一种促红细胞生长素在重症颈椎病颈髓损伤中的探究与应用
【专利摘要】本发明公开了一种促红细胞生长素在重症颈椎病颈髓损伤中的探究与应用，包括促红细胞生长素细胞试验研究、动物实验和临床应用研究，该促红细胞生长素的研究材料、方法与步骤如下所述：S1、研究EPO对体外培养的骨髓间充质干细胞的干预作用，S2、研究EPO与骨髓间充质干细胞治疗大鼠急性脊髓损伤，S3、研究EPO治疗临床中颈髓损伤。本发明通过细胞、动物、临床三个层面的研究，深刻了解到促红细胞生成素能够对脊髓损伤的治疗效果显著，能够单独或与骨髓间充质干细胞、甲强龙等协同治疗，从而有效治疗重症脊髓损伤型颈椎病。
【专利说明】
一种促红细胞生长素在重症颈椎病颈髓损伤中的探究与应用
技术领域
[0001]本发明涉及医药技术领域，尤其涉及促红细胞生长素的药物用途，主要用于指导临床颈髓损伤的药物治疗及临床医学研究，具体涉及一种促红细胞生长素在重症颈椎病颈髓损伤中的探究与应用。
【背景技术】
[0002]促红细胞生成素(erythropoietin,ΕΡ0)，又称为红细胞生长因子，为分子量34kD含唾液酸的酸性糖蛋白。EPO是一种作用于骨髓造血细胞，促进红系祖细胞增生、分化并最终成熟的内分泌激素，以往认为EPO只是一种调节血细胞生成和分化的细胞因子，近来研究证实EPO还具有抗炎症、抗氧化、抗兴奋性细胞毒和抗细胞凋亡等强大的神经保护作用，是一种多功能营养因子及神经保护因子，具有调节中枢神经系统发育、神经营养及神经保护作用。
[0003]使用EPO进行动物脊髓损伤的治疗，EPO能够长期直接作用于神经干细胞，诱导神经营养因子的表达，促进受损处神经再生。有研究发现，在实验性自身免疫性脑脊髓炎模型中，EPO能够增强少突胶质细胞的增殖和髓鞘的再生，从而促进脊髓损伤后神经功能的恢复。此外，EPO还可以促进神经细胞轴突再生，调节机体血管痉挛，刺激新生血管形成，从而为脊髓损伤的修复提供良好的微环境，对脊髓功能的恢复非常有益。但是目前，EPO对颈髓损伤后治疗机制的研究处于动物实验阶段，临床上应用个体差别较大，EPO在临床上的应用也存在许多亟待解决的问题。
[0004]随着生活压力的增加、交通事故的增多，重症颈椎病及颈椎外伤的发病率逐渐增加，颈髓损伤也越来越多，无论急性颈髓损伤还是慢性颈髓损伤，都有着较差的预后，从而人们迫切需要对EPO进行深入研究，且将EPO应用于临床当中。
【发明内容】
[0005]基于【背景技术】存在的技术问题，本发明提出了一种促红细胞生长素在重症颈椎病颈髓损伤中的探究与应用。
[0006]本发明提供如下技术方案:
[0007]—种促红细胞生长素在重症颈椎病颈髓损伤中的探究与应用，包括促红细胞生长素细胞试验研究、动物实验和临床应用研究，该促红细胞生长素的研究材料、方法与步骤如下所述:
[0008]S1、研究促红细胞生长素(EPO)对体外培养的骨髓间充质干细胞的干预作用:
[0009]I)选择实验大鼠，分离、培养大鼠骨髓间充质干细胞，
[0010]2)取第3代骨髓间充质干细胞(Bone marrow mesenchymal stem cell ,BMSCs)，无血清条件下，根据使用EPO的不同浓度(0.50、1.00、2.00、4.00、10.00U/mL)分组，与骨髓间充质干细胞共同培养为实验组，不加EPO的骨髓间充质干细胞为空白对照，在96h后行MTT检测，观察骨髓间充质干细胞的增殖情况，计算细胞增殖指数，并进行比较，
[0011]3)取第3代骨髓间充质干细胞，促红细胞生长素10U/mL与骨髓间充质干细胞共同培养，于96h后用流式细胞仪分析细胞增殖周期；
[0012]S2、研究促红细胞生长素(EPO)与骨髓间充质干细胞治疗大鼠急性脊髓损伤:
[0013]s2_l、研究促红细胞生长素(EPO)动员骨髓间充质干细胞治疗大鼠急性脊髓损伤:
[0014]I)将30只SD大鼠随机分成假手术组、生理盐水组及EPO治疗组，各组均经尾静脉注射 Hoechst3342标记的 BMSCs，
[0015]2)移植后l、3、7、14、21、28d采用BBB法进行大鼠后肢运动功能评分观察大鼠神经功能恢复情况，应用免疫荧光检测比较各组BMSCs动员到脊髓损伤处的数目，Westernblot检测损伤局部BMSCs表达脑源性神经营养因子(BDNF)和神经生长因子(NGF)的水平；
[0016]s2_2、研究促红细胞生长素(EPO)联合骨髓间充质干细胞治疗大鼠急性脊髓损伤:
[0017]I)将75只SD大鼠随机分成脊髓损伤组、EPO治疗组、BMSCs治疗组、EPO+BMSCs治疗组和假手术组，共5组，每组15只，采用改良Alien法制成大鼠急性脊髓损伤(acute spinalcord injury ,ASCI)模型，
[0018]2)EP0治疗是在脊髓损伤前24h腹腔注射重组人促红细胞生成素(rhEP0)5000U/kg，BMSCs治疗是将纯化的BMSCs在脊髓损伤时经尾静脉注射，术后第1、3、7、14、21、28天采用BBB法进行大鼠后肢运动功能评分，观察大鼠神经功能恢复情况，术后第1、28天HE染色观察脊髓形态学变化，
[0019]3)、Western blot检测第14天损伤局部脑源性神经营养因子(brain derivedneurotrophic factor，BDNF)的表达水平；
[0020]S3、研究促红细胞生成素(EPO)治疗临床中颈髓损伤:
[0021]s3_l、研究促红细胞生成素(EPO)联合甲强龙治疗脊髓损伤的临床应用:
[0022]I)回顾性分析我科既往收治的脊髓损伤患者55病例，随机分为EPO联合甲强龙组和甲强龙组。治疗前、治疗后I周及I年按美国脊髓损伤学会(ASIA)标准行神经功能评分，统计神经功能改善率，并行日常生活活动(activity of daily living，ADL)评分比较。
[0023]s3_2、研究促红细胞生成素(EPO)在颈髓损伤围手术期的应用:
[0024]I)回顾性分析既往在我科行手术治疗的重症脊髓型颈椎病颈髓损伤病例43例，随机分为两组，其中22例A组围手术期使用EP0，21例B组不使用EPO的，记录术前、术后一周、术后一年按日本骨科协会(JOA)评分计算患者的神经功能恢复率，统计并发症。使用0D0M标准评估远期神经功能变化。
[0025]本发明提供了一种促红细胞生长素在重症颈椎病颈髓损伤中的探究与应用，通过细胞、动物、临床三个层面的研究，深刻了解到促红细胞生成素能够对脊髓损伤的治疗效果显著，采用促红细胞生成素，能直接调节受损区域循环血量，促进新生血管的生成，促使骨髓间充质干细胞分泌血管内皮生长因子，增加受损区域新生血管的形成，且有效动员骨髓间充质干细胞向脊髓损伤部位迀移，促进其表达脑源性神经营养因子和神经生长因子来加快运动神经功能的恢复，具有神经营养和神经保护的作用，能够通过促进脑源性神经营养因子的表达，能发挥长期的神经营养作用，从而有效治疗重症脊髓型颈椎病，同时能够单独或与骨髓间充质干细胞、甲强龙等协同治疗颈髓损伤，在重症颈椎病颈髓损伤的围手术期使用安全有效，使得重症颈椎病颈髓损伤患者的神经功能恢复较快，提高重症脊髓型颈椎病颈髓损伤患者术后神经功能的恢复率，进而极大提高了促红细胞生长素用于重症颈椎病颈髓损伤当中的可行性、安全性和有效性。
【具体实施方式】
[0026]下面，通过具体实施例对本发明的技术方案进行详细说明。
[0027]实施例1
[0028]—种促红细胞生长素在重症颈椎病颈髓损伤中的探究与应用，研究促红细胞生长素(EPO)对体外培养的骨髓间充质干细胞的干预作用:
[0029]I)选择实验大鼠，分离、培养大鼠骨髓间充质干细胞，
[0030]2)取第3代骨髓间充质干细胞(BMSCs)，在无血清条件下，根据使用EPO的不同浓度(0.50、1.00、2.00、4.00、10.00U/mL)分组，与骨髓间充质干细胞共同培养为实验组，不加EPO的骨髓间充质干细胞为空白对照，
[0031]3)在96h后行MTT检测，观察骨髓间充质干细胞的增殖情况，计算细胞增殖指数，并进行比较，
[0032]4)取第3代骨髓间充质干细胞，促红细胞生长素10U/mL与骨髓间充质干细胞共同培养，于96h后用流式细胞仪分析细胞增殖周期。
[0033]本实施例1细胞试验中，经EPO处理后，BMSCs细胞的增殖增加显著，且EPO浓度愈大，作用时间愈长，其增殖效能愈明显，即EPO呈剂量依赖性促进骨髓间充质干细胞增殖，以10U/mL的浓度时EPO促进BMSCs增殖作用最明显。对照组BMSCs相对静止期G0/G1比例较高，是(85.1士0.61) %，合成S期及增殖分化G2/M期比例相对较低分别为(10.64±0.37) %、(4.26士0.69) % ;与 10U/mL的EPO共培养96h后，G0/G1 期比例降低为(69.0士0.89) %，而S期和G2/M期细胞比例增加分别为(22.1 士 0.47)%、(8.9 士 0.93)%。
[0034]实施例2
[0035]—种促红细胞生长素在重症颈椎病颈髓损伤中的探究与应用，研究促红细胞生长素(EPO)与骨髓间充质干细胞治疗大鼠急性脊髓损伤:
[0036]Al、研究促红细胞生长素(EPO)动员骨髓间充质干细胞治疗大鼠急性脊髓损伤:
[0037]I)将30只SD大鼠随机分成假手术组、生理盐水组及EPO治疗组，各组均经尾静脉注射 Hoechst3342标记的 BMSCs，
[0038]2)移植后l、3、7、14、21、28d采用BBB法进行大鼠后肢运动功能评分观察大鼠神经功能恢复情况，
[0039]3)应用免疫荧光检测比较各组BMSCs动员到脊髓损伤处的数目，Westernblot检测损伤局部BMSCs表达脑源性神经营养因子(BDNF)和神经生长因子(NGF)的水平；
[0040]A2、研究促红细胞生长素(EPO)联合骨髓间充质干细胞治疗大鼠急性脊髓损伤:[0041 ] I)将75只SD大鼠随机分成脊髓损伤组、EPO治疗组、BMSCs治疗组、EPO+BMSCs治疗组和假手术组，共5组，每组15只，
[0042]2)采用改良Alien法制成大鼠急性脊髓损伤(acute spinal cord injury ,ASCI)模型，EPO治疗是在脊髓损伤前24h腹腔注射重组人促红细胞生成素(rhEP0)5000U/kg，BMSCs治疗是将纯化的BMSCs在脊髓损伤时经尾静脉注射，
[0043]3)手术后第1、3、7、14、21、28天采用BBB法进行大鼠后肢运动功能评分，观察大鼠神经功能恢复情况，术后第1、28天HE染色观察脊髓形态学变化，
[0044]4)、Western blot检测第14天损伤局部脑源性神经营养因子(brain derivedneurotrophic factor,BDNF)的表达水平。
[0045]本实施例2动物试验Al步骤中，脊髓损伤后24小时，生理盐水组和EPO治疗组的大鼠双后肢运动功能的BBB评分无明显差异;术后3天，两组大鼠的神经功能均有不同程度的恢复，但EPO治疗组的运动功能评分明显高于生理盐水组;第1天起，荧光显微镜下可观察到各组的脊髓组织处及其邻近组织有Hoechst3342标记的BMSCs，从第3天起，EPO治疗组脊髓损伤局部BMSCs的数量明显比生理盐水组多，与生理盐水组比较，EPO治疗组在术后第3天开始BDNF和NGF的表达明显增多。
[0046]本实施例2动物试验A2步骤中，经过组织学观察显示，术后第I天假手术组脊髓组织结构正常，神经细胞形态完好，未见肿胀改变，细胞核圆，可见核仁，其余各组脊髓组织内可见点、片状出血，部分神经细胞肿胀、空泡形成，细胞核偏移，核仁尚清;术后第28天假手术组脊髓组织结构正常，神经细胞形态完好;脊髓损伤组脊髓组织局部明显空洞形成，大量瘢痕组织，神经细胞稀少，EPO组和BMSCs组受损脊髓组织局部空洞，神经细胞较多，EPO+BMSCs组脊髓组织内无明显空洞及疤痕组织形成，有大量神经细胞，细胞胞体和突起清晰可见;术后3天起，EPO组、BMSCs组、EPO+BMSCs组的神经功能的恢复明显优于脊髓损伤组，而且EPO+BMSCs组的神经功能改善显著高于EPO组和BMSCs组，Western-Blot结果显示假手术组的BDNF表达水平最低，脊髓损伤组的BDNF表达水平略有升高，EPO组和BMSCs组的BDNF表达水平与脊髓损伤组相比均明显升高，EPO+BMSCs组的BDNF的表达水平明显高于单个治疗组。
[0047]实施例3
[0048]—种促红细胞生长素在重症颈椎病颈髓损伤中的探究与应用，研究促红细胞生成素(EPO)治疗临床中颈髓损伤:
[0049]B1、研究促红细胞生成素(EPO)联合甲强龙治疗脊髓损伤的临床应用:
[0050]I)回顾性分析我科既往收治的脊髓损伤患者55病例，随机分为EPO联合甲强龙组和甲强龙组，
[0051]2)治疗前、治疗后I周及I年按美国脊髓损伤学会(ASIA)标准行神经功能评分，统计神经功能改善率，并行日常生活活动(activity of daily living，ADL)评分比较。
[0052]B2、研究促红细胞生成素(EPO)在颈髓损伤围手术期的应用:
[0053]I)回顾性分析既往在我科行手术治疗的重症脊髓型颈椎病颈髓损伤病例43例，
[0054]2)随机分为两组，其中22例A组围手术期使用ΕΡ0，21例B组不使用EPO的，记录术前、术后一周、术后一年按日本骨科协会(JOA)评分计算患者的神经功能恢复率，统计并发症。
[0055]3)使用0D0M标准评估远期神经功能变化。
[0056]本实施例3临床应用研究BI步骤中，远期随访未发现激素相关性股骨头坏死、病理性肥胖等并发症，植骨融合良好，内固定稳定；治疗后I周和I年，MPSS组及EP0+MPSS组患者神经功能评分较术前有明显升高，且EP0+MPSS组更高，EP0+MPSS组较之于单纯使用MPSS组，神经功能改善率较高，与治疗前相比；治疗后I周和I年两组患者ADL评分均显著改善，组间比较，治疗后I周和I年，EP0+MPSS组ADL评分明显高于单用MPSS组。
[0057]本实施例3临床应用研究B2步骤中，在科行手术治疗的重症脊髓型颈椎病颈髓损伤患者，均获I年以上随访，随访中未发现高血压、血栓疾病、心脑血管意外等并发症;影像学提示植骨融合良好，内固定无松动、断裂、脱落等情况发生;应用EPO组的神经功能的恢复明显好于未用EPO组;应用EPO组的ODOM分级及改善率明显优于未用EPO组。
[0058]上述实施例1-3需要进行大鼠外周血、骨髓中BMSCs测定;大鼠后肢运动功能评分；大鼠脊髓损伤模型的制备;大鼠脊髓损伤部位组织学观察，相关粘附分子、神经营养因子的免疫组化分析;临床患者ASIA评分、日常生活活动评分、JOA评分;查看临床患者的神经功能改善、神经功能恢复率。通过实施例1-3得出以下研究结论:(1)、促红细胞生成素对骨髓间充质干细胞的生长和迀移有明显的促进作用；(2)促红细胞生成素能有效动员骨髓间充质干细胞向脊髓损伤部位迀移，还可以促进其表达脑源性神经营养因子和神经生长因子来加快运动神经功能的恢复；(3)促红细胞生成素不仅直接调节受损区域循环血量、促进新生血管的生成，还能促使骨髓间充质干细胞分泌血管内皮生长因子，增加受损区域新生血管的形成，从而治疗颈髓损伤；(4)对于外伤引起的颈髓损伤，促红细胞生成素具有神经营养和神经保护的作用，抑制颈髓损伤引起的神经元凋亡是其短期效果，同时它通过促进脑源性神经营养因子的表达，能发挥长期的神经营养作用；(5)促红细胞生成素在重症颈椎病颈髓损伤的围手术期使用安全有效，能明显提高重症脊髓型颈椎病颈髓损伤患者术后神经功能的恢复率；(6)促红细胞生成素在重症颈椎病颈髓损伤治疗中表现出的保护作用，主要是通过减轻局部炎症反应、抑制神经元的坏死和凋亡、促进局部神经生长因子的表达、动员机体干细胞向损伤部位聚集并最终实现神经元及胶质细胞的再生与修复来实现的，促红细胞生成素作为一种神经保护因子和多功能营养因子，不仅可以调节中枢神经系统发育，发挥神经营养和神经保护的作用；能够增加神经生长因子和神经营养因子-3的表达;还可以明显地减少神经细胞凋亡，从而抑制继发性脊髓损伤。
[0059]通过细胞、动物、临床三个层面的研究，探讨促红细胞生成素对各种原因引起的颈髓损伤给予治疗的可能性及机制，推理严密;实验设计兼顾实验的科学原则与经济原则，具有很强的可操作性。
[0060]本发明通过细胞试验、动物实验及临床三个方面的研究，观察促红细胞生成素对骨髓间充质干细胞的增殖、分化、迀移等过程的影响;观察经促红细胞生成素及骨髓间充质干细胞处理后的脊髓损伤大鼠的病理学、行为学改变;观察促红细胞生成素联合甲强龙对急性脊髓损伤患者神经功能改善情况及日常生活活动能力恢复情况;并将促红细胞生成素用在重症颈椎病颈髓损伤患者的围手术期的治疗之中，促红细胞生成素能够有利于重症脊髓型颈椎病治疗的可行性、有效性及安全性，为临床重症脊髓型颈椎病的治疗提供新思路、新方法。
[0061]本发明提供了一种促红细胞生长素在重症颈椎病颈髓损伤中的探究与应用，通过细胞、动物、临床三个层面的研究，深刻了解到促红细胞生成素能够对脊髓损伤的治疗效果显著，采用促红细胞生成素，能直接调节受损区域循环血量，促进新生血管的生成，促使骨髓间充质干细胞分泌血管内皮生长因子，增加受损区域新生血管的形成，且有效动员骨髓间充质干细胞向脊髓损伤部位迀移，促进其表达脑源性神经营养因子和神经生长因子来加快运动神经功能的恢复，具有神经营养和神经保护的作用，能够通过促进脑源性神经营养因子的表达，能发挥长期的神经营养作用，从而有效治疗重症脊髓型颈椎病，同时能够单独或与骨髓间充质干细胞、甲强龙等协同治疗颈髓损伤，在重症颈椎病颈髓损伤的围手术期使用安全有效，使得重症颈椎病颈髓损伤患者的神经功能恢复较快，提高重症脊髓型颈椎病颈髓损伤患者术后神经功能的恢复率，进而极大提高了促红细胞生长素用于重症颈椎病颈髓损伤当中的可行性、安全性和有效性。
[0062]以上所述，仅为本发明较佳的【具体实施方式】，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1.一种促红细胞生长素在重症颈椎病颈髓损伤中的探究与应用，其特征在于:包括促红细胞生长素细胞试验研究、动物实验和临床应用研究，该促红细胞生长素的研究材料、方法与步骤如下所述: S1、研究促红细胞生长素(EPO)对体外培养的骨髓间充质干细胞的干预作用: 1)选择实验大鼠，分离、培养大鼠骨髓间充质干细胞， 2)取第3代骨髓间充质干细胞(Bonemarrow mesenchymal stem cell ,BMSCs)，无血清条件下，根据使用EPO的不同浓度(0.50、1.00、2.00、4.00、10.00U/mL)分组，与骨髓间充质干细胞共同培养为实验组，不加EPO的骨髓间充质干细胞为空白对照，在96h后行MTT检测，观察骨髓间充质干细胞的增殖情况，计算细胞增殖指数，并进行比较， 3)取第3代骨髓间充质干细胞，促红细胞生长素10U/mL与骨髓间充质干细胞共同培养，于96h后用流式细胞仪分析细胞增殖周期； S2、研究促红细胞生长素(EPO)与骨髓间充质干细胞治疗大鼠急性脊髓损伤: s2-l、研究促红细胞生长素(EPO)动员骨髓间充质干细胞治疗大鼠急性脊髓损伤: 1)将30只SD大鼠随机分成假手术组、生理盐水组及EPO治疗组，各组均经尾静脉注射Hoechst3342标记的 BMSCs， 2)移植后l、3、7、14、21、28d采用BBB法进行大鼠后肢运动功能评分观察大鼠神经功能恢复情况，应用免疫荧光检测比较各组BMSCs动员到脊髓损伤处的数目，Westernblot检测损伤局部BMSCs表达脑源性神经营养因子(BDNF)和神经生长因子(NGF)的水平； s2-2、研究促红细胞生长素(EPO)联合骨髓间充质干细胞治疗大鼠急性脊髓损伤: 1)将75只SD大鼠随机分成脊髓损伤组、EPO治疗组、BMSCs治疗组、EPO+BMSCs治疗组和假手术组，共5组，每组15只，采用改良Al Ien法制成大鼠急性脊髓损伤(acute spinal cordinjury ,ASCI)模型， 2)EP0治疗是在脊髓损伤前24h腹腔注射重组人促红细胞生成素(rhEP0)5000U/kg，BMSCs治疗是将纯化的BMSCs在脊髓损伤时经尾静脉注射，术后第1、3、7、14、21、28天采用BBB法进行大鼠后肢运动功能评分，观察大鼠神经功能恢复情况，术后第1、28天HE染色观察脊髓形态学变化， 3)、Westernblot检测第14天损伤局部脑源性神经营养因子(brainderivedneurotrophic factor，BDNF)的表达水平； S3、研究促红细胞生成素(ΕΡ0)治疗临床中颈髓损伤: s3-l、研究促红细胞生成素(EPO)联合甲强龙治疗脊髓损伤的临床应用: I)回顾性分析我科既往收治的脊髓损伤患者55病例，随机分为EPO联合甲强龙组和甲强龙组。治疗前、治疗后I周及I年按美国脊髓损伤学会(ASIA)标准行神经功能评分，统计神经功能改善率，并行日常生活活动(activity of daily living，ADL)评分比较。 s3-2、研究促红细胞生成素(EPO)在颈髓损伤围手术期的应用: .1)回顾性分析既往在我科行手术治疗的重症脊髓型颈椎病颈髓损伤病例43例，随机分为两组，其中22例A组围手术期使用EP0，21例B组不使用EPO的，记录术前、术后一周、术后一年按日本骨科协会(JOA)评分计算患者的神经功能恢复率，统计并发症。使用0D0M标准评估远期神经功能变化。
【文档编号】G01N33/558GK106039290SQ201610540848
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2016年7月11日
【发明人】王林, 熊敏, 韩珩, 王嗣岑, 党晓谦, 陈洁, 毛丹
【申请人】王林, 熊敏, 韩珩