一种多肽或其衍生物在预防和/或治疗高血压性心肌肥厚中的应用
【专利摘要】本发明公开了一种可特异性结合TRB3的多肽或多肽衍生物或多肽嵌合肽在制备预防和/或治疗高血压性心肌肥厚药物或疫苗中的应用；所述的多肽的氨基酸序列为SEQ ID NO：1所示序列，所述的多肽衍生物的氨基酸序列为SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与SEQ ID NO：1的氨基酸残基序列相同活性的由SEQ ID NO：1衍生的氨基酸序列，所述的多肽嵌合肽为所述多肽或多肽衍生物与细胞穿膜肽连接所形成的嵌合肽。本发明还进一步公开了编码所述多肽或多肽衍生物的核苷酸片段，以及包含所述多肽或多肽衍生物或多肽嵌合肽以及其核苷酸序列的药物组合物在制备预防和/或治疗高血压性心肌肥厚的药物或疫苗中的应用。
【专利说明】
一种多肽或其衍生物在预防和/或治疗高血压性心肌肥厚中 的应用
技术领域
[0001] 本发明属于医药技术领域，涉及一种多肽或多肽衍生物或多肽嵌合肽在制备预防 和/或治疗高血压性心肌肥厚的药物或疫苗中的应用。
【背景技术】
[0002] 心肌肥厚是血压升高和后负荷增加最初的生理适应性反应，也是许多心血管疾 病，如高血压、心肌梗死、心脏瓣膜病、心肌病等共同的病理生理过程。尽管通过药物干预可 将血压控制于正常范围，但心肌肥厚仍将不可避免地逐渐进展至慢性心力衰竭。事实上心 肌肥厚是心血管疾病的一个独立危险因素，成倍地增加心血管疾病的死亡率。对于心肌肥 厚的治疗目前仍局限于扩张血管，降低心肌收缩力和降低后负荷等，很少直接针对心肌肥 大的形成过程进行干预。心肌肥厚主要表现为心肌细胞的肥大和间质成分的改变，心脏顺 应性和循环栗功能降低，同时心肌肥厚病理的发生发展与炎症因子白介素6、白介素17A的 分泌密切相关。
[0003] 自噬是生物进化过程中产生的一种细胞蛋白和细胞器的循环利用机制，参与多种 疾病如神经退行性疾病、癌症及心脏疾病等的病理过程。在正常心脏中，存在着低水平的自 噬活动，若自噬缺陷可引起心功能不全、心肌肥厚甚至心力衰竭。自噬为机体病变的一种重 要防御机制，经典的自噬被定义为通过溶酶体途径清除细胞内冗余、错误折叠蛋白以及损 伤细胞器，防止氧自由基堆积与炎症。P62是自噬过程中重要的"货车蛋白"。P62蛋白结构域 中含有泛素相关结构域（Ubiquitin associated domain，UBA)，与泛素化蛋白 ((Ubiquitin，Ub)结合，作为"货车"将受损细胞器或蛋白募集于自噬小体膜上的LC3,这个 过程主要通过P62蛋白的LIR(LC3-Interacting Region，LIR)结构域实现，介导泛素化蛋白 的降解，同时，P62的表达水平也随之降低。当自噬受到抑制或自噬流被阻断时，P62与其结 合的泛素化蛋白不能及时降解，在胞浆内堆积而表达升高。胞浆内P62可与氧化应激形成恶 性循环，造成细胞毒性，促进炎症发生发展。
[0004] TRB3(Tribbles Homologue 3)是Tribbles同源蛋白家族成员之一，最早在果绳中 被鉴定到，并发现该蛋白能抑制有丝分裂，调节发育过程中细胞的增殖、迀移及形态形成。 在哺乳动物中，有三种Tribbles同源蛋白：TRB1，TRB2和TRB3，它们都是假激酶蛋白家族成 员。这三种蛋白都含有Ser/Thr蛋白激酶样结构域(Kinase like domain，KD)，但却缺乏ATP 的结合位点和催化残基，因此没有激酶活性。尽管如此，Tribbles蛋白却具有接头蛋白样的 功能，参与多种蛋白复合体的组装。在哺乳动物Tribbles家族成员中，TRB3的研究最为深 入，其相互作用蛋白包括转录因子、泛素连接酶、细胞膜上II型BMP受体以及MAPK、PI3K信号 通路成员。通过与这些蛋白相互作用，TRB3参与了糖脂代谢、脂肪细胞分化、凋亡、应激和胶 原表达等的调控。近来多种证据表明，TRB3在高血压性心肌肥厚相关疾病的发生发展过程 中都具有重要的调节作用，腹主动脉结扎诱导的高血压小鼠心脏组织中TRB3的表达明显升 尚，提不TRB3可能是治疗尚血压性心肌肥厚及其相关性疾病的潜在革巴点。
[0005] 有研究指出，TRB3与自噬底物p62相互结合，阻断自噬。因此，研究和开发TRB3蛋白 的抑制剂，或者阻断其与P62蛋白结合的物质，具有很好的恢复自噬流，治疗高血压性心肌 肥厚及其相关性疾病发生和发展的成药前景。
【发明内容】
[0006] 本发明所要解决的技术问题是提供一种能特异性结合TRB3的多肽或多肽衍生物 或多肽嵌合肽、以及编码该多肽或其衍生物或多肽嵌合肽的核苷酸片段、以及含有上述多 肽或多肽衍生物或多肽嵌合肽或其核苷酸片段的药物组合物在制备治疗和/或预防高血压 性心肌肥厚药物或疫苗中的应用。
[0007] 本发明提供的技术方案第一方面是:一种可特异性结合TRB3的多肽或多肽衍生物 或多肽嵌合肽在制备预防和/或治疗高血压性心肌肥厚药物或疫苗中的应用;其特征在于：
[0008] 所述的多肽的氨基酸序列为SEQ ID NO: 1所示序列，所述的多肽衍生物的氨基酸 序列为SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且 具有与SEQ ID NO: 1的氨基酸残基序列相同活性的由SEQ ID NO: 1衍生的氨基酸序列，所述 的多肽嵌合肽为所述多肽或多肽衍生物与细胞穿膜肽连接所形成的嵌合肽。
[0009] 本发明中，所述的多肽衍生物，是指在所述的多肽(SEQ ID N0:1所示序列）中适当 引入氨基酸的替换，缺失或添加，只要改变后的氨基酸序列仍然能够形成能与TRB3特异性 结合的多肽且该多肽仍然保持改变前的活性即可。
[0010] 本发明中，所述的细胞穿膜肽的氨基酸序列如序列表中SEQ ID N0: 2~SEQ ID NO :7中的任一种所示。
[0011] 本发明中，所述的细胞穿膜肽为本领域常规所述的细胞穿膜肽，只要其能辅助将 所述多肽送入细胞以发挥作用即可，一般而言，所述的细胞穿膜肽为由10~30个氨基酸组 成的短肽分子。所述的细胞穿膜肽较佳地为Pep2多肽，其氨基酸序列如SEQ ID N0:2所示； 即在本发明中，所述的多肽嵌合肽较佳地为以Pep2多肽连接如SEQ ID N0:1所示序列中的 嵌合多肽。所述的细胞穿膜肽还可以为HIV-1病毒反转录激活因子（Trans-activator transcription，Tat)蛋白的TAT肽(YGRKKRRQRRR，其氨基酸序列如SEQ ID:3所示）、果蝇触 角同源异型蛋白的转录因子Antp肽(RQIKIWFQNRRMKWKK，其氨基酸序列如SEQ ID:4所示）、 Pep-Ι 肽（KETWWETWWTEWSQPKKKRKV，其氨基酸序列如SEQ ID : 5所示）、MPG肽 (GALFLGFLGAAGSTMGAWSQPKSKRKV，其氨基酸序列如SEQ ID:6K*WPRO^ic(Arg-Gly-Asp， 其氨基酸序列如SEQ ID N0:7所示）中的任一种或多种。所述细胞穿膜肽较佳地连接在所述 多肽的N端或者C端，更佳的是N端。
[0012] 本发明提供的技术方案第二方面是:一种核苷酸片段在制备预防和/或治疗高血 压性心肌肥厚药物或疫苗中的应用，其特征在于，该核苷酸片段为可编码一种可特异性结 合TRB3的多肽或多肽衍生物或多肽嵌合肽的核苷酸片段；
[0013] 其中，所述的核苷酸片段包含所有生物信息学可接受的可编码一种可特异性结合 TRB3的多肽或多肽衍生物或多肽嵌合肽的核苷酸片段；
[0014]其中，所述的多肽的氨基酸序列为SEQ ID NO: 1所示序列，所述的多肽衍生物的氨 基酸序列为SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添 加且具有与SEQ ID NO: 1的氨基酸残基序列相同活性的由SEQ ID NO: 1衍生的氨基酸序列， 所述的多肽嵌合肽为所述多肽或多肽衍生物与细胞穿膜肽连接所形成的嵌合肽。
[0015] 本发明提供的技术方案第三方面是:一种药物组合物在制备预防和/或治疗高血 压性心肌肥厚药物或疫苗中的应用，其特征在于，该药物组合物可以以单一或联合的方式 包含可特异性结合TRB3的多肽或多肽衍生物或多肽嵌合肽和/或其核苷酸片段，以及药学 上可接受的载体或赋形剂；
[0016] 其中，所述的多肽的氨基酸序列为SEQ ID NO: 1所示序列，所述的多肽衍生物的氨 基酸序列为SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添 加且具有与SEQ ID NO: 1的氨基酸残基序列相同活性的由SEQ ID NO: 1衍生的氨基酸序列， 所述的多肽嵌合肽为所述多肽或多肽衍生物与细胞穿膜肽连接所形成的嵌合肽。
[0017] 本发明中，所述的多肽、所述的多肽衍生物或多肽嵌合肽、所述的核苷酸片段可以 与其他抗高血压性心肌肥厚药物单独或联合应用。
[0018] 本发明中，所述的药物组合物可以包含生理学或药学上可接受的载体，所述的载 体可以为任意合适的生理学或药学上可接受的药物辅料，较佳地选自壳聚糖及其衍生物、 卡波姆和脂质体中的一种或多种。因此，在本发明中，所述的多肽或所述多肽的衍生物或多 肽嵌合肽较佳地与所述药物辅料组成药物组合物。所述的药物组合物可以为本领域常规所 述的各种剂型，较佳地是固体、半固体或液体的形式，可以是水溶液、非水溶液或混悬液，更 佳地是片剂、胶囊、颗粒剂、注射剂或输注剂等。所述药物组合物的给药途径较佳地为注射 给药或口服给药，所述注射给药较佳地包括:静脉注射、肌肉注射、腹腔注射、皮内注射或皮 下注射途径给药。
[0019] 本发明所述的药物组合物在治疗时的使用剂量根据患者的年龄和病情而定，使用 剂量较佳地为〇 · 1~15mg/kg，更佳地为5~10mg/kg，最优选为5mg/kg，给药次数较佳地为一 天一次或数次。
[0020] 本发明中，所述的高血压性心肌肥厚为本领域常规所指的病理状态，包括心室异 常重构，心肌细胞体积增大，心脏质量增加，纤维组织增生，炎症因子白介素6、白介素17A高 度表达。
[0021] 在符合本领域常识的基础上，上述的各优选条件可任意组合，即得本发明各较佳 实例。
[0022] 本发明所用试剂和原料除特别说明之外，均市售可得。
[0023]有益技术效果
[0024]本发明的多肽或多肽衍生物能够特异性地与TRB3结合，从而阻断TRB3与P62蛋白 的相互作用，恢复自噬流，该肽段的嵌合肽Pep2-A2可以治疗小鼠高血压性心肌肥厚，具有 非常显著的疗效。
【附图说明】
[0025]图1为用表面等离子共振方法验证多肽A2与蛋白TRB3的动力学结合曲线。其中右 图为A2和TRB3的结合曲线。
[0026]图2为用免疫共沉淀的方法验证在细胞水平多肽A2的嵌合肽Pep2-A2对蛋白TRB3 和P62相互作用的影响。
[0027]图3为高血压性心肌肥厚小鼠心脏重量及心肌细胞大小较对照组增加。其中上图 为心脏大小典型图，下图为心肌细胞大小典型图，右图为其重量及面积统计结果。
[0028]图4为高血压性心肌肥厚小鼠心室壁厚度和心功能的改变。左图为典型超声心动 图，右图为小鼠心室后壁(LVPWd)、组织多普勒的舒张功能(E/E'）、射血分数(EF)的统计结 果。
[0029] 图5为高血压性心肌肥厚小鼠心脏出现纤维组织增生和炎性细胞浸润病理典型 图。
[0030] 图6为用竞争酶联免疫吸附法(ELISA)验证高血压性心肌肥厚病变部位白介素6、 17A表达水平增加。
[0031] 图7为用免疫荧光方法证明高血压性心肌肥厚病变部位TRB3聚集水平增加。
[0032]图8为用免疫印迹方法证明高血压性心肌肥厚病变部位TRB3表达增加。
[0033]图9为给予Pep2_A2治疗后降低高血压性心肌肥厚小鼠死亡率。
[0034]图10给予Pep2_A2治疗后可降低高血压性心肌肥厚小鼠心脏重量及心肌细胞大 小。上图为心脏大小典型图，下图为心肌细胞大小典型图，右图为其重量和面积统计结果。 [0035]图11给予Pep2_A2治疗后降低高血压性心肌肥厚小鼠心室壁厚度和改善心功能。 左图为超声心动典型图，右图为为小鼠心室后壁(LVPWd)、组织多普勒的舒张功能(E/E'）、 射血分数(EF)的统计结果。
[0036]图12为用免疫荧光方法证明给予Pep2_A2治疗后高血压性心肌肥厚病变部位P62 聚集降低。
[0037]图13为用免疫印迹方法证明给予Pep2_A2治疗后高血压性心肌肥厚病变部位P62 表达降低。
[0038]图14给予Pep2_A2治疗后改善心脏纤维组织增生和炎性细胞浸润。左图为病理典 型图，右图为纤维组织及炎性细胞浸润面积统计结果。
[0039]图15给予Pep2-A2治疗后降低心肌肥厚病变部位白介素6、17A水平。
【具体实施方式】
[0040] 下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实 施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商 品说明书选择。
[0041] 下述实施例中，部分物质的全称或相应的中文名称如下：
[0042] AAC:腹主动脉结扎
[0043] IL:白介素
[0044] BSA:牛血清白蛋白
[0045] DMEM: -种含各种氨基酸和葡萄糖的培养基 [0046] SDS:十二烷基硫酸钠
[0047] PVDF:聚偏氟乙烯
[0048] PBST:Phosphate Buffered Saline with Tween-20,ρΗ7·5,10x，去污缓冲液
[0049] ECL:电化学发光
[0050] TRB3:Tribbles 同源蛋白 3
[0051] DAPI:聚偏二氟乙烯
[0052] A2:序列如SEQ ID N0:1所示的多肽
[0053] Pep2:序列表中SEQ ID NO:2所示细胞穿膜肽
[0054] 下述实施例中，多肽A2连接Pep2细胞穿膜肽后形成的嵌合多肽称为Pep2_A2,上述 多肽或嵌合肽均由北京赛百盛基因技术有限公司人工合成。A2通过两个谷氨酸链连接到 Pep2的C端。以上嵌合肽的序列结构如下：
[0055] Pep2_A2 的序列为：
[0056] "N"-His-Leu-Tyr-Val-Ser-Pr〇-Trp-Gly-Gly-Gly-Gly-Trp-Leu-Thr_Arg-Leu-Leu-Gln-Thr-Lys-"(T (其序列如序列表中SEQ ID N0:8所示）。
[0057] 下述实施例中所述室温如本领域常规所述，一般指15~25°C。
[0058]实施例1:筛选与TRB3蛋白结合的肽段及其生物学功能鉴定。
[0059]与TRB3蛋白结合的肽段的具体筛选方法及鉴定参考专利：与TRB3蛋白特异性结合 的多肽，其筛选方法、鉴定和用途(发明名称），申请号:201310206907.9。具体如下：
[0060] (1)用表面等离子共振的方法筛选与TRB3蛋白结合的肽段。
[0061]首先将P62蛋白分段截短成不同的多肽片段，用多肽固相合成仪进行肽段合成，此 过程由北京赛百盛基因有限公司进行。实施例整个筛选过程在表面等离子共振仪Biacore T200中进行。
[0062] 筛选方法如下：
[0063] (1)将纯化的蛋白TRB3(购自R&D公司）通过氨基偶联到CM5芯片上（购自GE公司）， 以10yL/min的流速洗去未结合的蛋白，并且平衡芯片表面2小时。
[0064] (2)将不同浓度的250yL多肽片段(200，50，12.5，6.25nM)自动进样，整个过程在25 °C进行。所使用的缓冲液为HBS-EP缓冲液(0.01M HEPES，0.15M NaCl，3mM EDTA，0.005%表 面活性剂）。
[0065] (3)用Biacore T200自带分析软件模拟不同浓度多肽与TRB3的结合曲线，得出图1 中与TRB3蛋白结合能力较强的肽段A2 <^2序列如下：
[0066] A2：Gly-Gly-Trp-Leu-Thr-Arg-Leu-Leu-Gln-Thr-Lys
[0067] 图1中的横坐标为反应时间，单位为秒。纵坐标为反应芯片表面与多肽的反应强 度，单位为RU。结果表明从P62蛋白结构域中截取的肽段中，A2肽段与TRB3蛋白有较高的亲 和力。
[0068] (2)免疫共沉淀的方法验证嵌合肽Pep2_A2可以在细胞水平竞争蛋白p62与蛋白 TRB3的结合。
[0069]将肽段A2连接上细胞穿膜肽Pep2(序列为HLYVSPW)，组成新的嵌合肽Pep2-A2,此 肽段由赛百盛基因技术有限公司进行合成，纯度>98%。
[0070] 免疫共沉淀试剂如下：
[0071] 裂解液 A 液：0.6057g Tris 碱，1.7532g NaCl，0.1017g MgC12 · 6H20,0.0742g EDTA，10mL甘油，10mL10%NP40,加去离子水至150mL，用盐酸调pH值至7.6，定容至19111^，充 分混匀，使用0.45μηι滤膜过滤，4 °C储存。
[0072] 裂解液B液：200yL 2Μβ-磷酸甘油，4mL 2.5M NaF，2mL 100mM NaV03,2mL 100mM PMSF，200yL 1M DTT，lmg/mL的 Leu、Pep、Apr各200yL，总体积共9mL。母液于-20 °C 储存。使用 前，将B液中各成分的母液解冻，分别按上述组成比例加入A液中并混匀。
[0073] Protein A/G Plus-Agarose购自美国Santa cruz公司。
[0074] 具体操作步骤如下：
[0075] (1)将人上皮肾293T细胞铺90mm大皿，待细胞贴壁后加入lmg/ml的多肽Pep2-A2， 孵育12小时后收集细胞。
[0076] (2)以免疫共沉淀裂解液裂解细胞，收获细胞总蛋白约4-10mg，将各组蛋白调整至 相同浓度。每组蛋白各取200yg，留作细胞裂解液Input作为对照。
[0077] (3)剩余蛋白加入2yg P62抗体或者与P62抗体种属相同的Normal IgG，同时加入 10yL Protein A/G Plus-Agarose充分重悬，4°C缓慢旋转摇动过夜。4°C、3000rpm离心 5min，小心吸除上清，宁可留下少量上清也不能吸到Agarose。加入0.5mL免疫共沉淀洗液， 混匀，冰浴静置111^11，4°(：、3000印111离心30 8况，小心吸除上清。重复洗涤5次，最后一次离心 前静置5min。小心吸除上清，加入20-30yL 2 X SDS凝胶加样缓冲液，混匀，95°C变性3min，迅 速转移至冰浴冷却。12000rpm室温离心2min，上清即为沉淀的蛋白样品，取部分或全部进行 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。
[0078] 实施例2:高血压性心肌肥厚小鼠模型的建立及测评。
[0079] (1)高血压性心肌肥厚小鼠模型的建立
[0080] SPF级ICR小鼠（雄性，7-8周龄)购自北京维通利华实验动物技术有限公司，饲养于 中国医学科学院药物研究所实验动物中心，恒温恒湿，自由饮食。小鼠适应性饲养一周后， 以4%水合氯醛10ml/kg的剂量腹腔注射麻醉ICR小鼠，无菌条件下开腹，分离腹主动脉，在 右肾动脉上方沿腹主动脉用4号丝线将其与外径为0.6mm的注射针头一并扎紧，迅速将针头 移去，逐层缝合关腹。假手术(sham)组不做丝线结扎，其他处理相同。术后正常饲养30天，模 型建立。
[0081] (2)高血压性心肌肥厚小鼠模型的测评。
[0082] 1)高血压性心肌肥厚小鼠心脏重量及心肌细胞大小的测定。
[0083] 获取高血压性心肌肥厚对照与病变小鼠心脏并称重，并获取高血压性心肌肥厚对 照与病变部位的组织及石蜡切片，进行苏木素&伊红(H&E)染色（由北京雪邦科技有限公司 实施）。使用光学显微镜观察与拍照，标尺=20微米。
[0084] 结果如图3所示，相比于对照组，高血压性心肌肥厚小鼠心脏较对照组增大，心肌 细胞肥大。
[0085] 2)超声心动检测评价小鼠心脏功能和形态。
[0086]实验结束前一日，小鼠按50mg/kg剂量腹腔注射戊巴比妥钠进行麻醉后，对其胸腹 部进行脱毛处理，仰卧位固定于超声检测台，使用VisualSonics Vevo 770(VisualSonics， 加拿大)超声系统进行检测：先用l〇M Hz超声探头对小鼠心脏长轴方向进行B型超声监测， 确定左心室乳头肌位置后，再转为心脏短轴方向进行监测，并记录其10~20个心动周期的Μ 型超声变化图及多普勒超声图；用Vev〇770软件分别测量舒张末期小鼠心室后壁(LVPWd)、 组织多普勒的舒张功能(E/E'）、射血分数(EF)等各项心脏结构和心功能指标。
[0087] 结果如图4所示，相比于对照组，高血压性心肌肥厚小鼠舒张末期小鼠心室后壁厚 度增加，组织多普勒的舒张功能增强，射血分数降低。
[0088] 3)高血压性心肌肥厚小鼠心脏出现纤维组织增生和炎性细胞浸润。
[0089] 获取高血压性心肌肥厚对照与病变小鼠心脏，经4%多聚甲醛固定，石蜡包埋并进 行横切，经苏木素-伊红(HE)染色，评价整体心脏炎性细胞浸润改变。组织切片经马松染色 后偏振光显微镜下观察，确定心脏纤维胶原沉积情况判断纤维化程度，并应用高清晰彩色 病理图文分析系统Spot Advanced 3.0获得高清晰的马松特殊染色的病理图片（200倍放 大）。使用Image-Pro Plus 5.1测量每个视野天狼星红染色后胶原着色面积。每组分析6-8 个标本，每个标本随机选取10个视野，取均值代表一个动物胶原组织在心脏组织内的含量 和表达强度。通过非参数方差分析比较各组"胶原绝对面积"。
[0090] 结果如图5所示，相比于对照组，高血压性心肌肥厚小鼠出现较严重的组织纤维化 及免疫细胞浸润。
[0091] 4)用竞争酶联免疫吸附法(ELISA)验证高血压性心肌肥厚病变部位白介素6、17A 表达水平。
[0092]具体操作步骤如下：
[0093] (1)将小鼠 IL-2、IL-4、IL-6、TNF- γ、IL-17、IL-10蛋白及BSA用PBS稀释至 10μ1/ ml，每孔添加 100μΙ，4°C包被96孔ELISA板过夜。
[0094] (2)用含有0.1%Tween-20PBS 洗三次。用 200μ1 封闭液（10%BSA-PBS)包板，37°C 包 被2h。
[0095] (3)倒掉包被液，对应加入高血压性心肌肥厚病变部位及对照组正常部为蛋白溶 液200μ1，37Γ 孵育 lh。
[0096] (4)用含有0.1%TWeen-20PBS洗五次。于各反应孔中加新鲜稀释的酶标抗体 0. lml。37°C孵育0.5~1小时。
[0097] (5)用含有0.1%Tween-20PBS洗六次。配制底物显色液（100mmol/L乙酸钠 ，PH 6.0，每50ml缓冲液加入10μ1 30 %过氧化氢，100μg/mlTMB)，每孔加入100μΙ，室温孵育 5min。每孔加入50μ1 0.1Μ稀硫酸，终止反应。
[0098] (6)结果以样品孔的0D450值绘制柱状图。
[0099] 结果如图6所示，相比于对照组，高血压性心肌肥厚小鼠病变组织中IL-6，IL-17含 量较对照组增高，其余炎性指标变化不明显。
[0100] 5)免疫荧光方法证明高血压性心肌肥厚病变部位TRB3水平增加。
[0101] 具体操作如下：
[0102] (1)获取高血压性心肌肥厚对照与病变部位的冰冻切片（由北京雪邦科技有限公 司实施）。
[0103] (2)PBS 洗 5 遍。
[0104] (3)用TRB3-抗4°C孵育过夜。
[0105] (4)次日 PBS 洗 5 遍。
[0106] (5)用特异性二抗(购自北京中衫金桥有限公司），37度孵育半小时，PBS洗5遍。
[0107] (6)用含有抗淬灭剂的DAP I (购自北京中衫金桥有限公司)封片。
[0108] (7)待片子风干后用激光共聚焦显微镜扫描TRB3蛋白，结果见图6,标尺=50微米。
[0109] 结果如图7所示，高血压性心肌肥厚病变部位TRB3水平较对照组增加。
[0110] 6)免疫印迹方法证明高血压性心肌肥厚病变部位TRB3表达增加。
[0111] 具体操作步骤如下：
[0112] (1)用小剪刀剪碎并裂解高血压性心肌肥厚：对照与病变部位组织，并于4°C、 12000rpm离心30min，小心收取除上清；
[0113] (2)调整蛋白浓度相同，按体积比4:1加入5xloading buffer(购自北京普利莱基 因有限公司，即5xSDS-PAGE非还原性蛋白上样缓冲液B1030)
[0114] (3)上样至SDS电泳凝胶，电泳后，取胶，使用电转仪将蛋白转至PVDF膜。
[0115] (4)使用10%BSA封闭，按抗体说明书比例分别加入稀释特异性抗TRB3-抗(购自 美国CST公司），4°C孵育12h。
[0116] (5)使用PBST在摇床中室温洗涤6x8min，按说明书比例稀释辣根酶标记的二抗，室 温孵育2h。
[0117] (6)使用PBST在摇床中室温洗涤6x8min。
[0118] (7)使用ECL发光液曝光，使用ECL4000(购自北京普利莱基因有限公司，Super ECL Plus超敏发光液P1010)成像。以GAPDH(购自美国CST公司）作为内参，GAPDH斑块灰度一致表 明细胞总蛋白数目一致。
[0119] 结果如图8所示高血压性心肌肥厚病变部位TRB3水平较对照组增加。
[0120] 实施例3:给予Pep2_A2治疗小鼠高血压性心肌肥厚。
[0121] 小鼠高血压性心肌肥厚模型的建立和测评见实施例2,本实施例是在实施例2建立 的小鼠模型基础上，给予P印2-A2治疗后，检测治疗效果。
[0122] (1)给予Pep2_A2治疗后降低高血压性心肌肥厚小鼠死亡率。
[0123] 具体操作步骤如下：
[0124] SPF级ICR小鼠（雄性，7-8周龄)购自北京维通利华实验动物技术有限公司，饲养于 中国医学科学院药物研究所实验动物中心，恒温恒湿，自由饮食。小鼠适应性饲养一周后， 按体重随机分为3组:对照组20只，腹主动脉结扎(AAC)并给予对照多肽(剂量:5mg/kg，腹腔 注射)组20只，腹主动脉结扎(AAC)并给予Pep2-A2治疗(剂量:5mg/kg，腹腔注射)组20只。每 日记录小鼠死亡情况。
[0125] 结果如图9所示，给予Pep2_A2治疗后可降低小鼠的死亡率。
[0126] (2)给予Pep2_A2治疗后可降低高血压性心肌肥厚小鼠心脏重量及心肌细胞大小。
[0127] 给药方式同实施例3(1)，心脏重量及心肌细胞大小测定同实施例2中（2)中1)。
[0128] 结果如表1及图10所示，给予PeP2-A2治疗后可降低高血压性心肌肥厚小鼠心脏重 量及心肌细胞大小。
[0129] 表1.小鼠心脏重量
[0131] (3)给予Pep2_A2治疗后降低高血压性心肌肥厚小鼠心室壁厚度和改善心功能。
[0132] 给药方式同实施例3(1)，心室壁厚度和心功能的测定同实施例2中（2)中2)。
[0133] 结果如表2图10所示，给予Pep2_A2治疗后降低高血压性心肌肥厚小鼠心室壁厚度 和改善心功能。
[0134] 表2.小鼠心室壁厚度及射血分数
[0136] (4)免疫荧光方法证明给予Pep2_A2治疗后高血压性心肌肥厚病变部位P62表达降 低。
[0137] 给药方式同实施例3(1)，免疫荧光方法同实施例2中（2)中5)。
[0138] 结果如图12所示，给予Pep2_A2治疗后降低高血压性心肌肥厚病变部位P62聚集。
[0139] (5)免疫印迹方法证明高血压性心肌肥厚病变部位TRB3表达增加。
[0140] 给药方式同实施例3(1)，免疫印迹方法同实施例2中（2)中6)。
[0141] 结果如图13所示，给予Pep2_A2治疗后降低高血压性心肌肥厚病变部位P62表达。
[0142] (6)给予Pep2_A2治疗后改善心脏纤维组织增生和炎性细胞浸润。
[0143] 给药方式同实施例3(1)，心脏纤维组织增生和炎性细胞浸润测定同实施例2中（2) 中3)。
[0144] 结果如图14所示，给予Pep2_A2治疗后降低心脏纤维组织增生和炎性细胞浸润面 积。
[0145] (7)给予Pep2_A2治疗后降低心肌肥厚病变部位白介素6、17A含量水平。
[0146] 给药方式同实施例3(1)，竞争酶联免疫吸附法测定同实施例2中（2)中4)。
[0147] 结果如表3图15所示，给予Pep2_A2治疗后降低心肌肥厚病变部位白介素6、17A水 平，说明病变组织炎性微环境得到改善。
[0148] 表3.心脏中各细胞因子含量(单位:pg/ml)
[0149]
【主权项】
1. 一种可特异性结合TRB3的多肽或多肽衍生物或多肽嵌合肽在制备预防和/或治疗高 血压性心肌肥厚药物或疫苗中的应用;其特征在于： 所述的多肽的氨基酸序列为SEQ ID NO: 1所示序列，所述的多肽衍生物的氨基酸序列 为SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有 与SEQ ID NO: 1的氨基酸残基序列相同活性的由SEQ ID NO: 1衍生的氨基酸序列，所述的多 肽嵌合肽为所述多肽或多肽衍生物与细胞穿膜肽连接所形成的嵌合肽。2. 根据权利要求1的应用，其特征在于，所述的细胞穿膜肽的氨基酸序列如序列表中 SEQ ID N0:2~SEQ ID N0:7中的任一种所示。3. -种核苷酸片段在制备预防和/或治疗高血压性心肌肥厚药物或疫苗中的应用，其 特征在于，该核苷酸片段为编码一种可特异性结合TRB3的多肽或多肽衍生物或多肽嵌合肽 的核苷酸片段； 其中，所述的多肽的氨基酸序列为SEQ ID NO: 1所示序列，所述的多肽衍生物的氨基酸 序列为SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且 具有与SEQ ID NO: 1的氨基酸残基序列相同活性的由SEQ ID NO: 1衍生的氨基酸序列，所述 的多肽嵌合肽为所述多肽或多肽衍生物与细胞穿膜肽连接所形成的嵌合肽。4. 一种药物组合物在制备预防和/或治疗高血压性心肌肥厚药物或疫苗中的应用，其 特征在于，该药物组合物可以以单一或联合的方式包含可特异性结合TRB3的多肽或多肽衍 生物或多肽嵌合肽和/或其核苷酸片段，以及药学上可接受的载体或赋形剂； 其中，所述的多肽的氨基酸序列为SEQ ID NO: 1所示序列，所述的多肽衍生物的氨基酸 序列为SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且 具有与SEQ ID NO: 1的氨基酸残基序列相同活性的由SEQ ID NO: 1衍生的氨基酸序列，所述 的多肽嵌合肽为所述多肽或多肽衍生物与细胞穿膜肽连接所形成的嵌合肽。5. 根据权利要求4的应用，其特征在于，所述的多肽、所述的多肽衍生物、所述的核苷酸 片段可以与其他抗高血压性心肌肥厚药物单独或联合应用。6. 根据权利要求1-5任一项的应用，其特征在于，所述的高血压性心肌肥厚为高血压心 肌肥厚所引起的心室异常重构、和/或心脏质量增加、和/或心脏组织纤维化、和/或炎症因 子白介素6表达增尚、和/或炎症因子白介素17A表达增尚。
【文档编号】A61K38/10GK106063928SQ201610262690
【公开日】2016年11月2日
【申请日】2016年4月25日 公开号201610262690.7, CN 106063928 A, CN 106063928A, CN 201610262690, CN-A-106063928, CN106063928 A, CN106063928A, CN201610262690, CN201610262690.7
【发明人】胡卓伟, 林珩, 刘晓波, 李珂, 花芳
【申请人】中国医学科学院药物研究所