专利名称：用于癌细胞捕获的叶酸修饰的静电纺纳米纤维的制备方法
技术领域：
本发明属于静电纺纳米纤维材料的制备领域，特别涉及一种用于癌细胞捕获的叶酸修饰的静电纺纳米纤维的制备方法。
背景技术：
目前，癌症的早期诊断和治疗正受到各国生物医学领域研究者的广泛关注。有研究表明很多肿瘤在一个毫米的情况下在血液里已经可以查到循环肿瘤细胞(circulatingtumor cell, CTC),这些CTC通过进一步迁移、粘附、相互聚集形成微小癌栓,并在一定条件下发展为转移灶，是目前导致癌症发生的原因之一。传统方法采用密度梯度离心法、膜滤过法、荧光细胞分选法及免疫磁珠分离法对血液中癌细胞进行捕获并检测。但是，肿瘤患者血液中循环肿瘤细胞含量极少，约每IO6 IO7个白细胞中才会发现一个，上述方法容易造成癌细胞丢失，缺乏特异性且检测灵敏度差。纳米材料由于其尺寸较小(1-lOOnm)，具有特殊的光学、电子学和磁学等性质而后来居上，受到越来越多的关注。据报道证明纳米结构可以很好地促进其与细胞间的相互作用，大大提高捕获效果[Chen, L.，et al., Aptamer - Mediated EfficientCapture and Release of T Lymphocytes on Nanostructured Surfaces.AdvancedMaterials2011, 23，4376-4380]。静电纺丝是一种有效地制备具有高比表面积的纳米或微米级纤维的生产技术，所制得的纳米纤维具有极大的比表面积，能提供大量的细胞接触位点，使单位体积内捕获细胞的数量增加；大量研究表明纳米纤维易进行表面修饰，并且可以负载生物活性分子，如蛋白质、核酸、糖类及生长因子等；同时，纳米纤维能够很好地模拟天然细胞外基质(ECM)，为细胞的粘附、增殖及生理功能提供良好的微环境。在癌症的早期诊断中，许多癌细胞捕获材料由于缺乏特异性、 检测灵敏度差，常常导致癌症患者无法及早发现病情，威胁生命健康。据报道，静电纺纳米纤维修饰后不仅可以提高癌细胞捕获灵敏度，并且具备检测特异性[Zhang, N.，et al., Electrospun Ti02Nanofiber - Based Cell Capture Assay forDetecting Circulating Tumor Cells from Colorectal and Gastric Cancer Patients.Advanced Materials2012, 24，2756-2760]。近年来，发展一种具有靶向分子修饰的纳米材料，实现对体内能够与该靶向分子特异性结合的癌细胞的捕获，已成为必然的发展趋势。叶酸(Folid acid, FA)与叶酸受体(Folate receptor, FR)有很高的亲和力。FR是一种跨膜单链糖蛋白，在多种癌细胞上都过度表达，而在正常的器官中很少表达，甚至不表达，常被用作抗肿瘤药物的靶点。但是，将FA修饰在纳米纤维表面存在着一定的技术困难，而聚酰胺胺(PAMAM)树状大分子可以很好地在其表面修饰叶酸，用于癌细胞的靶向[Shiet al.Dendrimer-Entrapped Gold Nanoparticles as a Nanoplatform for Cancer-CellTargeting and Imaging.Small2007, 3, 1245-1252] 聚酰胺胺(PAMAM)树状大分子是一种高度支化的大分子，表面有大量可控功能基团，容易在其表面进行化学反应或物理吸附。因此，借助PAMAM树状大分子，将靶向分子叶酸修饰在静电纺纳米纤维表面，有望制备一种能够高效特异性捕获癌细胞的材料，实现癌细胞的早期诊断。检索国内外相关文献和专利结果表明:用于癌细胞捕获的叶酸修饰的静电纺纳米纤维的制备方法，尚未见报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种用于癌细胞捕获的叶酸修饰的静电纺纳米纤维的制备方法，该方法制备的靶向分子叶酸修饰的功能化静电纺醋酸纤维素纳米纤维材料可用于特异性捕获人口腔上皮癌细胞(KB);该发明制备的癌细胞捕获材料具有制备工艺简单、特异性强、可短时间内靶向捕获癌细胞等优点，在癌症的早期诊断方面具有很好的应用前景。本发明的一种用于癌细胞捕获的叶酸修饰的静电纺纳米纤维的制备方法，包括:( I)将醋酸纤维素溶于有机溶剂中，搅拌，得到纺丝液进行纺丝，干燥，得醋酸纤维素纳米纤维，其中醋酸纤维素和有机溶剂的质量体积比为Ig:5ml ;(2)将上述醋酸纤维素纳米纤维在碱性条件下进行水解l_8h，洗涤，干燥，得到再生纤维素纳米纤维；再生纤维素纳米纤维表面携带大量负电荷；(3)通过静电吸附作用，依次将带有正电荷的聚电解质聚二甲基二烯丙基氯化铵PDADMAC和带负电荷的聚丙烯酸PAA组装在静电纺再生纤维素纳米纤维表面，得到聚电解质自组装纳米纤维，表面含有大量羧基；其中组装方法为:分别配制聚二甲基二烯丙基氯化铵PDADMAC/NaCl溶液和聚丙烯酸PAA/NaCl溶液，调节pH值为3.5，然后将再生纤维素纳米纤维浸泡在PDADMAC/NaCl溶液，取出后洗涤，吸干表面流动水，再浸泡在PAA/NaCl溶液中，洗涤，真空干燥，得到聚电解质自组装纳米纤维；(4)将第五代聚酰胺-胺树状大分子的DMSO溶液中，逐滴滴加含有异硫氰酸荧光素FITC的DMSO溶液，搅拌反应l-2d，然后加入EDC活化3_5h后的叶酸FA的DMSO溶液，搅拌反应3-5d，得到FITC与FA修饰的树状大分子溶液，最后将溶液进行透析，冷冻干燥，即得G5.NH2-F1-FA,然后配制成溶液；(5)配制聚电解质自组装纳米纤维溶液，加入EDC活化3_5h，然后逐滴加入G5.NH2-F1-FA溶液，避光，振荡，得G5.NH2-F1-FA修饰后的聚电解质自组装纳米纤维；其中G5.NH2-F1-FA在溶液中的最终浓度为0.2-1.2mg/mL ；通过G5.NH2-F1-FA表面氨基及纤维表面羧基间的化学反应将G5.NH2-F1-FA修饰到聚电解质自组装纳米纤维表面。(6)将上述G5.NH2-F1-FA修饰后的聚电解质自组装纳米纤维中加入三乙胺，反应30-60min，再加入乙酸酐，继续反应12_24h，即得具有靶向捕获癌细胞功能的纳米纤维材料，其中，三乙胺及乙酸酐与树状大分子的摩尔比控制在550:550:1，使树状大分子表面剩
余氨基全部乙酰化。通过乙酰化反应将修饰在聚电解质自组装纳米纤维表面G5.NH2-F1-FA的剩余氨基全部转化为乙酸基，提闻材料的生物相容性，制备得到具有祀向捕获癌细胞功能的纳米纤维材料。所述步骤(I)中醋酸纤维素的Mn为30，000 (Aldrich);有机溶剂为体积比为2:1
的丙酮和N，N- 二甲基甲酰胺的混合液。
所述步骤(I)中纺丝工艺条件为:电压为20-22kV，接收距离为25cm，流速为ImL/h，环境湿度40-50% ;所述的干燥为真空干燥，干燥时间为12-24h。所述步骤(2)中碱性条件为0.05M的NaOH/乙醇溶液，水解时间为4h。所述步骤(2)中洗涤为用去离子水洗涤3-5次，干燥为真空干燥，干燥时间为12-24h。所述步骤(3)中PDADMAC与PAA在再生纤维素纳米纤维表面组装层数各为I层。所述步骤(3)中PDADMAC/NaCl溶液的浓度为2mg/mL，PAA/NaCl溶液浓度为2mg/
mT.nPDADMAC/NaCl溶液和PAA/NaCl溶液的配制:称取5.85g NaCl，将其溶解在200mL超纯水中，得到浓度为0.5M的NaCl溶液，然后称取质量分数为20%的PDADMAC(Mw=IOO, 000 2000，000)溶液2.0g,将其加入上述0.5M的NaCl溶液中，得到2mg/mL的PDADMAC/NaCl溶液。同理，称取质量分数为25%的PAA (Mw=240, 000)溶液1.6g，将其加入上述0.5M的NaCl溶液中，得到2mg/mL的PAA/NaCl溶液。并分别将两种溶液的pH值调至
3.5。所述步骤(3)中浸泡时间均为3-10min，洗涤均为超纯水洗涤3_4次，每次2min，真空干燥时间为12-24h。所述步骤(4)中G5.NH2-F1-FA的制备方法为:称取第五代聚酰胺胺树状大分子G5.NH2 (购于Dendritech公司)，溶于DMSO中，配制成浓度为10.0mg/mL的溶液，称取异硫氰酸荧光素(FITC)，溶于DMSO，按照FI/G5.NH2摩尔比为5:1，将FITC溶液加入到G5.NH2溶液中，避光处理，室温条件下磁力搅拌l-2d，制备得到G5.NH2-FI溶液。称取叶酸(FA)，溶于DMSO，称取EDC溶于DMSO中，按照EDC/FA摩尔比为5:1，将EDC溶液加入到FA溶液中，避光处理，室温条件下磁力搅拌反应3-5h，按照FA/G5.NH2摩尔比为5:1，将活化好的FA溶液加入G5.NH2-FI溶液中，避光处理，室温下磁力搅拌，反应3-5d。反应结束后，将反应产物转移至截留分子量为14000的透析袋中，先用pH值为7.4的0.02M PBS缓冲液透析12-24h，再在蒸馏水中透析24_48h。然后进行冷冻干燥处理，得到G5.NH2-F1-FA反应产物。所述步骤(5)中聚电解质自组装纳米纤维溶液的浓度为3mg/mL，G5.NH2-F1-FA溶液浓度为lmg/mL ;振荡时间为3-5d。所述步骤(5)称取聚电解质自组装纳米纤维的质量为2.56mg，根据其在溶液中的最终浓度为3mg/mL计算所需溶液体积为0.853mL,首先加入0.427mL浓度为20mg/mL的EDC活化纳米纤维毡3-5h，最后将0.427mL浓度为2mg/mL的G5.NH2-F1-FA逐滴滴加至EDC活化后的纳米纤维毡中，使得G5.NH2-F1-FA在溶液中的最终浓度为1.0mg/mL，避光处理，摇床上摇晃反应3-5d。同理，称取聚电解质自组装纳米纤维的质量分别为4.68mg, 4.89mg, 4.48mg，4.65mg, 5.0lmg，根据其在溶液中的最终浓度为3mg/mL计算所需溶液总体积分别为
1.56mL, 1.63mL, 1.49mL, 1.55mL, 1.67mL,首先加入体积分别为 1.404mL, 1.304mL, 1.045mL,
0.93mL, 0.668mL浓度为20mg/mL的EDC活化纳米纤维毡3_5h，最后将将体积分别为0.156mL, 0.326mL, 0.448mL, 0.62mL, 1.002mL 浓度为 2mg/mL 的 G5.NH2-F1-FA 溶液逐滴滴加至 EDC活化后的纳米纤维毡中，使得G5.NH2-F1-FA在溶液中的终浓度分别为0.2mg/mL, 0.4mg/mL, 0.6mg/mL, 0.8mg/mL, 1.2mg/mL,避光处理,摇床上摇晃反应 3_5d。 利用Lambda25紫外-可见分光光度计(美国珀金埃尔默仪器公司)测量G5.NH2-F1-FA溶液修饰纳米纤维前及修饰后在500nm处的吸光值；绘制G5.NH2-F1-FA和G5.NH2-FI的浓度-吸光值标准曲线；并记录浓度为1.0mg/mL的G5.NH2-F1-FA和G5.NH2-FI溶液修饰纳米纤维前后的紫外吸收图谱。所述步骤(6)中三乙胺和乙酸酐与树状大分子的摩尔比控制在550:550:1，使树状大分子表面剩余氨基全部乙酰化。本发明以靶向分子叶酸修饰的静电纺醋酸纤维素纳米纤维为基质，通过培养叶酸受体高表达人口腔上皮癌细胞(KB)探究其特异性捕获癌细胞的效果。本发明通过核磁共振(NMR)对修饰在树状大分子表面的叶酸数量进行了表征。借助扫描电镜(SEM)对纳米纤维水解前后及靶向分子修饰后的形貌进行表征，傅里叶变换-红外光谱(FTIR)对其结构进行表征。同时利用激光共聚焦显微镜(CLSM)对靶向分子的成功修饰进行了定性表征；通过紫外-可见吸收光谱(UV-Vis )对修饰至纳米纤维毡表面靶向分子的量进行了定量表征。最后，通过在材料上培养细胞，借助共聚焦显微镜及细胞计数器，研究材料对癌细胞的特异捕获性能。和对照的未经靶向分子叶酸修饰的功能化静电纺醋酸纤维素捕获癌细胞的效果相比，本发明制备的材料能够显著地提高对人口腔上皮癌细胞的捕获能力，因此本发明制备的靶向分子叶酸修饰的功能化静电纺醋酸纤维素纳米纤维能够作为新型材料用于癌细胞的特异性捕获。核磁共振(NMR)、扫描电镜图(SEM)、傅里叶变换-红外光谱(FTIR)、激光共聚焦显微镜结果(CLSM)、紫外-可见吸收光谱(UV-Vis)、KB细胞捕获定性试验、KB细胞捕获特异性定量试验以及自由叶酸阻断试验结果分别如下:(I)核磁共振(1H NMR)测试结果1H NMR图谱用于表征叶酸对树状大分子表面的修饰。参见说明书附图1:在化学位移分别为6.4和7.0ppm处有两个小的质子峰，它们是FI分子结构中特征基团的质子峰。在化学位移分别为6.6,7.5和8.5ppm处有三个小的质子峰，它们是FA分子结构中特征基团的质子峰。根据积分面积可以求出每个G5.NH2表面连接了 3.4个FI分子和3.8个FA分子。(2)扫描电镜图(SEM)结果SEM图用于表征纳米纤维的形貌和直径大小。参见说明书附图2。所得到的CA纳米纤维形貌规整，表面光滑，平均直径为431.6nm。水解lh、2h、4h后，部分纤维表面均变粗糙，这主要是由于水解作用使纤维的组分发生改变，从而导致其行貌略有变化但不影响纤维结构。水解8小时后由于强烈的水解作用使得部分纤维发生断裂。为了保证纳米纤维的充分水解，选择最佳水解时间为4h。将G5.NH2-F1-FA和对照材料G5.NH2-FI修饰到聚电解质自组装纳米纤维表面后，纤维仍然保持良好形貌，但其平均直径略有增加，分别为506.9nm和544.0nm，这主要是因为纤维在溶液中反应使其部分溶胀所致。(3)傅里叶变换-红外光谱(FTIR)结果
FTIR结果表明，CA纳米纤维已成功水解，且G5.NH2-F1-FA和对照材料G5.NH2-FI均成功修饰到聚电解质自组装纳米纤维表面。参见说明书附图3。CA纳米纤维在1750CHT1、1370CHT1及1235CHT1处的吸收峰分别归属于醋酸纤维素中C=O键，C-O-C键的伸缩振动峰及C-CH3的弯曲振动峰。纤维水解后在1750CHT1及1235CHT1处吸收峰消失，这主要是因为醋酸纤维素上缩醛键发生断裂。同时，在3400CHT1左右出现一个宽峰，在1160CHT1处吸收峰强度增加，这两个峰均归属于羟基的振动峰，说明乙酰基被羟基取代，纤维被水解。G5.NH2在1560CHT1处存在振动吸收峰，同时，G5.NH2-F1-FA及G5.NH2-FI修饰的功能化纳米纤维在1560CHT1处也存在振动吸收峰，这说明在聚电解质自组装纳米纤维表面有G5的存在，即G5.NH2-F1-FA和G5.NH2-FI均成功修饰到纤维表面。(4)激光共聚焦显微镜结果(CLSM)表征结果共聚焦显微镜图片定性表征了 G5.NH2-F1-FA成功修饰到聚电解质自组装纳米纤维表面。参见说明书附图4。(5)紫外-可见吸收光谱(UV-Vis)结果UV-Vis定量表征了修饰在聚电解质自组装纳米纤维表面G5.NH2-F1-FA和对照材料G5.NH2-FI的质量。测试结果如说明书附图5所示。结果表明，修饰聚电解质自组装纳米纤维所用G5.NH2-F1-FA的最佳浓度应为lmg/mL。通过测定不同浓度G5.NH2-F1-FA和G5.NH2-FI在水溶液中的吸光值，绘制浓度-吸光值标准曲线，得到吸附在Img功能化纳米纤维毡表面G5.NH2-F1-FA和G5.NH2-FI的量分别为0.056mg和0.043mg。(6) KB细胞捕获定性试验结果以具有叶酸受体高表达的人口腔上皮癌细胞(KB)为模型细胞来检验两种材料G5.NH2-F1-FA和G5.NH2-FI修饰的功能化静电纺醋酸纤维素纳米纤维捕获KB细胞的效果。参见说明书附图6。试验结果表明，在不同的培养时间点(5min、20min、40min、60min)，含有革巴向分子叶酸的功能化纳米纤维均可以捕获更多的癌细胞。尤其在60min时,两种材料捕获癌细胞的数量相差最为明显。这主要是因为含有靶向分子的材料具备更强的特异性，但细胞的粘附需要一定的时间。(7) KB细胞捕获特异性定量试验结果以具有叶酸受体高表达的人口腔上皮癌细胞(KB)及不具备叶酸受体高表达的小鼠成纤维细胞(L929)两种模型细胞来检验两种材料G5.NH2-F1-FA和G5.NH2-FI修饰的功能化静电纺醋酸纤维素纳米纤维特异性捕获细胞的效果。参见说明书附图7。试验结果表明，对于KB细胞，经过40min、60min培养，两种材料捕获细胞的数量具有显著性差异，但对于L929细胞，在不同的捕获时间后(5min、20min、40min、60min)，两种材料捕获细胞的数量几乎相同。这说明，这种靶向分子修饰的功能化纳米纤维对特定的细胞具有高效捕获作用。(8)自由叶酸阻断试验结果以在添加叶酸的培养基生长的人口腔上皮癌细胞(KB)为模型来检测检验两种材料G5.NH2-F1-FA和G5.NH2-FI修饰的功能化静电纺醋酸纤维素纳米纤维对叶酸受体被屏蔽后的KB细胞的捕获效果。参见说明书附图8。对于在添加自由叶酸的培养基中培养24h的KB细胞，两种材料捕获细胞的数量接近。这一结果证明:在癌细胞上的叶酸受体被屏蔽后，G5.NH2-F1-FA修饰的功能化静电纺醋酸纤维素纳米纤维不再具备对癌细胞的特异性靶向捕获作用。
本发明采用静电纺丝法制备天然聚合物醋酸纤维素纳米纤维，充分利用纳米纤维比表面积大、孔隙率高且能够模拟细胞外基质结构的特性，有利于细胞与材料间的有效接触并促进其相互作用，同时结合靶向分子的特异细胞结合能力，可达到特异性捕获癌细胞的目的。有益.效果( I)本方法制备的靶向分子叶酸修饰的功能化静电纺醋酸纤维素纳米纤维材料可用于特异性捕获人口腔上皮癌细胞(KB)；(2)本发明制备的癌细胞捕获材料具有制备工艺简单、特异性强、可短时间内靶向捕获癌细胞等优点，在癌症的早期诊断方面具有很好的应用前景。
图1为本发明制备的G5.NH2-F1-FA的核磁共振氢谱图；图2为本发明制备的CA纳米纤维及直径分布(图2A)，水解不同时间后纳米纤维形貌(图 2B, (a) lh, (b)2h，(c)4h，(d) 8h)，及 G5.NH2-F1-FA (a)和 G5.NH2-FI (b)修饰的功能化静电纺醋酸纤维素纳米纤维的扫描电镜图及其直径分布(图2C)；图3为G5.NH2及本发明制备CA纳米纤维、水解后纳米纤维、及G5.NH2-F1-FA和G5.NH2-FI修饰的功能化静电纺醋酸纤维素纳米纤维的的红外图谱；图4为本发明制备的G5.NH2-F1-FA修饰的功能化后纳米纤维的共聚焦显微镜图片;图5为本发明制备的不同浓度G5.NH2-F1-FA修饰功能化纳米纤维前后在500nm处的紫外吸收值(图5A)、G5.NH2-F1-FA (a)和G5.NH2-FI (c)浓度-吸光值标准曲线、以及在lmg/mL条件下G5.NH2-F1-FA (b)和G5.NH2-FI Cd)修饰纳米纤维前后的紫外吸收图谱(图5B);图6为本发明制备的G5.NH2-F1-FA (a)和G5.NH2-FI (b)修饰的功能化静电纺醋酸纤维素纳米纤维对KB细胞捕获的共聚焦显微镜图片；图7为本发明制备的G5.NH2-F1-FA和G5.NH2-FI修饰的功能化静电纺醋酸纤维素纳米纤维在不同时间内(5min、20min、40min、60min)捕获KB (a)细胞及L929 (b)细胞的
数量；图8为本发明制备的G5.NH2-F1-FA和G5.NH2-FI修饰的功能化静电纺醋酸纤维素纳米纤维在不同时间内(5min、20min、40min、60min)对叶酸受体被屏蔽的KB细胞捕获的数量。
具体实施例方式下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。实施例1称取醋酸纤维素3g，将其溶于15mL丙酮和N，N- 二甲基甲酰胺混合有机溶剂中，两者体积比为2:1，磁力搅拌过夜制备得到纺丝液进行纺丝。所采用纺丝工艺条件为:电压为20-22kV，接收距离为25cm，流速为lmL/h，环境湿度40_50%。将纤维毡真空条件下干燥12-24h。SEM结果显示所得到的CA纳米纤维形貌规整，表面光滑，平均直径为431.6nm (图2A)。实施例2称取400mgNa0H，将其溶于200mL无水乙醇溶液中，磁力搅拌30min，得到浓度为
0.05M的NaOH/乙醇溶液，用该溶液对醋酸纤维素纤维毡进行水解，水解时间为4h，使纤维毡在碱性条件下发生皂化反应，去除表面的乙酰基，得到再生纤维素纳米纤维。然后用去离子水洗涤3-5次，放入真空干燥箱12-24h。SEM结果显示，水解后部分纤维表面变粗糙，但不影响显微结构(图2B)。FTIR结果表明，CA纳米纤维已成功水解(图3)。实施例3称取第五代聚酰胺胺树状大分子(G5.NH2)66.47mg,溶于6.647mL DMSO中，配制成浓度为10.0mg/mL的溶液。称取异硫氰酸荧光素(FITC)6.79mg，溶于2mL DMSO。按照FI/G5.NH2摩尔比为5:1，将1.465mLFITC加入到G5.NH2溶液中，避光处理，室温条件下磁力搅拌l-2d，得到G5.NH2-FI溶液。称取叶酸斤4)6.0411^，溶于511^01^0，称取16.3311^0(:溶于21111DMSO 中，按照EDC/FA摩尔比为5:1，将1.60mLEDC加入到FA溶液中，避光处理，室温条件下磁力搅拌反应3_5h。按照FA/G5.NH2摩尔 比为5/1，将活化好的FA溶液6.163mL加入G5.NH2-FI溶液中，避光处理，室温下磁力搅拌，反应3-5d。反应结束后，将反应产物转移至截留分子量为14000的透析袋中，先用pH值为7.4的0.02M PBS缓冲液透析12-24h (3x2L)，再在蒸馏水中透析24_48h (6x2L)。然后进行冷冻干燥处理，得到G5.NH2-F1-FA反应产物。NMR表征结果如
书I所示，在化学位移分别为6.4和7.0ppm处有两个小的质子峰，它们是FI分子结构中特征基团的质子峰。在化学位移分别为6.6,7.5和8.5ppm处有三个小的质子峰，它们是FA分子结构中特征基团的质子峰。根据积分面积可以求出每个G5.NH2表面连接了 3.4个FI分子和3.8个FA分子(图1)。实施例4称取纤维毡的质量为2.56mg,根据其在溶液中的最终浓度为3mg/mL计算所需溶液体积为0.853mL,首先加入0.427mL浓度为20mg/mL的EDC活化纳米纤维毡3_5h，最后将0.427mL浓度为2mg/mL的G5.NH2-F1-FA逐滴滴加至EDC活化后的纳米纤维毡中，使得G5.NH2-F1-FA在溶液中的最终浓度为1.0mg/mL，避光处理，摇床上避光摇晃反应3_5d。然后加入2.51iiL三乙胺，磁力搅拌30_60min，再加入L71yL乙酸酐，反应12-24h。其中，三乙胺及乙酸酐与树状大分子的摩尔比控制在550:550:1，使树状大分子表面剩余氨基全部乙酰化。扫描电镜结果表明G5.NH2-F1-FA组装到功能化纳米纤维表面后，纤维仍然保持良好形貌，但其平均直径略有增加，为506.9nm (图2C，(a))。FTIR (图3)及激光共聚焦显微镜图片(图4)表明G5.NH2-F1-FA已成功修饰到功能化纳米纤维表面，且UV-Vis结果表明吸附在Img功能化纳米纤维毡表面G5.NH2-F1-FA的质量为0.056mg (图5B，(a))。实施例5以具有叶酸受体高表达的人口腔上皮癌细胞(KB)为模型细胞来检验实施例4制备的G5.NH2-F1-FA修饰的功能化纳米纤维及对比例2制备的G5.NH2-FI修饰的功能化纳米纤维特异性捕获KB细胞的效果。将两种材料剪成方形(a=16mm),将大于玻片(C>=14mm)的部分折在玻片的背面，然后将样品放入12孔培养板。不同时间点的样品要放置在不同的培养板中，每个样品3个平行样。将培养板用铝箔纸包裹，防止FI淬灭，在紫外条件下照射灭菌6h。最后用ImL含有10%FBS的1640培养基浸泡，放入CO2培养箱过夜。KB细胞的种植密度为5X IO4个每孔，培养不同时间后(5min、20min、40min、60min)，吸取上清液，并且用PBS将纤维毡清洗三遍，收集PBS清洗液使之与上清液混合，离心5min，速度为lOOOrpm，并将其用一定体积培养液吹打均匀，用细胞计数器测定该培养液中剩余细胞的个数，计算得知两种纤维毡表面在不同时间内捕获KB细胞的数量。激光共聚焦显微镜结果定性表明含有靶向分子叶酸的功能化纳米纤维可以捕获更多的KB细胞(图6)，且细胞计数结果表明经过40min、60min培养，两种材料捕获细胞的数量具有显著性差异(图7，(a))。对比例I称取第五代聚酰胺胺树状大分子(G5.NH2)66.49mg，溶于6.649mL DMSO中，配制成浓度为10.0mg/mL的溶液。称取异硫氰酸荧光素(FITC)6.23mg，溶于2mL DMSO。按照FI/G5.NH2摩尔比为5/1，将1.58mLFITC加入到G5.NH2溶液中，避光处理，室温条件下磁力搅拌l-2d。反应结束后，将反应产物转移至截留分子量为14000的透析袋中，先用pH值为7.4的0.02M PBS缓冲液透析12-24h (3x2L)，再在蒸馏水中透析24_48h (6x2L)。然后进行冷冻干燥处理，得到G5.NH2-FI反应产物。NMR表征结果表明在化学位移分别为6.4和7.0ppm处有两个小的质子峰，它们是FI分子结构中特征基团的质子峰。根据积分面积可以求出每个G5.NH2表面连接了 4.7个FI分子。对比例2称取纤维毡的质量为2.47mg，根据其在溶液中的最终浓度为3mg/mL计算所需溶液体积为0.823mL,首先加入0.412mL浓度为20mg/mL的EDC活化纳米纤维毡3_5h，最后将0.412mL浓度为2mg/mL的G5.NH2-FI逐滴滴加至EDC活化后的纳米纤维毡中，使得G5.NH2-FI在溶液中的最终浓度为1.0mg/mL，避光处理，摇床上摇晃反应3_5d。然后加入2.42 ii L三乙胺，磁力搅拌30_60min，再加入1.65iiL乙酸酐，反应12-24h，其中，三乙胺及乙酸酐与树状大分子的摩尔比控制在550:550:1，使树状大分子表面剩余氨基全部乙酰化。扫描电镜结果表明G5.NH2-FI修饰到功能化纳米纤维表面后，纤维仍然保持良好形貌，但其平均直径略有增加，为544.0nm (图2C, (b))。FTIR结果表明G5.NH2-FI已成功修饰到功能化纳米纤维表面(图3)，且UV-Vis结果表明吸附在Img功能化纳米纤维毡表面G5.NH2-FI 的质量为 0.043mg (图 5B，(b))。对比例3以不具备叶酸受体高表达的小鼠成纤维细胞(L929)为模型细胞来检验实施例4制备的G5.NH2-F1-FA修饰的功能化纳米纤维及对比例2制备的G5.NH2-FI修饰的功能化纳米纤维捕获不含靶向配体的L929细胞的效果。材料处理方法同实施例5。所用培养基为含有10%FBS的DMEM培养基。L929细胞的种植密度为5X IO4个每孔，培养不同时间后(5min、20min、40min、60min)，吸取上清液，并且用PBS将纤维毡清洗三遍，收集PBS清洗液使之与上清液混合。离心5min，速度为lOOOrpm，并将其用一定体积培养液吹打均匀，用细胞计数器测定该培养液中剩余细胞的个数。计算得知两种纤维毡表面在不同时间内捕获L929细胞的数量，细胞计数结果显示培养不同时间后两种材料捕获L929细胞的数量几乎一致(图7，(b))。对比例4以具有叶酸受体被屏蔽的人口腔上皮癌细胞(KB)为模型细胞来检测实施例4制备的G5.NH2-F1-FA修饰的功能化纳米纤维及对比例2制备的G5.NH2-FI修饰的功能化纳米捕获叶酸受体屏蔽后KB细胞的效果。材料处理方法同实施例5，细胞屏蔽方法为将模型细胞培养于含有自由叶酸(5 ii M)的培养基中24h。叶酸受体屏蔽KB细胞的种植密度为5 X IO4个每孔，培养不同时间后(5min、20min、40min、60min),吸取上清液,并且用PBS将纤维租清洗三遍。收集PBS清洗液使之与上清液混合，离心5min，速度为lOOOrpm，并将其用一定体积培养液吹打均匀。用细胞计数器测定该培养液中剩余细胞的个数，计算得知两种纤维毡表面在不同时间内捕获叶酸屏蔽后KB细胞的数量。细胞计数结果显示对于在添加自由叶酸的培养基中培养24h的KB细胞，两种材料捕获细胞的数量接近(图8)。
权利要求
1.一种用于癌细胞捕获的叶酸修饰的静电纺纳米纤维的制备方法，包括: (1)将醋酸纤维素溶于有机溶剂中，搅拌，得到纺丝液进行纺丝，干燥，得醋酸纤维素纳米纤维，其中醋酸纤维素和有机溶剂的质量体积比为Ig:5ml ； (2)将上述醋酸纤维素纳米纤维在碱性条件下进行水解l_8h，洗涤，干燥，得到再生纤维素纳米纤维； (3)依次将聚电解质聚二甲基二烯丙基氯化铵PDADMAC和聚丙烯酸PAA组装在静电纺再生纤维素纳米纤维表面，得到聚电解质自组装纳米纤维；其中组装方法为:分别配制聚二甲基二烯丙基氯化铵PDADMAC/NaCl溶液和聚丙烯酸PAA/NaCl溶液，调节pH值为3.5，然后将再生纤维素纳米纤维浸泡在PDADMAC/NaCl溶液，取出后洗涤，吸干表面流动水，再浸泡在PAA/NaCl溶液中，洗涤，真空干燥，得到聚电解质自组装纳米纤维； (4)将第五代聚酰胺-胺树状大分子的DMSO溶液中，逐滴滴加含有异硫氰酸荧光素FITC的DMSO溶液，搅拌反应l-2d，然后加入EDC活化3_5h后的叶酸FA的DMSO溶液，搅拌反应3-5d，得到FITC与FA修饰的树状大分子溶液，最后将溶液进行透析，冷冻干燥，即得G5.NH2-F1-FA,然后配制成溶液； (5)配制聚电解质自组装纳米纤维溶液，加入EDC活化3-5h，然后逐滴加入G5.NH2-F1-FA溶液，避光，振荡，得G5.NH2-F1-FA修饰后的聚电解质自组装纳米纤维；其中G5.NH2-F1-FA在溶液中的最终浓度为0.2-1.2mg/mL ； (6)将上述G5.NH2-F1-FA修饰后的聚电解质自组装纳米纤维中加入三乙胺，反应30-60min，再加入乙酸酐，继续反应12_24h，即得具有靶向捕获癌细胞功能的纳米纤维材料，其中，三乙胺及乙酸酐与树状大分子的摩尔比控制在550:550:1。
2.根据权利要求1所述的一种用于癌细胞捕获的叶酸修饰的静电纺纳米纤维的制备方法，其特征在于:所述步骤(I)中醋酸纤维素的Mn为30，000 ;有机溶剂为体积比为2:1的丙酮和N，N- 二甲基甲酰胺的混合液。
3.根据权利要求1所述的一种用于癌细胞捕获的叶酸修饰的静电纺纳米纤维的制备方法，其特征在于:所述步骤(I)中纺丝工艺条件为:电压为20-22kV，接收距离为25cm，流速为lmL/h，环境湿度40-50%;所述的干燥为真空干燥，干燥时间为12-24h。
4.根据权利要求1所述的一种用于癌细胞捕获的叶酸修饰的静电纺纳米纤维的制备方法，其特征在于:所述步骤(2)中碱性条件为0.05M的NaOH/乙醇溶液，水解时间为4h。
5.根据权利要求1所述的一种用于癌细胞捕获的叶酸修饰的静电纺纳米纤维的制备方法，其特征在于:所述步骤(2)中洗涤为用去离子水洗涤3-5次，干燥为真空干燥，干燥时间为 12-24h。
6.根据权利要求1所述的一种用于癌细胞捕获的叶酸修饰的静电纺纳米纤维的制备方法，其特征在于:所述步骤(3)中PDADMAC与PAA在再生纤维素纳米纤维表面组装层数各为I层。
7.根据权利要求1所述的一种用于癌细胞捕获的叶酸修饰的静电纺纳米纤维的制备方法，其特征在于:所述步骤(3)中PDADMAC/NaCl溶液的浓度为2mg/mL，PAA/NaCl溶液浓度为 2mg/mL。
8.根据权利要求1所述的一种用于癌细胞捕获的叶酸修饰的静电纺纳米纤维的制备方法，其特征在于:所述步骤(3)中浸泡时间均为3-10min，洗涤均为超纯水洗涤3_4次，每次2min，真空干燥时间为12-24h。
9.根据权利要求1所述的一种用于癌细胞捕获的叶酸修饰的静电纺纳米纤维的制备方法，其特征在于:所述步骤(4)中第五代聚酰胺-胺树状大分子的DMSO溶液的浓度为10.0mg/mL, FITC与树状大分子的摩尔比为5:1，FA与树状大分子的摩尔比为5:1，透析为:在截留分子量为14000的透析袋中，先用pH值为7.4的0.02M PBS缓冲液透析12_24h，再在蒸馏水中透析24-48h。
10.根据权利要求1所述的一种用于癌细胞捕获的叶酸修饰的静电纺纳米纤维的制备方法，其特征在于:所述步骤(5)中聚电解质自组装纳米纤维纤维溶液的浓度为3mg/mL,G5.NH2-F1-FA溶液浓度为l mg/mL ;振荡时间为3_5d。
全文摘要
本发明涉及一种用于癌细胞捕获的叶酸修饰的静电纺纳米纤维的制备方法，包括(1)静电纺醋酸纤维素纳米纤维的制备并干燥；(2)醋酸纤维素纳米纤维水解，得到再生纤维素纳米纤维，干燥；(3)将聚电解质聚二甲基二烯丙基氯化铵PDADMAC和聚丙烯酸PAA组装在静电纺再生纤维素纳米纤维表面，得到聚电解质自组装纳米纤维，干燥；(4)将G5.NH2-FI-FA修饰到聚电解质自组装纳米纤维表面；(5)将修饰在聚电解质自组装纳米纤维表面G5.NH2-FI-FA的剩余氨基全部转化为乙酰基。本发明制备的癌细胞捕获材料具有制备工艺简单、特异性强、可短时间内靶向捕获癌细胞等优点，在癌症的早期诊断方面具有很好的应用前景。
文档编号D06M13/355GK103114450SQ20131005805
公开日2013年5月22日 申请日期2013年2月22日 优先权日2013年2月22日
发明者史向阳, 赵毅丽 申请人:东华大学