无针注射流感疫苗系统与应用

无针注射流感疫苗系统与应用
【专利摘要】本发明公开了无针注射流感疫苗系统与应用，本发明提供了无针注射流感疫苗系统，包括灌装有疫苗的无针注射安瓿，所述疫苗为单价或多价，所述单价疫苗或多价疫苗中每一种疫苗的HA含量均为3?15μg。本发明实验证明了无针注射流感疫苗系统进行免疫时，抗原用量只需传统肌肉注射抗原用量的一部分，即可与其产生相同或更高的HI效价。进一步说明无针免疫途径为免疫流感疫苗可供选择的理想途径。
【专利说明】
无针注射流感疫苗系统与应用
技术领域
[0001 ]本发明涉及医药领域，尤其是传染性疾病领域。更具体地，涉及无针注射流感疫苗系统与应用。适用于各类流感疫苗免疫预防接种。
【背景技术】
[0002]最理想的疫苗接种系统应该具有安全性、有效性并且经济和实用，在应用时可行性便利，剂量控制方便，依从性良好。并且疫苗接种系统能有效防止非法和重复使用，降低医护人员感染的风险。而目前国内外普遍应用的注射方式为，使用不锈钢制成的注射针刺入接种者从而进行疫苗或药物注射，这种注射方式存在诸多缺陷，如人群难以克服的恐针感，医疗意外导致的针头刺伤，及其带来的危险等。全世界范围内，每100次注射中就有5次针头刺伤事故发生。相反，无针免疫技术应用特殊的设备，通过高速射流将疫苗注射于特定的组织深度，避免针头暴露、皮肤受损感染等上述缺陷带来的危害。并且无针免疫技术具有无针无痛、简便快速、经济高效及便于操作等诸多优势，将成为免疫接种新的增长领域。
[0003]自从1978年引入三价流感以来，疫苗接种已成为预防和控制流感的主要策略。季节性流感疫苗通常为三价疫苗。2011年，全球范围内生产的季节性三价流感超过6亿剂。三价流感疫苗包含三种流感病毒，分别包括两种A型流感病毒和一种B型流感病毒。每年世界卫生组织会根据对即将到来的流感病毒的流行株的预测，推荐三价流感疫苗的组成。而三价流感因为对乙型流感的保护不够全面，为了增加对两种乙型病毒株疫苗的保护，将三价流感的谱系中配入一个乙型流感病毒株这样的疫苗可以有效地预防流感疾病的发生。世界卫生组织于2012年初首次提出关于四价流感疫苗应包含两种乙型谱系毒株的建议，并将这项建议列入了当年的北半球免疫计划。四价流感病毒裂解疫苗包含11謂1、!13吧、81、82四种病毒型别流感原液，且两种B型原液存在交叉反应。
[0004]许多研究已经证实皮肤的免疫原性优于肌肉或其他途径，真皮层包含丰富的免疫细胞，皮内免疫低剂量疫苗也可能引起同于全量肌肉疫苗的免疫反应，这不仅节约疫苗用量，降低成本，解决疫苗短缺的限制，同时，减少疫苗注射量也可以降低发生深层渗透的几率；因此，该技术减少疫苗所需抗原量，在经济上降低了公共健康的费用，有充分优势面对流感大流行，并为大规模接种提供可能。

【发明内容】

[0005]本发明的一个目的是提供无针注射疫苗系统。
[0006]本发明提供的无针注射疫苗系统，为如下I)或2):
[0007]I)所示的系统包括灌装有疫苗的容器，所述疫苗的灌装剂量小于等于该疫苗的标准剂量;其中，灌装有疫苗的容器为一次性使用的装有疫苗的容器；
[0008]2)所示的系统包括灌装疫苗的容器和可读载体;所述可读载体记载内容包括:所述疫苗的无针注射剂量小于等于该疫苗标准剂量;其中，灌装有疫苗的容器为可多次连续使用的装有疫苗的容器。
[0009]上述系统中，所述灌装有疫苗的无针注射安瓿包括:
[00?0]预灌装疫苗的一管体，
[0011 ] 一体设置于所述管体一端的一无针注射器接头，
[0012]由所述管体另一端滑动设置在所述管体内、并封闭所述管体的一动力推杆，
[0013]设置在所述无针注射器接头内的一喷射口，
[00?4]易断地连接于所述动力推杆的前端的一止动杆，
[0015]可拆卸地设置在所述无针注射器接头上、并封闭所述喷射口的一密封帽，和
[0016]可拆卸地设置在所述动力推杆上、并与所述管体的入口相嵌合的一密封锁块；
[0017]其中，所述喷射口具有一止动槽，所述喷射口通过所述止动槽与所述管体内腔相连通;所述止动杆与所述止动槽相配合。
[0018]上述系统中，所述疫苗的灌装剂量或无针注射剂量均为1/5-1倍该疫苗标准剂量。
[0019]上述系统中，所述疫苗为单价疫苗或多价疫苗；
[0020]所述单价疫苗或所述多价疫苗中每一种疫苗的灌装剂量或无针注射剂量均为I/5-1倍该疫苗标准剂量。
[0021]上述系统中，所述疫苗为病毒灭活疫苗、病毒裂解疫苗、病毒组分疫苗、灭活病毒体、重组VLP疫苗、重组纳米颗粒疫苗、减毒活疫苗、亚单位疫苗、DNA疫苗、重组活载体疫苗、通用型广谱疫苗等中的任何一种或几种混合，但不限于此。
[0022]所述疫苗的剂型为液体、冻干剂、粉末、乳脂或利用生物降解材料包埋的疫苗制剂等，但不限于此。
[0023]上述系统中，所述疫苗为单价流感疫苗或多价流感疫苗，所述流感疫苗的无针注射剂量或灌装剂量以该流感疫苗的HA含量记；
[0024]所述单价流感疫苗或多价流感疫苗中每一种流感疫苗的灌装剂量或无针注射剂量均不大于标准剂量15yg，且不等于O;
[0025]和/或，所述单价流感疫苗或多价流感疫苗中每一种流感疫苗的灌装剂量或无针注射剂量均为3-15yg;
[0026]和/或，所述单价流感疫苗或多价流感疫苗中每一种流感疫苗的灌装剂量或无针注射剂量均具体为3-7.5yg;
[0027]和/或，所述单价流感疫苗或多价流感疫苗中每一种流感疫苗的灌装剂量或无针注射剂量均具体为3或7.5ygo
[0028I近年来流感疫苗剂量可通过参考HA的水平进行标准化，HA水平通常通过单向福射状免疫扩散SRID试验来定量。用于肌肉注射的流感疫苗通常包含来自每一毒株的约15ygHA。但是，无针注射流感疫苗系统使用，通过皮内注射途径，不需要像肌肉内注射时的抗原量，因此，本发明系统中，多价流感疫苗中各种灭活流感病毒裂解疫苗中的HA均为来自每一毒株3-15yg ； HA—般为每株小于15yg，优选3yg、7.5yg或9yg。
[0029]疫苗标准剂量为2015版中国药典上公布的剂量，其中流感疫苗标准剂量为流感疫苗肌肉注射剂量，在本发明的实施例中，流感疫苗肌肉注射剂量为每一毒株HA15yg。
[0030]流感疫苗可以是各种形式的流感病毒疫苗，通常包括活病毒或灭活病毒。灭活流感病毒可以是全病毒颗粒、裂解病毒颗粒或亚单位疫苗。可以是重组流感病毒毒株，和/或通过反向遗传学技术获得的病毒。流感病毒可以是减毒的。可以是温度敏感的，也可以是冷适应性的。也可以是包含致病株来源的HA和/或NA病毒部分和非致病株来源的重分类流感病毒。血细胞凝集素(HA)是灭活流感疫苗中的主要免疫原，季节性流感疫苗通常为三价疫苗或对B型保护更加全面的四价流感疫苗，通常包括两种甲型流感病毒株，和一种或两种乙型流感病毒株。
[0031]所述流感疫苗具体为四价流感疫苗;所述四价流感疫苗由灭活HlNl流感病毒裂解疫苗、灭活H3N2流感病毒裂解疫苗、灭活B型流感病毒裂解疫苗I和灭活B型流感病毒裂解疫苗2组成;所述灭活HlNl流感病毒裂解疫苗、灭活H3N2流感病毒裂解疫苗、灭活B型流感病毒裂解疫苗I和灭活B型流感病毒裂解疫苗2的HA的含量均为3yg或7.5yg;
[0032]所述灭活B型流感病毒裂解疫苗I和所述灭活B型流感病毒裂解疫苗2中的B型流感病毒为不同病毒株。
[0033]所述四价流感疫苗具体由灭活HlNl流感病毒裂解疫苗(A/California/7/2009(HlNl)pdm09-like virus)、灭活H3N2流感病毒裂解疫苗(A/Texas/50/2012(H3N2)_likevirus)、灭活B型流感病毒裂解疫苗(B/Massachusetts/2/2012-like virus)和灭活B型流感病毒裂解疫苗(13/131^8匕3116/60/2008-111^ virus)组成；
[0034]上述系统中，所述疫苗的灌装体积为0.02-1.0ml;或所述疫苗的灌装体积具体为0.1ml ο
[0035]上述系统中，所述动力推杆的直径与所述管体的内径一致;所述止动杆和止动槽为锥形;所述密封帽采用嵌合结构可拆卸地设置在所述无针注射器接头上；
[0036]所述动力推杆上设置有密封锁块凹槽，所述密封锁块嵌合在所述密封锁块凹槽中，从而可拆卸地安装在所述动力推杆上；
[0037]所述密封帽采用嵌合结构可拆卸地设置在所述无针注射器接头上;所述动力推杆上设置有密封锁块凹槽，所述密封锁块嵌合在所述密封锁块凹槽中，从而可拆卸地安装在所述动力推杆上；
[0038]所述管体、无针注射器接头、动力推杆、喷射口和止动杆均采用优质医用级材料制成，如玻璃、聚乙烯、聚丙烯、聚碳酸酯、COP或者环状聚烯烃等中的一种或几种混合制造而成，或通过共聚、接枝、交联等化学改性和/或共混、填充等物理改性进行优化的材料，但不限于此。
[0039]所述管体、无针注射器接头、喷射口和止动槽一体制造而成。
[0040]上述管体的长度为1.5-4cm，所述无针注射器接头的长度为0.5-2cm，所述动力推杆的长度为1.5-6cm，整个无针注射安瓿的长度为2-6cm;所述喷射口的直径为0.05-
0.25mm0
[0041]上述系统中，I)所示的系统或2)所示的系统均还包括与所述灌装有疫苗的容器配套使用的无针注射装置；
[0042]和/或，所述无针注射装置具体为无针注射器。上述无针注射器为江苏米特公司无针注射器(例如:MG-0.1; MP-0.1)，本实施例中用的是MP-0.1。
[0043]所述可读载体记载内容还包括所述疫苗的无针注射部位、所述疫苗的无针注射方式和所述疫苗的无针注射使用体积；
[0044]所述无针注射部位为皮内、皮下或肌肉；所述无针注射部位具体为皮内，而不仅限于皮内。
[0045]所述无针注射方式为连续免疫或单次免疫；
[0046]所述疫苗的无针注射单次使用体积为0.02-1.0ml;或所述疫苗的无针注射单次使用体积为0.lml。
[0047]用于肌肉注射的流感疫苗体积一般为0.5ml。但是，无针注射流感疫苗系统通过皮内注射途径，不需要像肌肉内注射时的体积，因此本发明组合物的体积一般小于0.5ml，优选为0.1mlo
[0048]上述无针注射流感疫苗系统在制备免疫动物或人产品中的应用也是本发明保护的范围；
[0049]所述动物具体为家畜，所述家畜尤其具体为猪。
[0050]本发明还保护一种对动物或人免疫流感疫苗的方法，为用上述系统进行免疫，免疫剂量为上述系统中的无针注射剂量。
[0051]上述方法中，免疫方式具体为多次连续免疫或单次免疫;免疫部位具体为皮内、皮下或肌肉。
[0052]本发明的疫苗可以单剂量免疫方案递送。或者，本发明的疫苗也可作为初始免疫-加强免疫的方案的基本单元递送(这意味着在第一次免疫后数周或数月内进行抗原性相似的第二次免疫或多次免疫)。
[0053]免疫原性的特征为，与疫苗施用相关的，能够刺激机体形成特异中和抗体，或刺激特定的免疫细胞，使免疫细胞活化、增殖、分化，最终产生免疫效应。
[0054]安全性的特征为，与疫苗施用相关的副作用的局限，尤其是注射部位经无针注射装备注射后的反应减轻或缺乏。
[0055]与常规的有针肌肉注射相比，无针注射流感疫苗系统进行皮肤免疫还有很多优势，如有较强的免疫原性，更易进入，可以避免疼痛，以及减少接种人群对有针注射的恐惧，消除或降低意外针刺伤的风险，还可作为细胞和体液免疫系统的一部分，不需要专业操作，患者可自行注射等等，因此也可以扩大疫苗接种范围。此种方法同样适用于快速大量的免疫接种，来应对传染病的大流行或是在战争中应用。
[0056]皮肤产生免疫应答的基础为，表皮和真皮层富含朗格汉斯细胞和DC细胞，经皮免疫的抗原被这些抗原提呈细胞捕获，转移至淋巴结，从而触发T、B细胞的活化。未被捕获的抗原也可直接迀移至淋巴结，而后被DC细胞捕获并呈递给淋巴细胞。
[0057]本发明的实验证明，本发明提供无针注射流感疫苗系统，不经过传统有针免疫注射途径，能够准确、快速、无痛地将疫苗通过无针注射器注入靶向区域，更具体是不需要大剂量抗原的途径施用疫苗，该系统预灌装疫苗的无针注射安瓿可防止二次利用，避免交叉污染的发生，免疫前疫苗预灌装，提高注射速度，精确免疫剂量并为大规模快速免疫接种提供可能。
[0058]本发明的无针注射流感疫苗系统的免疫方式是一种新型的免疫策略，通过经皮的免疫途径，只需传统有针肌肉注射剂量的1/5、1/2或更低剂量，即可诱导抗体的产生和全身免疫应答的免疫效果；同时，避免针头的免疫方式还具有以下优势:I)使用安全、简便、快捷，并可适用于大规模免疫接种;2)避免了有针注射的恐针感，降低了注射疼痛，提高了注射的依从性;3)避免针头滥用带来的交叉污染;4)降低抗原用量，降低生产成本。
[0059]本发明证实了无针注射安瓿与无针注射器联合应用进行免疫时，注射的准确性与安全性。组合产品在提高免疫效率，节省免疫时间的同时，为大规模快速免疫接种提供了可會K。
[0060]本发明的优点还在于，无针注射安瓿与无针注射器联合应用进行免疫时，抗原用量只需传统肌肉注射抗原用量的一部分，即可与其产生相同或更高的HI效价。进一步说明无针注射流感疫苗系统为免疫流感疫苗可供选择的理想策略。
【附图说明】
[0061 ]图1为无针注射安瓿结构示意图。
[0062]图2为应用系统中的灌装有墨汁的无针注射系统，在小鼠、大鼠、兔子皮肤内注射墨汁分布的照片。
[0063]图3为Draizescale评分标准。
[0064]图4为加强免疫后14天血清中HlNl的抗血细胞凝集素抗体的水平。
[0065]图5为加强免疫后14天血清中H3N2的抗血细胞凝集素抗体的水平。
[0066]图6为加强免疫后14天血清中13型(13/]\^8 8&(31111861^8/2/2012-1丨1^ virus)的抗血细胞凝集素抗体的水平。
[0067]图7为加强免疫后14天血清中B型(B/Brisbane/60/2008-like virus)的抗血细胞凝集素抗体的水平。
[0068]图8为无针注射流感疫苗系统经皮内注射猪的DRAIZE评分。
【具体实施方式】
[0069]下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0070]下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0071]下述内容为本发明的示例及时说明，但不意味着因此受此限制，凡是本发明在应用过程中可能对结构的简单变换、和/或一些实施方式中实现的优点的其中一个或多个均在本申请的保护范围内。
[0072]实施例1、无针注射安瓿的制备
[0073]下面结合附图和实施例对本发明进行详细的描述。
[0074]如图1A、图1B所示，本发明提供的预装疫苗或药品的无针注射安瓿，其包括一管体
1、一无针注射器接头2、一动力推杆3、一喷射口 4、一止动杆5、一密封帽6和一密封锁块7;其中，管体I用于预灌装固定精确剂量的疫苗或药品，无针注射器接头2—体设置于管体I的一端，动力推杆3由管体I的另一端滑动设置在管体I内，并封闭管体I;喷射口 4设置在无针注射器接头2内，其具有一止动槽8，喷射口4通过止动槽8与管体I内腔相连通;止动杆5易断地连接于动力推杆3的前端，且止动杆5与止动槽8相配合。当动力推杆3向前运动至管体I底部，将疫苗从喷射口 4释放时，止动杆5与止动槽8吻合，止动杆5与动力推杆3断开连接，并停留在止动槽8内，从而防止无针注射安瓿的重复利用。密封帽6可拆卸地设置在无针注射器接头2上，并封闭喷射口 4，密封锁块7可拆卸地设置在动力推杆3上，并且与管体I的入口相嵌合;在向管体I灌装精确剂量的疫苗或药品后，将密封锁块7安装于动力推杆3的密封锁块凹槽9中，同时在无针注射器接头2上安装密封帽6，可以避免空气、细菌等与疫苗或药品接触，达到无菌要求，还可以防止意外碰触导致动力推杆移动带来的药品溢出，有利于疫苗或药品的长时间储存和运输。
[0075]上述实施例中，密封帽6采用嵌合结构可拆卸地设置在无针注射器接头2上;动力推杆3上设置有密封锁块凹槽9，密封锁块7嵌合在密封锁块凹槽9中，从而可拆卸地安装在动力推杆3上。
[0076]上述实施例中，动力推杆3的直径与管体I的内径一致。
[0077]上述实施例中，止动杆5和止动槽8为锥形。
[0078]上述实施例中，管体I的长度为1.5-4cm，无针注射器接头2的长度为0.5-2cm，动力推杆3的长度为1.5-6cm，整个无针注射安瓿的长度为2-6cm;喷射口 4的直径为0.05-
0.25mm0
[0079]上述实施例中，管体I内预灌装的疫苗剂量为0.02-1.0ml。
[0080]上述实施例中，管体1、无针注射器接头2、动力推杆3、喷射口4和止动杆5均采用具有良好透明性、较高韧性与刚性、耐高温、阻湿、与疫苗或药品相容性良好的优质医用级材料制成，例如玻璃、聚乙稀、聚丙稀、聚碳酸酯、C0P(Cyclo olefin polymer，环稀经聚合物，一种光学塑料材料)、环状聚烯烃或通过共聚、接枝、交联等化学改性和/或共混、填充等物理改性进行优化的材料。
[0081 ]上述实施例中，管体1、无针注射器接头2、喷射口 4及止动槽8—体制造而成，强度高，制造简单方便。
[0082]上述实施例中，在疫苗或药品预灌装和无针注射安瓿的组装过程中需进行灭菌，预装疫苗或药品的无针注射安瓿的组装和包装均在无菌生产环境下进行，同时检测物理、化学和生物性能，且需经过不溶性微粒等检查。
[0083]无针注射安瓿应用时，如图1B所示，首先将未使用过的预装疫苗或药品的无针注射安瓿的密封锁块7从动力推杆3上拆卸分离，通过无针注射器接头2与无针注射器连接，再将密封帽6取下，然后将组合后的无针注射系统抵靠在患者皮肤上定位；启动无针注射器，无针注射器的动力装置驱动无针注射安瓿的动力推杆3相对于管体I运动至管体I底部，推动管体I内的疫苗从喷射口 4释放，将抗原(疫苗)准确、快速、无痛地分布于靶向的皮内、皮下、肌肉和粘膜等部位，可引起相当于传统针头注射免疫全剂量抗原所达到的机体免疫保护效果。此时，与动力推杆3连接的止动杆5插入止动槽6中，顶端堵住喷射口4，并与动力推杆3断开连接;止动杆5停留在止动槽8内，防止二次抽药，二次接种必须更换新的安瓿，从而防止无针注射安瓿的重复利用。
[0084]上述各实施例仅用于说明本发明，其中各部件的结构、设置位置及其连接方式等都是可以有所变化的，凡是在本发明技术方案的基础上进行的等同变换和改进，均不应排除在本发明的保护范围之外。
[0085]各实施例中流感疫苗的yg是指HA的含量。
[0086]实施例2、无针注射流感疫苗系统的制备与应用
[0087]本实施例的无针注射流感疫苗系统包括灌装不大于流感疫苗标准剂量15yg(以HA含量记)的无针注射安瓿和配套使用的无针注射器。
[0088]一、无针注射流感疫苗系统的注射深度摸索
[0089]将墨汁水溶液替换疫苗灌装到实施例1制备的无针注射安瓿，得到灌装有墨汁水溶液的无针注射安瓿。
[0090]墨汁水溶液为将普通用蓝黑色墨水用孔径为0.22um的滤膜过滤，收集过滤液再用注射用水稀释得到浓度为I %的墨汁水溶液。
[0091 ]将灌装有0.1ml墨汁水溶液的无针注射安瓿与MIT无针注射器(江苏丞宇米特医疗科技有限公司，产品型号:ΜΡ-0.1，MG-0.1)连接，得到无针注射装置;将无针注射装置分别施用于体重16-188之间的8&113/(3小鼠和200-25(^之间的30大鼠以及2.51^的家兔，将待注射部位剃毛，每只注射0.1ml墨汁水溶液。注射施用位置为小鼠的背部和大鼠、家兔的大腿外侧。
[0092]注射后30分钟，处死Balb/c小鼠、SD大鼠和家兔，用手术刀在注射部位皮肤划开2cm2并将皮肤与肌肉分离，进行液体分布位置及深度观察。
[0093]结果如图2所示，A、B为Balb/c小鼠经无针皮内注射，C、D为SD大鼠经无针皮内注射，E、F为家兔经无针皮内注射;可以看出，只在真皮区域发现墨汁，未在皮下区域中发现墨汁，未在肌肉区域内发现墨汁。因此本发明采用的无针注射流感疫苗系统可以将液体准确地注射于表皮内，且无液体注射于肌肉部位。
[0094]二、无针注射流感疫苗系统的制备
[0095]无针注射流感疫苗系统包括灌装有不同剂量的四价流感疫苗的无针注射安瓿和MIT无针注射器(江苏丞宇米特医疗科技有限公司，产品型号:ΜΡ-0.1，MG-0.1)和说明书。
[0096]灌装有不同剂量的四价流感疫苗的无针注射安瓿为灌装有3yg-7.5yg流感疫苗标准的容器。
[0097]说明书记载流感疫苗的无针注射剂量为3yg-7.5yg，无针注射部位具体为皮下，无针注射方式为单次免疫或连续免疫。
[0098]1、四价流感疫苗的获得
[0099]四价流感疫苗各毒株为WHO推荐的2014-2015年度北半球季节性流感疫苗株，HlNl流感病毒裂解物(A/California/7/2009(HlNl)pdm09-like virus)、H3N2流感病毒裂解物(A/Texas/50/2012 (H3N2)-1 ike virus)、13型流感病毒裂解物(13/]\^88&(31111861^8/2/2012-1ike virus)和B型流感病毒裂解物(B/Brisbane/60/2008-like virus)组成;其中，HlNl流感病毒裂解物、H3N2流感病毒裂解物、B型流感病毒裂解物和B型流感病毒裂解物中的HA含量比通常为1:1:1:1。
[0100]上述HlNl流感病毒(A/California/7/2009(HlNl)pdm09_like virus)、H3N2流感病毒(A/Texas/50/2012(H3N2)-1 ike virus)、13型流感病毒(13/]\^8 8&(31111861^8/2/2012-1ike virus)和B型流感病毒(B/Brisbane/60/2008-like virus)均记载在如下文献中:Recommended composit1n of influenza virus vaccines for use in the 2014-2015northern hemisphere influenza season:
[0101 ] http://www.wh0.1nt/influenza/vaccines/virus/recommendat1ns/201402_recommendat1n.pdf ?ua = 10
[0102]上述各裂解物按照如下方法制备:
[0103]HlNl流感病毒(A/California/7/2009(HlNl)pdm09-like virus)与H3N2流感病毒(A/Texas/50/2012(H3N2)-like virus)接种9-11 日龄鸡胚，于33°C_35°C培养48小时，B型流感病毒(13/]\^88&(31111861^8/2/2012-1丨1^ ￥丨1'118)和13型流感病毒(13/131^8匕&116/60/2008-like virus)接种9-11日龄鸡胚，于33°C_35°C培养72小时，收获的尿液。应用低速离心机4000rpm/min离心20min去除大分子物质，澄清后病毒尿囊液分别用100-300KD膜式超滤器浓缩30-50倍，采用蔗糖密度梯度法，经30000rpm/min，离心3小时，去除病毒浓缩液中大部分卵清蛋白等杂质，甲醛灭活，得到灭活HlNl流感病毒、灭活H3N2流感病毒、灭活B型流感病毒(13/]\^8 8&(31111861^8/2/2012-111^ virus)和灭活B型流感病毒(B/Brisbane/GO/^OOS-1ike virus)用CTAB裂解分别裂解上述灭活HlNl流感病毒、灭活H3N2流感病毒、灭活B型流感病毒(B/Massachusett s/2/2012-1 ike virus)和灭活B型流感病毒(B/Brisbane/60/2008-like virus)，再通过鹿糖密度梯度方法30000rpm/min离心3小时，应用1KD超滤膜洗滤杂质，得到灭活HlNl流感病毒裂解疫苗、灭活H3N2流感病毒裂解疫苗、灭活B型流感病毒(B/Massachusetts/2/2012-like virus)裂解疫苗和灭活B型流感病毒(B/Brisbane/60/2008-like virus)裂解疫苗；
[0104]将灭活HlNl流感病毒裂解疫苗、灭活H3N2流感病毒裂解疫苗、灭活B型流感病毒(B/Massachusetts/2/2012-like virus)裂解疫苗和灭活B型流感病毒(B/Brisbane/60/2008-like virus)裂解疫苗按照HA含量1:1:1:1混合，得到四价流感疫苗。
[0105]2、灌装有不同剂量的四价流感疫苗的无针注射安瓿
[0106]灌装有不同剂量的四价流感疫苗的无针注射安瓿为以下三种:
[0107]灌装有3yg四价流感疫苗的无针注射安瓿，其中3yg四价流感疫苗由灭活HlNl流感病毒裂解疫苗、灭活H3N2流感病毒裂解疫苗、灭活B型流感病毒(B/Massachusetts/2/2012-1ike virus)裂解疫苗和灭活B型流感病毒(B/Brisbane/60/2008-like virus)裂解疫苗组成，灭活HlNl流感病毒裂解疫苗、灭活H3N2流感病毒裂解疫苗、灭活B型流感病毒(B/Massachusetts/2/2012-like virus)裂解疫苗和灭活B型流感病毒(B/Brisbane/60/2008-like virus)裂解疫苗的HA的含量分别均为3yg;四价流感疫苗灌装总体积为0.1ml ；
[0108]灌装有7.5yg四价流感疫苗的无针注射安瓿，其中7.5yg四价流感疫苗由灭活HlNl流感病毒裂解疫苗、灭活H3N2流感病毒裂解疫苗、灭活B型流感病毒(B/Massachusetts/2/2012-like ￥丨1'118)裂解疫苗和灭活13型流感病毒(13/131^8&3116/60/2008-1丨1^ virus)裂解疫苗组成，灭活HlNl流感病毒裂解疫苗、灭活H3N2流感病毒裂解疫苗、灭活B型流感病毒(B/Massachusetts/2/2012-like virus)裂解疫苗和灭活B型流感病毒(B/Brisbane/60/2008-like virus)裂解疫苗的HA的含量分别均为7.5yg;四价流感疫苗灌装总体积为0.lml;
[0109]灌装有15yg四价流感疫苗的无针注射安瓿，其中15yg四价流感疫苗由灭活HlNl流感病毒裂解疫苗、灭活H3N2流感病毒裂解疫苗、灭活B型流感病毒(B/Massachusetts/2/2012-like ￥丨1'118)裂解疫苗和灭活13型流感病毒(13/131^8&3116/60/2008-1丨1^ virus)裂解疫苗组成，灭活HlNl流感病毒裂解疫苗、灭活H3N2流感病毒裂解疫苗、灭活B型流感病毒(B/Massachusetts/2/2012-like virus)裂解疫苗和灭活B型流感病毒(B/Brisbane/60/2008-like virus)裂解疫苗的HA的含量分别均为15yg;三价流感疫苗灌装总体积为0.1ml;
[0110]使用时分别将上述3种灌装有四价流感疫苗的无针注射安瓿与无针注射器(江苏丞宇米特医疗科技有限公司，产品型号:MP-0.1，MG-0.1)；连接。
[0111]三、无针注射流感疫苗系统的应用
[0112]1、免疫
[0113]18只体重在20_25kg的雌性小型巴马猪(购自中科院实验动物中心)随机分为组I和组2，每组9只；将组I和组2又进一步分为a，b，c三个小组，每组3只小型猪;a，b，c三组的剂量分别为3yg上述二制备的四价流感疫苗(以流感病毒HA的量记)、7.5yg上述二制备的四价流感疫苗(以流感病毒HA的量记)、15yg上述二制备的四价流感疫苗(以流感病毒HA的量记)；
[0114]组1:采用上述分别灌装有3yg、7.5yg、15yg四价流感疫苗的无针注射安瓿与无针注射器(江苏丞宇米特医疗科技有限公司，产品型号:MP-0.1，MG-0.1)，进行免疫，在第O天和第14天进行皮内免疫，免疫方式为以每剂0.1ml的体积施用于大腿内侧区域中，命名为无针3yg、无针7.5yg、无针15yg。
[0115]组2:采用传统0.5mm*20mm为规格的有针注射器进行免疫，在第O天和第14天分别进行肌肉免疫3yg、7.5yg、15yg上述二制备的四价流感疫苗，免疫方式为以每剂0.1ml的体积施用于大腿内侧区域中，命名为有针3yg、有针7.5yg、有针15yg。
[0116]2、血清HI效价测定
[0117]在各组加强免疫后14天采集血样，通过血凝抑制反应分析血清中相关毒株的抗血细胞凝集素抗体。待测血清与RDE(霍乱弧菌滤液购自日本生研，货号:340016)以1:3混匀后，37 °C孵育16-18小时，后56 °C孵育30分钟。依据相应流感病毒毒株血凝效价配置4个血凝单位，将不同稀释倍数的待测血清与流感病毒毒株作用I小时，加入1%鸡红细胞，室温静置30分钟。待阴性孔内红细胞自然下滑呈现泪滴状时，以出现完全抑制的血清最高稀释度的倒数为中和抗体效价。
[0118]图4、图5、图6和图7分别表示加强免疫后14天血清中HlNl，H3N2，两种B型的抗血细胞凝集素抗体的水平，其中131为灭活13型流感病毒(13/]\&18 8301111861^8/2/2012-111^ virus)裂解疫苗，B2为灭活B型流感病毒(B/Brisbane/60/2008-like virus)裂解疫苗;可以看出，3yg和7.5yg无针注射流感疫苗系统接种的抗体效价明显高于经传统有针注射器经肌肉注射的抗体效价。
[0119]3、无针注射流感疫苗系统免疫安全性评价——DRAIZE评分
[0120]在应用无针注射流感疫苗系统免疫小型猪后的7天内，每天观察注射部位的皮肤损伤情况。并根据损伤情况及程度进行评分。评分标准如图3所示。O分:没有红斑，未见水肿；I分:轻微红斑，皮肤有轻微隆起，几乎难以察觉；2分:清晰红斑，可看到明显的隆起;3分:中度红斑，隆起可见明显边缘;4分:重度红斑，且有结痂及深度损伤。评分结果见图8，无针皮内注射与有针肌肉注射DRAIZE评分结果相似，均在注射后第I天和第2天出现偶见的表皮擦伤和轻微的红斑。且在注射后第4天，不良反应均消失。由此表明，无针皮内注射与有针肌肉注射均具有良好的安全性。
【主权项】
1.无针注射疫苗系统，为如下I)或2): 1)所示的系统包括灌装有疫苗的容器，所述疫苗的灌装剂量小于等于该疫苗的标准剂量； 2)所示的系统包括灌装疫苗的容器和可读载体;所述可读载体记载内容包括:所述疫苗的无针注射剂量小于等于该疫苗标准剂量。2.根据权利要求1所述的系统，其特征在于:所述灌装有疫苗的无针注射安瓿包括: 预灌装疫苗的一管体， 一体设置于所述管体一端的一无针注射器接头， 由所述管体另一端滑动设置在所述管体内、并封闭所述管体的一动力推杆， 设置在所述无针注射器接头内的一喷射口， 易断地连接于所述动力推杆的前端的一止动杆， 可拆卸地设置在所述无针注射器接头上、并封闭所述喷射口的一密封帽，和 可拆卸地设置在所述动力推杆上、并与所述管体的入口相嵌合的一密封锁块； 其中，所述喷射口具有一止动槽，所述喷射口通过所述止动槽与所述管体内腔相连通；所述止动杆与所述止动槽相配合。3.根据权利要求1或2所述的系统，其特征在于:所述疫苗的灌装剂量或无针注射剂量均为1/5-1倍该疫苗标准剂量。4.根据权利要求2所述的系统，其特征在于: 所述疫苗为单价疫苗或多价疫苗； 所述单价疫苗或所述多价疫苗中每一种疫苗的灌装剂量或无针注射剂量均为1/5-1倍该疫苗标准剂量。5.根据权利要求1-4中任一所述的系统，其特征在于: 所述疫苗为病毒灭活疫苗、病毒裂解疫苗、病毒组分疫苗、灭活病毒体、重组VLP疫苗、重组纳米颗粒疫苗、减毒活疫苗、亚单位疫苗、DNA疫苗、重组活载体疫苗、通用型广谱疫苗等中的任何一种或几种混合。6.根据权利要求1-5中任一所述的系统，其特征在于: 所述疫苗为单价流感疫苗或多价流感疫苗，所述流感疫苗的灌装剂量或无针注射剂量以该流感疫苗的HA含量记； 所述单价流感疫苗或多价流感疫苗中每一种流感疫苗的灌装剂量或无针注射剂量均不大于15yg，且不等于O; 和/或，所述单价流感疫苗或多价流感疫苗中每一种流感疫苗的灌装剂量或无针注射剂量均具体为3-15yg; 和/或，所述单价流感疫苗或多价流感疫苗中每一种流感疫苗的灌装剂量或无针注射剂量均具体为3-7.5yg; 和/或，所述单价流感疫苗或多价流感疫苗中每一种流感疫苗的灌装剂量或无针注射剂量均具体为3或7.5yg。7.根据权利要求1-6中任一所述的系统，其特征在于: 所述动力推杆的直径与所述管体的内径一致;所述止动杆和止动槽为锥形;所述密封帽采用嵌合结构可拆卸地设置在所述无针注射器接头上； 所述动力推杆上设置有密封锁块凹槽，所述密封锁块嵌合在所述密封锁块凹槽中，从而可拆卸地安装在所述动力推杆上； 所述密封帽采用嵌合结构可拆卸地设置在所述无针注射器接头上;所述动力推杆上设置有密封锁块凹槽，所述密封锁块嵌合在所述密封锁块凹槽中，从而可拆卸地安装在所述动力推杆上； 所述管体、无针注射器接头、喷射口和止动槽一体制造而成。8.根据权利要求1-7中任一所述的系统，其特征在于: I)所示的系统或2)所示的系统均还包括与所述灌装有疫苗的容器配套使用的无针注射装置； 和/或，所述无针注射装置具体为无针注射器； 和/或，所述疫苗的灌装体积为0.02-1.0ml。9.根据权利要求1-8中任一所述的系统，其特征在于: 所述可读载体记载内容还包括所述疫苗的无针注射部位和所述疫苗的无针注射方式； 所述无针注射部位为皮内、皮下或肌肉； 所述无针注射方式为连续免疫或单次免疫。10.权利要求1-9中任一所述无针注射疫苗系统在制备免疫动物或人产品中的应用； 所述动物具体为家畜，所述家畜尤其具体为猪； 或，一种对动物或人免疫流感疫苗的方法，为用权利要求1-9中任一所述系统进行免疫，免疫剂量为权利要求1-9中任一所述系统中的无针注射剂量;免疫方式具体为多次连续免疫或单次免疫;免疫部位具体为皮内、皮下或肌肉。
【文档编号】A61K9/00GK105999257SQ201610308465
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2016年5月11日
【发明人】刘晓峰, 任天宇, 王希良, 许振国, 刘洪 , 王鋮, 邢丽, 张良艳, 杨鹏辉, 赵忠鹏, 段跃强
【申请人】长春海基亚生物技术股份有限公司, 中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所