一种猪繁殖与呼吸综合征病毒脂质体稀释液冻干制品及其制备方法
【专利摘要】一种猪繁殖与呼吸综合征病毒脂质体稀释液冻干制品及其制备方法，属于兽用生物制品技术领域。每1000mlPBS溶液中含有以下组分：黄芪皂苷Ⅲ 2?8g、芦荟多糖5?10g、姜黄素2?6g、脂质体10?15g、葡萄糖10?15g和甘露醇10?15g。本发明所制备的脂质体稀释液冻干制品可以降低半成品的批间差异。本发明所制备的脂质体稀释液冻干制品可以促进猪繁殖与呼吸综合征病毒的繁殖，提高病毒含量，增强疫苗的免疫原性。
【专利说明】
一种猪繁殖与呼吸综合征病毒脂质体稀释液冻干制品及其制 备方法
技术领域
[0001] 本发明属于兽用生物制品技术领域，具体涉及一种猪繁殖与呼吸综合征病毒脂质 体稀释液冻干制品及其制备方法。
【背景技术】
[0002] 猪繁殖与呼吸综合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome， PRRS)，是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)引起猪的一种高度接触性传染病，不同年 龄、品种和性别的猪均能感染，该病以母猪繁殖障碍、仔猪呼吸道症状、免疫抑制、高感染 率、高死亡率为特征的一种高致病性疫病。该病已给全球养猪业造成严重的经济损失，为了 有效地控制该病，国内外已开发出多种用于预防PRRS的疫苗。
[0003] 脂质体是一种具有同生物膜性质类似的磷脂双分子层结构载体，而中药脂质体系 指将中药的有效成分包封于类脂质双分子层而制成的一种超微型球状药物载体制剂。该药 物载体具有靶向、缓释给药的优势，而且脂质体对正常细胞和组织无损害和抑制作用，还可 以表现出良好的细胞亲和性和组织相容性。脂质体在体内易降解、无毒性和无免疫原性，其 作为一种药物载体不仅可以提高药物治疗指数，还能够降低药物毒性和减少药物毒副作用 等优点。
[0004] 黄芪是一味重要的中药，具有益卫固表、利水清肿、托毒生肌、补中益气等功效，民 间常用于治疗自汗、盗汗、血痹、浮肿、痛疽不溃或溃久不敛、内份带虚、脾虚泄泻及一切气 衰血虚之症。黄芪皂苷为黄芪的主要活性成分之一，黄芪皂苷不仅可以促进淋巴增殖和抗 体的增加，还能促进体液和细胞免疫应答反应。
[0005] 多糖是中药活性成分之一，大量研究表明，多糖及糖复合物在生物体内不仅是作 为能量资源和构成材料，更重要的是它存在于一切细胞膜结构中，参与生命现象中细胞的 各种活动。多糖类物质是所有生命有机体的重要组成部分，具有清除自由基、提高抗氧化 酶活性和抑制脂质过氧化的能力 兽用生物制品质量评定最重要的指标之一就是批次间的稳定性，然而在实际生产过程 中难以控制半成品的批次间稳定性，究其原因主要是在接种活体生物时的比例不确定，也 就是说接种量不稳定导致生产出半成品有较大的差异。本发明宗旨在于解决猪繁殖与呼吸 综合征病毒增殖过程中批次间差异大以及病毒含量过低的难题。
【发明内容】
[0006] 针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于设计提供一种猪繁殖与呼吸综合征 病毒脂质体稀释液冻干制品及其制备方法的技术方案。
[0007] 所述的一种猪繁殖与呼吸综合征病毒脂质体稀释液冻干制品，其特征在于每 1000 mlPBS溶液中含有以下组分:黄芪皂苷ΙΠ 2-8g、芦荟多糖5-10g、姜黄素 2-6g、脂质体 10-15g、葡萄糖10-15g和甘露醇10-15g。
[0008] 所述的一种猪繁殖与呼吸综合征病毒脂质体稀释液冻干制品，其特征在于每 1000 mlPBS溶液中含有以下组分:黄芪皂苷ΙΠ 4-6g、芦荟多糖6-8g、姜黄素3-5g、脂质体12-14g、葡萄糖12-14g和甘露醇12-14g。
[0009] 所述的一种猪繁殖与呼吸综合征病毒脂质体稀释液冻干制品，其特征在于所述的 脂质体通过以下步骤制得:称取大豆卵磷脂、胆固醇，用氯仿进行溶解，并使其混合均匀，并 通过减压法去除溶液中氯仿，制备脂质体膜溶液;取pH值为7.0~8.0的枸缘酸和枸缘酸钾 缓冲溶液，将该缓冲溶液加入到脂质体膜溶液中，脱水后用匀浆机制备成脂质体。
[0010] 所述的一种猪繁殖与呼吸综合征病毒脂质体稀释液冻干制品，其特征在于所述的 PBS溶液通过以下步骤制得:取氯化钠6-10g、氯化钾0.05-0.5g、磷酸氢二钠1-1.2g、磷酸二 氢钾0.05-0.5g、氯化钙0.05-0.2g、含6个结晶水的氯化镁0.05-0.2g;将以上各成分混合 后，溶于1000 ml双蒸水中，经116°C，高压灭菌30分钟即得。
[0011] 所述的一种猪繁殖与呼吸综合征病毒脂质体稀释液冻干制品的制备方法，其特征 在于包括以下步骤:取所述重量的组分充分混合后，加入到1000ml pH 7的I3BS溶液中水 化，再经过0.22um的滤器进行过滤，分装于冻干瓶中，先在-40°C下预冻4-8h，再放真空冻干 机中干燥，即得到猪繁殖与呼吸综合征病毒脂质体稀释液冻干制品。
[0012] 所述的一种猪繁殖与呼吸综合征病毒脂质体稀释液冻干制品的制备方法，其特征 在于所述的PBS溶液通过以下步骤制得:取氯化钠6-10g、氯化钾0.05-0.5g、磷酸氢二钠1-1.2g、磷酸二氢钾0.05-0.5g、氯化钙0.05-0.2g、含6个结晶水的氯化镁0.05-0.2g;将以上 各成分混合后，溶于1000 ml双蒸水中，经116°C，高压灭菌30分钟即得。
[0013] 本发明中黄芪皂苷m由成都曼思特生物科技有限公司生产销售，芦荟多糖由兰州 沃特莱斯生物科技有限公司生产销售，姜黄素由百灵威科技有限公司生产销售。
[0014] 本发明具有以下有益效果： 1、 本发明所制备的脂质体稀释液冻干制品可以降低半成品的批间差异 2、 本发明所制备的脂质体稀释液冻干制品可以促进猪繁殖与呼吸综合征病毒的繁殖， 提高病毒含量，增强疫苗的免疫原性。
【具体实施方式】
[0015] 为了使本发明更加容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解， 这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，下列实施例中未提及的具体实 验方法，通常按常规实验方法进行。
[0016] 实施例1:PBS溶液的制备 取氯化钠6-10g、氯化钾0.05-0.5g、磷酸氢二钠1-1.2g、磷酸二氢钾0.05-0.5g、氯化钙 0.05-0.2g、含6个结晶水的氯化镁0.05-0.2g; 将以上各成分混合后，溶于1000ml双蒸水中，经116°C，高压灭菌30分钟即得。
[0017]实施例2:脂质体的制备 称取大豆卵磷脂6g、胆固醇2g，用500ml氯仿进行溶解，并使其混合均匀，并通过减压法 去除溶液中氯仿，制备脂质体膜溶液；取PH值为7.0~8.0的枸缘酸和枸缘酸钾缓冲溶液 200ml，将该缓冲溶液加入到脂质体膜溶液中，脱水后用匀浆机制备成脂质体。
[0018]实施例3:脂质体的制备 称取大豆卵磷脂4g、胆固醇4g，用500ml氯仿进行溶解，并使其混合均匀，并通过减压法 去除溶液中氯仿，制备脂质体膜溶液；取PH值为7.0~8.0的枸缘酸和枸缘酸钾缓冲溶液 200ml，将该缓冲溶液加入到脂质体膜溶液中，脱水后用匀浆机制备成脂质体。
[0019] 实施例4: 一种猪繁殖与呼吸综合征病毒脂质体稀释液冻干制品的制备 取黄芪皂苷m2g、芦荟多糖5g、姜黄素2g、脂质体(实施例2制得）10g、葡萄糖10g、甘露 醇 l〇g; 取所述重量的组分充分混合后，加入到1000ml pH 7的PBS溶液(实施例1制得）中水 化，再经过0.22um的滤器进行过滤，分装于冻干瓶中，先在-40°C下预冻6h，再放真空冻干机 中干燥，即得到猪繁殖与呼吸综合征病毒脂质体稀释液冻干制品。
[0020] 实施例5:-种猪繁殖与呼吸综合征病毒脂质体稀释液冻干制品的制备 取黄芪皂苷m4g、芦荟多糖6g、姜黄素3g、脂质体(实施例3制得）12g、葡萄糖13g、甘露 醇 12g; 取所述重量的组分充分混合后，加入到1000ml pH 7的PBS溶液(实施例1制得）中水 化，再经过0.22um的滤器进行过滤，分装于冻干瓶中，先在-40°C下预冻4h，再放真空冻干机 中干燥，即得到猪繁殖与呼吸综合征病毒脂质体稀释液冻干制品。
[0021] 实施例6:-种猪繁殖与呼吸综合征病毒脂质体稀释液冻干制品的制备 取黄芪皂苷m8g、芦荟多糖10g、姜黄素6g、脂质体(实施例3制得)15g、葡萄糖15g、甘露 醇 15g; 取所述重量的组分充分混合后，加入到1000ml pH 7的PBS溶液(实施例1制得）中水 化，再经过0.22um的滤器进行过滤，分装于冻干瓶中，先在-40°C下预冻8h，再放真空冻干机 中干燥，即得到猪繁殖与呼吸综合征病毒脂质体稀释液冻干制品。
[0022]试验例1本发明的应用 1材料 1.1猪繁殖与呼吸综合征病毒脂质体稀释液冻干制品 按本发明实施例4-6制得 1.2猪繁殖与呼吸综合征病毒(CH-Ia株），Marc-145细胞 1.3 25日龄健康断奶仔猪，ELISA检测PRRS抗体均为阴性检测伪狂犬抗体、抗原双 阴性 2方法 2.1包封率的测定 分别取空白的冻干脂质体和处理过的脂质体冻干粉，在磷酸盐缓冲液中进行复溶，超 速离心，取上清按一定比例稀释后，测定其吸光度(参考兽药典），平均每个样品测3次，算其 平均值。
[0023] 2.2形态观察和粒径 脂质体稀释液冻干粉在PBS缓冲液复溶后，在透射电镜（X20000)下观察 2.3细胞培养及接毒 按常规细胞培养方法培养Marc-145细胞;在细胞传代后均分4组，每组3瓶，将本发明实 施例4-6制备的脂质体稀释液冻干制品置于PH7磷酸盐缓冲液中进行复溶，分别将 20160701、20160702、20160703 三种不同批次的病毒稀释成 1000 TCID5〇/ml、1500 TCID50/ ml、2000 TCIDso/mhA组，采用本发明实施例4制备的脂质体稀释液对3种不同批次的PRRSV 进行稀释接种;B组，采用本发明实施例5制备的脂质体稀释液对3种不同批次PRRSV进行稀 释接种;C组，采用本发明实施例6制备的脂质体稀释液对3不同批次PRRSV进行稀释接种;D 组，对照组，采用无血清的细胞培养液对3不同批次PRRSV进行稀释接种，将以上各组分别置 于37°C、5% C02细胞培养箱中培养72 h之后进行收毒。
[0024] 2.4 TCID5O测定 将传代消化后的细胞稀释成IO5~IO6个/m L之后，转入96孔培养板中，按0. 2 m L /孔;将收获的四组病毒液分别作连续的10倍稀释，按0.2 mL /孔接种，置于37°C中吸附 2h后，加入含2%血清的DMEM细胞维持液中，置于37°C，5%的培养箱中培养，每天观察细胞病 变并记录，按Reed-Muench法计算TCID50。
[0025] 2.5免疫原性测定 将收获2.3提到的培养72h 20160701批次三组病毒液经检验合格，分别进行灭活、乳化 后制作成疫苗成品用来测定疫苗的免疫原性。将断奶仔猪分为4组，每组6头，第I组采用经 本发明实施例4制备的脂质体稀释液处理过的PRRSV灭活乳化后制成的疫苗进行免疫;第Π 组采用经本发明实施例5制备的脂质体稀释液处理过的PRRSV灭活乳化后制成的疫苗免疫； 第ΙΠ 组为采用经本发明实施例6制备的脂质体稀释液处理过的PRRSV灭活乳化后制成的疫 苗免疫;第IV组，疫苗对照组，未经脂质体处理灭活后制成的疫苗免疫;先后免疫2次，第一 次免疫2ml/头；间隔20d后，进行第2次免疫，按同等剂量进行免疫。各组均在首免第14 d、 21d、28d、35 d、45d、60d、90d、120d、180d采血并分离血清，用ELISA方法进行测定。
[0026] 3 结果 3.1包封率结果 按照公式:包封率（％ )=系统中包封的药量(Al)/系统中包封与未包封的总药量(A2) X 100%，结果见表1。
[0027]表1包封率测定结果
3.2形态观察和粒径测定 脂质体稀释液冻干制品为多室脂质体，粒度规则，为圆形，粒径基本一致，结果见表2。 [0028] 表2形态观察和粒径测定结果
3.4血清抗体检测结果 表4抗体测定结果
4结论 综上所述，本发明猪繁殖与呼吸综合征病毒脂质体稀释液冻干制品具有良好的包封 率，且粒度规则，粒径基本一致;能够很好的保证半成品接种量的稳定性，降低猪繁殖与呼 吸综合征病毒灭活疫苗半成品间的批次差异;提高疫苗的血清抗体效价，增强疫苗的免疫 原性。
【主权项】
1. 一种猪繁殖与呼吸综合征病毒脂质体稀释液冻干制品，其特征在于每lOOOrnlPBS溶 液中含有以下组分:黄芪皂苷m 2-8g、芦荟多糖5-10g、姜黄素2-6g、脂质体10-15g、葡萄糖 10-15g 和甘露醇 10-15g。2. 如权利要求1所述的一种猪繁殖与呼吸综合征病毒脂质体稀释液冻干制品，其特征 在于每lOOOrnlPBS溶液中含有以下组分:黄芪皂苷ΙΠ 4-6g、芦荟多糖6-8g、姜黄素3-5g、月旨 质体12-14g、葡萄糖12-14g和甘露醇12-14g。3. 如权利要求1或2所述的一种猪繁殖与呼吸综合征病毒脂质体稀释液冻干制品，其特 征在于所述的脂质体通过以下步骤制得:称取大豆卵磷脂、胆固醇，用氯仿进行溶解，并使 其混合均匀，并通过减压法去除溶液中氯仿，制备脂质体膜溶液;取pH值为7.0~8.0的枸缘 酸和枸缘酸钾缓冲溶液，将该缓冲溶液加入到脂质体膜溶液中，脱水后用匀浆机制备成脂 质体。4. 如权利要求1或2所述的一种猪繁殖与呼吸综合征病毒脂质体稀释液冻干制品，其特 征在于所述的PBS溶液通过以下步骤制得:取氯化钠6-10g、氯化钾0.05-0.5g、磷酸氢二钠 1-1.2g、磷酸二氢钾0.05-0.5g、氯化钙0.05-0.2g、含6个结晶水的氯化镁0.05-0.2g;将以 上各成分混合后，溶于l〇〇〇ml双蒸水中，经116°C，高压灭菌30分钟即得。5. 如权利要求1或2所述的一种猪繁殖与呼吸综合征病毒脂质体稀释液冻干制品的制 备方法，其特征在于包括以下步骤:取所述重量的组分充分混合后，加入到l〇〇〇ml pH 7的 PBS溶液中水化，再经过0.22um的滤器进行过滤，分装于冻干瓶中，先在-40°C下预冻4-8h， 再放真空冻干机中干燥，即得到猪繁殖与呼吸综合征病毒脂质体稀释液冻干制品。6. 如权利要求5所述的一种猪繁殖与呼吸综合征病毒脂质体稀释液冻干制品的制备方 法，其特征在于所述的PBS溶液通过以下步骤制得:取氯化钠6-10g、氯化钾0.05-0.5g、磷酸 氢二钠1-1.2g、磷酸二氢钾0.05-0.5g、氯化钙0.05-0.2g、含6个结晶水的氯化镁0. Οδ-Ο.2g; 将以上各成分混合后，溶于 1000ml 双蒸水中 ，经 116°C，高压灭菌 30 分钟即得。
【文档编号】A61K47/26GK106074404SQ201610678206
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年8月17日 公开号201610678206.9, CN 106074404 A, CN 106074404A, CN 201610678206, CN-A-106074404, CN106074404 A, CN106074404A, CN201610678206, CN201610678206.9
【发明人】沈建军, 张秀文, 李阳
【申请人】浙江美保龙生物技术有限公司