专利名称：一种制备乳清蛋白水解物的方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种制备乳清蛋白水解物的方法。
背景技术：
超高压技术作为新型非热加工技术之一，能在常温或者较低温度下实现杀菌、灭酶地目的，并保持食品或原材料中天然的营养成分及良好的感官特性，还可产生出传统热加工无法比拟的新的物化特性。此外，超高压技术还具有高效节能、保护环境等特点。作为一种半工业化方法，超高压技术作用于蛋白溶液时可以使蛋白链变得更加伸展，进而暴露更多的酶切位点而有利于水解反应的进行，还可能产生一些新的具有特殊生理活性的功能性肽。因此，超高压技术被公认为是一种最具潜力和发展前景的食品加工与保藏新技术，受到了广泛关注与研究。酶解技术是一种用于改善食物中的蛋白质，以获得更有价值和用途的产品的重要手段之一。在酶解过程中，可释放出小分子的蛋白质及肽段，使得蛋白质的营养品质和安全性得到改善。近年来，酶解制备抗氧化活性肽的研究得到广泛的关注，已有从牛奶、鸡蛋、肉类、鱼类，以及大豆、小 麦和玉米等多种动植物中分离抗氧化活性肽的报导。乳清是乳品工业生产干酪及干酪素的副产物，全世界每年生产乳清约8000万吨，且正以每年2.0%的速度增长。乳清蛋白具有营养价值高、易消化吸收、含有多种活性成分、具有很高的代谢效率和生物学价值等特点，是公认的人体优质蛋白质补充剂之一，因而又被称为蛋白之王。近年来的研究发现，乳清蛋白及其水解产物具有一定的抗氧化活性，如月旨质过氧化抑制作用、氧自由基吸收能力和自由基清除活性等。因此，开发利用乳清蛋白，不仅能提供营养丰富、生理功能卓越的各种保健食品、化妆品及抗氧化药物，而且能够缓解乳品企业的环境污染，提高乳清产品的附加值，实现经济、社会和生态效益的有机结合。
发明内容
本发明的目的是提供一种制备乳清蛋白水解物的方法。本发明提供的方法，包括如下步骤:将乳清蛋白在超高压和蛋白酶的联合作用下进行酶解反应，收集酶解产物即得到乳清蛋白水解物。在上述方法中，所述蛋白酶为碱性蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、风味蛋白酶、复合蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶或酸性蛋白酶；所述蛋白酶具体为碱性蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、中性蛋白酶或酸性蛋白酶。在上述方法中，所述将乳清蛋白在超高压和蛋白酶的联合作用下进行酶解反应的方法为如下A或B:A包括如下步骤:I)将所述乳清蛋白溶于缓冲液中，得到乳清蛋白溶液；2)将步骤I)得到的乳清蛋白溶液与所述蛋白酶混匀后在超高压条件下同时酶解，得到酶解产物；B包括如下步骤:a)将所述乳清蛋白溶于缓冲液中，得到乳清蛋白溶液；b)将步骤a)得到的乳清蛋白溶液进行超高压处理，得到预处理产物；c)将步骤b)得到的预处理产物与所述蛋白酶混匀后酶解，得到酶解产物。在上述A和B中，所述超高压的压力为100MPa_600MPa ;所述超高压的压力具体为400MPa ；在上述A和B中，所述蛋白酶和所述乳清蛋白的质量比为0.05.1。其中，上述酶解的温度为35 °C -60 °C ;所述缓冲液为浓度为0.05M-0.1M、PH7.0-8.5的Tris-HCl缓冲溶液或浓度为0.05M-0.1M、pH2.2-3.0的柠檬酸缓冲液；上述蛋白酶为碱性蛋白酶Alcalase、胰凝乳蛋白酶Chymotrypsin、中性蛋白酶ASl.398或酸性蛋白酶Pepsin ；在上述A和B中，上述碱性蛋白酶Alcalase的酶解温度及对应的缓冲液分别50°C _60°C和浓度为0.05M-0.1Μ、ρΗ7.5-8.5的Tris-HCl缓冲溶液；上述碱性蛋白酶Alcalase的酶解温度及对应的缓冲液分别具体为55°C和浓度为0.05M、pH8的Tris-HCl缓冲溶液；上述胰凝乳蛋白酶Chymotrypsin的酶解温度及对应的缓冲液分别为40°C -50°C和浓度为0.05-0.1M、p H7.5-8.5的Tris-HCl缓冲溶液；上述胰凝乳蛋白酶Chymotrypsin的酶解温度及对应的缓冲液分别具体为40°C和浓度为0.05M、pH8.5的Tris-HCl缓冲溶液；上述中性蛋白酶ASl.398的酶解温度及对应的缓冲液分别为40 55°C和浓度为0.05 0.1Μ、ρΗ7.0 8.0的Tris-HCl缓冲溶液；上述中性蛋白酶ASl.398的酶解温度及对应的缓冲液分别具体为45°C和浓度为0.05M、pH7.0的Tris-HCl缓冲溶液；上述酸性蛋白酶P印sin的酶解温度及对应的缓冲液分别为35 40°C和浓度为0.05 0.1Μ、ρΗ2.2 3.0的柠檬酸缓冲液；上述酸性蛋白酶P印sin的酶解温度及对应的缓冲液分别具体为37°C和浓度为0.05M、pH2.2的柠檬酸缓冲液。上述A和B中，所述酶解时间和所述超高压预处理的时间均为30min-120min。在上述A所示的方法的步骤2)中和B所示的方法的步骤c)中，在所述酶解的步骤后还包括将所述酶解产物依次进行超滤离心和凝胶过滤层析得到乳清蛋白水解物的步骤；其中超滤离心包括如下步骤:先将所述酶解产物进行截留分子量为IOkDa的超滤离心收集透过液1，再将所述透过液I进行截留分子量为3kDa的超滤离心，收集透过液2 ;其中凝胶过滤层析包括如下步骤:将所述透过液2经凝胶过滤色谱柱分离，收集保留时间为300min-410min的分离产物，得到乳清蛋白水解物。在上述超滤离心中，所述离心的离心力均为3000g_4000g，所述离心的时间均为10min_30min ；在上述凝胶过滤层析中，所述凝胶过滤色谱柱为S印hadex G_25，所述洗脱液为经过0.22um膜过滤的去离子水；所述凝胶过滤的流速为0.3mL/min-0.8mL/min,所述凝胶过滤的检测波长为214nm或220nm。
在上述方法中，在所述酶解产物进行超滤离心的步骤前，还包括将所述酶解产物依次进行灭活酶、离心取上清液、冷冻干燥的步骤；上述灭活酶的温度为100°C，灭活酶的时间为IOmin ;上述离心力为lOOOOg，上述离心时间为30min。由上述方法得到的乳清蛋白水解物也是本发明保护的范围。上述的乳清蛋白水解物在制备具有抗氧化活性功能产品中的应用也是本发明保护的范围。上述抗氧化活性具体体现提高超氧阴离子清除能力。本发明的实验证明，以乳清蛋白为原料，将超高压技术与酶技术联用，在高压处理中和高压处理后，分别对乳清蛋白进行酶解处理，制备具有高抗氧化活性的乳清蛋白酶解产物。并进一步将上述乳清蛋白酶解产物采用超滤离心、凝胶过滤色谱、MALD1-TOF MS及nano-LC/MS/MS分离纯化后，得到具有高抗氧化活性的乳清蛋白单一活性肽段。利用本发明所生产的乳清蛋白抗氧化活性肽，能够有效清除自由基，因此具有提高食品稳定性、延长食品货架期、延缓机体衰老及减少氧化损伤等特点。本发明不仅能够增加乳清产品附加值，实现干酪加工副产物的综合利用，而且在食品、化妆品及医药等领域中具有广阔的应用前景。
图1为不同高压处理下碱性蛋白酶Alcalase对WPI的水解作用。图2为高压处理中与高 压处理后WPI的Alcalase酶解产物的抗氧化活性。(A)高压处理中WPI酶解产物；⑶高压处理后WPI酶解产物。图3为WPI酶解产物不同超滤组分超氧阴离子自由基清除活性。图4为WPI酶解产物超滤离心分离所得组分III的S印hadex G-25凝胶色谱图；(A)经S印hadex G_25凝胶过滤色谱所得不同峰组分的超氧阴离子清除活性；(B)组分III的Sephadex G-25凝胶过滤色谱图。
具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。下述实施例中的乳清蛋白(WPI)选用美国Le Sueur Cheese公司的牛乳清分离蛋白(WPI)，蛋白含量> 95% (w/w)，产品注册商标:BiPRO 。实施例1、超高压技术与酶技术联用制备乳清蛋白酶解产物一、超高压技术与碱性蛋白酶联用得到酶解产物方法一:高压处理中水解1、WPI溶液的制备5% (质量百分含量)的WPI溶液:将WPI溶于0.05M、ρΗ8.0的Tris-HCl缓冲溶液(称取6.06g Tris，量取2.63mL浓盐酸，加水充分溶解并混匀后，定容至1L)中得到的混合液，使WPI在混合液中的浓度为5 % (质量百分含量)。2、WPI溶液的超高压处理中水解将上述I得到的20mL 5% (质量百分含量)的WPI溶液(0.05M Tris-HCl缓冲溶液，pH8.0)，装在聚氯乙烯塑料袋中，按照酶与底物浓度比E/S = 5.0% (w/w)添加碱性蛋白酶Alcalase (丹麦诺维信公司；产品批号:PLN05355)，密封，迅速混匀并置于超高压容器中进行水解反应。各样品的处理压力依次为100、200、300、400、500和600MPa，保压时间30min,反应温度为55°C。水解反应结束后均迅速置于沸水浴中灭酶IOmin,冷却后IOOOOg离心30min，取上清液冷冻干燥，获得不同压力下的WPI酶解产物粉末。将上述得到的不同压力下的WPI酶解产物粉末的酶解特性用水解度(DH)来表征，水解度(DH)的测定米用Nielsen和Petersen的方法(参考文献:Nielsen P M, PetersenD,Dambmann C,Improved method for determining food protein degree of hydrolysis.Journal of Food Science, 2001,66 (5):642-646.),其水解度的计算公式如下:DH = h/htotX 100%(公式 I)式中:htot指每个蛋白质中总的肽键数，主要取决于原料的类型，乳清蛋白为
8.8mmol/g蛋白质；h指每g蛋白质中被水解的肽键数,mmol/g蛋白质。上述得到的不同压力下的WPI酶解产物粉末的抗氧化活性的测定方法如下:
光化学发光法(PLC):(参考文献:PopovI, Lewin G, Baehr R,Photochemiluminescent detection of antiradical activity.1.Assay of superoxidedismutase.Biomed Biochim Acta, 1987,46(11):775-779.) ;PCL法采用超快速抗氧化剂和自由基全自动分析仪PHT0CHEM，利用具有光化学激发作用的光敏剂(发光氨)激发反应分子，使之在紫外光的作用下以比正常条件下快1000倍的速度发生氧化反应，迅速生成自由基，同时用化学发光法检测自由基。ACW 标准试剂包(德国 Analytik Jena AG ;产品目录号:KIT AOfhs 400.801)用于测定样品中水溶性成分的抗氧化能力，其包括:试剂1，稀释液(直接用);试剂2，缓冲液(直接用);试剂3，光敏剂；试剂4，抗坏血酸干粉作为标准试剂。将一定量的样品溶于IOmL超纯水中配置成5.0mg/mL的样品溶液，在IOOOOg条件下离心lOmin，取上清用于测定。将10 μ L浓H2SO4与490 μ L试剂I的混合液添加至标准试剂瓶中，配置成lOmmol/L的储备液，然后用试剂I将该储备液稀释成0.lmmol/L的标准溶液。根据表I的条件参数，将各试剂依次加入到检测试管中，迅速混匀后上样至抗氧化剂和自由基全自动分析仪(德国Analytik Jena AG公司；产品型号:Photochem )进行测定。测定参数如下:检测时间，250s ;平滑因子，40 ;调零功能，开；校正及测量参数，时间滞差Iag-1agO ;清洗，IX每测量一次。以0.5 2.5nmol的抗坏血酸溶液绘制标准曲线，样品的水溶性抗氧化能力表示为每毫克样品的抗坏血酸当量，即μ g抗坏血酸/mg。表I水溶性抗氧化能力的PCL测定法
权利要求
1.一种制备乳清蛋白水解物的方法，包括如下步骤: 将乳清蛋白在超高压和蛋白酶的联合作用下进行酶解反应，收集酶解产物即得到乳清蛋白水解物。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于: 所述蛋白酶为碱性蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、风味蛋白酶、复合蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶或酸性蛋白酶；所述蛋白酶具体为碱性蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、中性蛋白酶或酸性蛋白酶。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于: 所述将乳清蛋白在超高压和蛋白酶的联合作用下进行酶解反应的方法为如下A或B: A包括如下步骤: 1)将所述乳清蛋白溶于缓冲液中，得到乳清蛋白溶液； 2)将步骤I)得到的乳清蛋白溶液与所述蛋白酶混匀后在超高压条件下同时酶解，得到酶解产物； B包括如下步骤: a)将所述乳清蛋白溶于 缓冲液中，得到乳清蛋白溶液； b)将步骤a)得到的乳清蛋白溶液进行超高压处理，得到预处理产物； c)将步骤b)得到的预处理产物与所述蛋白酶混匀后酶解，得到酶解产物。
4.根据权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于: A和B中，所述超高压的压力为100MPa-600MPa ;所述超高压的压力具体为400MPa ； 所述蛋白酶和所述乳清蛋白的质量比为0.05: I ； 所述酶解的温度为35 V -60 °C ;所述缓冲液为浓度为0.05M-0.1M、pH7.0-8.5的Tris-HCl缓冲溶液或浓度为0.05M-0.1M、pH2.2-3.0的柠檬酸缓冲液。
5.根据权利要求1-4中任一所述的方法,其特征在于: 所述酶解时间和所述超高压预处理的时间均为30min-120min。
6.根据权利要求1-5中任一所述的方法,其特征在于: A所示的方法的步骤2)中和B所示的方法的步骤c)中，在所述酶解的步骤后还包括将所述酶解产物依次进行超滤离心和凝胶过滤层析得到乳清蛋白水解物的步骤； 所述超滤离心包括如下步骤:先将所述酶解产物进行截留分子量为IOkDa的超滤离心收集透过液1，再将所述透过液I进行截留分子量为3kDa的超滤离心，收集透过液2 ； 所述凝胶过滤层析包括如下步骤:将所述透过液2经凝胶过滤色谱柱分离，收集保留时间为300min-410min的分离产物，得到乳清蛋白水解物。
7.根据权利要求1-6中任一所述的方法,其特征在于: 所述超滤离心中，所述离心的离心力均为3000g-4000g，所述离心的时间均为10min_30min ； 所述凝胶过滤层析中，所述凝胶过滤色谱柱为Sephadex G_25，所述洗脱液为经过0.22 μ m膜过滤的去离子水；所述凝胶过滤的流速为0.3mL/min_0.8mL/min,所述凝胶过滤的检测波长为214nm或220nm。
8.根据权利要求1-7中任一所述的方法，其特征在于: 在所述酶解产物进行超滤离心的步骤前，还包括将所述酶解产物依次进行灭活酶、离心取上清液、冷冻干燥的步骤。
9.由权利要求1-8中任一所述方法得到的乳清蛋白水解物。
10.由权利要求9所述 的乳清蛋白水解物在制备具有抗氧化活性功能产品中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种制备乳清蛋白水解物的方法。本发明提供的方法，包括如下步骤将乳清蛋白在超高压和蛋白酶的联合作用下进行酶解反应，收集酶解产物即得到乳清蛋白水解物。本发明的实验证明，利用本发明所生产的乳清蛋白抗氧化活性肽，能够有效清除自由基，因此具有提高食品稳定性、延长食品货架期、延缓机体衰老及减少氧化损伤等特点。本发明不仅能够增加乳清产品附加值，实现干酪加工副产物的综合利用，而且在食品、化妆品及医药等领域中具有广阔的应用前景。
文档编号A61Q19/08GK103160558SQ20111041455
公开日2013年6月19日 申请日期2011年12月13日 优先权日2011年12月13日
发明者木泰华, 张苗, 盛小波 申请人:中国农业科学院农产品加工研究所