抑制肿瘤细胞增殖的干细胞制剂及其制备方法和应用
【专利摘要】本发明涉及一种抑制肿瘤细胞增殖的干细胞制剂，包括间充质干细胞、白蛋白和添加物；其中，所述添加物包括NSADs、逆转录酶抑制剂、原花青素和竹红菌乙素。本发明通过采用间充质干细胞与治疗肿瘤的添加物相结合，一方面通过间充质干细胞，影响肿瘤细胞周期变化，从而诱导肿瘤细胞死亡；另一方面，通过间充质干细胞将添加物运送并作用于肿瘤细胞，从而发挥添加物对肿瘤细胞的杀伤作用。
【专利说明】
抑制肿瘤细胞増殖的干细胞制剂及其制备方法和应用
技术领域
[0001] 本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种抑制肿瘤细胞增殖的干细胞制剂及其制 备方法和应用。
【背景技术】
[0002] 目前，为了开发适于癌症的治疗及症状减轻的治疗方法，一直在进行大量研究。作 为癌症的治疗方法，适宜地使用化学疗法、放射线疗法及外科疗法所谓的三大疗法。放射线 疗法具有作为急性反应及晚期反应的副作用，放射线对正常细胞与癌细胞同时给予损伤， 因此，有可能引起疲倦感、食欲不振、红斑等皮肤障碍、来自消化器官的出血、白细胞等的减 少、脱发等多种多样的问题。另外，外科疗法在精神、体力上对患者的负担大，有可能因手术 而引起后遗症或并发症。另外，也存在如下问题:在外科上难以切除的部位产生癌症的情况 下不能适用。
[0003] 另一方面，在化学疗法的领域，作为对癌细胞有效的抗肿瘤剂发现了抗生素、代谢 拮抗物、烷基化剂、激素剂等。但是，这些抗肿瘤剂不仅攻击癌细胞，而且对正常细胞也起作 用，因此，引起呕吐、恶心、食欲不振、脱发等副作用，产生使患者的Q0L显著降低的问题。因 此，期望安全性更高、副作用小的新型的抗肿瘤剂的开发。
【发明内容】
[0004] 本发明所要解决的技术问题是，针对现有技术中治疗肿瘤的药物治疗效率差、副 作用大等缺陷，提供一种能够提高治疗效率且副作用较小的抑制肿瘤细胞增殖的干细胞制 剂及其制备方法和应用。
[0005] 本发明解决其技术问题所采用的技术方案是:提供一种抑制肿瘤细胞增殖的干细 胞制剂，包括间充质干细胞、白蛋白和添加物;其中，所述添加物包括NSADs、逆转录酶抑制 剂、原花青素和竹红菌乙素。
[0006] 在本发明提供的抑制肿瘤细胞增殖的干细胞制剂中，所述间充质干细胞的浓度为 (l~5)Xl〇MVml。
[0007] 在本发明提供的抑制肿瘤细胞增殖的干细胞制剂中，所述逆转录酶抑制剂的浓度 为0·125mol/L-0·500mol/L。
[0008] 在本发明提供的抑制肿瘤细胞增殖的干细胞制剂中，所述原花青素的浓度为0.05 ~0·lmmol/L〇
[0009] 在本发明提供的抑制肿瘤细胞增殖的干细胞制剂中，所述竹红菌乙素的浓度为 0·5~1·5mol/L〇
[0010] 在本发明提供的抑制肿瘤细胞增殖的干细胞制剂中，所述NSADs的浓度为15~ 50mg/ml〇
[0011] 在本发明提供的抑制肿瘤细胞增殖的干细胞制剂中，所述白蛋白的质量分数为 0.5 ~2%〇
[0012] 本发明提供一种抑制肿瘤细胞增殖的干细胞制剂的制备方法，包括以下步骤：
[0013] 获取间充质干细胞，用基础培养基重悬间充质干细胞后加入白蛋白，获得干细胞 混悬液，然后将NSADs、逆转录酶抑制剂、原花青素和竹红菌乙素添加物混合后逐滴加入所 述干细胞混悬液，边加边混合均匀。
[0014] 在本发明提供的抑制肿瘤细胞增殖的干细胞制剂的制备方法中，所述干细胞混悬 液和添加物的体积比为1: (1~3)。
[0015] 本发明进一步保护上述干细胞制剂在制备肿瘤药物中的应用。
[0016] 实施本发明提供的抑制肿瘤细胞增殖的干细胞制剂及其制备方法和应用，可以达 到以下有益效果:本发明通过采用间充质干细胞与治疗肿瘤的添加物相结合，一方面通过 间充质干细胞，影响肿瘤细胞周期变化，从而诱导肿瘤细胞死亡；另一方面，通过间充质干 细胞将添加物运送并作用于肿瘤细胞，从而发挥添加物对肿瘤细胞的杀伤作用。
【具体实施方式】
[0017] 本发明提供的抑制肿瘤细胞增殖的干细胞制剂，包括间充质干细胞、白蛋白和添 加物;其中，添加物包括NSADs、逆转录酶抑制剂、原花青素和竹红菌乙素。
[0018] 其中，间充质干细胞可通过再循环途径到达肿瘤部位，混合于肿瘤支持细胞之中， 形成肿瘤细胞微环境，因此，将间充质干细胞浸润于抑制肿瘤细胞增殖的添加物中，可通过 间充质干细胞将添加物运送并作用于肿瘤细胞;并且间充质干细胞能够影响肿瘤细胞周期 变化，主要表现为G0/G1期阻滞，而S期细胞减少，抑制肿瘤细胞进入增殖周期，间充质干细 胞参与维持肿瘤细胞的静止状态，减慢其进入细胞周期的速率而导致肿瘤细胞数量减少； 除此之外，间充质干细胞还能够抑制肿瘤细胞的迀移。优选地，间充质干细胞来源于异体， 且间充质干细胞的浓度为（1~5) X 107个/ml。
[0019] NSADs(非留体类抗炎药物)是一类非类固醇激素类的能够消除疼痛、肿胀、四肢僵 直及炎症的药物，配合白蛋白和间充质干细胞使用，用于减轻炎症反应，调节免疫反应，以 提高治疗效率;另外，白蛋白同时能够为间充质干细胞提供一定的营养支持，以使间充质干 细胞保持其细胞活性，延长其存活时间，并提高干细胞制剂的生物相容性，减轻免疫排除反 应。优选地，白蛋白的质量分数为0.5~2 %，NSADs的浓度为15~50mg/ml。
[0020] 逆转录酶抑制剂能够抑制肿瘤细胞的逆转录作用，阻碍细胞反转录导致肿瘤细胞 周期阻断，干扰肿瘤细胞的正常分裂，使肿瘤细胞复制过程终止，从而抑制肿瘤细胞的增 殖。优选地，逆转录酶抑制剂的浓度为0.125mo 1 /L-0.500mo 1 /L。
[0021] 原花青素是一种有着特殊分子结构的生物类黄铜，其生物适应性好，生物利用度 高，毒性低，能够抑制P-糖蛋白功能与表达，从而抑制多种肿瘤细胞生长，促进肿瘤细胞凋 亡，而且还能够拮抗化疗药物对正常细胞的毒性，具有较好的防癌、抗癌功效。优选地，原花 青素的浓度为〇. 05~0.10mmol/L。
[0022] 竹红菌乙素具有良好的光敏活性，而且对正常细胞的毒性较低；且竹红菌乙素及 其衍生物再光和氧的参与下，通过活性氧的作用，竹红菌乙素能够使肿瘤细胞发生形态改 变、DNA碎裂及线粒体脱氢酶活性下降，使细胞阻断于G1期，在G1期峰前出现调性的亚二倍 体凋亡峰，从而使肿瘤细胞凋亡或坏死;除此之外，竹红菌乙素还能够增加肿瘤细胞线粒体 和微粒体膜脂过氧化作用，对肿瘤细胞有明显的杀伤作用。优选地，竹红菌乙素的浓度为 Ο·5~1·5mol/L〇
[0023] 综上所述，本发明提供的抑制肿瘤细胞增殖的干细胞制剂不仅能够高效促进肿瘤 细胞凋亡，而且该干细胞制剂的生物活性较高，毒性较低。
[0024] 进一步地，本发明提供的抑制肿瘤细胞增殖的干细胞制剂的制备方法，包括以下 步骤：
[0025] S1、获取间充质干细胞；
[0026] 步骤S1中，本发明优先采用细胞活性较高的第3~5代任一代的脐带血间充质干细 胞，具体获取过程为：
[0027] S11、原代脐带间充质干细胞的分离培养；
[0028] S12、对原代脐带间充质干细胞进行传代培养至收获第3~5代任一代脐带血间充 质干细胞。
[0029] S2、间充质干细胞混悬液的制备；
[0030] 步骤S2中，采用基础培养培养基重悬步骤S12中获得的第3~5代任一代脐带血间 充质干细胞，然后将白蛋白滴加进脐带血间充质干细胞内，边加边混合，获得干细胞混悬 液。
[0031] S3、干细胞制剂的混合制备。
[0032]将NSADs溶液、逆转录酶抑制剂、原花青素和竹红菌乙素添加物混合后，逐滴加入 步骤S2中获得的干细胞混悬液，每2~5秒滴加一滴，边加边混合均匀，优选地，干细胞混悬 液和添加物的体积比为1: (1~3)，并使得干细胞制剂中，间充质干细胞的终浓度为（1~5) X 107个/ml、逆转录酶抑制剂的终浓度为0.125mol/L-0.500mol/L、原花青素的终浓度为 0.05~0. lmmol/L、竹红菌乙素的终浓度为0.5~1.5mol/L、NSADs的终浓度为15~50mg/ml、 白蛋白的质量分数为0.5~2%，即获得本发明提供的抑制肿瘤细胞增殖的干细胞制剂。
[0033]本发明进一步保护该干细胞制剂在制备肿瘤药物中的应用，其中，肿瘤包括乳腺 癌、卵巢癌、肺癌、食管癌、肝癌、宫颈癌和恶性淋巴瘤等。
[0034]为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明 进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限 定本发明。
[0035] 实施例1
[0036] 本发明提供的抑制肿瘤细胞增殖的干细胞制剂的制备方法，包括以下步骤：
[0037] S1、获取间充质干细胞；
[0038] S11、获取原代间充质干细胞；
[0039]取正常足月健康婴儿脐带，浸泡于生理盐水(每毫升含25U肝素钠）中。超净台内取 出脐带，以含有1 %青-链霉素的ros液充分冲洗脐带外表面，20ml注射器冲洗脐带动、静脉 管腔后，将其置于1%青链霉素的PBS液中10分钟，取出后将其剪切成lmmXlmmXlmm大小的 组织块，在剪切时向所操作的组织上滴加1-2滴培养液，以保持组织湿润。将组织块接种于 培养瓶中，均匀铺放，上置盖玻片，待2h后，再加入间充质干细胞生长培养液，置入37°C且含 有5%C0 2的细胞培养箱中培养。倒置相差显微镜下观察细胞自组织块周边游出、贴壁后，每 隔3d更换培养液。当细胞贴壁生长达70 %以上汇合后，弃组织块，以0.25 %的胰酶/0.02 % EDTA消化。轻轻摇动培养瓶，使消化液覆盖所有细胞表面，倒置显微镜下观察，见细胞间隙 增大，胞质回缩，用血清终止消化，即获得原代间充质干细胞。
[0040] S12、传代培养；
[0041 ]接步骤S11，反复轻吹瓶壁细胞，制成单细胞悬液，取一滴消化后的细胞悬液，加入 苔盼蓝染液，显微镜观察细胞活性，活细胞率大于98 %时，其余单细胞悬液置于离心管中， lOOOrpm，离心3min。用间充质干细胞生长培养液重悬细胞，按1:2~1:3的比例传代培养，并 标记为Passagel (P1)，每3d换液，倒置相差显微镜下观察，直至贴壁细胞彼此融合铺满瓶底 时，重复上述操作，反复传代扩增。传至P3后，剩下形态较为单一的细胞。
[0042] S2、制备P3代间充质干细胞混悬液；
[0043] 用间充质干细胞生长培养基重悬步骤S12中获得的P3代间充质干细胞;然后，取 5ml人血清白蛋白匀速滴加于间充质干细胞中，边加边混合均匀，获得干细胞混悬液。
[0044] S3、干细胞制剂的制备；
[0045] 将NSADs溶液、逆转录酶抑制剂、原花青素和竹红菌乙素添加物混合后逐滴加入步 骤S2中获得的干细胞混悬液中，干细胞悬液与添加物的体积比为1:1，每3s滴加一滴，边加 边混合均匀，然后，用生理盐水重悬混合液，使得间充质干细胞的细胞浓度为3 X 107个/ml， 人血白蛋白的质量分数为1 %，NSADs的浓度为25mg/ml，逆转录酶抑制剂的浓度为0.3mo 1 / L，原花青素的浓度为0.075mol/L和竹红菌乙素的浓度为1.0m〇l/L;然后，分装到预充注射 器中，放到_80°C冰箱中冻存，待用。
[0046] 实施例2~3
[0047] 与实施例1的不同之处在于，各实施例中，间充质干细胞、白蛋白、NSADs、逆转录酶 抑制剂、原花青素和竹红菌乙素的终浓度如下表1所示：
[0048] 表 1
[0049]
[00511为进一步验证本发明提供的抑制肿瘤细胞增殖的干细胞制剂具有显著的有益效 果，设置以下实验进行验证。
[0052] MTT比色法测定肿瘤细胞生长、增殖的抑制率：
[0053] 将肿瘤干细胞接种于无血清干细胞培养基中，均调整细胞密度为2.0 X 105个/ml， 将细胞接种与96孔板，每孔100ul，共30组，分别为实验组和对照组；
[0054] 其中，实验组1~3分别为采用本发明实施例1~3所获得的干细胞制剂培养肿瘤干 细胞，实验组1~3各设置5组，共15组；
[0055] 对照组1~3分别为单独使用逆转录酶抑制剂、原花青素和竹红菌乙素培养肿瘤干 细胞，对照组1~3分别设置5组，共15组；
[0056] 并设不含细胞的培养液为空白对照，每组设5个复孔。
[0057]在37 °C、5 % C02、饱和湿度培养箱中培养，过夜。在接种于96孔板时，周边的培养孔 弃去不用，以避免边缘效应。终止培养前4h加入MTT(5mg/ml)每孔10ul，共培养4h后，加入三 联液每孔，上机检测0D值。
[0058] 表2
[0059]
[0060]由上表可知，实验组1~3中，0D值随着培养时间逐渐降低，且均低于对照组1~3和 空白对照组相应时段的0D值，由此表明，实验组1~3中肿瘤干细胞数量有大幅减少。
[0061]以上对本发明的实施例进行了描述，但是本发明并不局限于上述的具体实施方 式，上述的【具体实施方式】仅仅是示意性的，而不是限制性的，本领域的普通技术人员在本发 明的启示下，在不脱离本发明宗旨和权利要求所保护的范围情况下，还可做出很多形式，这 些均属于本发明的保护之内。
【主权项】
1. 一种抑制肿瘤细胞增殖的干细胞制剂，其特征在于，包括间充质干细胞、白蛋白和添 加物； 其中，所述添加物包括NSADs、逆转录酶抑制剂、原花青素和竹红菌乙素。2. 根据权利要求1所述的抑制肿瘤细胞增殖的干细胞制剂，其特征在于，所述间充质干 细胞的浓度为(1~5)X107个/ml。3. 根据权利要求1所述的抑制肿瘤细胞增殖的干细胞制剂，其特征在于，所述逆转录酶 抑制剂的浓度为 0.125mol/L-0.500mol/L〇4. 根据权利要求1所述的抑制肿瘤细胞增殖的干细胞制剂，其特征在于，所述原花青素 的浓度为〇. 05~0. lmmol/L。5. 根据权利要求1所述的抑制肿瘤细胞增殖的干细胞制剂，其特征在于，所述竹红菌乙 素的浓度为0.5~1.5mol/L。6. 根据权利要求1所述的抑制肿瘤细胞增殖的干细胞制剂，其特征在于，所述NSADs的 浓度为15~50mg/ml。7. 根据权利要求1所述的抑制肿瘤细胞增殖的干细胞制剂，其特征在于，所述白蛋白的 质量分数为0.5~2 %。8. -种如权利要求1~7任一项所述的抑制肿瘤细胞增殖的干细胞制剂的制备方法，其 特征在于，包括以下步骤： 获取间充质干细胞，用基础培养基重悬间充质干细胞后加入白蛋白，获得干细胞混悬 液，然后将所述添加物NSADs、逆转录酶抑制剂、原花青素和竹红菌乙素混合后逐滴加入所 述干细胞混悬液，边加边混合均匀。9. 根据权利要求8所述的抑制肿瘤细胞增殖的干细胞制剂的制备方法，其特征在于，所 述干细胞混悬液和添加物的体积比为1: (1~3)。10. 根据权利要求1~7任一项所述的干细胞制剂在制备肿瘤药物中的应用。
【文档编号】A61P35/00GK106039314SQ201610370954
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2016年5月30日
【发明人】曾宪卓, 鲁菲
【申请人】深圳爱生再生医学科技有限公司