专利名称：显微切割膜性载玻片清洗再利用方法
技术领域：
本发明涉及显微切割分子生物学切片清洗领域，具体的说是一种显微切割 膜性载玻片的清洗再利用技术。
背景技术：
激光捕获显微切割(Laser Capture Microdissection)技术及其系统的出现， 使得相关科研工作者可以精确分离待研究的目的组织标本、细胞(体外培养的 活细胞及固定在切片中的组织细胞)、细胞器甚至染色体区带，用于后续研究， 其控制样本的精确性受到全世界科研工作者的青睐，目前多数有实力的研究机 构均己配备此技术及相关设施。
用组织切片进行显微切割时，需要用到一种专用的膜性载玻片耗材，其价 格昂贵，同时，由于用于研究的目的标本需要富集足够的数量，使得研究过程 中该耗材使用数量较大。目前每片膜性载玻片仅能使用一次，有两个原因造成 该载玻片不可重复利用首先是激光切割膜性载玻片造成的机械缺损；第二个 原因是粘在膜上的组织、核酸、蛋白及其他小分子物质难以去除。之所以难去 除，是因为膜没有玻璃材质的普通载玻片那样的强度，不能在膜的表面刮擦； 膜和固体承载体是粘合在一起，因此膜性载玻片不能经受高温高压；膜由特殊 材质做成使得膜具有特殊黏附性，清洁膜表面物质时需兼顾不能损伤膜的黏附 性，-带有黏附性的膜与组织标本粘合十分牢固，普通方法极难使两者分离，即 使是免疫组化过程中抗原修复时所需要的高温(95°C10分钟)都很难使标本从 膜上脱落。
对于第一种原因，因为是损毁性的，没有办法避免。但是，该方法之所以称为"显微切割"，是因为所要切割的部分是在显微镜视野(一般用100倍、200
倍)下选取目的标本，每次切割所损害膜的面积甚至不到1/100，广大剩余的膜
提供了再利用的空间，因此十分有必要提出针对第二种原因的解决方案。 目前用于处理含有废弃标本、核酸、蛋白等物质的试剂瓶及孔板的方法主
要有机械/洗涤剂清洗、强酸/强碱浸泡过夜、高温高压、紫外线照射、钴60照 射等方法。这些措施均不能达到既完整去除残留物又保持膜的黏附特性及完整 性的目的。
发明内容
本发明旨在克服现有技术的不足之处而提供一种使耗材表面残留的组织、 核酸、蛋白及其他小分子物质得以清除，同时又能充分保持显微切割膜性载玻 片的完整性及黏附性效果，以保障后续实验顺利进行，从而使膜性载玻片得到 最大程度利用的显微切割膜性载玻片清洗再利用方法。
为达到上述目的，本发明是这样实现的
显微切割膜性载玻片清洗再利用方法，可按如下步骤依次实施
(1) 将膜性载玻片置于硼酸、酒精及EDTA混合溶液A中浸泡、摇晃3 5 分钟，并重复一次；
(2) 双蒸水冲洗2 3分钟；将膜性载玻片转移至蛋白酶K溶液中，56X:孵 育1 2小时；
(3) 将载玻片置于清水，用带有塑胶手套的手指轻触膜性载玻片中的膜上
标本，双蒸水冲洗，去除大块标本；
(4) 将载玻片置于盐酸、酒精及EDTA混合溶液B中浸泡5 10小时；用双 蒸水及无水乙醇交替反复冲洗膜性载玻片5 10次，并使最后一次冲洗结束于 无水乙醇；
(5) 将膜性载玻片迅速转移至超净台，通风，将无水乙醇迅速吹干，同时， 打开紫外灯对膜性载玻片的两个表面分别照射30 50分钟。作为一种优选方案，本发明所述歩骤(2)中蛋白酶K溶液的pH为5 8， 浓度为80 150ug/ml。
作为另一种优选方案，本发明所述步骤(1)混合溶液A中硼酸的浓度为1%; 所述步骤(1)混合溶液A中酒精的浓度为70%，所述步骤(1)混合溶液A中 EDTA的浓度为0. 25mol/L 。
进一歩地，本发明所述步骤(1)混合溶液A中硼酸、酒精及EDTA的体积 比为O. 5 1.5: (96. 5 99): 0. 5 2。
更进一歩地，本发明所述步骤(4)混合溶液B中盐酸的浓度为1 1.5%; 所述歩骤(4)混合溶液B中酒精的浓度为30%;所述歩骤(4)混合溶液B中 EDTA的浓度为0. 25mol/L。
另外，本发明所述步骤(4)混合溶液B中盐酸、酒精及EDTA的体积比为 0. 5 L5: (96. 5 99): 0. 5 2。
其次，本发明在步骤a)前，可将显微切割完毕的膜性载玻片置于二甲苯
中，45 5(TC孵箱孵育20 30分钟。需要注意的是，冰冻组织标本无需此步骤。
与现有技术相比，本发明具有如下特点
1、 整个操作流程中不涉及高温、强酸碱等对膜有损害的因素；
2、 通过使用混合溶液A、混合溶液B，保证了在清洗过程中，充分保护膜 的黏附性，经上述处理的膜性载玻片性状几乎没有任何改变；
3、 紫外线照射后，可以使载玻片上的有机膜的黏性达到最佳状态；
4、 清洗后的载玻片上不含有对实验有影响的成分；
5、 所需试剂均为生物实验室常规试剂，且价格低廉，借助玻璃切片盒，可 批量操作；
6、 重复利用可节省3 5倍的载玻片数量，节省大量科研经费。
下面结合附图和具体实施方式
对本发明作进一步描述。本发明的保护范围不仅局限于下列内容的表述。
图1为验证显微切割膜性载玻片是否清洗干净而进行的2%琼脂糖凝胶电泳图。
具体实施方式
实施例1
用本方法清洗残留肺癌组织(石蜡包埋标本)的显微切割膜性载玻片。 取两片粘贴有肺癌组织(石蜡包埋标本)的显微切割完毕的膜性载玻片， 其中一片不使用本方法清洗， 一片使用本方法清洗。
将显微切割完毕的膜性载玻片置于二甲苯屮，5(TC孵箱孵育20分钟(冰 冻组织标本无需此步骤)；将载玻片置于硼酸、酒精、EDTA混合溶液A (混合溶 液A为P/。硼酸、70%酒精、O.25mol/L EDTA的混合溶液，其体积配比为1: 98:
1)中浸泡、摇晃4分钟，并重复一次；双蒸水冲洗2分钟；将膜性载玻片转移
至pH6、 80ug/ml的蛋白酶K溶液，56。C孵育2小时；将载玻片置于清水，用 带有塑胶手套的手指轻触膜上的标本，双蒸水冲洗去除大块标本；将载玻片置 于盐酸、酒精、EDTA混合溶液B (混合溶液B为1. 5%盐酸、30%酒精、0. 25mol/L EDTA的混合溶液，其体积配比为l: 98: 1)中浸泡7小时；用双蒸水及无水乙 醇交替反复冲洗膜性载玻片8次，并保证最后一次冲洗结束于无水乙醇；将载
玻片迅速转移至超净台，通风，将无水乙醇迅速吹干，同时，打开紫外灯对膜
性载玻片的两个表面分别照射30分钟。 实施例2
显微切割膜性载玻片清洗再利用方法，可按如下步骤依次实施
(1) 将显微切割完毕的膜性载玻片置于二甲苯中，45 5(TC孵箱孵育20
30分钟；
(2) 将膜性载玻片置于硼酸、酒精及EDTA混合溶液A中浸泡、摇晃3分钟， 并重复一次；所述混合溶液A中硼酸的浓度为1%，酒精的浓度为70%， EDTA的浓度为0.25mol/L ;其中硼酸、酒精及EDTA的体积比为0.5: 96.5: 0.5。
(3) 双蒸水冲洗3分钟；将膜性载玻片转移至蛋白酶K溶液中，56。C孵育l 小时；蛋白酶K溶液的pH为6，浓度为90ug/ml。
(4) 将载玻片置于清水，用带有塑胶手套的手指轻触膜性载玻片中的膜上 标本，双蒸水冲洗，去除大块标本；
(5) 将载玻片置于盐酸、酒精及EDTA混合溶液B中浸泡7小时；用双蒸水 及无水乙醇交替反复冲洗膜性载玻片7次，并使最后一次冲洗结朿于无水乙醇； 所述盐酸的浓度为1%，酒精的浓度为30%， EDTA的浓度为0. 25mol/L;其中盐 酸、酒精及EDTA的体积比为0.5: 96.5: 0.5。
(6) 将膜性载玻片迅速转移至超净台，通风，将无水乙醇迅速吹干，同时， 打开紫外灯对膜性载玻片的两个表面分别照射40分钟。
实施例3
显微切割膜性载玻片清洗再利用方法，可按如下步骤依次实施
(1) 将膜性载玻片置于硼酸、洒精及EDTA混合溶液A中浸泡、摇晃5分钟， 并重复一次；所述硼酸的浓度为1%;所述酒精的浓度为70%，所述EDTA的浓度 为0.25mol/L ，其中硼酸、酒精及EDTA的体积比为1: 97: 1。
(2) 双蒸水冲洗3分钟；将膜性载玻片转移至蛋白酶K溶液中，56"C孵育2 小时；所述步骤(2)中蛋白酶K溶液的pH为7，浓度为100ug/ml。
(3) 将载玻片置于清水，用带有塑胶手套的手指轻触膜性载玻片中的膜上 标本，双蒸水冲洗，去除大块标本；
(4) 将载玻片置于盐酸、酒精及EDTA混合溶液B中浸泡9小时；用双蒸水 及无水乙醇交替反复冲洗膜性载玻片9次，并使最后一次冲洗结束于无水乙醇; 所述盐酸的浓度为1%;所述酒精的浓度为30%;所述EDTA的浓度为0. 25mol/L， 其中盐酸、酒精及EDTA的体积比为1.5: 98: 1。
(5) 将膜性载玻片迅速转移至超净台，通风，将无水乙醇迅速吹干，同时，打开紫外灯对膜性载玻片的两个表面分别照射35分钟。
目前能检测到的最微量的生物分子即为核酸，为了检验清洗效果，分别从清 洗过和未清洗过的载玻片上取O. 5X0. 5cm大小的膜，放入200ul Eppendorf管 中，向管中加入80u l双蒸水，37t:孵育l小时。分别取出4ul液体作为模板， 配置50ul标准体系(dNTP: 0. 5ul， Taq酶:0. 5ul，上下游引物各O. 5ul， 10Xbuffer: 5u]， dd跳43. 5ul)，进行多聚酶链反应(PCR)，经40个循环 扩增后，分别取6ul液体放入2%琼脂糖凝胶进行电泳如图1，泳道l为Marker 标志；泳道2为经本方法处理后的样本，未扩增出任何条带，表明经本方法清 洗后的膜上已经没有核酸污染，该膜性载玻片可以继续用于显微切割；泳道3 为未经处理的样本，明显有核酸模板存在。
可以理解地是，以上关于本发明的具体描述，仅用于说明本发明而并非受 限于本发明实施例所描述的技术方案，本领域的普通技术人员应当理解，仍然 可以对本发明进行修改或等同替换，以达到相同的技术效果；只要满足使用需 要，都在本发明的保护范围之内。
权利要求
1、显微切割膜性载玻片清洗再利用方法，其特征在于，按如下步骤依次实施(1)将膜性载玻片置于硼酸、酒精及EDTA混合溶液A中浸泡、摇晃3～5分钟，并重复一次；(2)双蒸水冲洗2～3分钟；将膜性载玻片转移至蛋白酶K溶液中，56℃孵育1～2小时；(3)将载玻片置于清水，用带有塑胶手套的手指轻触膜性载玻片中的膜上的标本，双蒸水冲洗，去除大块标本；(4)将载玻片置于盐酸、酒精及EDTA混合溶液B中浸泡5～10小时；用双蒸水及无水乙醇交替反复冲洗膜性载玻片5～10次，并使最后一次冲洗结束于无水乙醇；(5)将膜性载玻片迅速转移至超净台，通风，将无水乙醇迅速吹干，同时，打开紫外灯对膜性载玻片的两个表面分别照射30～50分钟。
2、 根据权利要求l所述的显微切割膜性载玻片清洗再利用方法，其特征在 于所述步骤(2)中蛋白酶K溶液的pH为5 8，浓度为80 150ug/ml。
3、 根据权利要求2所述的显微切割膜性载玻片清洗再利用方法，其特征在 于所述步骤(1)混合溶液A中硼酸的浓度为1%;所述步骤(1)混合溶液A 中酒精的浓度为70%，所述步骤(1)混合溶液A中EDTA的浓度为0. 25mol/L 。
4、 根据权利要求3所述的显微切割膜性载玻片清洗再利用方法，其特征在 于所述步骤(l)混合溶液A中硼酸、酒精及EDTA的体积比为0. 5 1. 5: (96. 5 99): 0. 5 2。
5、 根据权利要求4所述的显微切割膜性载玻片清洗再利用方法，其特征在 于所述歩骤(4)混合溶液B中盐酸的浓度为1 1. 5%;所述步骤(4)混合溶 液B中酒精的浓度为3(^;所述步骤(4)混合溶液B中EDTA的浓度为0. 25mol/L。
6、 根据权利要求5所述的显微切割膜性载玻片清洗再利用方法，其特征在 于所述步骤(4)混合溶液B中盐酸、酒精及EDTA的体积比为0. 5 1. 5: (96. 5 99): 0. 5 2。
7、 根据权利要求1 6之任一所述的显微切割膜性载玻片清洗再利用方法， 其特征在于在步骤(l)前，将显微切割完毕的膜性载玻片置于二甲苯中，45 50。C孵箱孵育20 30分钟。
全文摘要
本发明公开一种显微切割膜性载玻片的清洗再利用技术，可按如下步骤依次实施(1)将膜性载玻片置于硼酸、酒精及EDTA混合溶液A中浸泡、摇晃；(2)双蒸水冲洗；将膜性载玻片转移至蛋白酶K溶液中，孵育；(3)将载玻片置于清水，用手指轻触膜上标本，双蒸水冲洗；(4)将载玻片置于盐酸、酒精及EDTA混合溶液B中浸泡；用双蒸水及无水乙醇冲洗膜性载玻片，并使最后一次冲洗结束于无水乙醇；(5)将膜性载玻片迅速转移至超净台，将无水乙醇迅速吹干，同时，进行紫外光照射。本发明使耗材表面残留的组织、核酸、蛋白及其他小分子物质得以清除，同时又能充分保持显微切割膜性载玻片的完整性及黏附性效果。
文档编号B08B3/00GK101576653SQ20091001215
公开日2009年11月11日 申请日期2009年6月22日 优先权日2009年6月22日
发明者陈洪铎, 高兴华, 齐瑞群 申请人:中国医科大学附属第一医院