面积和高空隙率，并且可以通过纺丝条件进行调控等优点，近年来越来越引起人们的重视。[I] Mincheva R, Manolova N, Paneva D, Roshkov 1.Preparation ofpolyelectrolyte-containing nanofibers by electrospinning in the presence ofa non-1onogenic water-soluble polymer.J Bioactive Compat Polym 2005， 20:419-435.CN100371372C通过电纺丙烯腈/磷脂共聚物，得到磷脂改性的丙烯腈纳米纤维，并通过物理吸附的方法将酶固定化在纳米纤维膜上。美国专利US20070077567A1提供了一种首先将酶单分子层共价键固定化在聚(苯乙烯-马来酸酐)纳米纤维上，然后再利用戊二醛将更多的酶分子与第一层固定化好的酶分子进行交联，在纳米纤维表面形成酶聚集体。但上述固定化酶的方法存在固定化过程操作繁琐、固定化酶催化稳定性较低和固定化载体机械强度较低等缺点。因此有必要研制一种固定化酶过程操作简单且具有稳定结构、比表面积高和固定化酶材料机械强度高 的纳米纤维膜用于酶的固定化，以有效的提高固定化酶的载酶量、提高固定化酶的催化效率，同时易于从反应体系中回收且重复使用，极大地提高酶的利用率和降低生产成本。
发明内容
针对一些用于固定化酶的载体容易导致酶催化稳定性降低、固定化酶过程操作繁琐、固定化材料机械强度低和难以回收等问题，本发明的目的在于提供一种具有高比表面积、高空隙率、固定化酶过程操作简单和固定化材料机械强度高的一种聚丙烯腈纳米纤维膜固定化酶的制备方法。本发明提出的聚丙烯腈纳米纤维膜固定化酶的制备方法，具体步骤如下:
将聚丙烯腈纳米纤维膜浸入纯乙醇溶液中，通入氯化氢气体1(Γ30分钟，进行活化处
理取出聚丙烯腈纳米纤维膜并用pH为7.0的磷酸盐缓冲溶液充分冲洗，以除去聚丙烯腈纳米纤维膜上残余的乙醇；然后，将活化之后的纳米纤维膜浸入浓度为0.广2毫克/毫升的酶磷酸盐缓冲溶液中，密封后于1(T30°C、转速为3(Γ120转/分钟条件下，震荡f 5小时；从溶液中取出处理后的聚丙烯腈纳米纤维膜，用去离子水反复冲洗:Γ5次，即可得到聚丙烯腈纳米纤维膜固定化酶；将固定化酶的纳米纤维膜浸入PH为5.0的磷酸缓冲溶液中，于4°C下储存备用。本发明中，所述酶磷酸盐缓冲溶液上的酶为酚氧化酶、过氧化物酶、蛋白酶、淀粉酶或脂肪酶中任一种。本发明中，聚丙烯腈纳米纤维膜的制备方法为:将聚丙烯腈溶于N，N- 二甲基甲酰胺溶剂中，配成重量百分比为59TlO%的溶液。然后，将配好的溶液注入静电纺丝装置中，在电压为12 20千伏、喷丝头溶液流量为0.8^1.5毫升/小时、接受距离为1(Γ20厘米的条件下进行静电纺丝得到纤维直径在100飞00纳米的纤维膜。将得到的纤维膜放置于真空干燥箱中在30°C 50°C的条件下干燥5小时 12小时。本发明中，所述聚丙烯腈的相对分子量为12 18万。本发明的有益效果在于:
(I)聚丙烯腈纳米纤维膜的制备及其酶固定化操作过程简单。(2)聚丙烯腈纳米纤维膜具有高比表面积和高空隙率，有利于提高固定化酶的载酶量和提高固定化酶的催化稳定性。(3)聚丙烯腈纳米纤维膜作为酶的固定化载体，易于从反应体系中回收，可以重复使用，极大地提高酶的利用率和降低生产成本。(4)聚丙烯腈纳米 纤维膜的机械强度高，能够反复用于反应体系中，为酶的工业化应用提供了基础。
图1为实施例1所得到的聚丙烯腈纳米纤维膜固定化漆酶的扫描电镜 图2为实施例3所得到的聚丙烯腈纳米纤维膜固定化辣根过氧化物酶扫描电镜图。
具体实施例方式以下实施实例对本发明做更详细的描述，但所述例不构成对本发明的限制。实施例1
聚丙烯腈纳米纤维膜的制备方法为:将聚丙烯腈溶于N，N- 二甲基甲酰胺溶剂中，配成重量百分比为59TlO%的溶液。然后，将配好的溶液注入静电纺丝装置中，在电压为12 20千伏、喷丝头溶液流量为0.8^1.5毫升/小时、接受距离为1(Γ20厘米的条件下进行静电纺丝得到纤维直径在100飞00纳米的纤维膜。将得到的纤维膜放置于真空干燥箱中在300C 50°C的条件下干燥5小时 12小时。将I克聚丙烯腈纳米纤维膜浸入纯乙醇溶液中，通入氯化氢气体10分钟。取出纳米纤维膜并用pH为7.0的磷酸盐缓冲溶液充分冲洗，以除去膜上残余乙醇。然后，将活化之后的纳米纤维膜浸入浓度为0.5毫克/毫升的漆酶磷酸盐缓冲溶液中，密封后于15°C、转速为50转/分钟条件下，震荡2小时。从溶液中取出膜，用去离子水反复冲洗3次，即可得到聚丙烯腈纳米纤维膜固定化漆酶。将固定化漆酶的纳米纤维膜浸入pH为5.0的磷酸缓冲溶液中，于4°C下储存备用。从图1中扫描电镜的结果可以看出，上述得到的聚丙烯腈纳米纤维膜固定化漆酶形貌和结构较好，纤维直径也比较的均匀。实施例2
将I克聚丙烯腈纳米纤维膜浸入纯乙醇溶液中，通入氯化氢气体20分钟。取出纳米纤维膜并用PH为7.0的磷酸盐缓冲溶液充分冲洗，以除去膜上残余乙醇。然后，将活化之后的纳米纤维膜浸入浓度为1.0毫克/毫升的漆酶磷酸盐缓冲溶液中，密封后于30°C、转速为80转/分钟条件下，震荡3小时。从溶液中取出膜，用去离子水反复冲洗5次，即可得到聚丙烯腈纳米纤维膜固定化漆酶。将固定化漆酶的纳米纤维膜浸入pH为5.0的磷酸缓冲溶液中，于4°C下储存备用。实施例3
将I克聚丙烯腈纳米纤维膜浸入纯乙醇溶液中，通入氯化氢气体15分钟。取出纳米纤维膜并用PH为7.0的磷酸盐缓冲溶液充分冲洗，以除去膜上残余乙醇。然后，将活化之后的纳米纤维膜浸入浓度为1.0毫克/毫升的辣根过氧化物酶磷酸盐缓冲溶液中，密封后于20°C、转速为60转/分钟条件下，震荡1.5小时。从溶液中取出膜，用去离子水反复冲洗3次，即可得到聚丙烯 腈纳米纤维膜固定化辣根过氧化物酶、。将固定化辣根过氧化物酶的纳米纤维膜浸入PH为5.0的磷酸缓冲溶液中，于4°C下储存备用。从图2中扫描电镜的结果可以看出，上述得到的聚丙烯腈纳米纤维膜固定化辣根过氧化物酶的形貌和结构较好，纤维直径也比较的均匀。实施例4
将I克聚丙烯腈纳米纤维膜浸入纯乙醇溶液中，通入氯化氢气体25分钟。取出纳米纤维膜并用PH为7.0的磷酸盐缓冲溶液充分冲洗，以除去膜上残余乙醇。然后，将将活化之后的纳米纤维膜浸入浓度为1.5毫克/毫升的辣根过氧化物酶磷酸盐缓冲溶液中，密封后于30°C、转速为120转/分钟条件下，震荡3小时。从溶液中取出膜，用去离子水反复冲洗5次，即可得到聚丙烯腈纳米纤维膜固定化辣根过氧化物酶。将固定化辣根过氧化物酶的纳米纤维膜浸入pH为5.0的磷酸缓冲溶液中，于4°C下储存备用。实施例5
将I克聚丙烯腈纳米纤维膜浸入纯乙醇溶液中，通入氯化氢气体15分钟。取出纳米纤维膜并用PH为7.0的磷酸盐缓冲溶液充分冲洗，以除去膜上残余乙醇。然后，将活化之后的纳米纤维膜浸入浓度为0.5毫克/毫升的过氧化氢酶磷酸盐缓冲溶液中，密封后于10°C、转速为40转/分钟条件下，震荡I小时。从溶液中取出膜，用去离子水反复冲洗3次，即可得到聚丙烯腈纳米纤维膜固定化辣根过氧化物酶。将固定化辣根过氧化物酶的纳米纤维膜浸入pH为5.0的磷酸缓冲溶液中，于4°C下储存备用。实施例6
将I克聚丙烯腈纳米纤维膜浸入纯乙醇溶液中，通入氯化氢气体30分钟。取出纳米纤维膜并用PH为7.0的磷酸盐缓冲溶液充分冲洗，以除去膜上残余乙醇。然后，将活化之后的纳米纤维膜浸入浓度为1.5毫克/毫升的过氧化氢酶磷酸盐缓冲溶液中，密封后于25°C、转速为80转/分钟条件下，震荡3小时。从溶液中取出膜，用去离子水反复冲洗4次，即可得到聚丙烯腈纳米纤维膜固定化辣根过氧化物酶。将固定化辣根过氧化物酶的纳米纤维膜浸入pH为5.0的磷酸 缓冲溶液中，于4°C下储存备用。
权利要求
1.一种聚丙烯腈纳米纤维膜固定化酶的制备方法，其特征在于具体步骤如下 将聚丙烯腈纳米纤维膜浸入纯乙醇溶液中，通入氯化氢气体1(Γ30分钟，进行活化处理取出聚丙烯腈纳米纤维膜并用pH为7. O的磷酸盐缓冲溶液充分冲洗，以除去聚丙烯腈纳米纤维膜上残余的乙醇；然后，将活化之后的纳米纤维膜浸入浓度为O.广2毫克/毫升的酶磷酸盐缓冲溶液中，密封后于1(T30°C、转速为3(Γ120转/分钟条件下，震荡f 5小时；从溶液中取出处理后的聚丙烯腈纳米纤维膜，用去离子水反复冲洗:Γ5次，即可得到聚丙烯腈纳米纤维膜固定化酶；将固定化酶的纳米纤维膜浸入PH为5.0的磷酸缓冲溶液中，于4°C下储存备用。
2.根据权利要求I所述的制备方法，其特征在于所述酶磷酸盐缓冲溶液上的酶为酚氧化酶、过氧化物酶、蛋白酶、淀粉酶或脂肪酶中任一种。
3.根据权利要求I所述的制备方法，其特征在于聚丙烯腈纳米纤维膜的制备方法为将聚丙烯腈溶于N，N- 二甲基甲酰胺溶剂中，配成重量百分比为59TlO%的溶液；然后，将配好的溶液注入静电纺丝装置中，在电压为12 20千伏、喷丝头溶液流量为O. 8^1. 5毫升/小时、接受距离为1(Γ20厘米的条件下进行静电纺丝得到纤维直径在10(Γ600纳米的纤维膜；将得到的纤维膜放置于真空干燥箱中在30°C 50°C的条件下干燥5小时 12小时。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于所述聚丙烯腈的相对分子量为12 18万。
全文摘要
本发明涉及一种聚丙烯腈纳米纤维膜固定化酶的制备方法。将聚丙烯腈聚合物溶于N,N-二甲基甲酰胺，通过静电纺丝法制成聚丙烯腈纳米纤维膜。然后，将其浸入纯乙醇溶液中，通入氯化氢气体10~30分钟，通过化学键合的方法将酶固定到纳米纤维膜上。本发明利用聚丙烯腈纳米纤维膜的高空隙率和高机械强度，可以得到具有载酶量高、易于从反应体系中回收、可反复多次使用纳米纤维膜固定化酶。该固定化酶载体能够提高酶的利用率和降低生产成本，并且具有制备过程简单等优点。
文档编号D06M11/11GK103255124SQ20131018256
公开日2013年8月21日 申请日期2013年5月17日 优先权日2013年5月17日
发明者徐冉, 李风亭, 迟成龙 申请人:同济大学