专利名称：：二倍半萜化合物及其应用的利记博彩app
技术领域：
：本发明涉及天然药物化学领域，具体的，涉及一类二倍半萜化合物，以该类化合物为活性成分的药物组合物，及其在抑制血管生成、抗脯氨酰内肽酶、抗菌，拒食，以及香料中的应用。
背景技术：
：米团花(Leucosc印trumca皿mSmith)又名蜜糖花、山蜂蜜，为多年生灌木或乔木，在我国主要分布于云南、四川和西藏东南部，其花蜜为棕褐色。在佤族医药中，米团花根皮和叶煎水内服可治疗感冒发热和胃炎。据文献报道，Choudhary等从尼泊尔采集的米团花叶中发现7个新奇结构的二倍半萜化合物。此类二倍半萜类化合物具有一定的抗脯氨酰内肽酶和抑制血管生成活性。但浦湘渝等对云南分布的米团花叶中次生代谢产物的研究中只发现了二萜，黄酮类化合物，并未发现此类二倍半萜类化合物。此外还有研究报道米团花花中的色素在云南民间是一种传统的天然无毒的食用色素，有人认为该色素可能是胺类化合物，但是否确实为胺类化合物以及是一些什么样的胺类化合物还有待证实和研究。二倍半萜类化合物在植物中分布比较少见，主要存在于海洋生物中，特别是海绵中。对于二倍半萜类化合物的应用方面也少见报道。
发明内容本发明通过对米团花的化学成分和生物活性研究，旨在提供一类新奇结构的二倍半萜类化合物，它们的制备方法，以及它们在抑制血管生成和抗脯氨酰内肽酶，抗菌，拒食活性，以及在香精香料方面的应用。本发明的上述目的是通过下面的技术方案得以实现的下述通式(I)化合物(I)其中!^所代表的基团选自5<formula>formulaseeoriginaldocumentpage6</formula>X，Y，Z，W，各自独立代表的基团为氢(-H)，羟基(-0H)，过羟基(-00H)或过氧桥(-00-);12，13可以相同或不同，各自独立的基团为氢(-H)，羟基(-0H)，过羟基(-00H)或过氧桥(-00-);或者R2R3=双键(>C=C<);R4为氢(-H)，羟基(-0H)，过羟基(-00H)或过氧桥(-00-);15，16可以相同或不同，各自独立的基团为羰基(>0=0)，氢(-H)，羟基(-0H);或者R5R6=氧桥(-0-)。上述的二倍半萜化合物，优选取下列化合物1-14:<formula>formulaseeoriginaldocumentpage7</formula>式(I)化合物的制备方法,包括用有机溶剂直接冷浸或者执回流提取或者先有机溶剂冷浸或热回流提取后再用乙酸乙酯萃取唇形科植物米团浸膏经反复柱层析得到式z和式化合物。u化乂化祖妆#到&，药物组合物，其中含有治疗有效量的式(I)化合物和药学上可接受的载体。抗血管生成剂，含有式(I)化合物和常规辅剂。抗菌剂，含有式(I)化合物和常规辅剂。拒食剂，含有式(I)化合物和常规辅剂。式(I)化合物在制备血管抑制剂中的应用。式(I)化合物在制备抗脯氨酰内肽酶剂中的应用。式(I)化合物在制备抗菌剂中的应用。式(I)化合物在制备拒食剂中的应用。香料或者精油组合物，包含任一种式(I)中化合物，辅以香料或香精常规辅剂。本发明的通式(I)化合物的制备方法更具体地是用A:甲醇或乙醇冷浸或热回流提取米团花的叶或者花得到总浸膏，总浸膏用乙酸乙酯萃取得到乙酸乙酯浸膏，再对乙酸乙酯浸膏经反复柱层析可得到通式(I和II)化合物。B:有机溶剂(如氯仿、丙酮、乙醚、石油醚、正己烷、环己烷等)直接冷浸或热回流提取米团花叶或者花的粗粉得到总浸膏，总浸膏经反复柱层析可得到通式(I和II)化合物。本发明的用于抗血管生成、抗菌、抗脯氨酰内酶、拒食剂的药物组合物，其中含有式(I)任一化合物和药学上可接受的载体。本发明药物组合物中所述药学上可接受的载体是指药学领域常规的药物载体。本发明化合物可以组合物的形式通过口服、鼻吸入、直肠或肠胃外给药的方式施用于需要这种治疗的患者。用于口服时，可将其制成常规的固体制剂如片剂、粉剂、粒剂、胶囊等，用于肠胃外给药时，可将其制成注射用的溶液等。优选的形式是片剂、胶囊和注射剂。本发明药物组合物的各种剂型可以按照药学领域的常规生产方法制备。例如使活性成分与一种或多种载体混合，然后将其制成所需的剂型。本发明的药物组合物优选含有重量比为0.1%99.5%的活性成分，最优选含有重量比为0.5%95%的活性成分。本发明化合物的施用量可根据用药途径、患者的年龄、体重、所治疗的疾病的类型和严重程度等变化，其日剂量可以是0.0110mg/kg体重，优选0.15mg/kg体重。可以一次或多次施用。本发明的化合物显示出较好的抑制血管生成活性和抗脯氨酰内肽酶活性。本发明化合物进行了抗菌活性筛选，该类化合物显示较好的抗菌活性。本发明化合物进行了拒食活性筛选，该类化合物显示较好的拒食活性。本发明化合物具有在香料方面的应用前景。此类新的二倍半萜类化合物具有清新的香气，且透发性好，在调香中使用不仅可以提携头香，还可以使香型的头香及整体更清凛，含有此类化合物香精，具有独特的香气特征，且香气清新纯正，能较好地遮盖表面活性剂基质原料的不良气味，持久安全。本发明化合物进行了抗菌活性筛选，该类化合物显示较好的抗菌活性。在抗菌活性应用中，式(I)类化合物是以如下的量施用于基材或一种群上，所述量的范围10到1000iiM，优选在20到300iiM，任选地与载体和/或媒体相结合。本发明化合物进行了拒食活性筛选，该类化合物显示较好的拒食活性。在拒食活性应用中，式(I)类化合物是以如下的量施用于基材或一种群上，所述量的范围0.005到10iiM/cm2，优选在0.01到0.2iiM/cm2，任选地与载体和/或媒体相结合。具体实施方法下面的实施例可以使本专业人员更全面的理解本发明，但不以任何方式限制本发明。实施例1:化合物1的提取、分离1、提取和分离将米团花(Leucosc印trumca皿mSmith)叶(12.5kg)阴干，粉碎到30目，粉碎后以正己烷冷浸提取3次(每次40升，24小时)，提取液合并，减压浓縮提取液得到浸膏(203g)，浸膏用适量氯仿/丙酮溶解后用硅胶(200-300目)拌样，1.5kg硅胶(200-300目)以粗短型硅胶柱进行粗分离，以不同比例的石油醚-氯仿(i:o-o:i)，氯仿-丙酮(1:0-0:1)进行梯度洗脱，每1000mL为一个馏分，共400份。TLC检测合并相同部分，得到9个主要部分。其中第6部位(40g)用MCI-gel(60-100%MeOH_H20)处理后得4个部分，再对Fr6a-3(85XMeOH，4g)以石油醚乙酸乙酯(30:1)为洗脱溶剂进行硅胶柱层析，每100mL为一个馏分，共收集IOO份，其中27-56份经反复丙酮重结晶后得到化合物1(100mg)。2、化合物1的结构鉴定该化合物为无色结晶，m.p.186-188°C;旋光，[a]D19=+151.l(c=0.3，溶剂为氯仿)；紫外光谱(溶剂为氯仿)，入隨(logO=240(3.15)，202(2.82)nm;红外光谱(溴化钾压片)v隨=3456,2963,2874，1680，1509，1447，1384，1273，1239，1140，1063，1023，909，749cm—1;negativeFAB-MSm/z(%):569(100)[M+MNBA]+，415(83)[M—H]—，387(17)，339(10)，224(16)，211(18)，96(11);HR-ESI-MS显示其准分子离子峰451.2245[M+Cl]+，(calcd.for451.2251)，结合NMR谱确定其分子式为C25H3605。^和13CNMR谱(数据归属见表-1和表2)和HSQC图谱分析可知化合物1有6个甲基，4个亚甲基，8个次甲基，7个季碳。从"HNMR显示6个甲基信号分别为SH0.96(Me-22)，SH0.86(Me_23)，SHl.31(Me_24)，SH1.76(Me-l)，SH1.80(Me-21)，SHl.97(Me_25)，在较低场3个单峰分别为SH2.69(C-13)，SH2.47(C5_OH)，SH2.79(Cn_OH)，以及四个低场质子信号。结合力」HCOSY谱图，四个低场质子分别为H-20(SH7.21，d，J=1.2Hz)和H-19(Sh6.15，d，J=1.2Hz)，H-3(SH5.42，d，J=8.7Hz)和H_4(SH4.60，d，J=8.7Hz)。HMBC谱图显示H_3与两个甲基碳(Me-l，Me-21)相关，推测Me_l，Me_21与双键相连；H_4与Se82.8(C_14)有相关推测C-4与C-14有氧桥相连；Me-25与Sc150.3(C-17)，Sc113.6(C-18)，Sc112.8(C-19)相关，且H-20与Sc150.3(C-17)，Sc113.6(C-18)和Sc139.8(C-20)相关，推测C_17，C_18，C-19，C-20连成了一个呋喃环，且Me-25连在C_18位上。从HMBC谱图上还可以发现Me_22与Sc84.8(C-5)，Sc38.9(C-6)，Sc49.7(C_7)相关，且SH1.87(H_6)与SC85.8(C_11)和SC69.3(C-13)相关，结合C-12(Sc213.1)数据，可以推测C-5，C_6，C_7，C_ll，C_12，C-13形成了一个六元环。Me-23在HMBC谱图上显示与Sc29.8(C_9)，Sc47.1(C-10)，Sc85.8(C-11)相关，结合H-IO与Sc49.7(C-7)，Sc69.3(C-13)，Sc30.6(C_8)的相关，可以推测化合物1中还存在一个五元环。H-4和Me-22、Me-24，Me_22和H_7，Me_23和H_13，9H-13和5-0H，11-OH和H-10显示ROESY相关，由此可以推定化合物1的立体结构。对化合物1进行单晶X-衍射，证实了其结构。实施例2:化合物2的提取、分离和结构鉴定1、提取和分离按照实施例1对米团花叶进行提取、分离，然后对Fr6a-4(89XMe0H，10g)以石油醚乙酸乙酯(35:1)为洗脱溶剂进行硅胶柱层析，每100mL为一个馏分，共收集150份，其中40-96份S印hadx-LH20(CHCl3:MeOH=1:1)纯化后再经半制备液相(80%MeOH:H20)纯化得到化合物2(300mg)。2、化合物结构鉴定该化合物为无色油状；旋光，。29=+55.5((3=0.9，溶剂为氯仿)；紫外光谱(溶剂为氯仿)，入隨(loge)=240(3.06)nm;红外光谱(溴化钾压片)vmax=3442，2962，2934,2870，1702，1452，1376，1276，1150，1052，983，727cm—1;negativeFAB-MSm/z(%):399(20)[M-H]—，381(59)，279(100)，255(20)，141(24);HR-ESI-MS显示其准分子离子峰435.2297[M+Cl]+，(calcd.435.2302)，结合NMR谱确定其分子式为C25H3604。比化合物1少了一个氧原子。^和13CNMR谱(数据归属见表-1和表2)和HSQC图谱分析可知化合物2比化合物l少了一个季碳，但多了一个次甲基，结合HMBC谱图中Me-23与该次甲基有相关，推测化合物2中C-ll相连羟基被氢取代。H-ll与Me-23的ROESY信号，提示H-ll与Me_23同为a-取向，由此确定了化合物2的结构。实施例-3化合物3的提取、分离和结构鉴定1、提取和分离将米团花(Leucosc印trumca皿mSmith)叶(5.2kg)阴干，粉碎到30目，粉碎后以甲醇热回流提取3次(每次15升，4小时)，提取液合并，减压浓縮提取液得到总浸膏(125g)，总浸膏用乙酸乙酯萃取(4次，每次3升)得到乙酸乙酯浸膏(65g)，乙酸乙酯浸膏用适量氯仿/丙酮溶解后用硅胶(200-300目)拌样，O.5kg硅胶(200-300目)以粗短型硅胶柱进行粗分离，以不同比例的石油醚-氯仿(i:o-o:i)，氯仿-丙酮(i:o-o:i)进行梯度洗脱，每500mL为一个馏分，共300份。TLC检测合并相同部分，得到8个主要部分。其中第6部位(28g)用MCI-gel(60-100%MeOH-H20)处理后得4个部分，再对Fr6a-2(80%MeOH，2g)以石油醚乙酸乙酯(25:1)为洗脱溶剂，进行硅胶柱层析，每100mL为一个馏分，共收集125份，其中45-78份反复重结晶后得到化合物3(100mg)。2、化合物结构鉴定该化合物为无色油状；m.p.204-206";旋光，[a]d29=+121.3(c=0.4，溶剂为甲醇)；紫外光谱(溶剂为氯仿)，Amax(l0gO=205(3.65)咖；红外光谱(溴化钾压片)Vnlax=3513，3413，2967，2935，2874，1705，1444，1380，1107，1039，1026，921，850cm—1;negativeFAB-MSm/z(%):585(94)[M+MNBA]+，431(67)[M_H]—，413(100);HR-ESI-MS显示其准分子离子峰455.2418[M+Na]+，(calcd.455.2409)，结合NMR谱确定其分子式为C25H3606。丄H和13CNMR谱(数据归属见表-l和表2)和HSQC图谱分析可知化合物3有6个甲基，3个亚甲基，9个次甲基，7个季碳。13CNMR数据显示化合物3的6个甲基信号与化合物1的相似，但缺少一个亚甲基，多出一个次甲基，提示化合物3和化合物1结构类似。HMBC谱图显示H-19与Sc10.0(Me-25)，Sc53.8(C-16)，Sc207.4(C-17)，Sc141.8(C-18)，Sc76.7(C-20)相关，推测这五个碳组成了一个a，P-不饱和五元环。化合物3准确的结构通过单晶X-衍射得到了证实。实施例-4:化合物4的提取、分离和结构鉴定1、提取和分离按照实施例3对米团花叶进行提取分离，再对Fr6a-2(80%MeOH，2g)以石油醚乙酸乙酯(25:1)为洗脱溶剂，进行硅胶柱层析，每100mL为一个馏分，共收集125份，其中25-44份反复重结晶后得到化合物4(30mg)。2、化合物结构鉴定该化合物为无色固体；旋光，[a]/=+6.7(c=0.6，溶剂为甲醇)；紫外光谱(溶剂为氯仿)，Amax(loge)=363(3.47)，226(2.18)nm;红外光谱(溴化钾压片)v隨=3449,2965,2922，1713，1666，1451，1378，1046cm—1;positiveFAB-MSm/z(%):415(87)[M]+，397(24)，83(100);HR-ESI-MS显示其准分子离子峰415.2484[M+H]+(calcd.415.2489)，结合NMR谱图确定其分子式为C25H3405，比化合物3少了18个质量数，说明比化合物3少了1分子H20。化合物4的13CNMR(数据归属见表_1和表2)数据和化合物3非常相似，不同之处在于化合物3的一个季碳信号(Sc84.1，C-5)和一个次甲基信号(Sc73.3，C-13)在化合物4中被一个三取代的双键(Sc164.4，Sc139.4)代替，提示化合物4为化合物3的C-7位和C-13位的脱水产物。HMBC谱中Me_22和H_4都与C-5相关，以及Me-24与C_13相关，也证实了化合物4的结构。实施例-5:化合物5的提取、分离和结构鉴定1、提取和分离将米团花(Leucosc印trumca皿mSmith)叶(7.5kg)阴干，粉碎到30目，粉碎后以石油醚冷浸提取3次(每次25升，24小时)，提取液合并，减压浓縮提取液得到浸膏(116g)，浸膏用适量氯仿/丙酮溶解后用硅胶(200-300目)拌样，l.lkg硅胶(200-300目)以粗短型硅胶柱进行粗分离，以不同比例的石油醚-氯仿(i:o-o:i)，氯仿-丙酮(1:0-0:1)进行梯度洗脱，每1000mL为一个馏分，共400份。TLC检测合并相同部分，得到9个主要部分。其中第7部位(25g)用MCI-gel(60-100%MeOH_H20)处理后得7个部分，再对Fr7a-4(75%MeOH，6g)以石油醚乙酸乙酯(20:1)为洗脱溶剂，进行硅胶柱层析，每lOOmL为一个馏分，共收集100份，其中20-75份反复重结晶后得到化合物5(300mg)。2、化合物结构鉴定该化合物为白色固体；旋光，[^]。29=+169.1((3=0.62，溶剂为氯仿)；紫外光谱(溶剂为甲醇)，入隨(loge)=206(3.96)nm;红外光谱(溴化钾压片)vmax=3442，2971,2939,2916，1742，1685，1641，1441，1381，1300，1100，1024，987，917cm—1;negativeFAB-MSm/z(%):585(100)[M+MNBA]+，431(87)[M_H]—;HR-ESI-MS显示其准分子离子峰467.2205[M+Cl]+(calcd.467.2200)，结合NMR谱确定其分子式为C25H3606，比化合物1多了一个氧原子。化合物5的^和13CNMR数据(数据归属见表-1和表2)与化合物1相似，11不同之处在于化合物1的^NMR谱中低场的H-20信号(SH7.21)在化合物5中没有出现，而在中场多出一个质子信号(Sh4.87)，且化合物5的"CNMR谱中多了一个连氧次甲基(Sc84.3)和一个羰基(Sc173.1)，结合化合物5比化合物1多一个氧原子，推测化合物1的呋喃环在化合物5中变成了a，|3-不饱和五元内酯环。HMBC谱图数据分析显示H_19与Sc84.3(C-17)和Sc173.1(C-20)相关，证实了化合物5的结构。实施例-6:化合物6的提取、分离和结构鉴定1、提取和分离按照实施例5对米团花叶进行提取、分离，然后对Fr7a_5(80%MeOH，lg)以石油醚乙酸乙酯(25:1)为洗脱溶剂，进行硅胶柱层析，每25mL为一个馏分，共收集150份，其中21-39份石油醚异丙醇(25:1)为洗脱溶剂进行硅胶柱层析得到化合物6(16mg)。2、化合物结构鉴定该化合物为无色油状；旋光，[a]D2°=+41.7(c=0.36，溶剂为甲醇)；紫外光谱(溶剂为甲醇)，入隨(loge)=250(3.63)，204(4.00)，193(3.73)nm;红外光谱(溴化钾压片)vmax=3432,2965,2924，1771，1751，1655，1629，1450，1339，1103cm—1;negativeFAB-MSm/z(%):567(5)[M+MNBA]+，115(100);HR-ESI-MS显示其准分子离子峰413.2327[M-H]—(calcd.413.2329)，结合NMR谱(数据归属见表_3和表4)确定其分子式为〇25113405，质量数比化合物5少18，说明比化合物5少了1分子1120。化合物6的13CNMR数据和化合物5非常相似，不同之处在于化合物5的一个季碳信号(Sc84.6，C-5)和一个次甲基信号(Sc82.6，C-13)在化合物6中被一个三取代的双键(Sc166.4，Sc138.0)代替，提示化合物6为化合物5的C-7位和C-13位脱水产物。HMBC谱中Me_22和H_4都与C_5相关，以及Me-24与C-13相关，也证实了化合物6的结构。实施例-7:化合物7的提取、分离和结构鉴定1、提取和分离按照实施例5对米团花叶进行提取、分离，然后对Fr7a_5(80%MeOH，lg)以石油醚乙酸乙酯(25:1)为洗脱溶剂，进行硅胶柱层析，每25mL为一个馏分，共收集150份，其中40-95份经制备液相(75%MeOH-H20)得到化合物7(15mg)。2、化合物结构鉴定该化合物为无色油状；旋光，[a]D2°=+98.7(c=0.39，溶剂为甲醇)；紫外光谱(溶剂为甲醇)，入隨(loge)=288(2.36)，205(3.98)nm;红外光谱(溴化钾压片)vmax=3446，2963，2937，2874，1759，1688，1643，1449，1378，1297，1176，1034，960，917cm—1;negativeFAB_MSm/z(%):569(100)[M+MNBA]+，255(51);HR-ESI-MS显示其准分子离子峰415.2484[M-H]—(calcd.415.2493)，结合NMR谱确定其分子式为C25H3605，比化合物5少了一个氧。化合物7的^和13CNMR数据(数据归属见表-3和表4)与化合物5非常相似，不同之处在于化合物7少了一个季碳，但多了一个次甲基，结合HMBC谱图中Me-23与该次甲基有相关，推测化合物7中ll-OH被氢取代。ROESY普图中H-ll与Me-24相关，显示H-ll和Me-24都为P-构型。实施例-8:化合物8的提取、分离和结构鉴定1、提取和分离按照实施例5对米团花叶进行提取、分离，然后对Fr7a_5(80%MeOH，lg)以石油醚乙酸乙酯(25:1)为洗脱溶剂，进行硅胶柱层析，每25mL为一个馏分，共收集150份，其中40-95份经制备液相(75%MeOH-H20)后得到化合物8(25mg)。2、化合物结构鉴定该化合物为无色油状；旋光，。2°=+75.2((3=0.46，溶剂为甲醇)；紫外光谱(溶剂为甲醇)，入隨(loge)=205(3.95)，195(3.45)nm;红外光谱(溴化钾压片)v隨=3459，2962，2937，2870，1759，1700，1643，1450，1376，1299，1272，1166，1042，961cm—1;negativeFAB_MSm/z(%):569(100)[M+MNBA]+，415(5)[M-H]，397(75);HR-ESI-MS显示其准分子离子峰415.2484[M-H]—(calcd.415.2474)，结合NMR谱确定其分子式为C25H3605，与化合物7相同。将化合物8的^和13C画R数据(数据归属见表-3和表4)与化合物7比较，除了C-IO，C-ll的化学位移有差别外，其余部分非常相似，说明这两个化合物的结构也非常相似。对HMBC和HSQC谱图的相关信号分析表明，化合物8的平面结构与化合物7相同，二者的区别在于C-ll的相对构型不同。ROESY谱中H-ll与Me-23相关，显示H-11和Me-23空间取向相同，均为a-取向。实施例-9:化合物9的提取、分离和结构鉴定1、提取和分离将米团花(Leucosc印trumca皿mSmith)叶(6.3kg)阴干，粉碎到30目，粉碎后以丙酮冷浸提取3次(每次30升，24小时)，提取液合并，减压浓縮提取液得到总浸膏(155g)，总浸膏用乙酸乙酯萃取(4次，每次3升)得到乙酸乙酯浸膏(98g)，乙酸乙酯浸膏用适量氯仿/丙酮溶解后用硅胶(200-300目)拌样，1.5kg硅胶(200-300目)以粗短型硅胶柱进行粗分离，以不同比例的石油醚-氯仿(i:o-o:i)，氯仿-丙酮(i:o-o:i)进行梯度洗脱，每1000mL为一个馏分，共400份。TLC检测合并相同部分，得到9个主要部分。其中第7部位(25g)用MCI-gel(60-100%MeOH_H20)处理后得8个部分，再对Fr7a-3(70%MeOH，2.3g)以石油醚乙酸乙酯(15:1)为洗脱溶剂，进行硅胶柱层析，每50mL为一个馏分，共收集150份，其中32-68份经以石油醚异丙醇(25:1)为洗脱溶剂进行硅胶柱层析后得到化合物9(110mg)。2、化合物结构鉴定该化合物为白色固体；旋光，[a]d26=+96.6(c=0.38，溶剂为甲醇)；紫外光谱(溶剂为甲醇)，A隨(loge)=205(3.87)，194(3.45)nm;红外光谱(溴化钾压片)vmax=3438，3424，2924，2854，1737，1641，1461，1451，1035cm—1;negativeESI-MSm/z(%):447(100)[M-H]—;HR-ESI-MS显示其准分子离子峰483.2149[M+Cl]+(calcd.467.2144)，结合NMR谱(数据归属见表-3和表4)确定其分子式为C25H3607，比化合物5多了一个氧原子。化合物9的13CNMR数据与化合物5非常相似，不同之处在于化合物5的一个次甲基信号(Sc85.7)在化合物9中位移到了更低场(Sc96.8)，且在化合物9的^NMR谱图数据中也发现有一个很低场的质子信号(SH10.7)，结合化合物9比化合物5多一个氧原子，推测化合物5中羟基在化合物9被过羟基取代。HMBC谱图数据分析显示Me-23与Sc96.8(C_ll)相关，证实了化合物9中与C-11相连的基团为过羟基。实施例-10:化合物10的提取、分离和结构鉴定1、提取和分离按照实施例9对米团花叶进行提取、分离，再对Fr7a-3(70XMe0H，2.3g)以石油醚乙酸乙酯(15:1)为洗脱溶剂，进行硅胶柱层析，每50mL为一个馏分，共收集150份，其中69-86份经以石油醚异丙醇(15:1)为洗脱溶剂进行硅胶柱层析，在用半制备液相(68%MeOH-H20)得到化合物10(18mg)。2、化合物结构鉴定该化合物为白色固体；旋光，[a]D26=+56.3(c=0.35，溶剂为甲醇)；紫外光谱(溶剂为甲醇)，、ax(loge)=204(3.98)，196(3.47)nm;红外光谱(溴化钾压片)v隨=3441，2962，2935，2870，1746，1701，1451，1377，1279，1079，926cm—1;negativeESI-MSm/z(%):431(100)[M-H]—，413(49)，255(25);HR-ESI-MS显示其准分子离子峰431.2433[M-H]+(calcd.431.2424)，结合NMR谱(数据归属见表_3和表4)确定其分子式为。25113606，比化合物8多了一个氧原子。化合物10的"CNMR数据与化合物8非常相似，不同之处在于化合物8的一个次甲基信号(Sc85.2)在化合物10中被一个更为低场的季碳信号(Sc109.1)所代替，推测化合物10中C-17为一个半縮酮。HMBC谱图数据分析显示Me-25和H-19(SH5.79)都与Sc109.1相关，证实了化合物10中C-17为一个半縮酮。实施例-ll:化合物11的提取、分离和结构鉴定1、提取和分离按照实施例9对米团花叶进行提取、分离，再对Fr7a-3(70%MeOH，2.3g)以石油醚乙酸乙酯(15:1)为洗脱溶剂，进行硅胶柱层析，每50mL为一个馏分，共收集150份，其中69-86份经以石油醚异丙醇(15:1)为洗脱溶剂进行硅胶柱层析后得到化合物11(15mg)。2、化合物结构鉴定该化合物为无色油状；旋光，[a]D26=+45.8(c=0.26，溶剂为甲醇)；紫外光谱(溶剂为甲醇)，Amax(loge)=374(2.54)，205(3.87)nm;红外光谱(溴化钾压片)v隨=3443，2963，2928，2855，1738，1642，1452，1380，1300，1272，1039cm—1;negativeESI-MSm/z(%):467(100)[M+Cl]+，413(90);HR-ESI-MS显示其准分子离子峰467.2200[M+Cl]+(calcd.467.2187)，结合NMR谱(数据归属见表_3和表4)确定其分子式为。25113606，与化合物8分子量相同。化合物11的"CNMR数据与化合物8非常相似，不同之处在于化合物8的一个季碳信号(Sc85.2)在化合物11中向高场位移了4.3ppm(Sc80.9)，推测化合物ll中C-11位羟基的立体构型发生了变化。对HMBC和HSQC谱图的相关信号分析表明，化合物11的平面结构与化合物8相同。ROESY谱图显示11-0H与Me-23有相关，表明11-0H和Me-23空间取向相同，都为a-构型。实施例-12:化合物12的提取、分离和结构鉴定1、提取和分离14将米团花(Leucosc印t進ca皿mSmith)叶(3.6kg)阴干，粉碎到30目，粉碎后以乙醇冷浸提取3次(每次10升，24小时)，提取液合并，减压浓縮提取液得到总浸膏(62g)，总浸膏用乙酸乙酯萃取，回收乙酸乙酯得到乙酸乙酯浸膏(46g)。乙酸乙酯浸膏用适量氯仿/丙酮溶解后用硅胶(200-300目)拌样，O.5kg硅胶(200-300目)以粗短型硅胶柱进行粗分离，以不同比例的石油醚-氯仿(i:o-o:i)，氯仿-丙酮(i:o-o:i)进行梯度洗脱，每250mL为一个馏分，共400份。TLC检测合并相同部分，得到9个主要部分。其中第5部位(16g)用MCI-gel(60-100%，MeOH-H20)处理后得9个部分，在对Fr5a-3(70%MeOH，5.4g)以石油醚乙酸乙酯(35:1)为洗脱溶剂，进行硅胶柱层析，每50mL为一个馏分，共收集150份，其中47-75份经S印hadex-LH20(氯仿甲醇=1:1)和制备液相(80%MeOH-H20)纯化得到化合物12(45mg)。2、化合物结构鉴定该化合物为白色固体；旋光，[^]。28=+21.6((3=0.24，溶剂为丙酮)；紫外光谱(溶剂为甲醇)，A隨(loge)=244(3.69)，198(3.47)nm;红外光谱(溴化钾压片)vmax=3516，2956，2936，2906，2869，1700，1608，1446，1379，1215，1149，1139，1084，726cm—1;negativeFAB_MSm/z(%):415(100)[M_H]—，223(89)，163(66);HR-ESI-MS显示其准分子离子峰439.2460[M+Na]+(calcd.467.2187)，结合NMR谱(数据归属见表5)确定其分子式为C25H3605。将化合物12的^和13CNMR数据与化合物1比较，两个化合物的数据较为相似，说明两个化合物结构也相似。化合物12的^NMR数据与化合物1相比，不同之处在于化合物1低场的信号SH4.60(H-4)，和SH2.69(H_13)在化合物12中均未发现，且Me_24在化合物1中是单峰，而在化合物12中变成了双峰；化合物12的13CNMR数据与化合物1相比，明显多出一个羰基(Sc204.1)。在HMBC谱图中Me-1和Me_21都和羰基(Sc204.1)有相关，因此推测化合物12的C-4位和C-14位氧桥发生了断裂，C-4位形成了羰基(Sc204.1)。HMBC谱图中Me-23与两个次甲基(C-lO，C-ll)有相关，推测C_ll位碳为次甲基。Me-24与H-11有R0ESY相关，显示Me-24与H-ll构型相同，都为P-构型。实施例-13:化合物13的提取、分离和结构鉴定1、提取和分离按照实施例12对米团花叶进行提取、分离，再对Fr5a-4(70%MeOH，1.2g)以石油醚乙酸乙酯(35:1)为洗脱溶剂，进行硅胶柱层析，每25mL为一个馏分，共收集150份，其中32-60经S印hadex-LH20(氯仿:甲醇=1:1)纯化得到化合物13(30mg)。2、化合物结构鉴定该化合物为白色固体；旋光，。27=+19.4((3=0.12，溶剂为丙酮)；紫外光谱(溶剂为甲醇)，、ax(loge)=244(3.65)，198(3.47)nm;红外光谱(溴化钾压片)vmax=3450，2960，2937，2872，1714，1678，1616，1452，1381，1214，1076，971cm—1;negativeFAB-MSm/z(%):415(50)[M-H]—，141(66);HR-ESI-MS显示其准分子离子峰417.2640[M+H]+(calcd417.2638)，结合NMR谱(数据归属见表5)确定其分子式为C25H3605，与化合物12分子量相同。将化合物13的^和13CNMR数据与化合物12比较，两个化合物的数据非常相似，说明两个化合物的结构也非常相似。HMBC谱图数据分析表明化合物13和化合物12的平面结构完全一样。化合物13和化合物12的ROESY谱图也非常相似，仅有的不同之处在于化合物13的Me-24与Me-23呈现相关，而化合物12的Me_24与H_ll呈现相关，显示化合物13与化合物12的Me-24立体构型不一样，因此鉴定化合物13的Me_24为a-构型。、实施例-14:化合物14的提取、分离和结构鉴定1、提取和分离按照实施例12对米团花叶进行提取、分离，再对Fr5a-6(80XMeOH，O.8g)用石油醚乙酸乙酯(30:1)为洗脱溶剂，进行硅胶柱层析，每15mL为一个馏分，共收集100份，其中27-65份以石油醚异丙醇(40:1)为洗脱溶剂，进行硅胶柱层析，每10mL为一个馏分，共收集100份其中17-32份回收溶剂后得到化合物14(15mg)。2、化合物结构鉴定该化合物为无色油状；旋光，[a]D19=+16.5(c=0.l，溶剂为丙酮)；紫外光谱(溶剂为甲醇)，入隨(loge)=245(3.83)，210(3.87)，194(3.70)nm;红外光谱(溴化钾压片)v隨=3504，3450，2959，2928，2862，1734，1697，1612，1436，1380，1302，1175，972cm—1;HR-ESI-MS显示其准分子离子峰431.2433[M-H]—(calcd.431.2444)，结合NMR谱(数据归属见表5)确定其分子式为C25H3606，比化合物12多了一个氧。将化合物14的^和13CNMR数据与化合物12比较，两个化合物的数据较为相似，说明两个化合物结构也非常相似。化合物12的13CNMR中位于Sc140.7的信号在化合物14中被一个酯羰基信号(Sc172.9)所替代，且多出一个连氧的次甲基信号(Sc85.3)，因此推测化合物12中的呋喃环在化合物14中被不饱和五元内酯环取代，由此鉴定了化合物14的结构。表1化合物1-5的^NMR(SH[卯m]，(JHz]))数据aPosition1b2b3C4C5b11.76,s1.72,s1.72,s1.84,d(1.0)1.74,s35.42,d(8.7)5.46,d(9.0)5.57,dt(1.5,9.0)5.22,d(10.0)5.38,d(9.0)44.60,d(8.7)4.35,d(9.0)4.76,d(9.0)5.74，d(10.0)4.58,d(9.0)61.87,m1.87,m1.78,m2.32,dq(7.0,1.0)1.85,overlap72.U,m1.61,m2.00，in2.13,overlap2.09，m8a2.16,m2.08,overiap2.13,overlap2.15,overiap8b1.82,m1.28,m1.64,m1.70,m1.82,m9a2.01,m1.93,overlap2.03,overlap2.16,m2.05，overlap9b1.50，m1.31,m1.38,m1.40,m1.49,m102.22，m2.1，m2.25，m2.16,m2.21,m111.76,overlap132.69,s2.74,s2.76,s2.61,s15a15b2.06,dd8.5).(8.1，2.07,t(8.6)2.28,dd(2.5,17.5)1.89,dd(13.5,2.65,dd(2.0,14.0)1.40,dd(2.0,1.85，overlap17.5)14.0)16a16b2.74,dd8.5)(8.1,2.71,t(8.6)2.43,dt(2.5，13.5)2.36,dt(2.0，12.0)2.15,overiap1.66,m174.87，d(5.0)196.15,d(1.2)6.10，d(1.5)7.20，t(2.5)7.17,t(1.5)5.80,s207.21,d(1.2)7.16,d(1.5)4.63,t(2.5)4.54,brs211.80，s1.77，s1.72,s1.77,d(1.0)1.78，s220.96,d(6.9)0.94,d(7.0)0.94,d(8.5)1.13,d(7.0)0.94，d(6.9)230.86，d(7.3)1.14，d(6.5)0.80,d(9.5)0.87,d(7.0)0.85，d(7.3)241.31,s.20,s1.27,s1.46，s1.24,s251.97，s1.93,s1.70,s1.70,s2.05,saBrukerDRX-500MHz核磁共振仪测定，化学位移值(SH)用ppm表示，耦合常数J用Hz表示;b以CDC13为溶剂;c以acetone-d6为溶剂。表2化合物1-5的13CNMR(Sc[卯m])数据d17positionlb2b3C4b5b119.0,q18.8,q18.8,q18.3,q19.0,q2140.0,s138.8,s138.0,s140.2,s140.1,s3119.1,d119.8,d121.8，d123.0，d119.0,d476.3,d75.8,d77.4,d81.3,d76.3，d584.8,s86.2,s84.1,s164.4,s84.9,s638.9,d44.8,d41.8,d33.0,d39.3,d749.7,d45.8,d50.2,d56.0,d49.5，d829.8,t28.5,t30.4，t29.5,t29.8,t930.6，t32.1,t30.9,t32.3,t30.6,t1047.1,d32.8,d46.0,d47.7,d47.0,d1185.8,s64.6,d85.5,s86.1,s85.7,s12213.1,s209.4,s212.5,s197.8,s213.0,s1369.3,d70.7,d73.3,d139.4,s69.6,d1482.8,s81.9,s83.7，s89.4，s82.6，s1542.2，t41.4，t44.2,t39.9,t38.6,t1620.9，t20.6，t53.8，d54.3，d26.7,t17150.9,s150.5,s207.4,s206.4，s84.3,d18113.6，s113.4,s141.8,s141.8，s168.2，s19112.8,d112.7,d160.0,d156.6,d117.2，d20139.8,d139.6,d76.7,d76.7,d173.1，s2126.3,q26.1,q26.0,q25.9,q26.2，q2214.2，q13.8,q13.8,q18.3,q".0,q2316.6,q21.6,q17.2,q19.4,q16.7,q2422.7,q22.6,q23.6,q24.3,q22.7,q259.8,q9.7,q10.0,q10.1,q13.9,qdBrukerDRX_500MHz核磁共振仪测定，化学位移值(Sc)用ppm表示。表3化合物6-11的力NMR(SH[TOm]，([JHz]))数据(在acetone-d6中测定)18Position6b7b8C9C10b1111.76,d(1.5)1.72,d(1.0)1.68，(1.5)d1.76,(1.0)d1.69，(1.5)d1.68,d(1.0)5.12,dq(1.5，9.5)5.53,brd(9.0)5.59,(8.5)brd5.52,(9.0)brd5.60,(8.5)brd5.59,dq(1.2，8.5)45.60,dd(1.5,9.5)4.72,d(9.0)4.40,(8.5)d4.72，(9.0)d4.42，(8.5)d4.40,d(8.5)62.32,dq(1.5,7.0)1.57,overlap1.86，m1.87,overlap1.87,m2.42,m72.12,overlap2.38,m1.76,overlap2.28,m1.79，overlap1.87,m8a2.11,overlap2.01，m1.78,m2.00,m1.79，overlap1.68,overlap8b1.66,m1.54，m1.29,overlap1.72,overlap1.29，overlap1.52,m9a9b2.12，'overlap1.36,m1.60,m1.93，in1.29，overlap1.87,overlap1.34,m1.93,m1.29,overlap1.92,m1.35,m102.14,ni2.42,m2.04,m2.37,m2.04，overlap2.03,m112.87,dd(7.0,1.76，1.79，11.0)overlapoverlap132.65,s2.73，s2.57,s2.73,s2.94,s15a1.80,overlap1.77,m1.78,o1.74,m1.79,overlap1.78,m15b1.71,m1.68,in1.64,m16a2.09，m2.22,m2.17，m2.17,m2.19，m2.17,m16b1.41,m1.57,overlap1.57，in1.65,m1.96，m1.59,m174.76,brs5.00,brd(7.5)4.98,(7.5)brd5.01,brs4.98,brd(6.0)18195.79，brs5.80,brs5.79,brs5.80,brs5.79,brs5.79,brs211.80,d(1.0)1.71,d(1.5)1.70,(1.5)d1.71,(1.0)d1.71，(1.5)d1.70，d(1.2)22l.ll，d(7.0)0.94,d(7.0)0.94,(6.5)d1.10,(7.0)d0.94,(7.0)d0.87,d(7.0)230.88,d(7.5)0.89,d(7.5)1.12'(7.0)d0.85,(7.5)d1.12，(7.0)d1.11,d(7.0)241.33,s1.12，s1.10,s1.24,s1.10，s1.12,s252.05,brs2.10,brs2.08,brs2.10,brs2.03,brs2.08,brseBrukerDRX-500MHz核磁共振仪测定，化学位移值(SH)用ppm表示，耦合常数J用Hz表示。表4化合物6-11在13CNMR(5〔—[卯m])数据(在acetone-d6测定)f<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>实施例-16:本发明化合物的抑制血管生成活性检测1、细胞株及其培养细胞株为人微血管内皮细胞(HMEC)，存储于液氮中。细胞培养将HMEC用含lmM谷氨酰胺、lmg/L氢化可的松、10iig/LEGF和150mL/L小牛血清的MCDB-131培养液，于37°C，50mL/L(A培养箱中传代培养。2、活性测试方法样品活性测试方法参照Skehan等的SRB方法测定，计算化合物对HMEC增殖的抑制率及IC5。。取对数生长期细胞，按每孔70008000个细胞接种于96孔板中放置于37°C，50ml/LC02的培养箱中培养过夜，加入不同浓度的化合物1-14，以不加药组为阴性对照培养72h。去上清液，每孔轻轻加入100g/L三氯醋酸100iiL固定，静置5min后移到4t:再放置lh倒掉固定液，用去离子水洗5次，空气干燥。每孔加入4g/LSRB100yL室温放置30min，用10mL/L醋酸液洗5次，加入150yL10mmol/LTris碱液(pH10.5)溶解，用MK3型酶标仪在波长A^处测定每孔A值。计算抑制率(％)同时绘制药物浓度抑制率曲线，求出半数细胞抑制浓度(IC5。)。抑制率(％)=[(对照组的A值-化合物组的A值)/(对照组的A值-空白组的A值)]X100%。3.活性数据表7本发明化合物的抑制血管生成活性数据IC50(nM)CompoundIC50(nM)化合物l23.7化合物866.4化合物218.6化合物952.7化合物312.0化合物IO47.1化合物456.2化合物ll68.3化合物5>100化合物12>100化合物675.8化合物13>100化合物745.9化合物14>100实施例-17:本发明化合物的抑菌活性检测将化合物配制成系列浓度梯度，采用菌丝生长速率法研究次生代谢产物对病原菌的生物活性，十字交叉法测量不同时间的菌丝长度，计算抑制中浓度EC5。(iiM)。采用的供试菌种为荔枝炭疽病菌(Colletotrichumgloeosporioides)、香蕉炭疽病菌(Colletotrichummusae)、西瓜枯萎病菌(Fusariumoxysporumf.sp.Niveum)，水禾舀纹枯病菌(Rhizoctoniasolani)等。表8本发明化合物的抑菌活性数据<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>实施例-18:本发明化合物的拒食活性检测采用选择性拒食活性测定方法测定本发明化合物对甜菜夜蛾(Spodopteraexigua)和棉铃虫(Helicoverpaarmigera)的拒食活性。活性测试之前将幼虫饥饿4-5小时。选取生长一致的小白菜(Brassicachinensis)叶，冲洗干净，纱布拭干，用打孔器(直径l.lcm)打制成圆叶片(叶蝶)。将本发明化合物用丙酮配置成各种浓度梯度，取20y1均匀涂抹在叶蝶上，放在吸水纸上晾干，即成处理叶蝶；对照叶蝶为直接取丙酮溶液20U1涂抹在叶蝶上，并放在吸水纸上晾干。然后再将2张处理叶蝶和2张对照叶蝶交错放入一个直径9cm的培养皿内。为防止叶蝶干縮，在培养皿底垫一层滤纸，滴加蒸馏水保湿。让试虫取食24小时后，将残存叶片取出，用坐标纸法测量对照叶蝶和处理叶蝶被试虫取食的面积。抑制率=[(C-T)/(C+T)]X100。用几率值法计算抑制中浓度EC5。(iiM/cm2)。表9本发明化合物的拒食活性数据<table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table>实施例19:片剂实施例1-14所得任一种化合物10mg，乳糖180mg，淀粉55mg，硬脂酸镁5mg;制备方法将化合物、乳糖和淀粉混合，用丙二醇均匀湿润，把湿润后的混合物过筛并干燥，再过筛，加入硬脂酸镁，然后将混合物压片，每片重250mg，化合物含量为10mg。实施例20:安瓿剂实施例1-14所得任一种化合物2mg;制备方法实施例l-14所得任一种化合物溶解于2毫升丙二醇中，过滤所得溶液，在无菌条件下装入安瓿瓶中。实施例21:胶囊剂实施例1-14所得化合物10mg，乳糖187mg，硬脂酸镁3mg;制备方法将化合物与助剂混合，过筛，均匀混合，把得到的混合物装入硬明胶胶囊，每个胶囊重200mg，活性成分含量为10mg。实施例22:本发明化合物在香料方面的应用本发明新的二倍半萜类化合物具有清新的香气，且透发性好，在调香中使用不仅可以提携头香，还可以使香型的头香及整体更清凛，花香得以突出，是一种有开发应用前景的香原料。本发明参照国家日用香精标准(2005)，以此类新化合物为主香同时加以辅料，调制出LENo.l-4香精，经中国科学院昆明植物研究所测试人员和云南青年日用化工厂试用后，反映LENo.1-4香精香气清新纯正，具有独特的香气特征，能较好地遮盖表面活性剂基质原料的不良气味，且持久安全c<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table>化合物125.0化合物245.0化合物315.0化合物ll2.0香叶醇10.0丙二醇3.0_权利要求下述通式(I)化合物其中R1所代表的基团选自X，Y，Z，W，各自独立代表的基团为氢(-H)，羟基(-OH)，过羟基(-OOH)或过氧桥(-OO-)；R2，R3可以相同或不同，各自独立的基团为氢(-H)，羟基(-OH)，过羟基(-OOH)或过氧桥(-OO-)；或者R2R3＝双键(＞C＝C＜)；R4为氢(-H)，羟基(-OH)，过羟基(-OOH)或过氧桥(-OO-)；R5，R6可以相同或不同，各自独立的基团为羰基(＞C＝O)，氢(-H)，羟基(-OH)；或者R5R6＝氧桥(-O-)。FSA00000035082400011.tif,FSA00000035082400012.tif2.如权利要求1所述的通式(I)二倍半萜化合物，选取下列化合物1-14:<formula>formulaseeoriginaldocumentpage3</formula>3.权利要求l式(I)化合物的制备方法，包括用有机溶剂氯仿或丙酮或乙醚或石油醚或正己烷或环己烷直接冷浸或者热回流提取，或者先用有机溶剂冷浸或热回流提取后再用乙酸乙酯萃取唇形科植物米团花叶或花粗粉得到总浸膏，总浸膏经反复柱层析得到式I和式II化合物。4.药物组合物，其中含有治疗有效量的权利要求1或权利要求2任一化合物和药学上可接受的载体。5.抗血管生成剂，含有权利要求1或权利要求2任一化合物和常规辅剂。6.抗菌剂，含有权利要求1或权利要求2任一化合物和常规辅剂。7.拒食剂，含有权利要求1或权利要求2任一化合物和常规辅剂。8.香料或者精油组合物，以权利要求1或权利要求2的任一种化合物为主要成分，辅以香料或香精常规辅剂。9.权利要求1或权利要求2任一化合物在制备血管抑制剂中的应用。10.权利要求1或权利要求2任一化合物在制备抗脯氨酰内肽酶剂中的应用。11.权利要求1或权利要求2任一化合物在制备抗菌剂中的应用。12.权利要求1或权利要求2任一化合物在制备拒食剂中的应用。全文摘要提供式(I)二倍半萜类化合物，其制备方法，以及以该类化合物为活性成分的抑制血管生成和抗脯氨酰内肽酶，抗菌，拒食，香料方面的应用。文档编号C11B9/00GK101787007SQ20101010938公开日2010年7月28日申请日期2010年2月11日优先权日2010年2月11日发明者骆世洪,黎胜红申请人:中国科学院昆明植物研究所