粒状微生物生物量的制备及其有价值的化合物的分离方法

专利名称：粒状微生物生物量的制备及其有价值的化合物的分离方法
技术领域：
本发明涉及用于处理微生物生物量(一般为由发酵产生的包含微生物的产物)的方法，该方法可以使有用的或者有价值的化合物与所产生的待改进的生物量得到分离。本方法可以包括在化合物回收之前使生物量成为粒状(例如通过挤压)。
背景技术：
至今的一段时间以来人们已经把微生物当作各种产物的有价值来源。几种这样的微生物产物存在于微生物细胞的内部，或者与微生物细胞有关。为了回收比较纯的形式的这样产物，把产物与微生物生物量分离是必要的。例如，为了把亲脂化合物与微生物生物量分离，通常需要用有机溶剂或者超临界流体(例如液态CO2)实施抽提(浸提)步骤。
生物量得自发酵并且可以用于产物抽提。它通常是湿细胞饼，而各种预处理造成了细胞的严重破裂。物理处理(例如干燥，如喷雾干燥或者冻干，和/或机械粉碎，如均化或者研磨)、化学处理(酸或者碱)或者酶促处理都可以使细胞发生破裂。需要进行生物量的干燥以便减少溶剂含量，以及在亲脂化合物的抽提的情况下需要防止麻烦的乳状液产生。
喷雾干燥通常用来获得准备抽提的生物量。喷雾干燥器的干燥要求下列条件为了给干燥器供料，生物量应该是(浓缩的)液体或者具有小微粒(使之能够进行圆盘或者喷嘴喷雾)的浆液。这意味着对于微生物生物量来说浆液的最大干物质含量是限于大约20-30％，尔后的干燥步骤将达到90-95％的干物质含量，但这将是比较昂贵的。
就时间上来说喷雾干燥方法是比较短的。然而，在大多数情况下产物温度(相对)较高。这意味着对于氧化敏感的化合物来说有氧化和尔后的降解的高风险。在生物量含有高含量的胞内脂质物质的情况下，由于在高温下自生物量中产生的脂质的“出汗”，干燥有时是麻烦的。在这种情况下，将发生干燥器的淤积。
喷雾干燥的另一个弊端是其限制了抽提方法的类型，抽提方法可以用来在其后分离所需的化合物。它通常不可能把例如渗滤抽提技术运用于细磨成粉末的产物(如喷雾干燥的生物量)上。微生物生物量的机械破裂(如通过研磨)也有产生大量的细粉(或者粉末)的同样弊端。
英国专利号GB 1 466 853涉及把油与喷雾干燥的酵母粉分离的方法。在炊具中用80℃的蒸汽湿润和加热酵母粉。然后将湿粉加料于码垛机中，使之转化成为小球、成为片状并再一次干燥以便减少5-10％(重量)的含水量。然后由筛过滤所产生的薄片并在码垛机中再循环。这一物质适合于渗滤抽提。然而，该方法有弊端，即粉末一旦得到喷雾干燥就需要再水合以及在高温下处理然后再干燥。对于热敏感和/或氧化敏感的化合物，这样的不利处理步骤导致降解并因而使产量减少。
国际专利申请WO-A-93/25644(等同于US 5,539,133)涉及用于把具有高含量多不饱和脂肪酸(PUFAs)的类脂类与大型和/或微型藻类(一种海草)分离的方法，其中大型藻类可以反复是得自藻酸盐或者角叉菜胶抽提物的残渣。得自藻类的物质具有少于50mm的颗粒大小以及大于50％的干物质含量。当藻类材料具有比所表明的值大的颗粒大小和/或比所表明的值小的干物质含量时，就需要通过研磨和/或干燥预处理该材料。然而，正如以上所指出的，研磨对于有效的抽提和精炼方法是不利的。
DD-A-150627涉及制备包含生物量的酵母(或者细菌)，其中该生物量得到干燥，然后变成大颗粒(8-12mm，表面上为球形的)。这些颗粒有20％的含水量，然后得到研磨。利用石油醚进行抽提以便回收不需要的柴油(或者烃)，该柴油可用作为微生物的碳源。余下的残渣用作为动物饲料。
DE-A-1923529涉及在用流化床干燥以便产生颗粒之前使之蒸发的生物量。然后研磨或者粉碎这些材料。然后抽提剩余油(作为污染物)。与以前的文件相同，所提取的物质是杂质并且不能由包含在生物量中的微生物产生。
EP-A-0322227涉及用于通过以芝麻油喂养微生物来产生花生四烯酸(ARA)和γ-亚油酸(GLA)的方法。
美国专利5,340,594涉及从真菌产生高度不饱和脂肪酸。可以将生物量与磨过的玉米混合，所产生的产物用作为动物饲料。
WO-A-92/12711涉及微生物油的混和，特别是作为婴儿配方的添加物时，其中生物量在滤器上得到过滤和挤压从而产生滤饼，然后冻干该滤饼。
本发明寻求提供从生物量中抽提所需化合物的方法，该方法可以解决现有技术中存在的一些或者所有问题。
发明描述按照本发明的第一个方面，本发明提供了把一种或多种化合物与包含微生物(已产生所需的化合物之一)的微生物生物量分离的方法，该方法包括a)提供或者获得干物质含量为25％至80％的生物量；b)使生物量粒化成为具有25％至80％的平均干物质含量的粒状颗粒；c)干燥粒状颗粒以便产生具有至少80％的平均干物质含量的干燥颗粒；d)从得自c)的干燥颗粒中纯化、提取或者分离上述或者每一种化合物。
惊人的是曾有人发现通过利用生物量的干燥颗粒，可以达到比将要分离的化合物的预期产率高的高产率。一般认为这是因为颗粒的结构可以使用于抽提的溶剂最大量地进入。当然，如果微粒太大，那么表面积可能是低的，从而产生相应较低的产率。然而，微粒不应该太小否则它们可能阻塞在抽提期间使用的滤器。因为这一原因，本发明方法不包括研磨、成片或者粉碎步骤或者阶段。
各阶段的含水量也可以影响产量。干物质含量太高，生物量将破碎并且可能形成细粉或者粉末，如果使用过滤提取方法这是不利的。然而，含水量太高，就可能获得太湿以致不能形成颗粒的浆液。
使物质成为粒状的方法是本领域已知的。然而，它们在一些阶段经常与研磨或者成片结合在一起，这产生了如上所讨论的不利之处。在本发明中，正是干燥的颗粒用于化合物的抽提，并且无研磨的或者成片的形式。此外，通过成粒，可以使对生物量中的细胞的损害得到最大限度地减少，这可以再一次有助于增加化合物的产量。在美国专利5,340,594中没有揭示生物量的挤压，但是在这里挤压形式用作为动物饲料而对于自该粒状形式中抽提具体化合物将产生高产率的方面，则无任何正确评价。
通过把生物量加工成粒状颗粒，可以有助于干燥过程。在生物量已经处理成粒状形式之后，干燥可以是相当容易和有效的。
此外，已经发现干燥颗粒是特别稳定的，尤其是在环境温度或者室温下。生物量可以这种形式存储相当长的一段时间而没有降解。虽然不希望为理论所束缚，但是人们怀疑这种情况发生是因为化合物位于颗粒内部，因此至少部分保护该化合物免受环境影响，对于某些化合物，这种环境影响可以造成因氧化而降解。
按照本发明的第二方面，本发明提供了包含生物量的粒状颗粒的组合物，该颗粒具有至少30％的平均干物质含量，但是少于70％，并且通过使生物量成为粒状而获得。这样的粒状颗粒可以通过利用第一个方面的方法而获得，并且从成粒阶段(b)产生。
按照本发明的第三方面，本发明提供了包含干燥颗粒的组合物，该颗粒得自微生物生物量，并且具有至少80％的干物质含量(平均值)。这些颗粒可以通过利用第一个方面的方法而获得，并且在于燥阶段(c)之后产生。已经发现这样的组合物是生物量的特别稳定型。它可以存储数周，要不然数年(例如在室温下)，而极少甚至没有降解或者其性质方面的变化。这意味着它所含有的化合物也可以稳定地存储(乃至输送)。此外，它可以存储在室温下，这避免了冻结的需要，或者存储在特别低的温度下，这是现有技术的生物量材料的存储方式。明显地，这样的稳定性是有利的，因为存储条件相当便宜。
优选的生物量成粒方法是通过挤压。这可以最大限度地减少细胞的破裂。已经发现当具有最小程度的细胞破裂时生物量的稳定性将更好，换句话说本发明的方法可以适应于最大化仍然完整的细胞的数量。这是与许多现有技术的提取相反的，其中现有技术是使细胞破裂以便分离化合物。
本发明的第四方面涉及用于把一种或多种化合物与生物量的颗粒分离的方法，该方法包括a)提供具有至少80％的干物质含量的干燥颗粒，该颗粒得自包含微生物(产生一种这样的化合物)的微生物生物量；b)通过溶剂抽提从干燥颗粒中提取或者分离上述或者每种化合物。
优选的提取方法是使用溶剂，其中合适地化合物是可溶性的。优选的提取方法是利用渗滤在这里，溶剂可以漫过颗粒的床。对于这一技术，需要明白的是颗粒不应该太小(例如不应该研磨或者粉碎它们)，否则将获得太多的将阻塞滤器的“粉末”(或者细粉)。大颗粒也要避免，但是在这两个极端之间，人们可以获得最适的表面积，因此优选地颗粒比滤器的孔隙大。优选地，颗粒是高度多孔的以便使得溶剂易于接近所要提取的化合物。
在本发明中，使微生物生物量饼形成粒状颗粒的预处理可以极大地改善尔后的干燥方法。所产生的干燥的粒状生物量可以特别适合于任何种浸泡式或者渗滤式抽提。可以具体地调整颗粒的大小以适于最适的干燥和抽提条件。通过利用按照本发明预处理的生物量，可有利地提取所需的化合物而无需在抽提之前破裂细胞。
本发明的方法可以用来由几乎任何类型的微生物制备粒状颗粒或者干燥颗粒。微生物可以是丝状形式的，如同真菌或者某些细菌一样，或者作为单细胞，如同酵母、藻类和细菌一样。因此，生物量可以包含微生物，该微生物是酵母、真菌(fungae)、细菌或者藻类。优选的真菌是毛霉目。例如，真菌可以是被孢霉属、须霉属、布拉霉属或者曲霉属。优选的真菌是高山被孢霉种、三孢布拉霉种和土曲霉种。
就酵母而论，优选的是毕赤酵母属，如Pichia ciferrii种。
细菌可以是丙酸杆菌属。
如果生物量包含藻类，那么这优选地是甲藻和/或属于Crypthecodinium属。优选的藻类是Crypthecodinium cohnii种。
要从微生物生物量(按照本发明制备的)中分离出来的化合物可以定位于细胞内，与细胞膜或者细胞壁相联系，或者细胞外产生(然后它可以是不溶于水的)。
要分离的化合物可以是亲水的或者疏水的(例如亲脂的)。这样的化合物的例子是胞内蛋白质或者酶、类脂类、如维生素(例如维生素B12)一样的次生代谢物、大环内酯或者多烯抗菌素、提供香料的物质或者类胡萝卜素。优选地，要从微生物生物量分离的化合物是亲脂化合物。
从按照本发明处理的生物量中提取的化合物可以具有高质量，这是由于它只有因用于处理方法中的温和条件而致的少量变质(如果有的话)。因此，本发明特别适合于微生物生物量(对热和/或氧化敏感的化合物需要从其中分离)的制备。
本发明适合于制备微生物生物量以便具有高度不饱和度的化合物(如包含多不饱和脂肪酸(PUFA)的类脂类)的分离。优选地PUFA是C18、C20或者C22ω-3或者ω-6多不饱和脂肪酸。例如，所说化合物可以是二十二碳六烯酸(DHA)(得自藻类或者真菌，如Crypthecodinium甲藻或者破囊壶菌属真菌)、γ-亚麻酸(GLA)、二高(dihomo)-γ-亚麻酸或者花生四烯酸(ARA)(得自真菌，如被孢霉属、腐霉属或者虫霉属)，或者二十碳五烯酸(EPA)(得自藻类，如紫球藻属或者菱形藻属)。这些PUFAs之任一都可以独立地分离或者(更通常)以脂质形式分离。
按照本发明可以得到分离的化合物的另外例子包括如得自霉菌属的β-胡萝卜素(例如得自毛霉目(例如须霉属或者布拉霉属))、得自酵母Phaffiarhodozyma的虾青素、得自酵母Pichia ciferrii的四乙酰植物鞘氨醇(TAPs)和/或得自丙酸杆菌的维生素B12。
可以提取的其它化合物包括亲脂性化合物/非极性化合物如洛伐他汀、环孢菌素和菜特洛霉素。这些化合物中，头两种化合物在胞外产生或者与细胞壁结合。因此，合适的溶剂包括庚烷、己烷、丙酮、甲醇和甲苯以及乙醇。然而，对于后两种化合物，对于环孢菌素可以利用异丙醇或者乙酸丁酯，对于莱特洛霉素可以利用乙醇或者甲醇。一般地说，己烷适合于非极性抗菌素，如那些由链霉菌属的有机体产生的抗菌素。
其它化合物包括聚酮化合物或者得自聚酮化合物的代谢物，该聚酮化合物包括许多抗菌素。优选的聚酮化合物是那些不含有氮并且可以是芳香族(优选地，包含至少6个成员环)的聚酮化合物。优选的聚酮化合物是抑制素，该抑制素包括洛伐他汀、西伐他停、普伐他汀和compactin。其它优选的化合物是HMG-CoA还原酶抑制剂。这些化合物可以在血液中减少胆固醇水平。
可以提取的另一类化合物包括如麦角固醇的类固醇。这些都是由酵母和霉菌产生的。
本发明的方法特别适合于亲脂化合物(如包含多不饱和脂肪酸(PUFA)的类脂类和/或类胡萝卜素)的分离。
按照本发明方法分离的化合物(组合物)适合用于人或者动物食品中(例如婴儿配方)或者其它可食用的组合物中以及化妆品中、保健组合物或者添加物中、或者药物组合物中。
在本发明的方法中，可以首先将所选择的微生物发酵以便为尔后的化合物抽提获得足够量的生物量。发酵条件取决于所利用的有机体，并且可以在所产生的生物量中产生最高含量的化合物。
在比较实施例26中提出了合适的发酵条件。
在发酵过程完成之后，可以对发酵肉汤(取决于要分离的化合物的类型)进行巴氏消毒以便杀死生产性有机体并灭活任何不需要的酶。如果需要的话，可以在肉汤中加入絮凝剂和/或其它加工辅助剂以便提高它的过滤本领。
合适的絮凝剂包括CaCl2、AL2(SO4)3以及极性阳离子聚酰胺。这些絮凝剂可以以0.1至2％的重量百分含量出现。
优选地，要对生物量(或者肉汤)进行巴氏消毒。在发酵之后，可能必须进行巴氏消毒以便获得浆液，该浆液可以用卫生方法处理。在发酵罐中对生物量进行巴氏消毒可以具有几个优点。首先，生产性有机体没有暴露在环境中。其次，还可以灭活不需要的酶促活性(影响靶化合物的质量)。
巴氏消毒在60至100℃的温度下进行，温度的高低取决于生产性有机体的种类。可以通过用通入发酵罐的蒸汽(直接)加热或者利用通过换热器的介质(间接)加热来进行巴氏消毒，该换热器通过器壁或者用冷却盘管或者外部换热器(如已知的平板换热器或者其它合适的换热器)换热。
可以使用下列的优选巴氏消毒条件，尤其是对于被孢霉属有机体。
对发酵肉汤(或者生物量)进行巴氏消毒以便杀死微生物，并且灭活酶的活性。这可以在主发酵罐接种之后的大约144小时进行。生物量(或者肉汤)适于在50至95℃下进行巴氏消毒，优选地为60至75℃，最适为63至68℃。这一过程可以进行30至90分钟，优选地为50至75分钟，最适为55至65分钟。这一过程可以使用任何合适的加热方法，但是优选的是直接蒸汽注入，如注入主发酵容器中。
在巴氏消毒之后，使肉汤冷却，或者变凉。这一过程可以花费大约4小时，合适的是冷却至大约25℃。
如果包括得自不同生物量或者发酵肉汤的两种或者多种有机体，那么可以逐个地对每个生物量(或者肉汤)进行巴氏消毒，或者在混合之后对它们进行巴氏消毒。然而，前者是优选的，因为不同的巴氏消毒条件可以用于不同的有机体。
通常，巴氏消毒将发生于发酵已经完成的发酵罐之中。然而，对于某些有机体(如细菌)，通常优选的是首先从发酵容器中除去微生物，然后进行巴氏消毒(例如，在附聚成粒过程的喷雾干燥之前)。
一般地说，巴氏消毒是有利的，因为它不仅可以杀死微生物而且更重要的是它可以灭活一种或多种对化合物产生不利影响的酶。例如，巴氏消毒可以灭活各种脂酶，这些脂酶可以从甘油三酯主链上切下脂肪酸。这对于PUFAs(其中甘油三酯含量是优选的)是不利的。
正如所知道的，巴氏消毒通常将杀死大多数微生物，即使不是所有。因此，在干燥颗粒中，杀死(即不是活着的)至少95％(如至少98％，即使不是99％)微生物。
对于某些有机体(例如毕赤酵母属)，优选的是不实施巴氏消毒。
为了阻止巴氏消毒过的生物量在尔后的加工处理步骤期间再受到污染，可以设计条件以减少生长的风险。一种可能性是用合适的酸酸化肉汤。为了阻止许多微生物物种的过度生长，3至4的pH范围结合低处理温度是足够的。
如乙醇、山梨酸酯等等的其它生物机能结构剂(biostatic agent)也可以用于这一目的。
对于热稳定产物来说，可以采用高温(60-100℃)处理。
优选的酸化条件(例如对于被孢霉属的有机体)如下。
将巴氏消毒过的肉汤的pH调整为2至5以便提高微生物的稳定性，优选的pH范围为3至4，最适的pH为大约3.5。
肉汤的酸化作用(在巴氏消毒之前或者之后)可以具有附加的优点。如果化合物是聚酮化合物(例如抑制素)，那么酸化作用可以使化合物产生沉淀。对于许多化合物，尤其是水溶性化合物，在进一步的处理步骤之前的沉淀是需要的，以免当过滤肉汤以便除去水时失去化合物。因此，在巴氏消毒之前或者之后，可以沉淀化合物(例如，通过酸化作用，虽然可以使用任何其它为本领域技术人员所知的方法)。
可以由任何合适的方法调整pH，例如用85％磷酸，优选为稀释的55％磷酸，最适为稀释的33％磷酸。
在这一阶段人们可以得到已巴氏消毒过的肉汤。下一阶段是通过把微生物与周围介质分离来获得生物量。
可以进行固液态分离技术以便把生物量与发酵肉汤分离。这一(收获的)生物量通常具有变化于20至35％的干物质含量，含量的多少取决于微生物的类型。然而，对于挤压(和尔后的干燥)，生物量典型地应该具有范围为25％至80％的干物质含量。
如果生物量的含水量太高(例如对于挤压和/或尔后的干燥)，那么可以使它脱水和/或使其干物质含量增加。用一些方法可以达到这一目的。首先，可以使生物量受于(附加的)脱水。可以利用任何本领域技术人员所知的脱水方法；所需的干物质含量可以是25或者30至80％。
优选的是利用机械脱水方法。然而，机械脱水方法所能达到的最大干物质含量将是变化的，变化的范围取决于微生物的类型。对于某些微生物(例如酵母)，生物量在机械脱水之后的干物质含量不会超过35至40％的水平，而对某些富含脂质的微生物的生物量实施相同的方法可以产生45至60％的高干物质含量。
一种优选的方法是利用薄膜压滤机(带有挤压薄膜的板式和框式压滤机)，该方法可以把固液分离与机械脱水相结合，尤其是适于获得所需的干物质含量。
另外或者此外，通过加入增稠(或者干燥)剂可以增加微生物生物量的所需的干物质含量。这些增稠剂是适当地干燥的，优选的是不负面干扰化合物的抽提过程和/或沉淀。例如，增稠剂可以包含淀粉和/或植物纤维，如燕麦或者小麦的糠或者纤维素。甚至可以利用另一种生物量(具有更低的含水量)。可以用任何方法加入这些物质，只要它能改进可挤出性。
有时，例如在固液分离和/或机械脱水之后，可以形成大饼形式的生物量。这可能不适合于成粒(例如挤压)。为了将生物量的大小减少至能够成粒(例如有效的挤出机加料)的程度，可以将生物量进行适当的粉碎、揉捏和/或混合。通过在高剪切混合器中(短时的)处理可以实现粉碎和/或揉捏。可有可无地，可以在这部分过程期间加入上述或者每一种增稠剂。
然后使处理(可选择粉碎或者揉捏)后的生物量经过成粒过程以产生粒状颗粒。可以以一些不同的方法进行成粒。
减少含水量(或者增加干物质含量)的另一种方法是利用盐(例如盐水)洗液洗涤生物量，或者(优选地)在生物量与肉汤分离之后进行处理，如利用洗涤过滤。
在本发明的优选实施方案中，所需的颗粒结构和大小由挤压方法获得。为了优化干燥和/或抽提过程，颗粒特征(如结构和大小)是重要的。在干燥步骤期间，如果颗粒太小那么它们可以产生问题，因为它们可以产生粉末和细粉；而太大的颗粒是不流化的，并可以产生不良的干燥效率。在抽提期间，一个太小的粒度可以使得渗滤方法不能利用，因为加于生物量床的压降太高。太多的细粉在尔后的纯化步骤中可以产生问题。太大的粒度可以在抽提期间阻止溶剂有效的进入。此外，颗粒结构应该是足够紧密的，以便在干燥和抽提期间阻止颗粒破碎，但是颗粒(干燥颗粒)优选地具有一定的孔隙率，该孔隙率使得溶剂在抽提期间可以(有效的)进入。
技术人员可以调整挤压条件以便获得具有所需结构与大小的粒状(生物量)颗粒。
可以调整挤压条件以便使细胞的破裂最大限度地减少。最小限度的细胞破裂可以确保最适地保护不稳定的、氧化敏感的化合物免受氧化诱导的降解。因此，优选的是在低温和没有任何加热手段的条件下实施挤压。优选的温度范围为大约20-30℃，如大约室温下。在挤压期间，粒状颗粒可以天然形成，“挤出物”通过重力作用在自身重量下离开压出板，由此形成颗粒。然而，如果在由压出板挤压之后形成的生物量是如意大利面条一样的自然长条形式，那么可以将该面条切成所需大小的颗粒。
已经发现生物量的温度影响挤压产生的粒状颗粒的性质。优选地，生物量在挤压之前具有6-15℃的温度。然而，当在挤出机中时生物量的温度可以升至10-60℃，虽然优选的是15-30℃。温度的上升将取决于施加在生物量上的压力及其干物质含量。
在挤压期间，通常迫使生物量通过桶压向压出板，经常以螺杆方式压入。优选的是不加热该桶。事实上，冷却该桶是有利的。合适地，冷却剂(例如诸如水之类的水溶液)的温度为1-4℃，如大约2℃。
一般地说，挤压不改变含水量。这是为什么在阶段(b)的干物质含量与在阶段(a)的相同。然而，正如所将知道的，其它成粒技术(如稍后所描述的)确实改变含水量，并可以减少含水量(即增加干物质含量)。对于包含如毛霉目(特别是产生PUFA的)的真菌的生物量，在阶段(a)的生物量干物质含量(通常将与在成粒(在挤压成粒的情况下)产生的粒状颗粒中的相同)合适地是在35-60％之间，优选为50-60％。在干燥之后，干燥颗粒优选地具有至少90％(如至少95％)的干物质含量。
优选的成粒技术是利用挤出机。W.Pietsch(“Size Enlargementby Agglomeration”:Wiley and Sons,1991，第385页)给出了关于挤出机的高质量综述。这类挤出机可以是分批或者连续挤出机。对于连续挤出机，可以是指简单的单螺杆挤出机(轴向和径向输送)。也有同向或者逆向旋转的双螺杆挤出机。输送将要挤压的生物量，使之部分地变得紧密，并将其压过孔板(压出板)。另一类挤出机包括造粒机。此时，一个圆柱状的压制工具滚动在一层堆积在孔板上的材料上。
如果通过挤压获得颗粒，那么需要生物量具有可挤压的形式。如果需要的话，可以调整含水量，这取决于生物量的条件、所使用的微生物以及挤压条件。可以除去水，或者通过加入固体(例如淀粉)增加干物质含量。以这种方法调整生物量至正确的稠度(这通常是糊状物)。
虽然颗粒可以用于化合物的抽提，但是它们也表示可以存储的稳定型生物量。颗粒可以具有其它用途例如，它们可以用于婴儿配方的制备，其中该生物量包含一种或多种多不饱和脂肪酸(PUFAs)。
本发明也正视其它能够使(粒状的)颗粒形成的成粒方法。例如，多级干燥方法可以包含喷雾干燥和流化床的结合并且也可以产生粒状颗粒。
可以使用其它类型的成粒技术。一般地，成粒是通过增加或者减少粒度获得粒状形式的固体的方法。一般是使粒度增加。一篇关于可供使用的成粒方法的类型的高质量综述被描述在W.Pietsch,“SizeEnlargement by Agglomeration”(Wiley and Sons,1991，第385页)中。在这篇综述中有许多不同的可供使用的成粒技术，这包括几个将要描述的附聚方法。在这里，附聚产生相互粘附(附聚)的小颗粒以便形成较大颗粒(在这种情况下为粒状颗粒)。因此，如果第一种技术产生太小的颗粒，那么可以使用附聚技术产生较大的(粒状的)颗粒。
通常利用转动和/或旋转鼓或者锥干燥器实现转动附聚，该干燥器含有具粘合性质(因此使颗粒粘合在一起)的粉。在某些情况下，可以混合额外加入的粘合剂。可以由这一机理形成球形颗粒。
压力附聚通常具有在大量颗粒状物质上施加高压的特征。一般来说，对细粉或者“可塑性的”(无弹性的)材料使用这一方法。正常情况下，这一方法用于磨成粉末的材料。(然而它也用于干燥的酵母中产生一定稠度的捏塑体)。可以把成形的颗粒干燥至便于最适存储的合适干物质含量。由活塞、滚转机、均衡的和/或挤出机压力可以实现压力附聚。在以上所提及的Pietsch书中给出了关于这类设备的充分的描述。
挤压压力通常利用壁摩擦，这种摩擦对可塑性材料通过孔或者开口端的压出板的流动产生了阻力。尤其是在其中发生广泛的混合并应用高剪切力的螺杆挤出机中。
一般来说，可以直接附聚具有低熔点或者增塑温度的材料。
其它附聚技术是可能的。例如，与流化床附聚机结合起来的喷雾干燥。首先可以在喷雾干燥器中通过喷管或者利用旋转轮由雾化干燥生物量。使细的颗粒再循环至喷射部分。在流化床部分中进一步附聚所产生的粘性粉。在某些情况下，粉的再润湿可以改善附聚方法。这里所描述的技术称为多级干燥。
为了更详细地描述多级干燥，首先喷雾干燥生物量。这可以产生细粉。喷雾干燥的温度(进气温度)通常为160-260℃和/或出气温度为75-90℃。此时，通过快速旋转的轮盘或者产生小颗粒的喷管干燥生物量。然后在重力作用下，颗粒可以落向喷雾干燥塔的底部。在这里，可以提供可利用热空气进行干燥(合适的为90-95℃)的流化床。这里，附聚可以发生，并且颗粒可以粘结在一起。随后，使附聚的(粒状的)颗粒受到干燥，例如在带式干燥床或者辅助流化床上。在该过程开始时，生物量可以具有低于30％的干物质含量。在喷雾干燥之后，其干物质含量可以增至75-90％，在附聚之后干物质含量可以是90-95％。在干燥之后，干物质含量可以增加为至少95％。
另一个技术是利用流化床附聚机。这里，可以用气流流化粉末。在颗粒床中用水喷雾流体以便湿润粉和提高附聚能力。
一般来说，所描述的附聚方法用于干燥的可以塑化的粉。一个例外是在多级干燥器上干燥。在干燥器之后与流化床结合起来的喷雾干燥适合于许多不同类型的生物量的附聚。然而，该方法并非总是适合于热不稳定产物或者对(热)空气氧化敏感的产物。一种产生粒状的干燥生物量的好方法是挤压机械脱水过的滤饼，而后进行如流化床或者辅助流化床干燥一样的合适干燥步骤。
通过再湿润(喷雾)干燥的产物而后进行挤压步骤和在如流化床干燥器中再干燥，可以实施(干燥的)生物量附聚的另一种方法。可以挤压具有低熔点或者低增塑温度(或者在具有高含量胞内油的某些干燥生物量的情况下，其部分地熔化是由于挤出机中的力所致)的粉。在压出板中形成合适的小球。
正如在以上的(c)中一样，可以干燥(挤压的或者以其它方式形成的)粒状生物量，合适的是在使得颗粒仍然是完整的条件下。在成粒过程之后，一般认为生物量的颗粒结构和大小能够使生物量得到有效的干燥。可以利用各种干燥器(如带式干燥器、真空或者真空带式干燥器，流化或者辅助流化床干燥器)进行干燥。技术人员可以在分批或者连续方法之间选择。
在本发明的方法中，流化或者辅助流化床干燥器的利用是特别优选的。用流化和辅助流化床干燥，床中的温度可以调整至现值。这些值可以具有广泛的范围，例如35-120℃，如50-90℃，可以是也可以不是60-80℃。如果需要把不稳定的化合物与生物量分离，那么容易把干燥过程的温度调整为低温范围以减少氧化或者降解的风险。
二者择一地，或者还可以使用真空干燥方法，例如进行1至2小时。
干燥步骤可以显示出几个优点。首先，生物量颗粒(将要形成微粒)的干燥可以产生中间物质，该中间物质可以稳定地存储延长的一段时间。这里，(比较)高的生物量干物质含量可以阻止化合物的降解以便分离化合物与生物量。用这一方法，可以认为干燥颗粒是化合物的稳定结构，该化合物存在于生物量之内或者与生物量相联系。
例如，该颗粒可以起作为酶的载体的作用，由此通过在挤压之前把适量的交联剂(例如戊二醛)混入生物量来将酶固定在颗粒之内。
此外，按照本发明制备的干燥颗粒实际上可以得到有利的利用，例如作为食品或者饲料组合物或者添加剂。
颗粒和/或微粒(例如通过挤压产生的)可以具有下列的性质。
颗粒可以具有巧克力糖果的形状。(挤压的)颗粒的直径可以变化于0.1-12mm，如0.3至10mm。更优选的是1.5-6mm，最适的(对于干燥时的抽提物)直径为2至3mm。颗粒的长度大约可以是直径的2至5或者6倍。然后可以容易包装它们，并用市售的提取器利用它们(以保证床的通透性)。通常地，大多数(即使不是所有)颗粒将具有相同的大小，事实上，人们可以获得高度一致的或者均匀的颗粒，其中至少80％(如至少90％)的颗粒具有在所说明的范围之内的特殊性质。
第二个方面的组合物(颗粒)优选地是自由流动的。它们在形状上也许是大致圆柱形的。通过利用挤压可以得到这一形状。然后颗粒可以具有与用于挤压的压出板的孔差不多一样大小(虽然颗粒直径可以稍大一点)的直径。在这一过程期间，当组合物从压出板出来时可以自动形成颗粒。在这种情况下，颗粒的长度是变化的。然而，可以影响颗粒长度，例如，如果人们利用一种如刀(例如一个或多个邻近压出板的旋转刀片)的切割方法，那么大多数(即使不是所有)颗粒将具有基本一样的长度。这样的颗粒的优选长度是至少2mm，如至少3mm。合适地，颗粒具有使它们可以“倾泻而下”(使得它们可更容易地存储和输送)的大小与含水量。一般地说，虽然大多数颗粒本质上是细长的，但是一些数颗可以是近似的球形。颗粒的优选的脂质含量是30-50％的重量百分比。
颗粒的堆积密度通常为400-1100kg/m3。
正如所讨论的，颗粒优选地是多孔的，以便使溶剂可以进入要提取的化合物中。优选地，颗粒具有空洞通道，并且这些通道可以伸展至和伸展入颗粒的中心。通道的数量可以使得以体积计40-60％(如45-55％，最适为大约50％)的颗粒是空洞(空气)。就所涉及的通道来说，它们的长度可以是其平均直径的10至20倍。一般地说，在它们的组合物中颗粒是均匀的，其中本质上颗粒外部和中心是相同的材料。这是与现有技术的酵母组合物相比而言，这些酵母组合物在外部可能是实的而在中间是空的。
可以将颗粒稳定地存储在最适于最终要提取的化合物的温度下。
干燥颗粒的优选的干物质含量是大于80％，更优选为至少85％，最优选为至少90％，最适的范围是93-97％。如果把可与水混溶的溶剂用于抽提，那么可以利用具有低干物质含量的颗粒。
因此(干燥的)颗粒通常是多孔的以便用于抽提的溶剂易于进入颗粒(的内部)。因此，在挤压和干燥期间可以减少粉末的含量(增加产率)，并且可以在抽提物蒸发之前避免(溶剂)抽提物的额外过滤。
颗粒的孔隙率取决于粒状颗粒的(水或者)干物质含量。在干燥时粒状颗粒中的水分常常蒸发掉而留下(空洞)孔隙。干燥颗粒的孔隙率优选为15至50％，如20至40％，最适为25至35％。稍后将描述孔隙率的测量方法(实施例25)。
优选地，颗粒中的大多数(即使不是所有)细胞是完整的(也就是说没有破裂)。尤其是得自霉菌生物量的颗粒可以全部是生物量颗粒，这些颗粒具有0.3至10mm的直径，优选为0.7至5mm，可选择地是1至3mm。一般地，颗粒将以所需的长度自动形成。否则可以将颗粒切成所需的长度。如果通过挤压成粒，那么挤出机的压出板的孔的大小一般与颗粒的直径相当。
可有可无地，可以在成粒过程之前或者期间加入抗氧化剂。这些抗氧化剂可以包括生育酚和抗坏血酸棕榈酸酯，例如以高达0.1％(重量百分比)的含量存在。
因此本发明可以提供生物量材料，该材料具有使化合物能够得到有效成本的和有效的抽提的特征。然后纯化、分离或者(优选地)提取所存在的化合物。本发明的方法可以使渗滤抽提方法得到利用。这一抽提方法所具有的优点似乎是由于结构和大小以及高干物质含量所致。干燥的压出物要求减少的溶剂量以便于由此产生的有价值的化合物的抽提。此外，对于压出物形式的生物量，可以更好地和更有效地实施脱溶剂烘烤方法(即，使所利用的溶剂从生物量中释放出来)。
在脱溶剂烘烤过程之后获得的压出物残渣可以有利地用作为饲料组分。
超过90至95％的压出物干物质含量使压出物的稳定存储能够进行，而高于85％的干物质含量可以在尔后的抽提过程中给出一种重要的优点。
优选地利用溶剂实施抽提。所使用的溶剂将取决于要提取的化合物，但是尤其是人们可能提及C1-10烷基酯(例如乙酸乙酯或者乙酸丁酯)、甲苯、C1-6乙醇(例如甲醇、丙醇)和C3-8烷烃(例如己烷)和/或超临界流体(例如液态CO2或者超临界丙烷)。按现有技术，溶剂直接使用在肉汤中的微生物上。然而，通过在颗粒上进行抽提，人们可以极大地减少所需溶剂的量。在本申请人的一些实验中，只需要少20至30倍的溶剂就可以进行抽提。这不仅节省大量费用，因为只利用很少的溶剂，而且它也最大限度地减少了排放问题。通过利用颗粒，可供溶剂使用的表面积可以是极高的，因此人们可以获得好的产量。
如果要提取的化合物是疏水的，那么优选利用非极性溶剂。对于亲水化合物，适合使用极性溶剂(如醇)。
可以利用各种技术进行抽提。优选的方法是利用滤器的渗滤抽提。这里，可以用干燥颗粒填满柱子。然后加入溶剂(己烷)以便覆盖颗粒。虽然溶剂可以一次穿过柱子和遍及干燥颗粒，但是优选的是使溶剂循环(作为闭合或者开放体系)。合适的是使溶剂循环三至七次，如大约五次，合适的是半小时至一个半小时的时间，如大约一小时。图3显示了合适的渗滤抽提器。在溶剂加入至包含干燥颗粒的滤过式浸出器之前，将溶剂保存在容器中。利用泵使溶剂循环。精滤器旨在于除去细粉。
可以使用其它滤过式浸出器。这些提取器可以具有逆流或者错流设计。在前者中，可以将干燥颗粒保存在分成各种扇形区的旋转圆筒(如旋转式行李输送带)中。沿一个方向使溶剂通过一个扇形区的颗粒，然后通过(优选为沿相同的方向)另一个(如相邻的)扇形区的颗粒。经常将这些机器称作旋转式抽提器，其可由德国的Krupp提供。
用另一种技术，可以将颗粒放置在例如移动的(如多孔的)带或者运输器上，这些带或者运输器沿大体上与溶剂传送方向相反的方向移动。这意味着用通过其它颗粒的溶剂提取新鲜的颗粒，以及把新鲜的溶剂运用于已用溶剂提取过的颗粒。这一安排可以最大限度地提高效率。
在错流技术中以新鲜的溶剂部分抽提分批的颗粒。
通过把粒状的颗粒或者微粒与两种或者多种微生物的混合物分离，本发明的方法也可以用来从不同的微生物中获得两种或者多种化合物的混合物。通过在发酵完成之后直接混合两种或者多种不同微生物的发酵肉汤，或者通过在成粒(例如挤压方法)之前立即混合得自两种或者多种微生物的生物量，可以获得微生物的混合物。在抽提方法之前混合两种或者多种不同的微生物压出物也是可能的。
因此按照本发明的优选方法可以描述如下a)在使得微生物可以产生所需的化合物的条件下，在合适的培养基中发酵一种或多种微生物，该发酵过程可以产生(在周围培养基中的微生物的)肉汤；b)如果必要，则沉淀或者固化化合物，如通过酸化作用；c)把肉汤中的微生物与培养基分离(通过如过滤的固/液分离可以达到这一目的)以便获得生物量；d)对得自(a)的肉汤或者得自(c)的生物量进行巴氏消毒；e)如果必要，增加生物量的干物质含量，例如通过加入干物质或者材料，或者通过减少含水量(例如用脱水或者干燥技术)；f)粉碎和/或揉捏所产生的生物量(以及，可有可无地，通过加入一种或多种干燥物质增加干物质含量)；g)使生物量成粒以便产生粒状颗粒，如通过挤压；h)干燥粒状颗粒以便产生干燥颗粒；以及i)提取一种或多种化合物，如通过利用合适的溶剂。
按照本发明分离的化合物可以具有高质量，并且可以适合用于人或者动物的营养中。按照本发明分离的包含类脂类的多不饱和脂肪酸(PUFA)尤其适合于营养目的，特别是适合于在婴儿配方中掺入。
现在将通过例子(关于通过说明提供的下列例子)描述本发明。这些例子伴随着下列附图，其中

图1是温度和干物质(％)随时间变化的图，该图显示不同量的挤压过的生物量在不同温度下的干燥特性；图2是油产率随温度变化的图，该图显示在不同温度下得自挤压产生的生物量的油的产率；图3是(已知的)渗滤抽提方法的流程图；图4是油产率随时间变化的图，该图显示提取的油量和提取时间之间的关系；以及图5和6分别是按照本发明和现有技术成粒的干燥颗粒的大小分布图。
实施例1至6被孢霉属的发酵肉汤的加工用标准Dieffenbach板式和框式压滤机(布型nycot 2794)过滤160l已巴氏消毒(68℃下1小时)(码垛堆积生长)的高山被孢霉发酵肉汤。用1.0bar的最大施加压力过滤肉汤。在20分钟之内在4.35m2的总过滤面积(其产生平均流速大约为110l/m2h的流动)上过滤160l肉汤。以大约3个滤饼的体积(≈150l)的生产用水洗涤滤饼。
回收大约30kg的大约25％干物质含量的湿饼。使用三种类型的干燥方法。
真空干燥在24小时期间在真空(大约50mbar)盘架干燥器(大约1m2干燥表面)中在真空下在35℃下干燥10kg滤饼，产生大约2.5kg的大约94％干物质含量的干燥生物量。干燥生物量由粉碎的生物量和一些大块组成。真空干燥是消耗时间的，这可能是由于大块的存在。
通风盘架干燥器在通风盘架干燥器(大约1m2干燥表面)中在35℃下在24小时期间在氮气下干燥10kg滤饼。回收总共为大约2.5kg的大约93％干物质含量的干燥生物量。干燥生物量由粉碎的生物量和一些大块组成。通风盘架干燥是消耗时间的，这可能是由于大块的存在。
流化床干燥器在大约200℃的进气温度下在AEROMATIC(MP-1类型)的实验室型流化床干燥器中干燥5kg滤饼。出气温度为大约40℃。在大约45分钟内，使湿的生物量得到干燥而产生大约1kg的大约81％干物质含量的干燥生物量。
将由该最后方法回收的干燥材料用于在六个不同的温度(此处的实施例1至6)下利用己烷提取油。在氮气覆盖下用1500ml己烷(加热至回流)抽提150g的干燥生物量90分钟。过滤细胞群，并在真空下在rotavapor(循环蒸汽)中蒸发在产生的微胶粒中的溶剂。这产生了粗糙的PUFA油。结果显示在表1中。在室温下的抽提产生了较低的产量；在升高的温度下可获得更好的产量。
表1生物量中油的抽提
富含甘油三酯的油是一种浅黄色的油，并且包含一些固体物质。
实施例7和比较实施例8被孢霉属发酵肉汤的加工在大约0.5bar的压差下在薄膜压滤器(SCHULE)中过滤500l肉汤(已巴氏消毒过的，如上述例子所描述的)。以10个饼的体积的生产用水洗涤滤饼，而后在30分钟期间在5.5bar下挤压滤饼。所产生的饼具有大约46％的干物质含量。在中试(pilot)挤出机(ODEKERKE,50mm的直径桶，压型桶)中挤压以这一方法回收的饼。压出板有10个孔，每个孔的直径为1.6mm。在大约45分钟内挤压出总计为19kg的滤饼。
在中试工厂流化床干燥器(T4 AEROMATIC 0.26m2干燥表面)中干燥以这一方法回收的压出物。在65℃下在大约45分钟内干燥压出物，产生大约85％的干物质含量(实施例7)。
在相同实验期间，一些滤饼没有得到挤压(比较实施例8)，并使之在40℃下在真空盘架干燥器中干燥。干燥十分消耗时间的，因为大块的存在。
利用己烷抽提上述两种材料。发现这些材料具有下列特征干燥压出物 主要是小球(实施例7) 相当容易的抽提方法真空干燥的生物量小球和块，许多细粉(比较实施例8)困难的抽提方法；不良的过滤性质实施例9和10利用下列挤出机进行利用与实施例7相同的肉汤的挤压实验LALESSE(Arnhem，荷兰)在实施例9中利用LALESSE单螺杆通用挤出机。这种类型的挤出机通常用于小吃食品的生产。首先将磨过的玉米(干物质含量为大约95％)作为试验材料来供料，并在一定压力和加热条件下挤压玉米；一次性从压出板膨胀压出压出物。
这类挤出机的桶是一种压型桶以便转运处理过的玉米。用于挤压的螺杆的类型取决于所处理的材料的类型。螺杆是通用的直径为48mm的转运螺杆或者压缩螺杆。LALESSE机器是7.5Kw中试机器(以额定功率驱动)。所需的机器总功率是12.1Kw。可以加热或者所冷却挤出机的桶。在生物量的挤压期间利用具有1至多达4个孔的和1.8、2.0和2.2mm直径的压出板。
产生被孢霉属生物量(冷却的桶)的能力是大约40kg/h。在挤压过程中，压出板中的孔的长/直径(L/D)比是变化的。
ALMEX(Zutphen，荷兰)在实施例10中，利用实施例7的被孢霉属生物量，利用ALMEX公司的膨胀挤出机。这类挤出机用于生产宠物食品。它具有平滑的带栓的桶，这些栓使得生物量的转运能够进行。这些栓具有与在LALESSE挤出机的桶中的侧面相同的作用。膨胀挤出机的螺杆是一个调制螺杆。技术数据ALMEX Contivar 150L/D为10(螺杆的长度和直径的比)最大螺杆速度为180rpm22Kw(以额定功率驱动)螺杆直径为150mm用自来水冷却压出板3个圆环形孔，每孔直径为1.8mm在加工期间将生物量的温度升至大约25℃。机器的生产能力是每小时大约250kg被孢霉属压出物。
比较实施例11以不同方法实现的固/液分离的比较滗析器在‘FLOTTWEG’滗析器(Z 23-3/441型)中滗析得自高山被孢霉的发酵的350l肉汤。速度设置为大约4000rpm。在操作期间差速度范围变化于7.5-20rpm。
进料速度设置为400l/h。不洗涤生物量。滗析总计为350l的肉汤。进料的温度是8℃，上清液的温度为15℃。所回收的生物量的干物质含量是大约25％。
滗析器+真空鼓式过滤机在5001生产用水(其中溶解有10kg NaCl)中悬浮20kg的干物质含量为25％的生物量(得自上述滗析实验)。在具有带式卸料的真空鼓式过滤机(PAXMAN，布型865.912K/5 polyprop)上过滤所产生的浆液，而无需进一步洗涤。转鼓的速度设置为1rpm，并且压差设置为600mbar的最大值。在15分钟之内过滤出总计400l的肉汤。滤面净面积是大约0.3m2，这产生了5000l/m2h(滤面)的平均流速。过滤速度是很好的，但是“饼的成型”是相当差的。所回收的过滤过的生物量的干物质含量是大约35％。
板式和框式压滤机在板式和框式压滤机(标准的R&B，布型nycot 2794)中过滤5001肉汤。以0.3bar的压差过滤肉汤。在5m2的总过滤面积上在35分钟之内过滤出5001肉汤，这产生了+175l/m2h的平均流速。以大约2.5个滤饼的体积的生产用水洗涤滤饼30分钟，这产生了400l/m2h的平均流速。
用30分钟以空气吹干滤饼，这产生了大约25％的所回收的生物量的干物质含量。
薄膜压滤机在薄膜压滤机(SCHULE，布型propex 46K2)中过滤7001肉汤。以0.3bar的压差过滤肉汤。在6.8m2的总过滤面积上在30分钟之内过滤出7001肉汤，这产生了大约205l/m2h的平均流速。
以3个滤饼的体积(≈300l)的生产用水洗涤滤饼7分钟，这产生了375l/m2h的平均流速。
相比于板式和框式压滤机，薄膜压滤机的优点是过滤之后的饼可以在高压下挤压，因此饼的干物质含量将增加。在30分钟期间以5.5bar挤压滤饼，这产生了大约45％的所回收的生物量的干物质含量。
在另一个实验中，在薄膜压滤机(SCHULE，布型propex 46K2)中过滤11001肉汤。以0.3bar的压差过滤肉汤。在12.3m2的总过滤面积上在45分钟之内过滤出1100 1肉汤，这产生了大约120l/m2h的平均流速。以3个滤饼的体积(≈600l)的1％NaCl溶液洗涤滤饼18分钟，这产生了162l/m2h的平均流速。
在30分钟期问在6bar下挤压滤饼，这产生了大约55％的所回收的滤饼的干物质含量。
滤饼的挤压以及洗涤(用1％盐溶液)对滤饼的干物质含量有极大的影响。
实施例12不同干物质含量的生物量的挤压对不同干物质含量的生物量进行挤压，该生物量由实施例7中提出的方法获得(参见表2)。利用具有压型桶和通用螺杆的单螺杆挤出机实现挤压。用于挤压的压出板具有不同数量的孔，并且孔的直径在2mm的范围内。
在挤压之后获得的颗粒的直径是大约2mm。
效率和压出物的质量取决于用于挤压的生物量的干物质百分含量。虽然25％的干物质产生最差的结果，但是对于其它微生物来说，这样一种低干物质含量是可以接受的。
表2不同干物质含量的生物量的挤压实验的结果<
>实施例13和14以及比较实施例15常规的以及挤压的高山被孢霉的生物量的干燥真空干燥在真空盘架干燥器中干燥以常规方法回收的生物量(比较实施例15，不挤压)，但是在40℃下用了大约50小时。这一干燥过程是十分缓慢的，因为大块的存在。用这一方法干燥的生物量的干物质含量是大约92.5％。
为了比较，在循环蒸汽中在实验室型干燥器上干燥大约20g具有55％干物质含量的压出物(得自实施例11，颗粒直径为2mm)。水浴的温度是68℃，施加的压力为40mbar。除干燥生物量粘贴到壁上和渗出少量油以外，干燥的效率是合理的。干燥之后的干物质含量是92.3％。
流化床干燥在实施例13中在不同温度下对生物量(实施例1)进行干燥。当没有对生物量进行预处理时，不能完全干燥大块的生物量。在这种情况下，就颗粒大小来说干燥生物量是十分不均匀的。
如果在干燥之前由挤压来预处理生物量，那么将极大地提高干燥效率。在这种情况下，干燥生物量的颗粒大小是更一致的。
这些结果的结论是可以对以不同形式分离得到的生物量进行流化床干燥，但是利用压出物可以改善干燥。
在另一个实验(实施例14)中，用空气(8000Nm3/m2h)在流化床干燥器中对不同数量(15和30kg)的压出物进行干燥。在干燥期间，取样并计算干物质含量。在图1中显示了(两个)不同数量的干物质含量和温度之间的关系。
床温设置为80℃。挤压所得的生物量的直径是1.3mm。挤压的生物量在干燥之后的干物质含量是大约96％。
实施例16高山被孢霉的干燥压出物的脂质的抽提在不同温度下的干燥压出物的搅拌抽提以500ml己烷或者500ml丙醇-2，(对于己烷)在20℃、35℃和50℃温度下，(对于丙醇-2)在20℃、40℃和70℃温度下，在3小时期间提取100g干燥压出物(干物质含量分别为93.4％和97.8％)的样品。在“四颈”圆底烧瓶中用两叶片搅拌器搅拌浆液，并用加热罩加热该浆液。最后借助于回流冷却器再循环蒸发的己烷或者丙醇-2。
在抽提期间，在搅拌器停止以及颗粒已经沉降之后每30分钟从烧瓶中取15ml上清液样品。用移液管吸移1ml样品至预称重的2ml的微量离心管中。在40℃下在真空下干燥一夜之后称重微量离心管，并计算总油量。实验结果如图2所示。
已烷抽提的结论-温度对可以提取的脂质的总量没有影响，即相对较低的提取温度产生好的脂质产量，-温度只对提取全部脂质所花费的时间有小的影响，-在20℃以上的温度下在30分钟内可用5体积己烷从生物量中提取全部脂质。
丙醇-2抽提的结论-温度对可以提取的脂质的总量有极大的影响，-温度对提取全部脂质所花费的时间有极大影响，-在73℃下在2小时内可用5体积丙醇-2从生物量中提取全部脂质。
油的组成取决于用于抽提的溶剂(参见表3)。提取溶剂的极性越强，就能抽提越多的磷脂。可以选择溶剂的极性以便优化油的组成。
表3利用两种不同的溶剂在室温下对干燥的被孢霉属生物量的抽提
通过微胶粒的过滤大规模地观察到问题，这是由于压出物因抽提过程期间的高搅拌器速度而破碎成为小颗粒所致。
利用渗滤抽提替代搅拌抽提可避免这些问题。
利用己烷的干燥压出物的渗滤抽提在中试规模上实现几个渗滤抽提过程(参见该方法的流程3)。在20℃下以己烷(初始的己烷/生物量比率为4.4l/kg)提取大约40-45kg的干燥的挤压的生物量。齿轮泵的流速设置为1.5m3/h。在大约0.1bar的存储容器上有少量氮清洗。
在4小时期间实现抽提(在抽提期间温度从18℃升至25℃)。每30分钟从微胶粒中取一次样品。在真空(大约50mbar)下在20分钟期间在循环蒸汽中在实验室型仪器中使每种样品蒸发100ml(水浴温度为64℃)。估算油量。结果显示在图4中。可以注意到在2小时之后达到一种“平衡”。然后，以大约0.6床体积的己烷洗涤所提取的生物量。在抽提期间床的高度不发生变化。
在蒸发之前精过滤微胶粒。在抽提期间我们注意到微胶粒变得越来越清晰，这是由于在颗粒的床上的深度过滤所致。
实施例17和比较实施例18三孢布拉霉的β-胡萝卜素油的回收利用实验室过滤设备收获10l预先巴氏消毒(15分钟，75℃)的三孢布拉霉菌的发酵肉汤。为了提高肉汤的过滤本领，加入CaCl2(5g/l的终浓度)。利用典型的水果榨汁机(柑橘榨汁机，HAFICO D.G.M)，在实验室中使以这一方法回收的生物量机械脱水(挤压)至45％的干物质含量。借助于装备有压出板(有4个孔，每孔直径为1.8mm)的不锈钢注射器挤压以这一方法回收的饼。在实验室流化床干燥器中干燥产生的压出物(空气温度为40℃，干燥时间为90分钟，气流速度为150Nm3/h,AEROMATIC MP-1)。以这一方法干燥的生物量的干物质含量是大约95％。
以乙酸乙酯(初始体积/生物量的比率为30l/kg)利用渗滤抽提提取大约50g的干燥压出物的样品。在50℃下的2小时抽提之后，借助于真空抽滤收获抽提物。以1个床体积的乙酸乙酯洗涤生物量。在蒸发之前用软化水(抽提物/水的比率为5v/v)将以这一方法回收的抽提物洗涤两次。在50℃(水浴温度)下蒸发乙酸乙酯直到达到8gβ-胡萝卜素/l的浓度。
借助于可控制的结晶和尔后的过滤，从浓缩液中回收β-胡萝卜素晶体。
用得到混和和干燥的以及没有挤压过(实施例18)的生物量实现相同的实验。在混合的干燥生物量的抽提之后，与干燥压出物相比其过滤本领较差。
实施例19和比较实施例20TAPS与毕赤酵母属酵母的干燥压出物的分离10分钟期间用5000rpm的离心收获来源于2l的没有巴氏消毒过的Pichia ciferrii酵母发酵肉汤的生物量。用包含5％NaCl的盐溶液洗涤固相滤饼。在实验室中利用典型的水果榨汁机(HAFICO,D.G.M)使以这一方法回收的具有33％干物质含量的生物量机械脱水。在一分钟期间以200kg/cm2使饼脱水。
干物质含量已增加至47％。借助于单螺杆实验室挤出机(利用通用螺杆和压型桶)挤压脱水的饼(实施例19)。压出板中的孔的直径是2mm。在40℃下在40小时期间在真空下干燥所产生的压出物，结果产生大约92％的干物质含量。在50℃下在6.5小时期间用乙酸乙酯(生物量/溶剂的比率为1∶5(w/v))提取25克干燥的压出物。
在真空(250mbar)下在50℃下蒸发以这一方法回收的抽提物，结果产生TABS油(大约60％四乙酰基植物鞘氨醇/l油)。
包含TABS的Pichia ciferrii的喷雾干燥(比较实施例20)在180℃(进气温度)和110℃(出气温度)的空气温度下，在Buchi190实验室喷雾干燥器中喷雾干燥大约1kg的Pichia ciferrii肉汤。在喷雾干燥的加料期间连续不断地搅拌肉汤。以1.2l/h将肉汤加料于干燥器中。在喷雾干燥产物中分析初始量TAPS的TAPS浓度。在喷雾干燥产物中仅有13％的TAPS得到回收。由于高温使TAPS降解。由于其高的处理温度所以不能选择这一方法用于TAPS的分离。
实施例21从Crypthecodinium的DHA油的回收利用BECKMAMN JM/6E型的实验室离心机收获来源于7l的藻类Crypthecodinium cohnii发酵肉汤(预先在65℃下巴氏消毒过1小时)的生物量。在2分钟期间以800ml的份量以5000rpm离心肉汤，结果产生清晰的上清液。
回收总计为224g的干物质含量为13％的生物量。这意味着在发酵肉汤的收获物中的生物量浓度为大约4g/kg。为了回收这一生物量，加入300g淀粉(ROQUETTE，批号10EV0024)的)以便增加干物质含量。借助于单螺杆实验室挤出机(利用通用螺杆和压型桶)挤压以这一方法回收的饼。压出板中的孔的直径是2mm，压出板的厚度是6mm，结果使压出板的L/D为3。在50℃下在真空下使所产生的光滑的压出物干燥一夜，结果产生有小裂缝的干燥压出物。以这一方法干燥的生物量的干物质含量是大约94％。
以己烷(初始的体积/生物量比率为5l/kg)提取大约180g的干燥压出物的样品。在3小时的抽提之后在60℃下在Whatman滤器上过滤微胶粒。以1000ml新鲜己烷一次性洗涤所提取的生物量。在68℃(水浴温度)下蒸发以这一方法回收的过滤微胶粒。用这一方法回收粗糙的包含DHA的油。油中的DHA的浓度是32.6％(由GC分析得到)。以这一方法回收的油包含大约67％的甘油三酯、12％的甘油二酯、3.7％的甾醇以及大约0.2％的消泡剂(NMR)。该油的另一特征是类胡萝卜素的水平(0.15mg/mlβ-胡萝卜素以及5mg/mlγ-胡萝卜素)。
实施例22丙酸杆菌种(Propionibacterium sp.)的维生素B12的回收借助于BRPX-213-SGV型(ALFA LAVAL,3-7吨/小时)的澄清器在大约5000的G-因子下，收获来源于丙酸杆菌种(28吨)的大量发酵的肉汤。借助于超滤利用ABCOR KOCH模块利用具有5kD截断值(HFK131-VSV型)的150m2螺旋形聚乙烯砜薄膜，使以这一方法澄清的肉汤浓缩2.5倍。用生产用水将所产生的超滤滤液渗滤为500％(按照浓缩体积)。借助于真空蒸发使所产生的渗滤滤液浓缩3倍，使所产生的浓缩液在90℃下热震荡2分钟。
使所产生的浓缩物成粒并在NIRO250多级干燥器(流化床喷雾干燥器/附聚机)中使之干燥。干燥器的进气温度为大约250℃，出气温度为大约70℃。所施加的空气流速为大约3000m3/h。这产生了大约70-80℃的产物温度。供给干燥器的浓缩物的密度是大约1050kg/m3。
将大约2g的干燥颗粒的样品用于抽提，该抽提利用125ml的大约75％的乙醇(该含水量产生最适的抽提/技术性能)在锥形瓶中借助于搅拌在60分钟期间在环境温度(清晰的抽提物)下进行。在抽提之后，利用Whatman纸滤器过滤所提取的生物量(容易的过滤)。分析发现以这一方法回收的清晰的粉红滤液是维生素B12。以25ml的大约75％的乙醇洗涤所产生的生物量。用这一方法可从粒状的生物量中提取大约90％的维生素B12(表4)。
表4与来源于多级附聚的丙酸杆菌的维生素B12的抽提有关的数据
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实施例23Crypthecodinium cohnii和高山被孢霉的共挤压把101高山被孢霉菌的发酵肉汤与10 I Crypthecodinium cohnuii的发酵肉汤混合在一起。为了提高混合的肉汤的过滤本领，加入CaCl，(5g/l的终浓度)。过滤混合的肉汤，并利用典型的水果榨汁机(柑橘榨汁机，HAFICO)使所产生的饼机械脱水。
借助于单螺杆实验室挤出机利用在压型桶中的通用传输螺杆和一个2mm孔的压出板挤压以这一方法回收的饼。压出物的直径是大约2mm。在实验室流化床干燥器(气温为40℃，干燥时间为大约一小时，气流速度为150Nm3/h,AEROMATIC MP-1)中干燥以这一方法回收的压出物。以这一方法干燥的生物量的干物质含量是大约92％。
将大约100g的干燥压出物的样品用于利用己烷(初始的体积/生物量比为4l/kg)的抽提。在环境温度下抽提2小时之后，借助于真空抽滤回收微胶粒。以4体积新鲜的己烷(初始的体积/生物量比为4l/kg)洗涤余下的提取过的压出物。将洗涤过的己烷与微胶粒混合，并在50℃(水浴温度)下蒸发所产生的微胶粒。用这一方法回收粗糙的PUFA油，该油包含ARA(C20:4ω6)和DHA(C22:6ω3)。
可以通常用于精炼食用油/植物油的方法精炼粗糙的油。
实施例24土曲霉的粗糙的洛伐他汀的回收用硫酸将7.5l土曲霉的(没有巴氏消毒过的)发酵肉汤(每千克肉汤包含2g洛伐他汀)的pH调整为pH2.1，以便沉淀洛伐他汀，并在这一pH下搅拌该肉汤15分钟。其后过滤肉汤，并丢弃滤液(仅仅包含存在在肉汤中的洛伐他汀总量的3.5％)。
利用典型的水果榨汁机(柑橘榨汁机，HAFICO)使湿滤饼(230g,18.5％干物质)机械脱水至干物质含量为45％，其后借助于装备有压出板(包含四个孔，每孔直径为1.8mm)的不锈钢注射器挤压该滤饼。在真空烘箱中在40℃下历时一夜使所产生的压出物干燥至大约95％的干物质含量。在环境温度下在15分钟期间用1l甲苯(0.85L)和丙酮(0.15L)混合物提取10g干燥压出物。在压出物由过滤分离之后，获得洛伐他汀含量为1.5g/l的包含洛伐他汀的抽提物。
实施例25市售的FERMIPAN的麦角固醇的回收FERMIPAN是由Gist brocades生产的市售的干燥酵母。在环境温度下在30分钟期间借助于100ml的70％的乙醇提取大约2克的FERMIPAN样品(批号9510702)。借助于过滤把所产生的清晰的抽提物与提取出来的FERMIPAN分离。借助于NMR分析以这一方法回收的清晰滤液。在大约22g的抽提物中发现0.09mg麦角固醇。在麦角固醇的抽提中重要的是乙醇中的含水量。这一浓度并不是最适的。上述实验是一个指示性实验，该实验显示了有价值的化合物麦角固醇从粒状的(挤压过的干燥酵母)酵母中的抽提。
实施例25粒状的/挤压的生物量的优点按照在实施例1中所描述的方法(过滤、挤压和干燥)处理PUFA生物量。
用2000孔度计(Pharmitalia Carlo Erba，意大利)和一个(CarloErba)大孔(macroporse)单位120测量干燥的挤压过的PUFA生物量的孔隙率。结果如表5所示。
孔量分布显示在图5中。作为比较，图6给出了干燥酵母(FERMIPAN,Gist-brocades)的孔量分布。
线(用左边的Y轴)显示累积的孔量，直方图(用右边的Y轴)是相对有差别的孔量的分布。这表明大多数孔隙出现在10,000-100,000nm孔隙直径的区域中。
表5相同PUFA挤压的干燥的生物量的孔隙率测量(汞孔隙率方法)的结果
用错流渗滤抽提方法在环境温度(20℃)下借助于己烷在柱中抽提81g的干燥的挤压的PUFA生物量，以便获得PUFA油。使十三个床体积的新鲜己烷(一个床体积是淹没整个床所需要的己烷的数量)流过生物量的床。在己烷蒸发之后，测定在流过的每床体积的己烷中的原油重量。
抽提的条件-生物量床的颗粒内部体积是80ml(=1个床体积)。
-流速为每300秒1个床体积。
-以一个床体积在300秒内可提取全部油的50％。
-干燥生物量的堆积密度是570kg/m3。
-颗粒直径是0.0025m。
-抽提温度为20℃。
-油在己烷中的溶解能力是无限的。
-生物量的含油量为35.5w/w(％)。
在真空条件下在60℃(水浴温度)下在实验室条件下在循环蒸汽中蒸发己烷，从而产生PUFA。所描述的PUFA颗粒(干燥的压出物)是多孔的均匀颗粒，这对于抽提是理想的。有大的表面积可供油的交换使用。因此，扩散对抽提的限制是小的。
比较实施例26现在将在下列的表中给出用来获得生物量和肉汤(在上述实施例中描述的)的各种培养条件。
表(续)
表(续)
<p>表(续)
关于发酵技术的参考文献Maister H.G.,Rogovin S.P.,Stodola F.H.,Wickerham L.J.，“微生物的胞外鞘脂类的形成。Ⅳ．西弗汉逊酵母的四乙酰基植物鞘氨醇的中试工厂生产”。
应用微生物学，10,401-406。(1962)Zu-Yi Li,Yingyin Lu,YadwadV.B.,Ward O.P.，“由高山被孢霉菌株生产花生四烯酸浓缩物的方法”。
Can.J.Biochem.Eng.73,135-139(1995)Finkelstein M.,HuangC-C.,Byng G.S.,Tsau B-R.,Leach J.，“能够增加β-胡萝卜素产量的以三孢布拉霉为垫的培养物”美国专利5,422,247(1995)。
Kojima I.,Kouji K.,Sato H.,Oguchi Y.，“由发酵技术生产维生素B12的方法，以及产生维生素B12的微生物”。美国专利4,544,633(1985)。
Kyle D.J.,Reeb S.E.,Sicotte V.J.，“由甲藻生产二十二碳六烯酸”。美国专利5,407,957(1995)。
权利要求
1．一种把一种或多种化合物与微生物生物量分离的方法，该微生物生物量包含已产生这样的化合物的微生物，该方法包括a)提供或者获得干物质含量为25至80％的生物量；b)使所说生物量粒化成为平均干物质含量为25至80％的粒状颗粒；c)干燥所说粒状颗粒从而形成平均干物质含量至少为80％的干燥颗粒；以及d)从得自(c)的干燥颗粒中纯化、提取或者分离上述或者每种化合物。
2．按照权利要求1或者2的方法，其中在(b)中的制粒过程是通过挤压所说的生物量实施的。
3．按照权利要求2的方法，其中在成粒之前使所说生物量得到粉碎或者揉捏。
4．按照上述权利要求之任一的方法，其中通过对发酵肉汤进行固/液分离来获得(a)中的生物量。
5．按照权利要求4的方法，其中使上述固/液分离与机械脱水相结合。
6．按照上述权利要求之任一的方法，其中在(a)中干物质含量为25至80％的生物量是通过以下方法获得的ⅰ)在所说生物量中加入固相物质；或者ⅱ)使所说生物量脱水。
7．按照上述权利要求之任一的方法，其中通过流化床或者辅助流化床干燥或者真空干燥对(c)中的粒状生物量进行干燥，使其干物质含量至少为80％。
8．按照上述权利要求之任一的方法，其中所说生物量包含或者来源于真菌。
9．按照权利要求8的方法，其中所说真菌属于毛霉目。
10．按照权利要求9的方法，其中所说真菌属于被孢霉属。
11．按照权利要求8至10之任一的方法，其中所说真菌是高山被孢霉。
12．按照权利要求1至6之任一的方法，其中所说生物量包含或者来源于藻类。
13．按照权利要求12的方法，其中所说藻类是甲藻和/或属于Crypthecodinium属。
14．按照权利要求12至13之任一的方法，其中所说藻类是Crypthecodinium cohnii。
15．按照上述权利要求之任一的方法，其中所说化合物是可有可无地包含在脂质中的多不饱和脂肪酸(PUFA)。
16．按照权利要求15的方法，其中所说多不饱和脂肪酸是C18、C20或者C22ω-3或者C18、C20或者C22ω-6多不饱和脂肪酸。
17．按照权利要求16的方法，其中所说化合物是C20或C22ω-3或者C20或C22ω-6多不饱和脂肪酸。
18．按照上述权利要求之任一的方法，其中所说化合物是花生四烯酸(ARA)、二十碳五烯酸(EPA)和/或二十二碳六烯酸(DHA)。
19．按照权利要求8的方法，其中所说真菌属于须霉属、布拉霉属或者曲霉属。
20．按照权利要求1至13之任一的方法，其中所说化合物是类胡萝卜素或者HMG-CoA还原酶抑制剂(例如洛伐他汀、普伐他汀或者compactin)。
21．按照上述权利要求之任一的方法，其中所说微生物是酵母。
22．按照权利要求21的方法，其中所说化合物是四乙酰基植物鞘氨醇(TABS)。
23．按照上述权利要求之任一的方法，其中所说微生物是细菌。
24．按照权利要求23的方法，其中所说化合物是维生素。
25．按照上述权利要求之任一的方法，其中所说生物量得自酸化作用(如达到pH＜5)之后的发酵肉汤。
26．按照权利要求25的方法，其中所说酸化作用(例如达到pH为大约2)导致化合物的沉淀。
27．一种包含或者来源于真菌的微生物压出物。
28．按照权利要求27的压出物，其中所说真菌属于被孢霉属。
29．一种包含生物量的粒状颗粒的组合物，其中所说颗粒具有至少30％但不到70％的平均干物质含量并且得自成粒的生物量。
30．一种包含干燥颗粒的组合物，其中所说颗粒来源于微生物生物量并得到干燥，并且具有至少80％的平均干物质含量。
31．按照权利要求30或者31之任一的组合物，其中所说粒状颗粒或者干燥颗粒由挤压形成。
32．按照权利要求29至31之任一的组合物，其中所说生物量包含真菌。
33．按照权利要求29至32之任一的组合物，其中所说粒状颗粒的直径为0.3-10mm，同时它们的长度平均为颗粒的直径的2至6倍。
34．由按照权利要求1至26之任一的方法分离、提取或者纯化的化合物用于制备食品组合物、营养添加剂、化妆品和/或药物组合物的用途。
35．按照权利要求34的用途，其中所说食品组合物包含婴儿配方。
36．一种用于把一种或多种化合物与生物量的颗粒分离的方法，该方法包括a)提供干物质含量至少为80％的干燥颗粒，所说颗粒得自包含产生这样的化合物的微生物的微生物生物量；以及b)从由溶剂提取的干燥颗粒中提取或者分离上述或者每种化合物。
全文摘要
本发明公开了把所需的化合物与微生物生物量分离的方法,其中包括使微生物生物量(如果必要,预处理该微生物生物量使之成为25至80%的干物质含量)成为粒状(例如通过挤压),然后使之干燥为至少80%的干物质含量。将所说生物量形成颗粒可使尔后的生物量(其可以作为干燥的颗粒储存)干燥过程十分易于进行并且可形成高产率的化合物提取物。
文档编号C11B1/02GK1226923SQ97194211
公开日1999年8月25日 申请日期1997年3月21日 优先权日1996年3月28日
发明者H·L·比尔, A·沙普, J·M·J·维瑟 申请人:吉斯特-布罗卡迪斯股份有限公司