一种猪圆环病毒ii型病毒样颗粒疫苗及其制备方法和应用
【专利摘要】本发明公开了一种猪圆环病毒II型病毒样颗粒疫苗及其制备方法和应用，属于生物制药技术领域。本发明所述的病毒样颗粒疫苗包括可溶性蛋白，该可溶性蛋白为大肠杆菌表达猪圆环病毒II型完整衣壳蛋白基因得到的蛋白。其中该衣壳蛋白基因是筛选自目前国内猪圆环病毒II型流行毒株的衣壳蛋白基因，并且经过密码子优化，不仅能在大肠杆菌中大量表达，而且表达的可溶性蛋白还能形成病毒样颗粒。应用本发明的方法制备的猪圆环病毒II型亚单位疫苗具有抗原纯度高、免疫原性强等特点，此外该疫苗制备过程简单，生产成本低廉，有很好的应用前景。
【专利说明】
-种猪圆环病毒Μ型病毒样颗粒疫苗及其制备方法和应用
技术领域
[0001] 本发明属于生物制药技术领域，具体设及一种猪圆环病毒II型病毒样颗粒疫苗及 其制备方法和应用。
【背景技术】
[0002] 猪圆环病毒II型（Porcine circovirus 2，PCV2)是断奶仔猪多系统衰竭综合征 (postweaning multisystemic wasting syn化ome，PMWS)的主要病原，其主要感染6-15周 龄的仔猪，临床表现为进行性消瘦、发热、淋己结肿大、黄痘、呼吸困难等症状。此外，PCV巧 猪皮炎与肾炎综合征、猪呼吸道综合征、A2型先天性震颤、猪增生性和坏死性肺炎、繁殖障 碍等疾病密切相关。PCV2的危害还在于能够使感染的猪只免疫功能受到损伤，从而导致机 体抵抗力下降，使机体容易继发或并发其它感染性疾病，造成更大危害。本病表现为世界流 行，已经给世界各国养猪业造成了巨大的经济损失，但对PCV2的致病机制研究仍不透彻，目 前仅能通过加强饲养管理、疫苗接种等方法控制该病毒在猪群中的爆发。因此，研发一种廉 价且有效地猪圆环疫苗显得尤为迫切。
[0003] 研究表明PCV2含有两个主要的开放阅读框，分别为0RF1和0RF2,其中0RF1与病毒 的复制相关，免疫原性较弱;0RF2为编码该病毒的主要结构蛋白Cap的基因，Cap是病毒的衣 壳蛋白，该蛋白含有可中和病毒的抗原表位，还可自我装配成病毒样粒子，因此0RF2是研制 新型疫苗的主要候选基因。
[0004] 此外，有文献报道，Cap蛋白的N端富含碱性氨基酸(如精氨酸），序列高度保守，其 中前41个氨基酸是化P蛋白的核内化信号肤序列，而位于第12~18与34~41位的氨基酸对 Cap蛋白的核定位起着决定性作用。还有研究表明，核定位信号肤区域含有潜在的抗原表 位，因此，要想获得更好的保护效果，最好能表达完整的化P蛋白。但由于化P蛋白的N端大量 精氨酸的存在，严重影响了完整化P蛋白的大量表达，因此，大多研究人员选择了截短或是 部分表达Cap蛋白，大量表达完整的化P蛋白目前仍是亟待解决的难题。通过本发明提供的 方法不仅可W大量表达完整的化P蛋白，而且表达的蛋白还是可溶的，活性高，易于大规模 生产。
[0005] 病毒样颗粒(Virus Like hdicles，化P)是含有病毒一个或多个结构蛋白的空 屯、颗粒，不含遗传物质，其形态、大小、结构及表面抗原和多肤表位与真正的病毒粒子相同 或相似，可通过与病毒感染一样的途径呈递给免疫细胞，有效地诱导机体的免疫应答，具有 良好的免疫原性，且没有毒副作用。目前，已有部分化Ps疫苗上市，如流感化Ps疫苗、乙肝 VLPs疫苗、乳头瘤VLPs疫苗等，说明该类疫苗有巨大的潜力。
[0006] 目前市场上的PCV2商品化疫苗主要有全病毒灭活苗和亚单位疫苗两种，其中关于 全病毒灭活苗，由于病毒自身特点和生产工艺的问题，经常出现病毒滴度难W提高等问题， 有时需要浓缩才能达到要求。国内使用的亚单位疫苗主要是勃林格公司生产的，该公司生 产的PCV2亚单位疫苗是使用杆状病毒表达目的蛋白，生产成本很高，造成很多养殖场难W 在生产中使用该疫苗。因此本发明使用的大肠杆菌表达系统因其操作简单、表达量高、成本 低廉等一系列优点而具有很好的前景。
【发明内容】
[0007] 为克服上述现有技术中存在的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种猪圆 环病毒II型病毒样颗粒疫苗的制备方法。
[0008] 本发明的另一目的在于提供上述制备方法获得的猪圆环病毒II型病毒样颗粒疫 苗。
[0009] 本发明的再一目的在于提供上述猪圆环病毒II型病毒样颗粒疫苗的应用。
[0010] 本发明的目的通过下述技术方案实现:一种猪圆环病毒II型病毒样颗粒疫苗的制 备方法，包括W下步骤：
[00川 （1)合成目的基因：WPCV2 119-GD01株(PCV2b基因亚型，由本实验分离保存）的 Cap蛋白的氨基酸序列为基础，在保证此株化P蛋白的氨基酸不变的前提下，使用大肠杆菌 通用密码子将氨基酸序列翻译为核巧酸序列，使其适合在大肠杆菌中表达，然后委托华大 基因公司合成，基因合成时两端加入酶切位点，氨基酸序列见SEQ ID N0:1，合成后的基因 命名为r0RF2,基因序列见沈Q ID N0:2;
[0012] (2)重组表达载体质粒的构建:将步骤（1)中获得的r0RF2与祀T-43.1a空载体分别 进行双酶切，然后连接、转化;获取单菌落，培养后之后抽提质粒保存待用，重组质粒命名为 pET-43.1a-r0RF2；
[001引（3)重组表达菌株的构建:将步骤(2)中获得的质粒转化大肠杆菌化-21 (DE3)，获 得单菌落，经检测正确后保存，并命名为祀T-43. la-r0RF2菌株，即为重组表达菌株；
[0014] (4)重组蛋白的表达、纯化和去标签:将步骤(3)中构建成功的重组表达菌株pET- 43. la-r0RF2进行培养，并加入IPTG诱导表达;收集诱导后的菌体，破碎后经Ni亲和层析柱 纯化，在纯化后期加入蛋白酶将目的蛋白与标签切开，收集目的蛋白；
[0015] (5)疫苗的制备:将步骤(4)中纯化出来的目的蛋白进行浓度测定，然后与佐剂混 合、乳化，获得猪圆环病毒II型病毒样颗粒疫苗。
[0016] 步骤(1)中所述的两端加入酶切位点，优选为BamHI和化ndin两个酶切位点。
[0017] 步骤(5)中所述的佐剂优选为法国赛比克公司提供的201佐剂。
[0018] 步骤(5)中目的蛋白与佐剂的混合比例优选为体积比1: 1。
[0019] -种猪圆环病毒II型病毒样颗粒疫苗由上述制备方法获得。
[0020] 上述获得的猪圆环病毒II型病毒样颗粒疫苗在制备防治断奶仔猪多系统衰竭综 合征的药物中应用。
[0021] 本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
[0022] 首先，本发明的基因是在保证氨基酸不变的情况下，使用大肠杆菌通用密码子将 氨基酸序列翻译为核巧酸序列，然后获得基因，使被普遍认为的全长化P蛋白在原核表达系 统中表达量低，容易形成包涵体等局限性得到解决，获得了表达量高，且目的蛋白可溶的重 组表达菌株，其中上清中目的蛋白约占总蛋白的43.1 %。
[0023] 其次，本发明表达的为化P蛋白全长，它包含了 Cap蛋白氨基端41aa里面含有的潜 在抗原表位，因此本发明表达的化P蛋白相比截短表达的蛋白拥有更齐全的抗原表位，更接 近天然病毒衣壳蛋白，更易形成病毒样颗粒，免疫原性更强。
[0024] -方面，使用本发明提供的纯化与去标签联合处理的方法制备蛋白，不仅操作简 便，纯度很高，适于大规模生产，而且获得的蛋白不带有任何的标签（目前很多亚单位疫苗 都含有标签，如6x化S标签、分泌性信号肤等，运些都不利于病毒样颗粒的形成），运样也会 减少表达的蛋白与天然衣壳蛋白的差异，W至于获得更接近天然病毒的颗粒
[0025] 又一方面，应用上述方法制备的猪圆环病毒II型亚单位疫苗对实验动物没有致病 性，且使用该疫苗免疫后，短时间内能在动物体内产生高水平的猪圆环病毒抗体。
【附图说明】
[0026] 构成本申请一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意 性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
[0027] 图1为大肠杆菌表达的目的蛋白的可溶性的检测结果图；其中，Μ泳道是蛋白 marker; 1:祀Τ-43. la-r0RF2诱导表达破碎后上清；2: ρΕΤ-43. la-r0RF2诱导表达破碎后沉 淀;3: pET-43. la-r0RF2诱导表达后全菌;4:空载体诱导表达后全菌；图中箭头所指为融合 蛋白。
[002引图2为电镜观察目的蛋白的结果图，图中病毒样颗粒得直径20nm左右。
[0029] 图3为免疫仔猪后不同时间血清的抗体水平;其中：横坐标代表不同组别；纵坐标 代表W450nm/630nm双波长检测的样品吸光度;2W、4W、6W、8W分别代表一免后2、4、6、8周。
【具体实施方式】
[0030] 下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限 于此。
[0031] 实施例1化P蛋白表达载体的构建
[0032] 化P蛋白基因的获得
[0033] WPCV2 119-GD01株(PCV化基因亚型，由本实验分离保存）的化P蛋白的氨基酸序 列为基础，在保证此株化P蛋白的氨基酸不变的前提下，使用大肠杆菌通用密码子将氨基酸 序列翻译为核巧酸序列，使其适合在大肠杆菌中表达，然后委托华大基因公司合成，基因合 成时两端加入酶切位点，氨基酸序列见SEQ ID NO: 1，合成后的基因命名为r0RF2,基因序列 见沈Q ID NO:2。
[0034] 重组表达载体质粒的构建
[00巧]将r0RF2用Ba恤I和化ndin两种限制性内切酶进行双酶切，然后回收纯化。pET- 43.1曰也进行与'01^^2同样的处理。将处理好的祀1'-43.1曰和'01^^2在16°(：连接12}1，之后将连 接产物转化到E.coli D册α感受态细胞，涂布含氨节青霉素的LB平板，37°C培养12-1化。挑 取平板上的单菌落，在含氨节青霉素的液体LB培养基培养4h左右，然后进行菌液PCR鉴定和 送金唯智测序。将测序正确的菌液1:1000加入到新鲜的含氨节青霉素的LB中，培养过夜，之 后抽提质粒保存待用，重组质粒命名为祀T-43. la-r0RF2。
[0036] 重组表达菌株的构建
[0037] pET-43.1a-r0RF2重组质粒转化大肠杆菌化-2UDE3)，同样的，涂布含氨节青霉素 的LB平板，37°C培养12-1化，获得重组表达菌株祀T-43.1a-r0RF2。
[0038] 实施例2重组蛋白的表达、纯化
[0039] 化p蛋白的诱导表达
[0040] 取过夜培养的祀T-43. la-r0RF2菌株1:100接种到新鲜的含氨节青霉素的液体LB 培养基中，37 °C，200巧m摇床上培养化左右，使0D600的值达到0.6左右。然后加入终浓度为 0.5mmol/L的IPTG，16°C，150巧m进行诱导表达20h。样品处理过后进行SDS-PAGE分析(结果 见图1)。
[0041] 化P蛋白的纯化和去标签
[0042] 将诱导完成的菌液按下述步骤处理
[0043] (1)5000巧m离屯、5min，收集菌体，然后按照100ml菌液加入10ml PBS重悬菌体。
[0044] 间重悬后的菌体超声破碎法破碎，破碎条件：功率200W，工作时间/间歇时间= 4sec/6sec，超声次数根据菌液的多少决定。
[0045] 间将破碎完成的菌液离屯、，4°C、12000巧m、15min，收集上清待用。
[0046] (4)化P蛋白的纯化按W下步骤进行
[0047] ① Ni填料装柱。
[004引②Binding buffer平衡。
[0049]③将收集的上清缓慢的通过处理后的含Ni填料的柱子。
[0化0] ④Binding buffer洗去杂蛋白。
[0化1 ] ⑤然后加入PBS稀释后的蛋白酶，16 Γ、100巧m、2化。
[0052]⑥收集蛋白酶切下的蛋白，此蛋白即为去除标签的化P蛋白。
[0化3] (5)SDS-P AGE 电泳检测、western-blot。
[0054] 实施例3电镜观察表达的化P蛋白
[0055] 取10倍稀释的纯化后的化P蛋白样品20ul滴到200目铜网上，室溫静置3min，用滤 纸轻轻吸去多余的液体。然后用3%的憐鹤酸染色3min，待完全干燥后在透射电镜下观察。 电镜照片结果见图2。
[0056] 实施例4病毒样颗粒疫苗的制备
[0057] 首先使用BCA试剂盒测定上述纯化好的蛋白，将化P蛋白浓度调至0.6mg/ml，然后 按照1:1的体积比例将蛋白与法国赛比克公司提供的201佐剂混合，接着进行超声乳化。经 检测粘度和稳定性合格后置于4°C保存。
[0058] 实施例5病毒样颗粒蛋白的仔猪免疫试验
[0059] 将15只3周龄经抗原抗体检测双阴性的仔猪随机分为3组，每组5头。各组均采用颈 部肌肉注射的方式免疫，共免疫两次。
[0060] 第一组:每头仔猪每次免疫2ml灭菌后的PBS。
[0061] 第二组:每头仔猪每次免疫2ml某公司灭活疫苗。
[0062] 第Ξ组:每头仔猪2ml由201佐剂乳化的化P蛋白，终浓度为0.3mg/ml。
[0063] -免后，每隔2周对每头仔猪进行采血，析出的血清使用猪圆环病毒化ISA检测试 剂盒进行抗体检测。检测结果见图3。
[0064] 结果显示:病毒样颗粒疫苗免疫仔猪后能快速产生针对猪圆环病毒的抗体，且与 商品化的灭活疫苗相比产生抗体更加迅速、水平更高。
[0065] 上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的 限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化， 均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 一种猪圆环病毒II型病毒样颗粒疫苗的制备方法，其特征在于:包括以下步骤： (1) 合成目的基因：合成两端加入酶切位点的如SEQ ID N0:2的基因序列，基因命名为 rORF2； (2) 重组表达载体质粒的构建:将步骤（1)中获得的rORF2与pET-43. la空载体分别进行 双酶切，然后连接、转化;获取单菌落，培养后之后抽提质粒保存待用，重组质粒命名为pET-43.1a-rORF2； (3) 重组表达菌株的构建:将步骤(2)中获得的质粒转化大肠杆菌BL-21 (DE3)，获得单 菌落，经检测正确后保存，并命名为pET-43. la-rORF2菌株，即为重组表达菌株； (4) 重组蛋白的表达、纯化和去标签：将步骤（3)中构建成功的重组表达菌株pET- 43. la-rORF2进行培养，并加入IPTG诱导表达;收集诱导后的菌体，破碎后经Ni亲和层析柱 纯化，在纯化后期加入蛋白酶将目的蛋白与标签切开，收集目的蛋白； (5) 疫苗的制备:将步骤(4)中纯化出来的目的蛋白进行浓度测定，然后与佐剂混合、乳 化，获得猪圆环病毒II型病毒样颗粒疫苗。2. 根据权利要求1所述的猪圆环病毒II型病毒样颗粒疫苗的制备方法，其特征在于:步 骤(1)中所述的两端加入酶切位点为BamHI和Hindlll两个酶切位点。3. 根据权利要求1所述的猪圆环病毒II型病毒样颗粒疫苗的制备方法，其特征在于:步 骤(5)中所述的佐剂为法国赛比克公司提供的201佐剂。4. 根据权利要求1所述的猪圆环病毒II型病毒样颗粒疫苗的制备方法，其特征在于:步 骤(5)中目的蛋白与佐剂的混合比例为体积比1:1。5. -种猪圆环病毒II型病毒样颗粒疫苗由权利要求1~4任一项所述的制备方法获得。6. 权利要求1~4任一项所述的制备方法获得的猪圆环病毒II型病毒样颗粒疫苗在制 备防治断奶仔猪多系统衰竭综合征的药物中应用。
【文档编号】A61K39/12GK105999255SQ201610333059
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2016年5月19日
【发明人】樊惠英, 苗配思, 刘洁, 高应棋, 谢永生
【申请人】华南农业大学