组织封闭胶组合物，组织封闭胶及其制备方法和应用

组织封闭胶组合物，组织封闭胶及其制备方法和应用
【专利摘要】本发明提供一种组织封闭胶组合物，组织封闭胶及其制备方法和应用，组织封闭胶组合物包括：第一组分和第二组分，其中，所述第一组分包括：含有氨基的天然物质和/或在含有氨基的天然物质上修饰有巯基的第一修饰产物，所述含有氨基的天然物质和所述第一修饰产物各自独立的具有10个以上的活性基团，其中，所述活性基团为氨基、巯基；所述第二组分包括：在海藻酸钠和/或羧甲基纤维素上修饰有10以上的N?琥珀酰亚胺基的第二修饰产物。本发明的组织封闭胶具有较高的抗破裂强度和较低的溶胀率，并且具有良好的粘合性，可以使组织创面快速闭合，有效起到组织封闭的作用，防止组织液、血液或脑脊液泄漏，减轻病人的痛苦，避免了更多的危险性。
【专利说明】
组织封闭胶组合物，组织封闭胶及其制备方法和应用
技术领域
[0001] 本发明涉及一种组织封闭胶组合物，组织封闭胶及其制备方法和应用，属于生物 医药技术领域。
【背景技术】
[0002] 组织封闭胶在医学上主要用在手术中或手术后对出血位点封闭止血、缺损组织物 理填充、防止组织脏器黏连、防止组织液渗漏等方面。组织封闭胶的主体材料按成分可分为 两类:一是人工合成类的水凝胶基材料，如聚乙二醇、丙烯酰胺类等;二是天然生物材料，如 明胶、胶原、壳聚糖、海藻酸钠、纤维素等。
[0003] 人工合成类的水凝胶材料分为可降解和不可降解两大类。其中，可降解的材料多 为聚乙二醇，聚乙烯亚胺等。现市售使用全合成可生物降解的材料得到的组织封闭胶主要 为COSEAUAngiotech医药品公司）和DURASEAL(Conf Iuent手术器械公司）的产品，此类产品 降解速度较快，但原材料成本较高，制备工艺较为复杂，直接导致整体的产品价格偏高。
[0004] 不可降解材料得到的组织封闭胶主要是丙烯酰胺类产品，其中氰基丙烯酸酯类是 不可降解产品的典型代表，如DERMABOND(Ethicon Surgical Care)。此类产品成胶后具有 较强的粘附力、成胶速度快等优点，但却存在着较多的组分残留、具有一定的生物毒性、不 可生物降解、除掉残留组分非常困难等问题，因此只能用于允许材料自然脱落或长时间需 要材料填充的环境。
[0005] 相对于人工合成类材料，天然生物材料也可以作为组织密封胶的主要材料。例如 GEFOAM的可吸收性明胶(Pharmacia&Upjohn，Kalamazoo，MI)，强生（上海）医疗器材有限公 司的Bioseal和Surgif Io，以及纤维蛋白密封剂等；虽然天然生物材料具有成本低廉，来源 可靠，易于获取等优势，作为植入性医用材料已有长期的使用历史和安全评价，但其使用时 的功能效果和使用位置始终具有很高的局限性。

【发明内容】

[0006] 发明要解决的问题
[0007] 本发明的目的是提供一种以天然物质为主体材料，制备可原位交联成型、具有较 高的涨破强度和粘附力、并具有较低溶胀率且可生物降解的组织封闭胶。
[0008] 用于解决问题的方案
[0009] 本发明提供一种组织封闭胶组合物，包括:第一组分和第二组分，其中，
[0010] 所述第一组分包括:含有氨基的天然物质和/或在含有氨基的天然物质上修饰有 巯基的第一修饰产物，所述含有氨基的天然物质和所述第一修饰产物各自独立的具有10个 以上的活性基团，其中，所述活性基团为氨基、巯基；
[0011] 所述第二组分包括:在海藻酸钠和/或羧甲基纤维素上修饰有10个以上的N-琥珀 酰亚胺基的第二修饰产物。
[0012] 根据本发明的组织封闭胶组合物，其中，所述第一组分中的活性基团与所述第二 组分中的N-琥珀酰亚胺基的摩尔比为1:1~1:3,优选为1:2~1: 3。
[0013] 根据本发明的组织封闭胶组合物，其中，所述第二修饰产物为修饰有N-琥珀酰亚 胺基的海藻酸钠。
[0014] 根据本发明的组织封闭胶组合物，其中，所述含有氨基的天然物质为壳聚糖、聚赖 氨酸中的一种或两种。
[0015] 根据本发明的组织封闭胶组合物，其中，所述第一修饰产物是利用巯基化试剂在 所述含有氨基的天然物质上修饰巯基得到的;优选地，所述巯基化试剂为半胱氨酸、乙酰基 半胱氨酸、巯基乙酸、巯基丙酸中的一种或多种;更优选地，所述巯基化试剂为巯基乙酸、巯 基丙酸、乙酰基半胱氨酸中的一种或多种。
[0016] 根据本发明的组织封闭胶组合物，其中，所述含有氨基的天然物质、所述第一修饰 产物的重均分子量为3000~5000Da。
[0017] 本发明提供一种组织封闭胶，其由本发明的组织封闭胶组合物的第一组分和第二 组分反应后形成；优选地，所述组织封闭胶由所述第一组分和所述第二组分在缓冲溶液中 反应后形成。
[0018] 根据本发明的组织封闭胶，其中，所述组织封闭胶由所述第一组分溶于第一缓冲 溶液中，所述第二组分溶于第二缓冲溶液中，然后混合、反应后形成。
[0019] 本发明还提供一种根据本发明的组织封闭胶的制备方法，其包括以下步骤：
[0020] 将所述第一组分溶于第一缓冲溶液中，得到第一混合液；
[0021 ]将所述第二组分溶于第二缓冲溶液中，得到第二混合液；
[0022] 将所述第一混合液与第二混合液混合，得到所述组织封闭胶。
[0023] 根据本发明的组织封闭胶的制备方法，其中，所述第二修饰产物的制备方法包括：
[0024] 在碳二亚胺类缩合剂和酰化试剂存在的条件下，将所述海藻酸钠和/或羧甲基纤 维素中的羧基活化为羧基活性酰胺，得到所述第二修饰产物。
[0025] 根据本发明的组织封闭胶的制备方法，其中，所述酰化试剂为4-二甲氨基吡啶及 其衍生物、4-吡咯烷基吡啶及其衍生物、羟基苯并三唑及其衍生物、N-羟基琥珀酰亚胺及其 衍生物、N-羟基硫代琥珀酰亚胺及其衍生物中的一种或多种。
[0026] 根据本发明的组织封闭胶的制备方法，其中，所述第一修饰产物的制备方法包括：
[0027] 在碳二亚胺类缩合剂和酰化催化剂存在的条件下，利用巯基化试剂在含有氨基的 天然物质上接枝巯基，得到所述第一修饰产物。
[0028]根据本发明的组织封闭胶的制备方法，其中，所述碳二亚胺类缩合剂为1-(3-二甲 氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐及其衍生物、N，N'_二异丙基碳二亚胺及其衍生物、二环 己基碳二亚胺及其衍生物中的一种或多种。
[0029] 根据本发明的组织封闭胶的制备方法，其中，所述酰化催化剂为4-二甲氨基吡啶 及其衍生物、4-吡咯烷基吡啶及其衍生物、羟基苯并三唑及其衍生物、N-羟基琥珀酰亚胺及 其衍生物、N-羟基硫代琥珀酰亚胺及其衍生物中的一种或多种。
[0030] 本发明还提供一种组织封闭胶试剂盒，其包括本发明的组织封闭胶组合物以及用 于溶解所述组织封闭胶组合物的各组分的缓冲溶液。
[0031 ]本发明还提供一种根据本发明的组织封闭胶在伤口粘合制品、内脏或软组织伤口 闭合制品、脑脊液及组织液封堵制品、大面积创伤止血辅助物、软组织修复补片与软组织粘 合制品中的应用。
[0032] 发明的效果
[0033] 本发明的组织封闭胶具有较高的抗破裂强度和较低的溶胀率，并且具有良好的粘 合性，可以使组织创面快速闭合，有效起到组织封闭的作用，防止组织液、血液或脑脊液泄 漏，能够减轻病人的痛苦，并且避免了更多的危险性。
[0034] 本发明的组织封闭胶是采用具有生物相容性的天然物质制备得到的，在使用时经 过物理混合，可原位交联形成组织封闭胶。具有良好的生物相容性，可以完全在人体内进行 降解代谢，并被排除体外无残留。本发明的组织封闭胶的制备方法简单，且易于操作。
【附图说明】
[0035] 图1为动物实验中的实验组Tl接受硬脑膜修补术后，将组织封闭胶II喷涂于人工 硬脑膜材料周围后的照片。
[0036] 图2为动物实验中的对照组T5接受硬脑膜修补术后，未喷涂组织封闭胶于人工硬 脑膜材料周围的照片。
[0037] 图3为组织封闭胶II应用于自体硬脑膜修复部位的组织切片图。
[0038]图4为细胞毒实验中，减去空白组之后的实验组和对照组的吸光度值(0D值）。
【具体实施方式】
[0039] 本发明提供一种组织封闭胶组合物，组织封闭胶及其制备方法和应用，本发明的 组织封闭胶组合物主要包括含有亲核试剂的第一组分和含有亲电试剂的第二组分，所述亲 核试剂包括含有氨基的天然物质和/或在含有氨基的天然物质上修饰有巯基的第一修饰产 物，所述含有氨基的天然物质和所述第一修饰产物各自独立的具有10个以上的活性基团， 其中，所述活性基团为氨基、巯基;所述亲电试剂包括在海藻酸钠和/或羧甲基纤维素上修 饰有10个以上的N-琥珀酰亚胺基的第二修饰产物。优选地，所述第一组分中，进行修饰巯基 的位置为主链和/或侧链上所含氨基(例如:伯氨基)的位置。
[0040] 本发明的含有氨基的天然物质和/或第一修饰产物以及第二修饰产物的主链和/ 或侧链上均具有多个可交联位点，从而使得含有氨基的天然物质和/或第一修饰产物与第 二修饰产物交联后具有较高的交联度，还具有突出的抗破裂强度和较低的溶胀率。
[0041] 本发明的组织封闭胶具有良好的粘合性，使组织创面快速闭合，有效起到组织封 闭的作用，能够防止组织液、血液或脑脊液泄漏，减轻病人的痛苦，从而避免了更多的危险 性。本发明的第一组分和第二组分能够在一定的物理共混的条件下通过迈克尔加成反应机 理形成一种交联的三维网状结构，起到组织封闭的作用。
[0042] 优选地，所述第一组分和第二组分可以是分离的，在使用时将第一组分和第二组 分混合。在实际应用的过程中，所述第一组分和第二组分可以分别单独储存，使用前或使用 时再溶解于同一溶剂中。为了使用方便，也可以将第一组分和/或第二组分分别在溶剂中以 预先溶解的形式储存，例如可以溶解到少量的缓冲溶液中，使用前采用缓冲溶液进行稀释， 也可以按照使用时的浓度溶解于缓冲溶液中储存。本发明对所述的组织封闭胶组合物中的 各组分的储存方式没有限制，所属技术领域人员可以根据需要，选择具体的储存方式，均在 本发明的范围之内。
[0043] 另外，修饰有巯基的第一修饰产物具有更好的生物安全性，其对细胞的破坏作用 会进一步减弱，分子内二硫键可以进一步增强分子的刚性结构，减少与红细胞膜的接触面 积。因此在含有氨基的天然物质上修饰巯基，具有更好的生物学特征，在人体内可以被完全 降解。并且还可以与生物体内的蛋白质形成蛋白质复合物，从而具有特定的生物学功能。
[0044] 所述海藻酸钠和/或羧甲基纤维素中的羧基经活化后，具有N-琥珀酰亚胺基，可以 稳定存在并参与交联反应。
[0045] 本发明的组织封闭胶，所述第一组分中的活性基团与所述第二组分中的N-琥珀酰 亚胺基的摩尔比为1:1~1:3，优选为1:2~1: 3。优选地，当所述活性基团与N-琥珀酰亚胺基 的摩尔比为1:2~1:3时，N-琥珀酰亚胺基是过量的，多余的N-琥珀酰亚胺基可以与生物体 组织表面的氣基和/或疏基键合，从而具有突出的粘附力。
[0046]当所述活性基团与N-琥珀酰亚胺基的摩尔比不在1:1~1:3的范围内时，例如所述 活性基团的含量高于N-琥珀酰亚胺基时，没有多余的N-琥珀酰亚胺基与组织细胞接触面的 氨基和/或巯基键合，所得到的组织封闭胶与组织的粘附性较低;例如所述活性基团的含量 低于N-琥珀酰亚胺基含量的1/3时，所形成的交联网络结构的强度和韧性较低，从而不利于 形成具有高破裂强度的组织封闭胶。
[0047]本发明的组织封闭胶，其中，所述含有氨基的天然物质为壳聚糖、聚赖氨酸中的一 种或两种。由于壳聚糖、聚赖氨酸以及修饰有巯基的壳聚糖、修饰有巯基的聚赖氨酸具有良 好的生物相容性(例如:血液相容性、组织相容性等）、安全性、生物降解性等优良性能，从而 可以减弱对细胞的破坏作用。另外，本发明的聚赖氨酸可以以其盐酸盐或氢溴酸盐的形式 进行反应，当然也可以以其它盐的形式进行反应，均在本发明的范围内。
[0048 ]本发明的聚赖氨酸可以为聚-L-赖氨酸、ε -聚赖氨酸中的一种或两种。
[0049] 根据本发明的组织封闭胶组合物，所述第一修饰产物是利用巯基化试剂在所述含 有氨基的天然物质上修饰巯基得到的;优选地，所述巯基化试剂为半胱氨酸、乙酰基半胱氨 酸、巯基乙酸、巯基丙酸中的一种或多种；更优选地，所述巯基化试剂为巯基乙酸、巯基丙 酸、乙酰基半胱氨酸中的一种或多种。
[0050] 具体而言，所述修饰有巯基的壳聚糖包括但不限于半胱氨酸壳聚糖(Cys-CHS)、乙 酰基半胱氨酸壳聚糖(NAC-CHS)、、巯基乙酸壳聚糖(TGA-CHS)、巯基丙酸壳聚糖(MPA-CHS)、 中的一种或多种;优选为巯基乙酸壳聚糖(TGA-CHS )、巯基丙酸壳聚糖(MPA-CHS )、乙酰基半 胱氨酸壳聚糖(NAC-CHS)中的一种或两种。所述乙酰基半胱氨酸壳聚糖(NAC-CHS)的分子式 (部分)为：
[0051]
[0052]优选地，所述含有氨基的天然物质、所述第一修饰产物的重均分子量为3000~ 5000Da〇
[0053]另外，本发明组织封闭胶的第二修饰产物优选为修饰有N-琥珀酰亚胺基的海藻酸 钠，所述修饰有N-琥珀酰亚胺基的海藻酸钠的粘度优选在500-600mPa · s之间。另外，本发 明中，所述壳聚糖的脱乙酰度不小于87.5%。
[0054]本发明的组织封闭胶的成胶时间为1-120S，降解时间为10-180天，并且具有交联 网络结构。
[0055] 本发明还提供一种组织封闭胶，其由本发明的组织封闭胶组合物的第一组分和第 二组分反应后形成；优选地，所述组织封闭胶由所述第一组分和所述第二组分在缓冲溶液 中反应后形成。
[0056] 具体地，所述组织封闭胶由所述第一组分溶于第一缓冲溶液中，所述第二组分溶 于第二缓冲溶液中，然后混合、反应后形成。
[0057]优选地，用于溶解亲核试剂的所述第一缓冲溶液的pH值为7.5~12.5，优选8.0~ 10. 〇;用于溶解亲电试剂的所述第二缓冲溶液的pH值为2.6~6.5，优选3.5~6.0。
[0058]本发明还提供一种组织封闭胶的制备方法，包括以下步骤：
[0059] 将所述第一组分溶于第一缓冲溶液中，得到第一混合液；
[0060] 将所述第二组分溶于第二缓冲溶液中，得到第二混合液；
[0061 ]将所述第一混合液与第二混合液混合交联，得到所述组织封闭胶。
[0062] 其中第一组分包括含有氨基的天然物质和/或在含有氨基的天然物质上修饰有巯 基的第一修饰产物;第二组分包括在海藻酸钠和/或羧甲基纤维素上修饰N-琥珀酰亚胺基 的第二修饰产物。
[0063] 本发明的组织封闭胶组合物中的第一混合液和第二混合液混合后，例如可以使用 双联混合器混合，第一混合液中的亲核试剂(含有氨基的天然物质和/或第一修饰产物)与 第二混合液中的亲电试剂(第二修饰产物)发生反应，可以快速成胶，从而制得本发明的组 织封闭胶。
[0064] 根据本发明的组织封闭胶的制备方法，其中，所述第一修饰产物制备方法包括：
[0065] 在碳二亚胺类缩合剂和酰化催化剂存在的条件下，利用巯基化试剂在含有氨基的 天然物质上接枝巯基，得到所述第一修饰产物。举例而言，在碳二亚胺类缩合剂和酰化催化 剂存在的条件下，壳聚糖中的氨基与乙酰基半胱氨酸中的羧基进行反应，脱去一分子水，从 而得到乙酰基半胱氨酸壳聚糖(NAC-CHS)。所述乙酰基半胱氨酸壳聚糖(NAC-CHS)的分子式 (部分)为：
[0066]
[0067]上述酰化催化剂包括但不限于4-二甲氨基吡啶(DMAP)及其衍生物、4-吡咯烷基吡 啶(4-PPY)及其衍生物、羟基苯并三唑(HOBt)及其衍生物、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)及其衍 生物、N-羟基硫代琥珀酰亚胺(sulfo-NHS)及其衍生物中的一种或多种。
[0068] 本发明的组织封闭胶的制备方法，所述第二修饰产物的制备方法包括:在碳二亚 胺类缩合剂和酰化试剂存在的条件下，将所述海藻酸钠和/或羧甲基纤维素中的羧基活化 为羧基活性酰胺，得到所述第二修饰产物，即：修饰有N-琥珀酰亚胺基的海藻酸钠和/或羧 甲基纤维素。
[0069] 优选地，以所述氨基的摩尔数为基准，所述碳二亚胺类缩合剂、酰化催化剂或酰化 试剂的摩尔数均是所述氨基摩尔数的1~1 〇倍。
[0070] 碳二亚胺类缩合剂可以有效增强羧基官能团的活性。在通过碳二亚胺缩合剂活化 后的羧基，由于酰化试剂的存在，可以进一步增强羧基物质的活性，有利于羧基活性酰胺的 反应活性的保持，使缩合反应稳定进行，并且可以长期储存。
[0071] 优选地，所述的碳二亚胺类缩合剂包括但不限于1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳 二亚胺盐酸盐(EDC)或其衍生物、N，N'_二异丙基碳二亚胺(DIC)或其衍生物、二环己基碳二 亚胺(DCC)或其衍生物中的一种或多种。另外，制备第二修饰产物与制备第一修饰产物所使 用的碳二亚胺类缩合剂可以相同。
[0072]优选地，制备第二修饰产物的酰化试剂包括但不限于4-二甲氨基吡啶(DMAP)及其 衍生物、4-吡咯烷基吡啶(4-PPY)及其衍生物、羟基苯并三唑(HOBt)及其衍生物、N-羟基琥 珀酰亚胺(NHS)及其衍生物、N-羟基硫代琥珀酰亚胺(sulfo-NHS)及其衍生物中的一种或多 种。
[0073] 本发明的组织封闭胶的制备方法，所述第一缓冲溶液和/或第二缓冲溶液包括但 不限于磷酸盐溶液、碳酸盐溶液、硼酸盐溶液、磷酸溶液、乙酸溶液、盐酸溶液中一种或多 种。所述缓冲溶液的具体成分可根据亲核试剂或亲电试剂在缓冲溶液中的稳定性和成型的 组织封闭胶的理化性能情况进行选择，缓冲溶液不应含有有害或有毒的溶剂，通常选用水 做溶剂，缓冲液的渗透压应与生物体血液渗透压相同或接近。
[0074] 优选地，所述第一缓冲溶液包括但不限于pH值为8.0-10.0的四硼酸钠缓冲溶液或 pH为9.6~9.9的磷酸二氢钠溶液与碳酸钠溶液的组合的缓冲溶液;所述第二缓冲溶液包括 但不限于pH值为3.5-5.0的盐酸溶液、pH为5.0~6.0的磷酸钠缓冲溶液或pH为3.5-4.5的磷 酸二氢钠溶液和碳酸溶液的组合的缓冲溶液。
[0075] 本发明的组织封闭胶的制备方法，所述第一缓冲溶液液和/或第二缓冲溶液中包 含有显色剂；优选地，所述显色剂包含但不限于ro&C蓝色#1、FD&C蓝色#2、FD&C蓝色#3、D&C 绿色#6、亚甲基蓝中的一种或多种。
[0076] 本发明还提供一种组织封闭胶试剂盒，其包括本发明的组织封闭胶组合物以及用 于溶解组织封闭胶组合物的各组分的缓冲溶液。
[0077] 根据本发明所述的组织封闭胶试剂盒，其包括:第一组分、第二组分、第一缓冲溶 液和第二缓冲溶液，所述第一组分包括含有氨基的天然物质和/或在含有氨基的天然物质 上修饰有巯基的第一修饰产物;所述含有氨基的天然物质和所述第一修饰产物各自独立的 具有10个以上的活性基团，其中，所述活性基团为氨基、巯基;所述第二组分包括在海藻酸 钠和/或羧甲基纤维素上修饰有1 〇个以上的N-琥珀酰亚胺基的第二修饰产物。
[0078] 根据本发明所述的组织封闭胶试剂盒，其中，所述第一组分和第二组分可以是分 离的，在使用时将第一组分和第二组分混合。在实际应用的过程中，所述第一组分和第二组 分可以分别单独储存，使用前或使用时再溶解于同一溶剂中。为了使用方便，也可以将第一 组分和/或第二组分分别在溶剂中预先溶解的形式储存，例如可以溶解到少量的缓冲溶液 中，使用前采用缓冲溶液进行稀释，也可以按照使用时的浓度溶解于缓冲溶液中储存。本发 明对所述的组织封闭胶组合物中的各组分的储存方式没有限制，所属技术领域人员可以根 据需要，选择具体的储存方式，均在本发明的范围之内。
[0079] 本发明还提供一种根据本发明的所述的组织封闭胶在伤口粘合制品、内脏或软组 织伤口闭合制品、脑脊液及组织液封堵制品、大面积创伤止血辅助物、软组织修复补片与软 组织粘合制品中的应用。
[0080] 另外，本发明中的成胶时间的测定方法为:将所述第一混合溶液与第二混合溶液 混合后开始计时，当混合后的二元混合物不再流动时即为成胶，此段时间记为成胶时间。 [0081 ]本发明中的溶胀率的测试方法为:将制得的组织封闭胶置于精确度为万分之一位 的天平上，测得其重量为X g。然后将所述组织封闭胶置于pH=7.4的磷酸盐(PBS)缓冲溶液 中12小时，使得组织封闭胶达到溶胀平衡后取出。用滤纸擦干表面水分，再次将其置于精确 度为万分之一位的天平上，测得其重量为y g。重复测定十次，计算其平均值^和按照以 下公式计算溶胀率:溶胀〗
[0082]本发明中破裂强度的测定方法为:取新鲜猪皮或猪肠衣，其面积为20X20cm，将其 固定于只有一个开口的密闭箱的开口处，然后将所述密闭箱的开口密封，密闭箱的另一侧 连接有压力打气栗，并配有压力传感器。在所述猪皮或猪肠衣的中心位置切开一个直径为 0.5cm±0.02cm的小口，然后将人工硬脑膜或其他可封堵的材料置于小口表面，通过双联注 射器在封堵材料周围均匀的喷上所述第一混合溶液和所述第二混合溶液，喷涂后计时1至5 分钟，然后通过压力栗向密闭箱内打气，记录人工硬脑膜或其他封堵材料被顶开时压力传 感器的读数，即破裂强度。
[0083]本发明中的降解时间的测定方法为:称取一定重量的组织封闭胶（例如0.5g)，置 于不可降解的聚丙烯网袋中，将其充分干燥后，放入PH=7.4的磷酸盐(PBS)缓冲溶液中，然 后置于恒温恒湿的37°C烘箱内。每隔24小时从缓冲溶液中取出一次样品，吸干其表面水分 并干燥样品后测试其重量。重量损失超过其原始重量5%时记为降解开始时间；重量损失达 到100%时为完全降解时间。
[0084] 实施例
[0085] 下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会 理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体 条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为 可以通过市购获得的常规产品。
[0086] 壳聚糖:Aladdin公司；产品编号：C105803。
[0087] 巯基丙酸:Aladdin公司；产品编号:M103035。
[0088] 可溶性碳二亚胺：Sigma-Aldrich公司；产品编号:MFCD00044916。
[0089] N-羟基琥珀酰亚胺(N-羟基丁二酰亚胺）=Sigma-Aldrich公司；产品编号：56480。 [0090] 海藻酸钠:Wako公司；产品编号：199-09961。
[0091] 聚-L-赖氨酸盐酸盐= Sigma-Aldrich公司；产品编号:P2658。
[0092] 4-arm-PEG-SG:厦门赛诺邦格生物科技有限公司，Mn = 10000。
[0093]三聚赖氨酸乙酸盐:吉尔生化(上海)有限公司。
[0094] 实施例1
[0095]〈第一组分的制备〉
[0096] 1)称取脱乙酰度为87.5%的壳聚糖1〇111111〇1(1.612(^)，巯基丙酸15111111〇1(1.31^)， 可溶性碳二亚胺20111111〇1(3.835(^)，1羟基琥珀酰亚胺20臟〇1(2.301(^)，置于温度为5°(：的 IOOmL纯化水中，搅拌反应8小时。
[0097] 2)将经步骤1)反应得到的混合物置于5L的生理盐水中渗析12小时，以除去未反应 的单体及小分子物质，并且每隔2小时更换一次生理盐水。
[0098] 3)将经步骤2)渗析得到的混合物置于冻干机中进行冷冻干燥，得到修饰有巯基的 壳聚糖，即为第一组分。
[0099]〈第二组分的制备〉
[0?00] 1)称取粘度为500_600mPa · s的海藻酸钠10mmol(2.1610g)，可溶性碳二亚胺 15mmol(2.8760g)，N_羟基琥泊酰亚胺15mmol(l .7260g)，置于室温的IOOmL纯化水中，搅拌 反应8小时。
[0101] 2)将经步骤1)反应得到的混合物置于5L的生理盐水中进行渗析12小时，以除去未 反应单体及小分子物质，并且每隔2小时更换一次生理盐水。
[0102] 3)将经步骤2)渗析得到的混合物置于冻干机中进行冷冻干燥，得到修饰有N-琥珀 酰亚胺基的海藻酸钠，即为第二组分。
[0103] 〈组织封闭胶的制备〉
[0104] 1)称取第一组分1.5mmol(0.50g)溶于2.5mL四硼酸钠缓冲溶液(pH = 9.97±0.02) 中，称取第二组分2. Ommol (0.53g)溶于2.5mL磷酸钠缓冲溶液(pH=5.64 ± 0.02)中。
[0105] 2)将经缓冲溶液溶解后的第一组分和第二组分通过挤出装置等体积混合挤出，得 到组织封闭胶I。
[0106] 实施例2
[0107]〈第一组分的制备〉
[0108] 1)称取重均分子量在3600~4300之间、伯胺基含量在聚-L-赖氨酸盐酸盐中的摩 尔百分含量为35%的聚-1^-赖氨酸盐酸盐0.48878，其中伯胺基的摩尔质量为1.51111]1〇1，该 聚-L-赖氨酸盐酸盐为第一组分。
[0109]〈第二组分的制备〉
[0110] 1)称取粘度为500-600mPa · s的海藻酸钠15mmol(3.2415g)，可溶性碳二亚胺 15mmol(2.8760g)，N_羟基琥泊酰亚胺15mmol(l .7260g)，置于室温的IOOmL纯化水中，搅拌 反应10小时。
[0111] 2)将经步骤1)反应得到的混合物置于5L的生理盐水中进行渗析12小时，以除去未 反应单体及小分子物质，并且每隔2小时更换一次生理盐水。
[0112] 3)将经步骤2)渗析得到的混合物置于冻干机中进行冷冻干燥，得到修饰有N-琥珀 酰亚胺基的海藻酸钠，即为第二组分。
[0113]〈组织封闭胶的制备〉
[0114] I)称取第一组分1.5mmol (0.4887g)溶于2.5mL的磷酸二氢钠与碳酸钠的混合缓冲 溶液(pH = 9.68±0.02)中；称取第二组分3 . Ommol (0.8g)溶于2.5mL盐酸溶液缓冲溶液中 (ρΗ=3·95±0·02)。
[0115] 2)将经缓冲溶液溶解后的第一组分和第二组分通过挤出装置等体积混合挤出，得 到组织封闭胶II。
[0116] 实施例3
[0117] 〈第一组分的制备〉
[0118] 1)称取重均分子量在3600~4300之间，伯胺基含量在聚-L-赖氨酸盐酸盐中的摩 尔百分含量为35%的聚-L-赖氨酸盐酸盐4.29mm 〇l(0.4887g)，其中伯胺基的摩尔质量为 1.5mmol，该聚-L-赖氨酸盐酸盐为第一组分。
[0119] 〈第二组分的制备〉
[0120] 1)称取羧甲基纤维素15mmol(3.6031g)，可溶性碳二亚胺20mmol(3.8347g)，N-羟 基琥珀酰亚胺20mmol(2.3013g)，置于室温的IOOmL纯化水中，搅拌反应10小时。
[0121] 2)将经步骤1)反应得到的混合物置于5L的生理盐水中进行渗析12小时，以除去未 反应单体及小分子物质，并且每隔2小时更换一次生理盐水。
[0122] 3)将经步骤2)渗析得到的混合物置于冻干机中进行冷冻干燥，得到修饰有N-琥珀 酰亚胺基的羧甲基纤维素(CMC-NHS)，即为第二组分。
[0123] 〈组织封闭胶的制备〉
[0124] 1)称取第一组分1.5mmol (0.4887g)溶于2.5mL的磷酸二氢钠与碳酸钠混合的缓冲 溶液(pH=9.65 ±0.02)中，称取第二组分1.5mmol (0.5329g)溶于2.5mL磷酸钠缓冲溶液中 (ρΗ=5·86±0·02)。
[0125] 2)将经缓冲溶液溶解后的第一组分和第二组分通过挤出装置等体积混合挤出，得 到组织封闭胶III。
[0126] 实施例4
[0127] 〈第一组分的制备〉
[0128] 1)称取重均分子量在3600~4300之间，伯胺基含量在聚-L-赖氨酸盐酸盐中的摩 尔百分含量为35%的聚-L-赖氨酸盐酸盐IOmmol(1.1392g)，巯基丙酸15mmol(1.3mL)，可溶 性碳二亚胺20mmol(3.8350g)，N-羟基琥珀酰亚胺20mmol(2.3010g)，置于温度为5°C的 IOOmL纯化水中，搅拌反应8小时。
[0129] 2)将经步骤1)反应得到的混合物置于5L的生理盐水中渗析12小时，以除去未反应 的单体及小分子物质，并且每隔2小时更换一次生理盐水。
[0130] 3)将经步骤2)渗析得到的混合物置于冻干机中进行冷冻干燥，得到修饰有巯基的 聚-L-赖氨酸，即为第一组分。
[0131] 〈第二组分的制备〉
[0132] 1)称取粘度为500_600mPa · s的海藻酸钠10mmol(2.1610g)，可溶性碳二亚胺 15mmol(2.8760g)，N_羟基琥泊酰亚胺15mmol(l .7260g)，置于室温的IOOmL纯化水中，搅拌 反应8小时。
[0133] 2)将经步骤1)反应得到的混合物置于5L的生理盐水中进行渗析12小时，以除去未 反应单体及小分子物质，并且每隔2小时更换一次生理盐水。
[0134] 3)将经步骤2)渗析得到的混合物置于冻干机中进行冷冻干燥，得到修饰有N-琥珀 酰亚胺基的海藻酸钠，即为第二组分。
[0135] 〈组织封闭胶的制备〉
[0136] 1)称取第一组分1.5mmol(0.50g)溶于2.5mL四硼酸钠缓冲溶液(pH = 9.97±0.02) 中，称取第二组分2. Ommol (0.53g)溶于2.5mL磷酸钠缓冲溶液(pH=5.64 ± 0.02)中。
[0137] 2)将经缓冲溶液溶解后的第一组分和第二组分通过挤出装置等体积混合挤出，得 到组织封闭胶IV。
[0138] 对比例1
[0139] 〈第一组分的制备〉
[0140] 1)称取重均分子量在3600~4300之间、伯胺基含量在聚-L-赖氨酸盐酸盐中的摩 尔百分含量为35%的聚-L-赖氨酸盐酸盐0.5087g，其中伯胺基的摩尔质量为1.6mmol，该 聚-L-赖氨酸盐酸盐为第一组分。
[0141] 〈第二组分的制备〉
[0142] 1)称取粘度为500-600mPa · s的海藻酸钠3.0mmol(0.8g)，该海藻酸钠即为第二组 分。
[0143] 〈组织封闭胶的制备〉
[0144] 1)称取第一组分1.6mmol溶于2.5mL的磷酸二氢钠与碳酸钠混合的缓冲溶液(pH = 9.58 ± 0.02)中；称取第二组分3. Ommol (0.8g)溶于2.5mL磷酸二氢钠和碳酸混合的缓冲溶 液中（ρΗ=3·95±0·02)。
[0145] 2)将经缓冲溶液溶解后的第一组分和第二组分通过挤出装置等体积混合挤出，得 到组织封闭胶V。
[0146] 对比例2
[0147] 称取1.5mmol的三聚赖氨酸乙酸盐，溶于2.5mL的pH= 10.0的磷酸钠缓冲溶液中， 震荡使其完全溶解。
[0148] 称取2. Ommol的4-arm-PEG-SG，溶于2.5mL的pH=4.0的硼砂缓冲溶液中，震荡使其 完全溶解。
[0149] 将经缓冲溶液溶解后的三聚赖氨酸乙酸盐和4-arm-PEG-SG通过挤出装置混合挤 出，得到组织封闭胶VI。
[0150] 对比例3
[0151] 称取1 · 5mmol的4-arm-PEG-NH2，溶于2 · 5mL的pH= 10 · 0的磷酸钠缓冲溶液中，震荡 使其完全溶解。
[0152] 称取2. Ommol的4-arm-PEG-SG，溶于2.5mL的pH=4.0的硼砂缓冲溶液中，震荡使其 完全溶解。
[0153] 将经缓冲溶液溶解后的4-arm-PEG-NH2和4-arm-PEG-SG通过挤出装置混合挤出， 得到组织封闭胶VII。
[0154] 测定上述实施例1-4和对比例1-3的成胶时间，溶胀率、破裂强度、剥离拉伸承载强 度、开始降解时间以及完全降解时间，结果如下表1所示：
[0155] 表1
[0157] 从表1可以看出，对比例1中未经修饰的海藻酸钠与天然的聚赖氨酸不能交联形成 组织封闭胶。本发明实施例1-4制备得到的组织封闭胶I-IV与对比例2-3得到的组织封闭胶 VI-VII相比，本发明的组织封闭胶I-IV具有较高的破裂强度和剥离拉伸承载强度，并具有 较低的溶胀率。因此本发明的组织封闭胶具有较好的抗破裂强度和粘合力，在组织封闭、创 面闭合、防止组织液、血液或脑脊液泄漏方面具有更好的优势。同时由于具有较低的溶胀 率，可应用于脑膜等较狭窄及神经分布较多的部位。
[0158] 人工硬脑膜修补实验
[0159] 采用按照实施例2的方法制备得到的经缓冲溶液溶解后的第一组分和第二组分进 行动物实验。
[0160] 取8只健康的新西兰兔作为实验兔，随机标号1'1，了2，了3，了4，了5，了6，了7，了8。将实验 兔麻醉后在其头顶制造1.5cmX 0.5cm的硬脑膜缺口，然后进行人工硬脑膜修补手术，其中 Tl~T4为实验组，T5~T8为对照组。实验组Tl~T4植入人工硬脑膜后，通过两组分注射器将 经缓冲溶液溶解后的第一组分和第二组分混合后，喷涂于人工脑膜材料周围及表面，30秒 后检查其交联情况，待两组分完全交联形成组织封闭胶II后将伤口封闭缝合。图1为实验组 Tl接受硬脑膜修补术后，将组织封闭胶II喷涂于人工硬脑膜周围后的照片。对照组T5~T8 在植入人工硬脑膜后不进行喷涂，直接将伤口封闭缝合。图2为对照组T5接受硬脑膜修补术 后，未喷涂组织封闭胶II于人工硬脑膜材料周围后的照片。
[0161] 手术一周后观察，所有实验兔均保持健康。解剖实验组Tl和T2的实验兔以及对照 组T5和T6的实验兔后发现:对照组T5和T6的实验兔均发生了人工硬脑膜侧向移动或与附着 位置脱离现象;实验组Tl和T2的实验兔在用组织封闭胶II封闭后均未发生人工硬脑膜移动 问题。
[0162] 手术两周后观察，剩余所有的实验兔均保持健康。解剖观察实验组T3和对照组T7 实验兔后发现:对照组T7的实验兔发生了人工硬脑膜侧向移动，堆积至一侧并发生脑脊液 泄漏；实验组T3在用组织封闭胶II封闭后均未发生人工硬脑膜移动，组织封闭胶的颜色变 淡并可观察到已发生明显的降解。
[0163] 手术四周后观察，剩余的实验兔均存活，解剖观察实验组T4和对照组T8实验兔后 发现:对照组T8已发生明显的脑脊液外漏问题;实验组T4中的组织封闭胶II已完全降解，消 失不见，且并未发生脑脊液外漏的问题。
[0164] 另外，在实验组Tl~T4中所有的实验兔身上均没有发现神经缺陷，从最初的手术 操作开始所有的实验兔均保持健康。
[0165] 上述结果表明，本发明的可生物降解的组织封闭胶可以有效地应用在人工硬脑膜 及邻近组织上，实现组织封闭，防止脑脊液泄露。
[0166] 自体硬脑膜修复实验
[0167] 将实施例2的组织封闭胶II应用于自体硬脑膜修复，两个月后取出修复部位组织 做病理切片，采用苏木精-伊红染色后在显微镜下观察。图3是组织封闭胶II应用于自体硬 脑膜修复部位的组织切片图，如图3所示，组织封闭胶II已完全降解，并且组织封闭胶II与 硬脑膜接触位置未见炎症细胞，硬脑膜组织无变性，无坏死，无纤维化增生。另外，硬脑膜周 围其它组织细胞也未见细胞变性和坏死等病理改变。因此，本发明的组织封闭胶具有良好 的组织相容性，可完全生物降解。
[0168] 细胞毒实验
[0169] 通过浸提液接触培养细胞，以L929为实验细胞，对细胞增殖观察，评价实施例2所 制备的组织封闭胶II对体外细胞的毒性作用。
[0170] 实验的具体过程为：用完全培养基(DMEM培养基+10%胎牛血清(FBS) + 1%双抗(青 霉素和链霉素的混合液））按照0.1g/mL的比例浸提组织封闭胶，得到的组织封闭胶的浸提 液。
[0171] 实验组:采用完全培养基(DMEM培养基+10%胎牛血清(FBS)+1 %双抗(青霉素和链 霉素的混合液)），添加组织封闭胶的浸提液，加入细胞悬液，进行细胞培养。
[0172] 对照组:采用完全培养基(DMEM培养基+10%胎牛血清(FBS)+1 %双抗(青霉素和链 霉素的混合液））加入细胞悬液，进行细胞培养。对照组中不添加组织封闭胶的浸提液，其余 细胞培养条件与实验组相同。
[0173] 空白组:采用完全培养基(DMEM培养基+10%胎牛血清(FBS)+1 %双抗(青霉素和链 霉素的混合液）），空白组中不添加组织封闭胶的浸提液和细胞悬液，于相同时间放置于与 实验组和对照组相同的环境中，以作为实验组和对照组测量吸光度值时的参照。
[0174] 采用实施例2的组织封闭胶II进行浸提液的配制，浸提温度为(37±1)°C，浸提时 间为(24±2)h。然后采用完全培养基重悬L929细胞，制得浓度为4\10 4个细胞/11^的细胞悬 液。以96孔平板为培养板，其中实验组和对照组为在培养板中加入上述细胞悬液，每孔加入 I OOyL;空白组为在培养板中每孔加入I OOyL的完全培养基，不加入细胞悬液。
[0175] 将实验组、对照组和空白组的培养板置于培养箱中预培养24小时(在37°C，5%CO2 条件下）。然后往实验组中加入组织封闭胶的浸提液，每孔加入l〇〇yL，对照组和空白组不加 组织封闭胶的浸提液，之后将各培养板置于培养箱中培养24小时(在37°C，5%C〇2条件下）。 然后小心吸出孔内的培养液，再向每孔内加入IOOyL的CCK-8混合液（由90yL的完全培养基+ I OyL的CCK-8混合制成），再将培养板置于培养箱中孵育2小时。然后用酶标仪测定在450nm 处的吸光度。
[0176] 图4为细胞毒实验中，实验组、对照组分别减去空白组后的吸光度值(0D值）。由图4 可以得出，实验组细胞的相对增殖率为RGR = 94.92%。
[0177] 其中实验组细胞的相对增殖率RGR的计算方法为：RGR=(实验组OD值-空白组OD 值)/(对照组OD值-空白组OD值）X 100%。因此，本发明的组织封闭胶具有良好的安全性，对 细胞生长无毒副作用。
【主权项】
1. 一种组织封闭胶组合物，其特征在于，包括:第一组分和第二组分，其中， 所述第一组分包括:含有氨基的天然物质和/或在含有氨基的天然物质上修饰有巯基 的第一修饰产物，所述含有氨基的天然物质和所述第一修饰产物各自独立的具有10个以上 的活性基团，其中，所述活性基团为氨基、巯基； 所述第二组分包括:在海藻酸钠和/或羧甲基纤维素上修饰有10个以上的N-琥珀酰亚 胺基的第二修饰产物。2. 根据权利要求1所述的组织封闭胶组合物，其特征在于，所述第一组分中的活性基团 与所述第二组分中的N-琥珀酰亚胺基的摩尔比为1:1~1:3,优选为1:2~1:3。3. 根据权利要求1或2所述的组织封闭胶组合物，其特征在于，所述第二修饰产物为修 饰有N-琥珀酰亚胺基的海藻酸钠。4. 根据权利要求1-3任一项所述的组织封闭胶组合物，其特征在于，所述含有氨基的天 然物质为壳聚糖、聚赖氨酸中的一种或两种。5. 根据权利要求1-4任一项所述的组织封闭胶组合物，其特征在于，所述第一修饰产物 是利用巯基化试剂在所述含有氨基的天然物质上修饰巯基得到的；优选地，所述巯基化试 剂为半胱氨酸、乙酰基半胱氨酸、巯基乙酸、巯基丙酸中的一种或多种;更优选地，所述巯基 化试剂为巯基乙酸、巯基丙酸、乙酰基半胱氨酸中的一种或多种。6. 根据权利要求1-5任一项所述的组织封闭胶组合物，其特征在于，所述含有氨基的天 然物质、所述第一修饰产物的重均分子量为3000~5000Da。7. -种组织封闭胶，其由权利要求1-6任一项所述的组织封闭胶组合物的第一组分和 第二组分反应后形成；优选地，所述组织封闭胶由所述第一组分和所述第二组分在缓冲溶 液中反应后形成。8. 根据权利要求7所述的组织封闭胶，其特征在于，所述组织封闭胶由所述第一组分溶 于第一缓冲溶液中，所述第二组分溶于第二缓冲溶液中，然后混合、反应后形成。9. 一种根据权利要求7或8所述的组织封闭胶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤： 将所述第一组分溶于第一缓冲溶液中，得到第一混合液； 将所述第二组分溶于第二缓冲溶液中，得到第二混合液； 将所述第一混合液与第二混合液混合，得到所述组织封闭胶。10. 根据权利要求9所述的组织封闭胶的制备方法，其特征在于，所述第二修饰产物的 制备方法包括： 在碳二亚胺类缩合剂和酰化试剂存在的条件下，将所述海藻酸钠和/或羧甲基纤维素 中的羧基活化为羧基活性酰胺，得到所述第二修饰产物。11. 根据权利要求10所述的组织封闭胶的制备方法，其特征在于，所述酰化试剂为4-二 甲氨基吡啶及其衍生物、4-吡咯烷基吡啶及其衍生物、羟基苯并三唑及其衍生物、N-羟基琥 珀酰亚胺及其衍生物、N-羟基硫代琥珀酰亚胺及其衍生物中的一种或多种。12. 根据权利要求10或11所述的组织封闭胶的制备方法，其特征在于，所述第一修饰产 物的制备方法包括： 在碳二亚胺类缩合剂和酰化催化剂存在的条件下，利用巯基化试剂在含有氨基的天然 物质上接枝巯基，得到所述第一修饰产物。13. 根据权利要求10-12任一项所述的组织封闭胶的制备方法，其特征在于，所述碳二 亚胺类缩合剂为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐及其衍生物、N，N'_二异丙基 碳二亚胺及其衍生物、二环己基碳二亚胺及其衍生物中的一种或多种。14. 根据权利要求12或13所述的组织封闭胶的制备方法，其特征在于，所述酰化催化剂 为4-二甲氨基吡啶及其衍生物、4-吡咯烷基吡啶及其衍生物、羟基苯并三唑及其衍生物、N-羟基琥珀酰亚胺及其衍生物、N-羟基硫代琥珀酰亚胺及其衍生物中的一种或多种。15. -种组织封闭胶试剂盒，其特征在于，其包括权利要求1-6任一项所述的组织封闭 胶组合物以及用于溶解所述组织封闭胶组合物的各组分的缓冲溶液。16. -种根据权利要求7或8所述的组织封闭胶在伤口粘合制品、内脏或软组织伤口闭 合制品、脑脊液及组织液封堵制品、大面积创伤止血辅助物、软组织修复补片与软组织粘合 制品中的应用。
【文档编号】C08B37/08GK106075549SQ201610446925
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年6月17日
【发明人】马骋, 邓坤学, 袁玉宇
【申请人】广州迈普再生医学科技有限公司