绿原酸诱导HepG2细胞凋亡的用图
【专利摘要】本发明公开一种绿原酸诱导HepG2细胞凋亡的用途。本发明以绿原酸为有效成分，加上医学上可接受的辅料或辅助性成分制成药物。本发明优点如下：1、绿原酸获取方便，天然物质。2、绿原酸可通过增加HepG2细胞膜的通透性将LDH释放到细胞外，但不伤害正常人的肝细胞，绿原酸可有效诱导HepG2细胞发生凋亡。3、绿原酸可通过促进促凋亡的基因和蛋白的表达同时抑制抗凋亡的基因、蛋白的表达来诱导HepG2细胞凋亡。
【专利说明】
绿原酸诱导HepG2细胞凋亡的用途
技术领域
[0001 ]本发明涉及一种绿原酸诱导HepG2细胞凋亡的用途。
【背景技术】
[0002] 肝癌在我国癌症死亡率中排第二位，目前治疗肝癌早期的有效方法是进行手术切 除，但大多数患者确诊时已是中、晚期，手术治疗受到限制，而放疗和化疗虽然有一定的效 果，但其毒副作用强，极大的限制了疗效。因此，探求能有效治疗肝癌，同时安全、纯天然的 药物具有重大的意义。
[0003] 如图18所示，中草药中也分离出一些活性化合物并进行了防癌功效测试。如β-榄 香烯（图18Β)，从传统重要姜科植物温郁金根茎中提取的有效活性单体，研究表明，其抗癌 作用确切、毒副作用小，通过抑制肿瘤细胞增殖、诱导细胞凋亡、抑制肿瘤血管生成，且能辅 助其他化疗药物，提高化疗疗效等发挥抗肿瘤作用。姜黄素（图18C)是一种活性黄酮类化合 物，主要来源于姜黄的根茎，其干草药重中含有3.08%的姜黄素，姜黄素已被用来治疗心血 管疾病、炎症和关节炎。流行病学研究发现，在印度姜黄素被广泛食用的地方有几种癌症的 发病率较低，这表明摄入姜黄素在癌症预防中有一定的作用。其他研究也表明，姜黄素能抑 制乳腺癌、结肠癌、胃癌、白血病、淋巴瘤和恶心黑色素瘤中细胞的增殖和生存。
[0004] 肝癌在我国癌症死亡率中排第二位，目前治疗肝癌早期的有效方法是进行手术 切除，但大多数患者确诊时已是中、晚期，手术治疗受到限制，而放疗和化疗虽然有一定的 效果，但其毒副作用强，极大的限制了疗效。因此，探求能有效治疗肝癌，同时安全、纯天然 的药物具有重大的意义。
【发明内容】
[0005] 针对上述问题，本发明提供一种绿原酸诱导HepG2细胞凋亡的用途。
[0006] 有益效果
[0007]本发明绿原酸诱导HepG2细胞凋亡的用途与现有技术具备如下有益效果：
[0008] 1、绿原酸获取方便，天然物质，绿原酸是植物在有氧呼吸过程中经莽草酸代谢产 生的苯丙素类物质，是人们饮食中最丰富的多酚类化合物之一，广泛存在与蔬果和中药材 中，如苹果、蓝莓、金银花、杜仲等，同时也是咖啡的重要组成物质。
[0009] 2、绿原酸可通过增加 HepG2细胞膜的通透性将LDH释放到细胞外，但不伤害正常人 的肝细胞，绿原酸可有效诱导IfepG2细胞发生凋亡。
[0010] 3、绿原酸可通过促进促凋亡的基因和蛋白的表达同时抑制抗凋亡的基因、蛋白的 表达来诱导ifepG2细胞凋亡。
【附图说明】
[0011]图1绿原酸对HepG2细胞的抑制曲线；
[0012]图2绿原酸对L02细胞作用的时间-浓度效应图；
[0013] 图3绿原酸对L02细胞的抑制曲线；
[0014] 图4绿原酸对HepG2细胞LDH活性的影响；
[0015] 图5细胞凋亡率图；
[0016] 图6绿原酸对HepG2细胞中Fas mRNA表达的影响；
[0017] 图7绿原酸对HepG2细胞中FasL mRNA表达的影响；
[0018] 图8绿原酸对HepG2细胞中FADD mRNA表达的影响；
[0019] 图9绿原酸对HepG2细胞中Caspase-3mRNA表达的影响；
[0020] 图10绿原酸对HepG2细胞中Caspase-8mRNA表达的影响；
[0021] 图11绿原酸对HepG2细胞中Caspase-9mRNA表达的影响；
[0022] 图12绿原酸对HepG2细胞中BimmRNA表达的影响；
[0023] 图13绿原酸对HepG2细胞中BakmRNA表达的影响；
[0024] 图14绿原酸对HepG2细胞中Bid mRNA表达的影响；
[0025] 图15绿原酸对HepG2细胞中Bcl-xL mRNA表达的影响；
[0026]图16绿原酸对HepG2细胞中蛋白表达水平的影响；
[0027] 图17绿原酸对HepG2细胞中Bcl-2/Bax比值的影响；
[0028]图18天然产物的化学结构图。
【具体实施方式】
[0029] 下面结合附图对本发明做进一步的描述。
[0030] 以下通过实验对绿原酸所具有的上述功效加以证实。应该理解的是，本发明的实 验例是用于说明本发明而不是对本发明的限制。根据本发明的实质对本发明进行的简单改 进都属于本发明要求保护的范围。
[0031] 实验一:绿原酸对HepG2细胞的细胞毒性作用
[0032] 1.1材料和方法
[0033] 1.1.1细胞系
[0034] L02人正常肝细胞系和HepG2人肝癌细胞系均购于中科院上海细胞库。
[0035] 1.1.2主要实验试剂和耗材
[0036]
[0037] 1.1.3主要仪器
[0038]
[0039] 完全培养液配方:DMEM高糖培养液，10%的胎牛血清，1 %的青霉素/链霉素溶液 (100U/mL)。
[0040] 收到购得的细胞后，将满瓶的培养液倒出部分，留下大约10mL，置于37°C，C02含量 为5%的饱和湿度细胞培养箱中培养，之后采用半量换液的方法适应培养。待细胞在培养瓶 壁上长至90 %时，取出培养皿，弃去旧培养液，往皿内加 roS清洗2次，将废液吸干后加 lmL胰 蛋白酶，室温消化lmin后在显微镜下观察，当细胞开始变圆变亮时，迅速加入5mL新鲜的完 全培养液终止细胞消化。用移液枪轻轻吹打细胞至细胞脱落，将细胞悬液转入无菌的离心 管，lOOOrpm离心5min，弃上清，加 lmL新鲜的完全培养液，据实验所需接种相应数量的细胞 于新的培养器皿中，适温培养。其中一部分用于实验，其余的细胞待长满后消化离心收集， 用冻存液(FBS: DMS0 = 9:1)重悬，用血球技术板技术，调整细胞悬液的密度为2 X 106个/mL， 分装到细胞冻存管中（lmL/管），用封口膜封口，做好标记后放入细胞冻存盒中，置于-80°C 超低温冰箱过夜，次日放入液氮中保存。
[0041 ] 1.1.5药物配制
[0042] 绿原酸和5-Fu都用DMS0作为溶剂，配制成10mM的母液避光保存的-20°C冰箱中。
[0043] 1.1.6CCK-8法检测绿原酸对HepG2细胞的抑制作用
[0044] 1.1.6.1 实验分组
[0045] (1)空白对照组（只加完全培养液）；
[0046] (2)HepG2绿原酸组，加入含不同浓度绿原酸的完全培养液，根据预实验结果，选择 绿原酸浓度为：〇M、20M、40M、60M、80M、100M、120M;
[0047] (3)L02细胞对照组，分别加入绿原酸浓度为：0M、20M、40M、60M、80M、100M、120i^9 完全培养液。
[0048] 2.1.6.2实验步骤
[0049] (1)取对数生长期的两种实验细胞，消化离心后制成细胞悬液，取样计数后按5000 个/孔的细胞量接种于96孔细胞培养板中，每孔200L完全培养液，放置在细胞培养箱中培养 24h；
[0050] (2)待细胞完全贴壁后，将旧液吸出，加入含不同浓度（0M、20M、40M、60M、80M、 100M、120M)绿原酸的培养液，每组设置6个平行孔，置于细胞培养箱中培养；
[0051 ] (3)绿原酸分别处理HepG2细胞24h、48h和72h，而绿原酸处理L02细胞24h和48h即 终止。将处理好的细胞弃除药液，用PBS清洗两次，加入100L新鲜培养液，接着向每孔加入 10LCCK-8溶液(注意加试剂时要避免产生气泡，因为气泡会影响0D值读数）。将培养板放在 细胞培养箱中孵育l_4h;
[0052] (4)用酶标仪测定在波长450nm处的吸光值，计算细胞抑制率，通过SPSS19.0软件 分析出IC50值。细胞抑制率％ =[(对照孔-实验孔)/(对照孔-空白孔）]X100%
[0053] 1 · 1.7乳酸脱氢酶(LDH)活性检测
[0054] 本实验采用南京建成生物工程研究所生产的乳酸脱氢酶测试盒检测绿原酸处理 HepG2细胞后乳酸脱氢酶活性。步骤如下：
[0055] (1)本实验设置五组:HepG2正常对照组，HepG2绿原酸组，HepG2 5-Fu组，L02正常 对照组，L02绿原酸组；对照组只加培养液，HepG2绿原酸组加入含IC50浓度的绿原酸培养 液，而L02绿原酸组加入同浓度的绿原酸作为对照，HepG2 5-Fu组加入含60M的5-Fu培养液， 作为阳性对照；
[0056] (2)药物作用48h后，取培养液上清按照试剂盒说明书的步骤操作，显色后，用酶标 仪测定波长450nm处的吸光值；
[0057] (3)计算乳酸脱氢酶活性:LDH活性(U/L) = (测定0D值-对照0D值)/(标准0D值-空 白0D值）X标准品浓度(0 · 2mmo 1 /L) X 1000 〇
[0058] 1.1.8Annexin V/PI双染法检测细胞的凋亡率（1)将对数生长期的HepG2细胞和 L02细胞分为HepG2 NC组、HepG2 CGA组、HepG25-Fu组、L02 NC组和L02 CGA组，接种于六孔 板中，细胞密度为2 105个/孔，贴壁培养24h;
[0059] (2)吸出废液，HepG2 NC组和L02 NC组加入新鲜完全培养液，HepG2 CGA组和L02 CGA组加入绿原酸浓度为22.17M的培养液，HepG2 5-Fu组加入5-Fu浓度为60M的培养液，置 于37 °C、5 % C02培养箱培养48h;
[0060] (3)收集细胞培养液上清，贴壁细胞用不含EDTA的胰酶消化收集；
[0061 ] (4)用PBS洗涤细胞2次，每次2000rpm离心5min，收集约1-5X105个细胞；
[0062] (5)加入500L的Binding buffer重悬细胞；
[0063] (6)加入5L Annexin V-FITC混勾后再加入5L Propidium Iodide，混勾；
[0064] (7)在室温、避光的条件下反应5-15min，lh内在流式细胞仪上观察检测。
[0065] 1.1.9统计学分析
[0066]所有实验均重复6次取平均值，以平均值土标准差表示，通过SPSS 19.0软件进行 比较分析，采用单因素方差分析组间差异(One-way 4^^4，1^0)，？〈0.05表示有显著性差 异，P〈0.01表示显著性差异极大。
[0067] 1.2结果与分析
[0068] 1.2.1绿原酸对HepG2细胞的抑制作用
[0069] (1)用CCK-8法检测不同浓度绿原酸处理HepG2细胞24-72h后的细胞抑制率，如图1 所示，作用24h时，细胞抑制率随着药物浓度升高而增加;作用48h和72h，当绿原酸浓度低于 40ymol/L时，抑制率随着浓度的升高显著上升，而大于40ym〇VL时，绿原酸浓度增加但细胞 抑制率保持在84%，不再上升。
[0070] (2)将用CCK-8法检测计算出的细胞抑制率用SPSS 19.0软件Probit分析出半抑制 浓度值，结果如表1所示。24h、48h、72h的半抑制浓度分别为212.04±7.15M、22.17±1.13M、 18.58± 1.07M，48h和72h组的半抑制浓度与24h组的相比，显著性差异极大(P〈0.01)，而72h 的半抑制浓度与48h的相比，无统计学差异。
[0071] 表1绿原酸作用HepG2细胞的半抑制浓度
[0072] Table 1. The half maximal inhibitory concentration of CGA treated HepG2 cells
[0073]
[0074] 注:林p〈0.01与24h组相比。
[0075] 绿原酸对L02细胞的抑制作用
[0076] CCK-8法测定不同浓度的绿原酸溶液处理L02细胞24h和48h，测得的0D值图如图2 所示，计算得到的抑制率曲线如图3所示。结果显示，低浓度绿原酸对L02细胞的生长无明显 的抑制作用。当CGA作用24h时，与正常对照组相比，CGA浓度为80M时，有显著性差异（P〈 0.05)，大于80M时，差异极大(P〈0.01);而作用48h时，与0M组相比，CGA浓度为60M时，有显著 性差异(P〈〇. 05)，大于60M时，差异极大(P〈0.01)。
[0077] 1.2.3绿原酸对细胞内乳酸脱氢酶活性的影响
[0078] 用绿原酸对HepG2细胞的半抑制浓度22.17M处理Η印G2细胞和L02细胞48h，阳性对 照药物5-Fu的半抑制浓度60M处理HepG2细胞48h，细胞培养液上清中LDH活性变化如图4所 示。与Η印G2 NC对照组相比，绿原酸处理HepG2细胞48h后，LDH活性增加了两倍，差异非常显 著(P〈0.01)，阳性对照HepG2 5-Fu组的LDH活性增加了0.64倍，有统计学意义(P〈0.01)。而 绿原酸处理L02细胞48h后，LDH活性稍有提高，但与L02 CGA阴性对照组相比，无统计学意 义。
[0079] 1.2.4流式细胞仪检测细胞凋亡率
[0080] 检测结果如图5所示。表示各组的细胞的凋亡率，HepG2细胞NC组的凋亡率为 1.85%，HepG2细胞CGA组的凋亡率为35.98%，HepG2细胞5-Fu组的凋亡率为20.1%，L02细 胞NC组的凋亡率为1.87%，L02细胞CGA组的凋亡率为4.7%。与HepG2 NC组相比，HepG2 CGA 组和HepG2 5-Fu组的细胞凋亡率显著升高（P〈0.01)，且与L02 CGA组比，差异极大（P〈 0·01)〇
[0081 ] 1.3讨论
[0082] 本实验以常用的人类体外模型HepG2人肝癌细胞系为研究对象，探究绿原酸对癌 细胞的抑制作用。
[0083] 半抑制浓度（half maximal inhibitory concentration，IC50)是指某种药物在 抑制细胞、微生物等生物的数量减半时所需要的浓度。在细胞凋亡层面来说，IC50为药物诱 导肿瘤细胞凋亡率达50%时的浓度，可用来衡量药物诱导细胞凋亡的能力，数值越低表示 诱导凋亡的能力越强。
[0084]本实验采用CCK-8法检测绿原酸对实验细胞生长的抑制作用。Cell Counting Kit-8(CCK-8)利用了水溶性四唑盐，它在电子载体1-Methoxy PMS存在的情况下能够被还 原成水溶性的甲臜。CCK-8法是用于测定细胞增殖或毒性实验中活细胞数目的一种高灵敏 度，无放射性的比色检测法。WST-8被细胞内脱氧氢酶氧化还原后生成的橙黄色甲臜染料能 够溶解在组织培养基中，生成的甲臜量与活细胞数量成正比。实验结果显示，绿原酸在一定 的时间和浓度范围内能有效抑制HepG2细胞的活性。作用24h时，细胞抑制率随着药物浓度 升高而增加;作用48h和72h，当绿原酸浓度低于40M时，抑制率随着浓度的升高显著上升，而 大于40M时，绿原酸浓度增加但细胞抑制率保持在84%，不再上升。
[0085]用正常人的肝细胞L02细胞做对比，发现低浓度的绿原酸对L02细胞的生长无明显 的抑制作用。
[0086] 当CGA作用24h时，与正常对照组相比，CGA浓度为80M时，有显著性差异(P〈0.05)， 大于80M时，差异极大(P〈0.01);而作用48h时，与0M组相比，CGA浓度为60M时，有显著性差异 (P〈0.05)，大于60M时，差异极大(P〈0.01)。用SPSS 19.0软件分析得出绿原酸处理HepG2细 胞 24 小时、48 小时和 72 小时 IC50 值分别为：212.04±7.15M、22.17±1.13M、18.58±1.07M， 与作用24h的IC50值相比，48h和72h的有极大的差异(P〈0.01)，但与作用48h的IC50值相比， 72h的没有差异。因此，后续实验选用浓度为22.17M的绿原酸处理HepG2细胞48h这一条件来 研究绿原酸诱导HepG2细胞凋亡的机制。本实验选择的阳性对照药物是5-氟尿嘧啶（5_ Fluorouracil，5-Fu)，1957年首次合成就成为肝癌、肠胃道癌，
[0087]头颈部癌和乳腺癌等恶性肿瘤标准治疗的重要组成部分。选用的浓度为60M，浓度 选定的方法同绿原酸作用IfepG2细胞48h时IC50值的测定方法。
[0088] 乳酸脱氢酶(Lactic dehydrogenase，LDH)是一种糖酵解酶，由四个多肽链组成， 存在于各种类型的人体组织和肿瘤。LDH是厌氧条件下丙酮酸转化成乳酸过程中的关键酶。 临床模型中LDH的上调是在缺氧条件下高效的厌氧/糖酵解代谢和减少对氧的依赖的保障。 据报道原发性肝细胞癌病人的血清LDH水平发生了变化。当细胞发生凋亡或者坏死的时候， 膜结构会破坏，导致胞浆酶从胞内释放出来，酶活性较稳定的LDH是其中之一，LDH可作为一 种标志性蛋白来检测细胞膜通透性是否升高，因此，测定药物处理细胞后培养液中LDH活性 可以通过确定细胞膜是否完整来探究药物对细胞的毒性作用。本实验通过比较绿原酸的 IC50浓度和5-Fu的IC50浓度处理HepG2细胞48h后细胞培养液中LDH的活性变化来确定绿原 酸是否能改变细胞膜的通透性，同时用L02细胞作对照，观察绿原酸在抑制HepG2细胞活性 时是否会杀伤正常肝细胞。
[0089] 实验结果表明，绿原酸处理HepG2细胞48h后，细胞培养液中LDH活性比正常对照组 中的LDH活性提高了两倍，有极大的显著性差异(？〈0.01)，541!阳性对照组中的1^活性也 上升且有统计学意义(P〈〇. 05)，与此同时，发现L02 CGA组中的LDH活性虽然比L02NC组的略 微增加，但无统计学意义。由此可知，绿原酸在抑制HepG2细胞活性时会增加细胞膜的通透 性，导致LDH释放到细胞外，但对正常人的肝细胞没有影响。
[0090] Annexin V结合分析法是一种通过流式细胞仪检测细胞凋亡的方法。Annexin V是 膜结合蛋白家族中的一员，能有效结合带负电荷的磷脂、磷脂酰丝氨酸，适量结合磷脂酰胆 碱。磷脂酰丝氨酸通常存在于健康细胞的内膜，当遇到促细胞凋亡刺激时迅速外化到细胞 外膜上，AnnexinV通过细胞外膜上的磷脂酰丝氨酸与早期凋亡细胞的细胞膜结合。磷脂酰 丝氨酸响应细胞凋亡刺激是哺乳动物和细菌细胞的一种高度保守的进化特征。在膜破裂时 坏死细胞也与Annexin V结合，与此同时用碘化丙啶(Propidiumiodide，PI)染色很重要。凋 亡细胞首先呈Annexin V阳性和PI阴性，随后被PI吸收；
[0091] 与此相反，坏死细胞直接呈Annexin V/PI双阳性74。本研究结果发现浓度为 22.17M的绿原酸处理HepG2细胞48h后，凋亡率由1.85%增加至35.98%，阳性对照组的凋亡 率也升高至20.1%，与阴性对照组相比都具有统计学意义且差异极大(P〈0.01)。而同样浓 度的绿原酸作用L02细胞48h后，凋亡率由1.87%升至4.7%，HepG2 CGA组和HepG2 5-Fu组 与L02 CGA组相比也有极大的差异性(P〈0.01)。流式细胞仪检测出来的细胞凋亡结果进一 步表明绿原酸能能诱导HepG2细胞发生凋亡。
[0092] 1.4小结
[0093] (1)绿原酸能有效抑制HepG2细胞的生长，作用48h时效果最佳，IC50值为22.17M;
[0094] (2)绿原酸可通过增加 HepG2细胞膜的通透性将LDH释放到细胞外，但不伤害正常 人的肝细胞；
[0095] (3)绿原酸可有效诱导HepG2细胞发生凋亡。
[0096]实验二:绿原酸诱导HepG2细胞凋亡的作用机制
[0097] 2.1材料
[0098] 2.1.1细胞
[0099] HepG2 细胞系。
[0100] 2.1.2药物
[0101]同上。
[0102] 2.1.3主要实验试剂
[0103]
[0105] 2.1.4实验仪器
[0106]
[0107] 2.2实验方法
[0108] 2.2.1分组
[0109] (l)HepG2 NC组（阴性对照）；（2)HepG2 CGA组（实验组）；（3)HepG2 5-Fu组阳性对 照组）。
[0110] 2.2.2实时荧光定量PCR法检测凋亡相关基因 mRNA的表达
[0111] 2.2.2.1 溶液配制（1)5XTBE
[0112]
[0113] 最后用蒸馏水定容至1L，调pH为8.0,高温灭菌后室温下保存。
[0114] (2)RNaseA 母液（10mg/mL)
[0115]
[0116] (3)Agarose 凝胶
[0117]
[0118] 微波炉加热至琼脂糖溶解，冷却至60°C，加入8yL EB染料，倒入胶槽，冷却20min左 右至凝固。
[0119] ⑷无酶水
[0120]
[0121] 2 · 2 · 2 · 2Trizol 法提取细胞总 RNA
[0122]
[0123] en无酶tip头、离心管，匀浆器等，浸泡于1%DEPC水中过夜。第二天将所有浸泡于 0.1 %DEPC中的器械捞起，用报纸包装好，121°C，60min湿热灭菌后，烘干待用。
[0124] (2)取处于对数生长期的HepG2细胞按上述分成三组，HepG2 CGA组加入含浓度为 22.17M绿原酸的新鲜培养液，HepG2 5-Fu组加入含浓度为60M 5-Fu的培养液，适宜条件下 培养48h;
[0125] (3)向细胞中加入lmL Trizol充分吹打混匀，室温裂解5min后，加入0.2倍体积的 三氯甲烷(预冷），振荡使其充分混匀，室温静置3-511^11，12000印111、4°(：离心151^11 ;
[0126] (4)吸取上层液相，加入等体积的异丙醇，上下轻轻晃动数次，置于冰上静置 lOmin，12000印111、4。〇离心 lOmin;
[0127] (5)去上清，往管底白色沉淀中加入lmL75%的乙醇(无菌无酶的DEPC水配制），上 下颠倒混匀，使残留的有机溶剂充分溶解，12000rpm、低温离心5min;
[0128] (6)去上清，室温干燥20-30min，直至白色沉淀逐渐变透明，加入40L无菌无酶的 DEPC水溶解沉淀；
[0129] (7)取2LRNA溶液用超微量分光光度计测定RNA浓度和纯度；
[0130] (8)琼脂糖凝胶电泳鉴定RNA是否降解电泳槽用3 %的双蒸水(灭菌DEPC处理水配 制）处理0.5h;配制1 %变性琼脂糖凝胶，0.2g琼脂糖，20ml无菌DEPC处理水，加热至琼脂糖 溶解，冷至60 °C，加入0.5μ 1EB (1 Omg/ml)，混匀后倒胶；取2μ 1提取的RNA，按1: 5的比例与 loading buffer premix混勾，170V恒压电泳，溴酸蓝前沿迀移至凝胶总长2/3处停止电泳； 凝胶成像系统下观察。
[0131] 2 · 2 · 2 · 3RNA 反转录
[0132] 反应体系、操作步骤和逆转录条件如下所示：
[0133] (1)反应体系
[0134] ( 2)涡旋振荡混匀，短暂离心，使管壁上的溶液收集到管底；（3)42°C孵育30-50min，85°C孵育5min。反应结束后，短暂离心，置于冰上冷却；
[0135] (4)逆转录产物可直接用于PCR反应和荧光定量PCR反应，或置于-20 °C长期保存。
[0136] 2.2.2.4实时荧光定量PCR
[0137] (1)引物设计:在Genebank中找到目的基因的序列，运用Primer Premier 5.0软件 设计引物，送由南京金斯瑞生物公司合成，目的基因和引物序列见表2。
[0138] 表2目的基因的引物序列表
[0139]
[0141] (2)体系组成
[0142]
[0143] (3)定量PCR扩增程序：
[0144]
[0145] (4)导出Ct值进行分析计算。
[0146] 2.2.3蛋白质印迹法检测凋亡相关蛋白的表达
[0147] 2.2.2.1蛋白质提取
[0148] 细胞分组及加药处理同上，48h后，用预冷的PBS洗涤细胞，加入50LRIPA裂解液，反 复吹打混匀，置于冰上裂解30分钟；4°C、12000rpm离心15分钟，将离心后的上清分装至 0.5mL的离心管，部分用于实验，其余的于-20°C保存。
[0149] 2.2.2.2蛋白质浓度测定
[0150] 白定量试剂盒使用说明操作，测定蛋白浓度：
[0151] (1)根据样品数量，按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B(50:1)配制适量BCA工作 液，充分混匀，BCA工作液室温24小时内稳定；
[0152] (2)完全溶解蛋白标准品，浓度为2mg/mL;
[0153] (3)将标准品按0，1，2,3,4,5,61^加到96孔板的标准品孔中，加用于稀释标准品的 溶液补足到20L;
[0154] (4)加适当体积样品到96孔板的样品孔中，加用于稀释标准品的溶液到20L;
[0155] (5)各孔加入200L BCA工作液，37°C放置30min;
[0156] (6)测定波长562nm处的吸光值，根据标准曲线计算出蛋白浓度，样品浓度范围在 2-4ug/ul。测得的样品浓度供下一步实验参考。
[0157] 2.2.2.3ffestern blot
[0158] (1)溶液配制
[0159] A.1.0mol/L Tris · HC1
[0160]
[0161 ] 溶解后，用浓盐酸调pH至所需点，最后用蒸馏水定容至200ml，高温灭菌后室温下 保存。
[0162] B.1.74mg/ml(10mmol/L)PMSF
[0163]
[0164] 溶解后，分装于1.5ml离心管中，_20°C保存。
[0165] C.10%SDS
[0166]
[0167] 50°C水浴下溶解，室温保存。如在长期保存中出现沉淀，水浴溶化后，仍可使用。
[0168] D. 10%过硫酸胺(APS)
[0169]
[0170] 溶解后，4°C保存，保存时间为1周。
[0171] E.1.5mol/L Tris · HCl(pH8.8)
[0172]
[0173] 溶解后，用浓盐酸调pH至8.8，最后用超纯水定容至250ml，室温下保存。
[0174] F.0.5mol/L Tris · HCl(pH6.8)
[0175]
[0176] 溶解后，用浓盐酸调pH至6.8，最后用超纯水定容至250ml，室温下保存。
[0177] G.30%Acr/Bic
[01781
[0179] 溶解后4°C保存。使用时恢复至室温且无沉淀。
[0180] H.还原型5XSDS上样缓冲液
[0181]
[0183] 混匀后，分装于1.5ml离心管中，4 °C保存。 1 I.电泳液缓冲液
[0185]
[0186] 溶解后室温保存，次溶液可重复使用3~5次。
[0187] J.转膜缓冲液
[0188]
[0189] 溶解后室温保存，次溶液可重复使用3~5次。
[0190] K.10X丽春红染液
[0191]
[0193] 使用时将其稀释10倍。 1 L.TBS缓冲液、TBST缓冲液
[0195]
[0197] 混匀后即可使用，现用现配。
[0198] M.封闭液
[0199]
[0200] (2)配胶
[0201]将玻璃板彻底洗净，安装好玻璃板夹心于电泳槽中并固定；配制分离胶，加入 TEMED后立即摇匀灌胶，并加入双蒸水压平胶面及驱除气泡；当水和胶之间有一条折射线 时，说明胶已凝，倒去胶上层水并用吸水纸将其吸干;配4%的浓缩胶，加入TEMED后立即摇 匀灌胶，将剩余空间灌满浓缩胶然后将梳子插入浓缩胶中。
[0202] (3)电泳
[0203]准备电泳样品，使每个样品总蛋白上样浓度为50ug-100ug计算各个样品所需取样 量，并与5*loading buffer混勾，沸水煮5min，放入冰盒中速冷;根据蛋白定量的结果，第 一孔点入maker，其它每空上样20ul已变性蛋白，开始电泳，浓缩胶电泳电压为80V，分离胶 电泳电压为120V，待溴酚蓝电泳至胶底部时终止电泳。
[0204] ⑷转膜
[0205] 分别切胶cytochromec(15KD)，Bid(22KD)，bax(23KD)，bcl-2(26KD)，p53(53KD)， smac(27KD)，Apafl(142KD)，CIAP-1(70KD)，0-actin(42KD);准备6张与胶同样大小的滤纸 和1张 PVDF膜，PVDF膜先在甲醇中浸湿，然后与滤纸一起放入转膜缓冲液中，至完全浸透。按 照3张滤纸，膜，胶，另3张滤纸的顺序依次放好，要求中间没有气泡。盖上仪器，接通电源，恒 流3〇〇11^，转膜厶卩&;1^1约15〇111；[11，071:0(3111'01116(3约30111；[11，13(31-2/^&叉/81]1&(3/1^(1约4〇111；[11，0- actin约lh，p53约70min，CIAP-l约90min，转膜完毕后，将膜取出放入1*TBST中洗1次，时间 5min。用丽春红染膜，检测蛋白转膜的效率。用1*TBST将丽春红洗净。
[0206] (5)封闭
[0207] 配制5%脱脂奶粉，将膜浸入后，室温放置1小时。（6) -抗孵育1*TBST将一 抗按照一定比例稀释(具体比列见下表），将膜与一抗一起孵育，4度过夜。孵育结束，1*TBST 洗3次，每次15min。（注:大部分CST的抗体需要用5 % BSA的1 *TBST稀释）
[0208]
[0209] (7)二抗孵育
[0210] 用1*TBST稀释HRP标记的二抗(Proteintech)，稀释比例1:3000,将稀释后的二抗 与膜共同孵育45-60min。孵育结束，1*TBST洗3次，每次15min。
[0211] (8)显色
[0212] ECL显色曝光:使用ECL化学发光液(Thermo)与膜孵育3min，用吸水纸吸尽液体，用 保鲜膜将膜包裹杂交膜，在暗盒内与X胶片曝光数秒至数分钟;显影冲洗。
[0213] (9)灰度分析
[0214]将曝光后的底片扫描，并用quantity one专业灰度分析软件进行分析。
[0215] 2.3统计学分析
[0216]所有实验均重复3次取平均值，以平均值±标准差表示，通过SPSS 19.0软件进行 比较分析，采用单因素方差分析组间差异(One-way 4^^4，1^0)，？〈0.05表示有显著性差 异，P〈0.01表示显著性差异极大。
[0217] 2.4结果与分析
[0218]琼脂糖凝胶电泳鉴定RNA4-1为Trizol法提取得到的RNA的琼脂糖凝胶电泳图，如 图，5S、18S、28S三条条带清晰，微量分光光度计检测显示A260/A280比值都在1.8-2.0之间， 表明所提RNA完整且没有蛋白质或酚类物质污染。
[0219] 2.4.2实时荧光定量PCR法检测凋亡相关基因 mRNA的表达
[0220] 2.4.2.1绿原酸对HepG2细胞中Fas、FasL、FADD mRNA表达的影响
[0221] 如图6，CGA组Fas mRNA较NC组上调了6倍，差异极大(P〈0.01);阳性对照5-Fu组中 的Fas mRNA较NC组略微上升，但无统计学意义。
[0222] 如图7，CGA组细胞中FasL的mRNA表达量比NC组的上升了 5.7倍，差异极大（卩〈 0.01)，而阳性对照5-FU组中的FasL mRNA与NC组无差异。
[0223] 绿原酸对HepG2细胞中Caspase mRNA表达的影响
[0224] 实时焚光定量检测Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9的mRNA表达量，结果如图9、 10、11所示。绿原酸作用HepG2细胞48h后，与NC组相比，Caspase-SXaspase-SXaspase-QmRNA 的表达量都大幅上升 ，且显著性差异极大 (P〈0.01) 。
[0225] 绿原酸对HepG2细胞中祀111、831^、8丨(1、8(3111^1111?熟表达的影响
[0226] 如图12、13、14所示，CGA组细胞中Bim mRNA比NC组增加了5倍，且差异极大（P〈 〇. 01)，与阳性对照5-Fu组的趋势一致;CGA组Bak mRNA的表达量比NC组上调了 1倍，而CGA组 Bid的mRNA表达量与NC组比上调了20%，有显著性差异(P〈0.05)。
[0227] 如图15所示，CGA组和5-Fu组的Bcl-xL mRNA表达量与NC组相比均下降，且差异极 大(P〈0.01)。绿原酸下调抑制凋亡的基因，从而促进凋亡。
[0228] 2.4.3蛋白质印迹法检测绿原酸作用HepG2细胞后凋亡相关蛋白的表达Western blot法检测绿原酸作用HepG2细胞48h后凋亡相关蛋白Cyto (λρδβΑΒο?υαχΑπ?Β?^οΙΑΡ-? 、Apaf_l 、Bid表达的影响 ，结果如图 16所示， 绿原酸可显著 （P〈0 . 01)上调Cyto c、p53、 Smac、Bid-系列促凋亡蛋白的表达，同时下调Apaf-1和cIAP-1等抑制凋亡的蛋白的表达， 且都具有统计学意义，进而加速ifepG2细胞的凋亡。
[0229] 绿原酸处理组HepG2细胞中Bcl-2蛋白表达量降低，Bax蛋白表达量升高，Bax/Bcl-2比值降低，如图17所示。
[0230] 2.5.讨论
[0231] 细胞凋亡是一种普遍存在的由程序性细胞凋亡高度调节的机制。抗凋亡是癌症的 一个标志，凋亡信号的缺失和抗凋亡机制的增加促进肿瘤生成。半胱氨酸蛋白酶和细胞凋 亡的激活中有几条网状通路，简单来说，主要是外在和内在两条途径。
[0232] 外源性途径是通过特定的配体和表面受体如Fas、TNFRl、TNFR2等之间的相互作 用，将死亡信号从细胞外微环境传入细胞质，与受体结合诱导受体多聚化，FADD衔接蛋白的 结合，DISC的形成募集Caspase 8和10的起始因子，随后激活Caspase3和7的效应器，诱导细 胞凋亡。Caspase 8参与受体依赖的细胞凋亡通路，而Caspase9则是线粒体依赖性凋亡家族 中的一员。本实验中，绿原酸作用人的肝癌细胞系HepG248h后，实时荧光定量技术检测结果 发现绿原酸能有效地上调死亡受体途径中Fas、FasL、FADD、Caspase3、Caspase 8和Caspase 9的mRNA表达量，从而促使H印G2细胞凋亡。
[0233] 内在途径可被多种刺激信号激活，如DNA损伤，缺氧，细胞脱落，细胞毒性药物等细 胞内的作用。所有这些信号汇聚在线粒体，通过Bcl-2家族成员调节细胞凋亡信号的程序。 Bcl-2和Bcl-xL发挥抗凋亡作用，而其他如Bid、Bad、Bak和Bim都是发挥促凋亡作用。促凋亡 信号过量超过抗凋亡信号时，启动线粒体外膜透化，导致蛋白质释放，如Cyto c、Smac/ Diablo从线粒体膜间隙进入细胞质，一旦Cyto c释放，它将结合Apaf-1和ATP，然后与pro-caspase 9结合形成一个蛋白质复合体叫做凋亡小体，反过来激活caspase 3效应器。Smac 结合细胞凋亡蛋白抑制剂（IAPs)，使它们失去活性，防止IAPs阻止细胞凋亡，从而促进细胞 凋亡的过程。绿原酸作用HepG2细胞48h后，用实时荧光定量实验测定Bim、Bcl- XL、Bak、Bid 基因 mRNA 的表达量，用 Wes tern blot测定Bax、Be 1-2、Smac、Bid、Cyto c、Apaf-1 和cIAP-1 蛋 白的表达，结果显示CGA组细胞中促凋亡基因 Bim和Bak的mRNA表达量大幅上调（P〈0.01)， Bid的mRNA表达量也显著性上调了（P〈0.05)，而抗凋亡基因 Bcl-xL的表达极显著地下降了 (P〈0.01);Western blot结果也显示CGA组细胞中促凋亡的Bax、Cyto c、Smac和Bid蛋白的 表达量升高，而抗凋亡的Bcl-2、cIAP-l和Apaf-1蛋白的表达量降低。
[0234] 说明绿原酸可通过促进促凋亡的基因和蛋白的表达同时抑制抗凋亡的基因、蛋白 的表达来诱导IfepG2细胞凋亡。
[0235] 人类肿瘤中超过50%的包含TP53基因突变或缺失。TP53编码的蛋白p53是一种调 节细胞周期的转录子，因此作为一种肿瘤抑制功能的基因。它有许多抗癌机制：当DNA持续 受损时，它可激活DNA修复蛋白，当DNA损伤无法修复时可启动细胞凋亡。
[0236] P53蛋白通过线粒体去极化和致敏细胞凋亡诱导物参与内源和外源凋亡途径起始 细胞凋亡。绿原酸处理HepG2细胞组中p53蛋白的表达与NC组比较，极限著增加(P〈0.05)。 Bcl-2家族已被证明是p53的一个祀点，促凋亡成员Bax在p53介导的细胞凋亡中上调一些体 系。一些研究提出Bcl-2/Bax比值是细胞色素 C从线粒体释放的调节关键，它也决定了细胞 凋亡的敏感性，高Bcl-2/Bax比值可以导致细胞凋亡抑制及抵抗化疗药剂。本实验中，绿原 酸通过抑制Be 1-2蛋白的表达，促进Bax蛋白的表达，降低Be l-2/Bax的比值，促进HepG2细胞 凋亡。
[0237] 2.6.小结
[0238] (1)绿原酸可通过上调死亡受体途径中的Fas、FasL、FADD mRNA的表达量，激活 Caspase 3、Caspase 8、Caspase 9等基因，同时通过调节线粒体中相关基因的表达，如抑制 抗凋亡基因 Be 1-xL和促进促凋亡基因 Bim、Bak、Bid的表达，诱导Η印G2细胞凋亡。
[0239] (2)绿原酸可通过上调促凋亡蛋白Bid，下调抑制凋亡的蛋白cIAP-Ι和Apaf-Ι，同 时增加线粒体膜的通透性和降低Bcl-1/Bax的比值，从而促使p53、Cyto c、Smac等蛋白释 放，进一步促进HepG2细胞凋亡进程。
[0240] 对本发明应当理解的是，以上所述的实施例，对本发明的目的、技术方案和有益效 果进行了进一步详细的说明，以上仅为本发明的实施例而已，并不用于限定本发明，凡是在 本发明的精神原则之内，所作出的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护 范围之内，本发明的保护范围应该以权利要求所界定的保护范围为准。
【主权项】
1. 一种绿原酸诱导HepG2细胞凋亡的用途。2. 根据权利要求1所述的用途，其特征在于:绿原酸能有效抑制HepG2细胞的生长，作用 48h时效果最佳。3. 根据权利要求1所述的用途，其特征在于:绿原酸通过促进促凋亡的基因和蛋白的表 达同时抑制抗凋亡的基因、蛋白的表达来诱导IfepG2细胞凋亡。4. 根据权利要求1所述的用途，其特征在于：绿原酸通过上调死亡受体途径中的Fas、 FasL、FADD mRNA的表达量，激活Caspase 3、Caspase 8、Caspase9基因，同时通过调节线粒 体中相关基因的表达，抑制抗凋亡基因 Be 1 -xL和促进促凋亡基因 B im、Bak、B i d的表达，诱导 Η印G2细胞凋亡。5. 根据权利要求1所述的用途，其特征在于:绿原酸通过上调促凋亡蛋白Bid，下调抑制 凋亡的蛋白cIAP-1和Apaf-Ι，同时增加线粒体膜的通透性和降低Bcl-2/Bax的比值，从而促 使p53、Cyto c、Smac等蛋白释放，进一步促进HepG2细胞凋亡进程。6. 根据权利要求1所述的用途，其特征在于：以绿原酸为有效成分，加上医学上可接受 的辅料或辅助性成分制成药物。7. 根据权利要求1所述的用途，其特征在于:绿原酸用DMS0作为溶剂，配制成药物。8. 根据权利要求1所述的用途，其特征在于:使用浓度为22.17M的绿原酸。9. 一种诱导HepG2细胞凋亡的药物，以绿原酸为有效成分，加上医学上可接受的辅料或 辅助性成分制成药物。
【文档编号】A61P1/16GK106038531SQ201610375363
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2016年5月31日
【发明人】王征, 许诗豪, 彭冰洁
【申请人】湖南农业大学